Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и сравнительная оценка способов определения магния в фармацевтическом и биофармацевтическом анализе

На правах рукописи

Копылов Николай Владимирович

РАЗРАБОТКА И СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА СПОСОБОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАГНИЯ В ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОМ АНАЛИЗЕ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Курск - 2004

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, профессор Новиков Дмитрий Алексеевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Бубенчикова Валентина Николаевна

кандидат фармацевтических наук, доцент Дурицын Евгений Петрович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия

Министерства здравоохранения Российской Федерации»

Защита диссертации состоится «/1 » 2004 г. в «/У » часов

на заседании диссертационного совета ^208.039.01 при ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет МЗ РФ» по адресу: 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет МЗ РФ» (305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3).

Автореферат разослан «/.7 » •0еи*г 2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Пашин Е.Н.

Общая характеристика работы

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ. За последние десятилетия наблюдается резкое увеличение номенклатуры лекарственных средств, содержащих комплекс минеральных солей и витаминов, как отечественного, так и импортного производства на Российском фармацевтическом рынке. Увеличение ассортимента лекарственных средств создает предпосылки к усилению контроля качества выпускаемой продукции, поступающей в аптечную сеть. В связи с этим возникает необходимость разрабатывать новые и совершенствовать уже существующие методики качественного и количественного анализа лекарств.

В арсенале методов, которые применяются в фармацевтическом и биофармацевтическом анализе для качественного и количественного определения неорганических катионов в лекарственных средствах, особого внимания заслуживают методы - высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) и фотометрия, которые обладают высокой чувствительностью и селективностью. Однако применение их в комплексных исследованиях, при количественном определении минеральных веществ имеет ряд трудностей, одной из которых является недостаточная изученность оптимальных условий комплексообразова-ния полидентантных органических лигандов с катионами анализируемых металлов.

В качестве объекта исследования нами был выбран эссенциальный элемент № 12 - магний, так как он входит в состав лекарственных средств, используемых для профилактики и лечения многих заболеваний: в терапии инфаркта миокарда, инфекционных, гинекологических и других. Необходимость проведения оптимальной терапии препаратами магния с целью эффективного и индивидуального назначения требует разработки более точных и чувствительных методик его определения в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека.

В связи с этим представляется актуальным изучать механизм комплексо-образования магния с различными органическими лигандами для оптимизации фотометрического и хроматографического определения этого элемента в фармацевтическом и биофармацевтическом анализе. Результаты такого подхода позволяют предложить новые, рациональные методики контроля качества выпускаемых магнийсодержащих лекарственных средств.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

БИБЛИОТЕКА СйшгаК оэ аооуб»«-

ь

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью работы является разработка фотометрической и хроматографической методик определения магния в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека, основанных на способности катиона образовывать комплексные соединения поли-дентантного типа с органическими лигандами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить особенности хроматографического поведения ионов магния с учетом введения в подвижную фазу комплексообразующего модификатора.

2. Разработать методики определения магния с использованием в качестве лигандов ксилидилового синего, ЭДТА, 8-оксихинолина, пентаметиндибар-битуровой кислоты.

3. Изучить возможность применения разработанных методик для определения содержания ионизированного магния в лекарственных формах и биологических жидкостях.

4. На основании полученных экспериментальных данных провести сравнительную оценку разработанных методик определения магния.

5. Исследовать уровень содержания магния в биологических жидкостях организма человека для выявления групп эндемического риска.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. На основании проведенных экспериментальных исследований установлены оптимальные условия определения магния методами фотометрии и ВЭЖХ в различных объектах, что позволяет повысить точность и экспрессность анализа.

Разработаны методики его определения, основанные на реакциях хелато-образования с ксилидиловым синим, ЭДТА, 8-оксихинолином, пентаметинди-барбитуровой кислотой, в лекарственных формах и биопробах.

В результате проведенных исследований доказана возможность применения разработанных методик для анализа магния в магнийсодержащих препаратах («Магнерот», «Панангин») и биологических жидкостях организма человека (плазма, эритроциты, моча).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Реакции хелатообразо-вания ионов магния с ксилидиловым синим, ЭДТА, 8-оксихинолином, пента-метиндибарбитуровой кислотой положены в основу разработанных методик его качественного и количественного определения методами фотометрии и ВЭЖХ. Разработанные методики определения магния в лекарственных формах дают

возможность повысить контроль качества магнийсодержащих лекарственных средств в процессе их промышленного производства.

Предлагаемые нами способы количественного определения ионов магния, в плазме, эритроцитах, моче позволяют использовать их в клинических исследованиях с целью проведения контроля электролитного баланса и выявления эндемических заболеваний.

Разработанные методики определения рекомендованы и могут быть использованы в научных исследованиях и учебном процессе при изучении неорганической, аналитической и фармацевтической химии студентами, аспирантами и научными работниками.

ВНЦДРЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ РАБОТЫ. На основании проведенных исследований способы качественного и количественного определения магния в биологических объектах разработаны и внедрены в практику:

- АНО «Липецкий городской лечебно-оздоровительный Центр» (акт №26 от 29.11.2002);

- инфекционного отделения медико-санитарной части г. Железногорска (акт №24 от 01.11.2002);

- Курского областного онкологического диспансера (акт № 113/03 от 01.11.2002);

- Курской городской клинической инфекционной больницы им. НА Семашко (акт № 016 от 25.10.2002).

СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЙ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Представленные результаты исследований относятся к теме — заданию «Разработка новых, совершенствование и унификация существующих методов исследования лекарственных веществ», включенной в проблему «Фармация». Диссертация выполнена в соответствии с планом научно -исследовательских работ Курского государственного медицинского университета по проблеме «Фармация», номер государственной регистрации 01.2.00 107782.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ. В качестве объектов исследования были использованы соединения магния: хлорид, сульфат и ацетат. Лекарственные формы: таблетки "Магнерот", драже "Панангин", "Магния сульфат" для инъекций, 25% раствор. Все используемые препараты включены в Государственный Реестр лекарственных средств 1998 г. и соответствуют требо-

ваниям нормативной документации. В работе использовались биологические жидкости организма человека (плазма, эритроциты, моча).

В ходе проведенных исследований были использованы методы фотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, потенциометрии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертационной работы доложены на научно-практической конференции Курского государственного медицинского университета, посвященной тридцатипятилетию фармацевтического факультета (г. Курск, 2001 г.), на 67-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (г. Курск, 2002 г.), на IX и X Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (г. Москва, 2002 и 2003 гг.).

ПУБЛИКАЦИИ ПО РАБОТЕ. По материалам диссертационных исследований опубликовано 7 работ, в том числе 1 работа- в центральной печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, четырёх глав экспериментальных исследований, общих выводов. Работа иллюстрирована 43 таблицами и 25 рисунками. Список литературы включает 156 источников, из которых 71 - работы зарубежных авторов.

НА ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ СЛЕДУЮЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ:

- результаты изучения зависимости устойчивости комплекса - кси-лидиловый синий от рН раствора;

- способы определения магния в лекарственных формах и биологических жидкостях (плазма крови) фотоколориметрически;

- результаты изучения оптимизации, хроматографического поведения магнийсодержащих комплексных соединений;

- ВЭЖХ - методика качественного обнаружения и количественного определения магния в лекарственных препаратах и биологических жидкостях.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Разработка способа определения магния в лекарственных формах и биологических жидкостях с использованием фотоэлектроколориметрии

Фотометрические методы анализа для определения микроколичеств веществ относятся к числу наиболее давно используемых. Фотоэлектроколори-метрическое определение неорганических катионов основано на проведении реакций хелатообразования с органическими лигандами и последующим анализом образца, что увеличивает избирательность и чувствительность метода.

Нами для определения ионов магния за основу был взят реагент — лиганд (ксилидиловый синий {4-окси-3-[2-окси—3-(2,4 ксилилкарбамил) - нафтилазо] бензол и его сульфокислота} (магон 1 или 2), образующий с ними окрашенный, растворимый в воде комплекс. Образующийся окрашенный комплекс, как и все ионогенные соединения, является стабильным в узком диапазоне значений рН рабочего раствора, что резко ограничивает универсальность методики. В связи с этим нами было проведено исследование по выявлению оптимальных условий комплексообразования ионов магния с ксилидиловым синим при различных значениях рН анализируемых образцов.

Для этого готовили серии разведений органических и неорганических магнийсодержащих соединений с содержанием магния от 0,18 до 1,80 ммоль/л. Смесь выдерживали в течение 10 минут в темном месте и измеряли оптическую плотность при максимуме светопоглощения 540 нм.

Таблица 1

Влияние значений рН на образование и время стабильности комплексного

соединения магния с ксилидиловым синим

Субстанция Конц. м82* рН реагента

3 | 4 | 5 | 6 1 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13

Время стабильности комплекса, мин.

в магния хлориде 0,18 + + + + 4 7 16 45 110 100 42

1,18 + + + + + 5 20 60 100 105 55

1,80 + + + + + 10 43 76 111 110 60

М§2* в магния сульфате 0,18 + + + + + 2 10 37 120 120 60

1,18 + + + + + + 15 70 100 100 60

1,80 + + + + + + 37 80 110 100 55

М£2+ в магния ацетате 0,18 + + + + + 3 15 60 140 110 45

1,18 + + + + + + 22 67 120 110 46

1,80 + + + + + + 45 78 112 115 54

Примечание: + - присутствие свободных ионов магния в растворе

Из таблицы 1 видно, что оптимальные значения рН соответствуют интервалу от 11 до 12, то есть при этих значениях образуется устойчивый хелат ионов магния с ксилидиловым синим, что увеличивает время стабильности комплекса до 120 минут.

Растворение неорганических соединений сопровождается различными физико-химическими явлениями: образованием простых (несольватированных) ионов, нейтральных молекул растворенного вещества, сольватированных молекул, ионных пар, комплексных ионов. Поэтому для оценки состояния ионов в растворе и более точных расчетов нами использована их активность. Данная величина вводится для учета взаимного притяжения ионов, взаимодействия растворенного вещества с растворителем и других явлений, изменяющих подвижность ионов. Было установлено, что для исследуемых нами ионов из-за проявления межионных сил активность меньше концентрации.

Рисунок 1. Зависимость оптической плотности от активности ионов магния

Данные графической зависимости Б от а показывают, что все ионы магния находятся в реакционной форме, вступая в реакцию хелатирования с кси-лидиловым синим, о чем свидетельствует образование устойчивого окрашенного комплекса, определяемого фотометрически.

Исходя из полученных экспериментальных данных, оптимальным составом лигандного реагента является водный раствор ксилидилового синего 0,01 ммоль/л и гликоколевый буфер до рН 11,5. Полученные экспериментальные данные были использованы для количественного определения магния в его солях.

На основании проведенных исследований были рассчитаны уравнения калибровочных графиков для анализируемых образцов субстанций, представленных в таблице 2.

Таблица 2

Уравнения калибровочных графиков количественного определения ионов магния в солях фотоколориметрическим методом

Соль Уравнение линейной зависимости у = Ьх + а

Магния хлорид У = 0,104783 х-0,0021492

Магния сульфат У = 0,0953543 х + 0,002701878

Магния ацетат У = 0, Ю8650328 х - 0,007143222

Примечание: х - концентрация ионов магния ммоль/л

Разработанная методика анализа была использована нами для количественного определения магния в лекарственных формах. Количественное содержание магния рассчитывали по уравнению калибровочного графика.

Таблица 3

Результаты статистической обработки количественного определения магния в лекарственных формах (п — 10)

Препарат Метрологические характеристики

Х% Б А X АХ. £ %

Магнерот 98,65 1,60 0,51 ±1,13 ±3,57 1,13

Панангин 98,95 1,51 0,48 ±1,07 ±3,37 1,08

Как. следует из полученных результатов, относительная ошибка определения магния не превышает 1,13%, что не превышает ошибку, допустимую НД при фотометрическом анализе данных лекарственных средств и позволяет применять ее в практике фармацевтического анализа.

Биологические жидкости (кровь, моча), используемые при биофармацевтических и клинико-диагностических исследованиях, сложны по своему химическому и компонентному составу. Поэтому для определения в них изучаемого элемента предварительно необходимо апробировать этот способ на модельных смесях этих биожидкостей. Анализ такой пробы позволяет использовать разработанные методики количественного определения магния для оценки его содержания в организме человека.

Концентрация ионов магния в плазме крови составляет 0,8-1,1 ммоль/л, учитывая это, прежде чем использовать модельные смеси, мы исследовали его содержание в плазме крови.

Концентрацию ионизированного магния в плазме рассчитывали по уравнению калибровочного графика. Значение этого показателя составило 0,83+0,07 ммоль/л.

Результаты статистической обработки количественного содержания исследуемого катиона представлены в таблице 4.

Таблица 4

Результаты статистической обработки количественного определения ионов магния в модельных смесях плазмы крови фотометрически (п=10)

Как следует из полученных данных, относительная ошибка определения ионов магния не превышает 4,99%. Результаты проведенных исследований позволяют использовать разработанную нами методику для определения содержания магния в биологических объектах, с целью клинико-диагностического контроля электролитного состава крови.

Определение ионов магния методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с обращенными фазами

Нами проведено исследование возможности обнаружения и количественного определения магния в органических и неорганических соединениях: сульфате, хлориде и ацетате с использованием метода ВЭЖХ - обращеннофаз-ный вариант. В качестве подвижной фазы использовался тетрабутиламмония гидросульфат, так как он разделяет образующиеся хелаты магния с ЭДТА, 8-оксихинолином, пентаметиндибарбитуровой кислотой.

Определение проводилось на отечественном жидкостном микроколоночном хроматографе "Милихром", оснащенном УФ-детектором и аналитическими колонками из стали размером 64x2 мм, заполненными сорбентами Nucleosil С18 и Separan С18. Средний диаметр частиц сорбента 5 мкм. Спектры поглощения исследуемых веществ измерялись в диапазоне 252-272 нм с аналитическим шагом 2 нм на лабораторном спектрофотометре СФ-46. Процесс хромато-графирования магнийсодержащих образцов осуществляется в изократйческих условиях. Состав подвижной фазы: 0,01 молярные растворы этилендиаминтет-рауксусной кислоты, 8-оксихинолина, пентаметиндибарбитуровой кислоты в гидрофталатном или фосфатном буферных растворах в определенных соотно-

шениях, которые изменялись в зависимости от условий хроматографирования и значений рН подвижной фазы. Скорость подачи подвижной фазы — 100 мкл/мин. Элюент перед использованием подвергался дегазации потоком гелия в течение двух минут. Оптимальная длина волны определялась нами на спектрофотометре СФ-46. Параллельно нами сканировался рабочий раствор на спектрофотометре хроматографа "Милихром" методом остановки потока, обеспечивающий поглощение всех исследуемых соединений. Максимум поглощения комплексов исследуемого катиона, полученный на спектрофотометре СФ-46 и на спектрофотометре хроматографа, был практически идентичным. Исходя из этого, рабочая длина волны составила 262 нм при хроматографическом анализе этих соединений.

В качестве аналитических характеристик хроматографического удерживания нами выбраны исправленный объем удерживания и коэффициент емкости, вычисляемый из полученных данных по формуле:

где Кд - удерживаемый объем вещества (мкл);

- удерживаемый объем условно несорбируемого компонента (мкл).

Как условно несорбирующееся вещество нами использован нитрат натрия. Для каждого соединения рассчитывалось среднее из трех параллельных измерений УЯ, расхождение между которыми не превышало 1-2%.

Комплексные соединения магния, стационарные фазы и используемые сорбенты малостабильны в сильно щелочной и в сильно кислой средах, поэтому нами изучено влияние рН на хроматографическое удерживание, которое ограничилось диапазоном 3-8. В ходе эксперимента готовились буферные растворы с определенным значением рН (3-8), далее готовили подвижную фазу. Для чего смешивали водные растворы ЭДТА, 8-оксихинолина, пентаметиндибарби-туровой кислоты с концентрацией 0,01 моль/л каждый и метиловый спирт, выбранный в качестве органического модификатора, в соотношении 20:80 соответственно. Затем проводили хроматографическое определение магнийсодер-жащих комплексов.

Из результатов, представленных на рисунке 2, следует, что К' является оптимальным при рН 6-7. Минимум удерживания наблюдается вблизи изо-электрической точки хелатов, при которой, вследствие наличия как положи-

тельного, так и отрицательного зарядов, затрудняется электростатическое взаимодействие со стационарной фазой.

О "Т—т—I-1—I—>—Г-1—I—I—I—"—I—I—Г-"—I—1—I-1—I—1—I

3 3,5 4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8

РН

-»- 15 17,5 -*-20 -*-22,5 -*-25

Рисунок 2. Зависимость К' магнийсодержащих комплексов от рН подвижной < фазы при различном содержании органического модификатора.

Типичные изменения геометрической формы хроматографических пиков анализируемых соединений в зависимости от рН подвижной фазы представлены на рисунке 3.

300 400 500 600 700 800

V

—*-рН=4 -в-рН=5 -*-рН=6 -*-рН=7 -*-рН=8_

Рисунок 3. Зависимость формы хроматографического пика комплексов магния от рН элюента (концентрация ионов магния 1,18 мкг/мл), где h - высота хроматографического пика (мм); V - объем удерживания (мкл).

Из рисунка 3 видно, что значения рН подвижной фазы в большей степени влияют на форму полученных пиков магнийсодержащих хелатов, чем на объем хроматографического удерживания исследуемых веществ.

Нами определено, что при проведении хроматографического анализа магниевых хелатов значительную роль играет межмолекулярное взаимодействие этих соединений с полярным элюентом. Межмолекулярное взаимодействие является специфическим и определяется возникновением водородных связей между п-связями или полярными функциональными группами элюента. Для случая, когда удерживание хелатов на обращенной фазе определяется двумя механизмами, коэффициент емкости выражается следующим соотношением:

вклады в удерживание за счет сольвофобного и си-ланофильного механизмов соответственно. Учитывая, что при удерживании за счет сольвофобного эффекта: линейная функция от объемной доли воды

в бинарной подвижной фазе а при сорбции на немодифицированном

силикагеле: К'з= (с + ¿^Л где & — объемная доля более полярного компонента бинарной подвижной фазы, коэффициенты емкости разделяемых веществ выражаются следующим образом:

К' « аехр (ЬфН20) + (с+ афнгоу'

Графики зависимости ¡пК' от фН^О наглядно демонстрируют эту закономерность.

Рисунок 4. Зависимость 1пК' от объемной доли воды в подвижной фазе (Separon С18; подвижная фаза метанол: вода, концентрация ионов магния 1,18 ммоль/л).

Как видно из рисунка 4, для магнийсодержащих хелатов линейная зависимость лежит в диапазоне содержания метанола от 15 до 30%, что говорит о преимущественно сольвофобном характере взаимодействия.

Для оценки возможности описания хроматографической подвижности магнийсодержащих комплексов нами проведено исследование хроматографи-ческого поведения комплексных соединений магния с ЭДТА, 8-оксихиноли-ном, пентаметиндибарбитуровой кислотой на сорбенте Separon C18. Процентное содержание метанола в подвижной фазе составило 20-50%.

Таблица 5

Значения коэффициентов емкости (К') комплексных соединений магния при ВЭЖХ определении (сорбент - Sepaгon 08, подвижная фаза буферный

раствор - метанол)

Хелат Mg2t с К' при содержании метанола об. %

20- 25 30 35 40- 45 50

ЭДТА 2,07 2,01 1,87 1,50 1,21 0,94 0,69

8-оксих и нолином 2,28 2,25 2,01 1,80 1,39 1 03 0,81

Пентаметиндибарбитуровой кислотой 2,15 2,09 1,95 1,60 1,19 0,92 0,73

Разработанные хроматографические методики определения изучаемого нами макроэлемента были использованы для его количественного определения с различными лигандами. На основании полученных данных были рассчитаны уравнения калибровочных графиков определения магния после проведения реакций комплексообразования.

Таблица 6

Уравнения калибровочных графиков для количественного определения магния методом ВЭЖХ

Комплексное соединение магния с Уравнение прямой у = kx + b

ЭДТА Y=3627x-41,54

8-оксихинолипом Y=5157x+82,97

Пентаметиндибарбитуровой кислотой Y=3874x+ 87,54

Разработанные методики были использованы для количественного определения магния в лекарственных средствах. Результаты проведенного анализа представлены в таблице 7.

Как следует из данных таблицы 7, относительная ошибка определения исследуемых препаратов не превышает 1,21%. Ошибка определения ионов магния в лекарственных средствах «Магнерот» и «Панангин» методом ВЭЖХ находится в пределах допустимых фармакопейными статьями на данные препараты.

Результаты статистической обработки количественного определения магния методом ВЭЖХ

Разработанная методика количественного определения ионов магния в сравнении с предложенной НТД является более чувствительной и селективной, что позволяет рекомендовать ее для целей фармацевтического анализа.

При разработке методик определения исследуемого биотика в крови нами учитывалось его распределение между плазмой и форменными элементами. Поэтому перед проведением его определения в цельной крови предусматривается центрифугирование исследуемого образцам разделение ее на плазму и форменные элементы с последующим исследованием отдельно плазмы и отдельно эритроцитов, для повышения достоверности анализа.

Учитывая, что белки способны практически необратимо связываться с сорбентом колонок для ВЭЖХ, нами проводилась очистка образцов от белка на силикагельных патронах «Диапак».

Анализ содержания магния в объектах биологического происхождения предусматривает подготовку проб к анализу, проведение реакций комплексо-образования, количественное определение образца, основным фактором при этом является знание эффективности выбранного метода, а так же степень взаимодействия изучаемого катиона с компонентами проб.

Поэтому нами была исследована возможность использования разработанной методики хроматографического определения для анализа катиона магния в плазме, эритроцитах, моче.

В результате проведенных исследований установлено, что среднее значение концентрации ионизированного магния в плазме составляет 0,82+0,07 ммоль/л, в эритроцитах - 1,68+0,03 ммоль/л, в суточной моче - 3,78+0,06 ммоль/л.

В ходе дальнейших исследований разработанные нами хроматографиче-ские методики были апробированы на модельных смесях биологических жидкостей. Данные статистической обработки результатов количественного содержания магния в модельных смесях представлены в таблице 8.

Результаты статистической обработки количественного содержания ионизированного магния в модельных смесях биожидкостей методом

ВЭЖХ (П = 10)

Биожидкость Метрологические характеристики •

Х% в Л X ЛХ £ %

Плазма 70,74 3,11 0,98 ±2,19 ±6,94 3,10

Эритроциты 76,23 3,89 1,23 ¿2,75 ±8,67 3,60

Моча 73,59 3,56 1,13 ±2,51 ±7,94 3,41

Как следует из полученных данных, относительная ошибка определения магния не превышает 3,60%. Это позволяет использовать нашу методику в ла-бораторно-клиническом и биофармацевтическом анализах с целью контроля магниевого статуса организма человека.

Сравнительная оценка способов определения магния методами фотометрии и ВЭЖХ в фармацевтическом и биофармацевтическом анализе

Для проверки достоверности использования разработанных фотометрических и ВЭЖХ методик определения магния, основанных на реакциях ком-плексообразования, проведена их сравнительная оценка по воспроизводимости.

Для этого нами была проведена совместная статистическая обработка нескольких выборок, полученных при исследовании магнийсодержащих образцов, с известным содержанием ионизированного магния. Данные проведенных расчетов представлены в таблице 9.

Таблица 9

Сравнительная метрологическая оценка двух методик анализа по воспроизводимости

Метод Лг п/п Г Х% в Р,% табл. Д* ё% ^ МЧ* Р выч- 5

1 9 98,54 48,94 7,00 95 2,23 ±4,94 4,99 0,94 5,07 1,46

2 9 70,74 9.65 3,11 95- ±2,19 3,10 43,01 29,26

Примечание: 1 -фотометрия; 2-ВЭЖХ.

Данные, представленные в таблице 9, демонстрируют, что результаты фотометрического определения магния показывают значительное стандартное отклонение. Результаты, полученные методом ВЭЖХ, являются более правильными, то есть они не отягощены случайной ошибкой, поэтому при определении

магния предпочтительнее использовать метод высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Использование комплексного определения магния в клинико-лабораторных исследованиях

Методика количественного определения ионизированного магния в биологических жидкостях (плазма, эритроциты, моча) была использована для клинико-диагностических исследований при изучении магниевого баланса организма человека.

Для оценки возможности использования разработанных нами хромато-графических методик количественного определения магния проведены исследования по определению его уровня у группы мужчин 18-20 лет. Средние значения содержания ионизированного магния в образцах биожидкостей в зависимости от сезонных ритмов представлены на рисунке 5.

С 5-Л-

Весна Лето Осень Зима

□ Плазма □ Эритроциты Ш Моча

Рисунок 5. Содержание ионизированного магния в образцах биожидкостей в зависимости от сезонных ритмов

Из рисунка 5 следует, что концентрация магния в биопробах практически одинакова и соответствует нижней границе нормы

Разработанные нами методики, были использованы в комплексном контроле определения магниевого баланса при проведении коррекции его дефицита.

В ходе эксперимента врачами назначалось по 6 таблеток «Магнерот» в сутки, разделенных на три приема. У участников эксперимента после приема препарата делали забор проб крови и мочи.

Результаты определения содержания магния в биожидкостях при назначении препарата «Магнерот»

№ п/п Содержание магния (ммоль/л) Отношение показателей содержания магния

Эритроциты Плазма Моча

Плазма / эритроциты Плазма / моча

1 1,81 ±0,09 0,8 НО ,04 5,05±0,03 0,45 0,16

2 1,85±0,07 0,85±0,02 4,86±0,06 0,46 0,17

3 1,72±0,08 0,82±0,02 4,78±0,09 0,48 0,17

4 1,91 ±0,08 0,87±0,01 5,17±0,06 0,45 0,17

5 1,84±0,08 0,84±0,05 5,35±0,07 0,46 0,16

6 1,88±0,08 0,88±0,07 5,40±0,03 0,47 0,16

7 1,83±0,06 0,84*0,04 5,48±0,04 0,46 0,15

8 1,83±0,04 0,84±0,03 5,67±0,08 0,46 0,15

9 1,83±0,07 0,87±0,05 5,32±0,05 0,48 0,16

10 1,85±0,08 0,81 ±0,01 5Д9±0,03 0,44 0,16

II 1,80±0,06 0,80±0,02 5,34±0,07 0,44 0,15

12 1,77±0,04 0,78±0,01 5,03±0,06 0,44 0,16

13 1,90±0,05 0,87±0,02 4,96±0,02 0,46 0,18

14 1,84±0,08 0,82±0,04 5,21±0,10 0,45 0,16

15 1,86*0,08 0,89±0,01 5,34±0,09 0,48 0,17

16 1,71 ±0,06 0,86±0,03 5,15±0,03 0,50 0,17

17 1,84±0,08 0,89±0,01 5,06±0,06 0,48 0,18

Из результатов, представленных в таблице 10, следует, что при применении таблеток «Магнерот» в эритроцитах нами обнаружено 1,83+0,07 ммоль/л, плазме 0,85+0,04 ммоль/л, моче 5,23+0,04 ммоль/л.

Рассчитанный нами показатель отношения содержания ионизированного магния в плазме и эритроцитах и в плазме и моче рекомендуется клиницистами в качестве критерия обеспеченности организма катионами.

Таблица 11

Метрологические характеристики количественного определения ионов магния в биожидкостях при применении препарата «Магнерот»

Содержание п в Я* Д X АХ 2 %

Эритроциты 10 4,63 1,47 ±3,27 ±10,32 9,02

Плазма 10 4,89 1,55 ±3,45 ±10,90 9,34

Моча 10 4,34 1,37 ±3,06 ±9,68 8,52

Из представленных в таблице 11 результатов следует, что нашу методику можно использовать для контроля магниевого баланса организма человека, при назначении магнийсодержащих лекарственных препаратов.

Ведущие клиницисты отмечают, что проявление дефицита магния, особенно ярко выражается при возникновении заболеваний, не связанных с эндемическими, а являющихся патологическими звеньями общего нарушения работы организма.

В ходе дальнейших исследований нами определено содержание ионизированного магния в крови у больных вирусным гепатитом»

Результаты количественного содержания ионизированного магния в биологических пробах при заболевании вирусным гепатитом представлены на рисунке 6.

Рисунок 6. Сравнительная • оценка содержания ионизированного магния у здоровых людей и больных вирусным гепатитом

Примечание: I - содержание ионизированного магния в биожвдкостях у здоровых людей, II - содержание ионизированного магния у больных вирусным гепатитом; III - отношение показателя плазма/эритроциты, плазма/моча у здоровых людей, IV - отношение показателя плазма/эритроциты, плазма/моча у больных вирусным гепатитом

Из представленных на рисунке 6 результатов следует, что у больных вирусным гепатитом наблюдается значительное снижение ионизированного магния в плазме, эритроцитах и моче, что может являться показателем возникновения магниевого дефицита.

Полученные экспериментальные данные наглядно показали возможность использования разработанных нами фотометрической и хроматографической методик определения магния для целей фармацевтического и биофармацевтического анализа.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучены условия образования комплексного соединения ксилидилово-го синего с магнием. Оптимальные значения диапазона рН при проведении реакций комплексообразования составляют 11-12, при этом наблюдается образование устойчивого хелата. Стабильность полученного соединения возрастает с 60 до 120 минут, то есть в 2 раза,

2. Разработана фотометрическая методика количественного определения магния в субстанциях (магния хлорид, магния сульфат и магния ацетат) и лекарственных препаратах «Магнерот» и «Панангин». Относительная ошибка определения не превышает 1,13%.

3. Показана возможность использования разработанной фотометрической методики для определения концентрации ионизированного магния «в плазме крови. Установлено, что среднее значение концентрация ионизированного магния для плазмы крови соответствует 0,83+0,07 ммоль/л, а относительная ошибка определения для модельных смесей составляет 4,99%.

4. Изучено хроматографическое поведение магнийсодержащих комплексов методом обращенно-фазной ВЭЖХ. Доказано существование линейной зависимости между значением коэффициента емкости и количеством органического модификатора в подвижной фазе, что говорит о едином механизме сорбции в данных условиях и позволяет прогнозировать оптимальный состав элю-ента.

5. Разработаны методики качественного и количественного определения магния в субстанциях и лекарственных формах методом ВЭЖХ (обращенно-фазный вариант). Установлено, что относительная ошибка определения магния в исследуемых образцах не превышает 1,5%.

6. Показана возможность использования хроматографической методики определения ионизированного магния в плазме, эритроцитах и моче. Для плазмы среднее значение концентрации составляет 0,82+0,07 ммоль/л, эритроцитов- 1,68+0,03 ммоль/л, суточной мочи - 3,78+0,06 ммоль/л. Полученные результаты показывают наличие умеренной корреляции

7. Проведена сравнительная оценка фотометрической и ВЭЖХ (обращен-но-фазный вариант) методик по воспроизводимости. Установлено, что при исследовании объектов биологического происхождения ВЭЖХ методика является

более воспроизводимой по сравнению с фотометрической, то есть она не отягощена систематической ошибкой. Чувствительность определения составляет 0,03 мкг в 10 мкл пробы.

8. Разработанный способ определения содержания магния был положен в основу клинико-диагностических исследований. С использованием разработанного способа определено содержание ионизированного магния в биожидкостях больных вирусным гепатитом после приема препарата «Магнерот». Относительная ошибка определения для плазмы составила 9,34%, эритроцитов 9,08%, мочи 8,52%.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ

1. Идентификация и количественное определение лекарственных средств производных 8-оксихинолина / В.К. Шорманов, М.К. Елизарова, А.А. Проко-шев, Н.В. Копылов // Уч.-метод. рекомендации. - Курск, 2000. - 12 с.

2. Копылов, Н.В. Биологическая роль и применение магния в урологии / Н.В. Копылов, В.А. Пузанов, Д.А. Новиков // Нефрология. - 2001. - Т. 5, № 3. -С. 132.

3. Копылов, Н.В. Изучение особенности магниевого статуса у жителей Курской области / Н.В. Копылов, ВА Пузанов, Д.А. Новиков // IX Рос. нац. конгр. «Человек и лекарство». - М. - 2002. - С. 547.

4. Копылов, Н.В. Использование аналитических подходов в биогеохимических исследованиях / Н.В. Копылов, В.А. Пузанов, Д.А. Новиков // «Человек и вселенная» - СПб., - 2003. - № 4(25). - С. 180-182.

5. Копылов, Н.В. Клинические исследования магниевого статуса у больных вирусным гепатитом / Н.В. Копылов, В.А. Пузанов, В.Я. Провоторов // Материалы 67-й межвузов, науч. конф.: Сб. науч. тр. - Ч. 2. - Курск, 2002. -С. 120-121.

6. Копылов, Н.В. Магний в жизнедеятельности организма / Н.В. Копылов, В.А. Пузанов, А.А. Хабаров, Д.А. Новиков // Достижения, проблемы, перспективы фарм. науки и практики: Сб. науч. тр. - Курск, 2001. - С. 172.

7. Хабаров, А.А. Биологическая доступность магнийсодержащих соединений / А.А. Хабаров, Н.В. Копылов // Сб. науч. тр. Ч. 2. - Курск, 2004. - С. 316.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г. Сдано в набор 07.07.2004 г. Подписано в печать 12.07.2004 г. Формат 30х42 1/8 Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ № 45 А. Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.

»16502

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

За последние десятилетия наблюдается резкое увеличение номенклатуры лекарственных средств, содержащих комплекс минеральных солей и витаминов, как отечественного, так и импортного производства на Российском фармацевтическом рынке. Увеличение ассортимента лекарственных средств создает предпосылки к усилению контроля качества выпускаемой продукции, поступающей в аптечную сеть. В связи с этим, возникает необходимость разрабатывать новые и совершенствовать уже существующие методики качественного и количественного анализа лекарств.

В арсенале методов, которые применяются в фармацевтическом и биофармацевтическом анализе для качественного и количественного определения неорганических катионов в лекарственных средствах, особого внимания заслуживают методы (ВЭЖХ) - высокоэффективная жидкостная хроматография и фотометрия, которые обладают высокой чувствительностью и селективностью. Однако применение их в комплексных исследованиях, при количественном определении минеральных веществ имеет ряд трудностей, одной из которых является недостаточная изученность оптимальных условий комплексообразова-ния полидентантных органических лигандов с катионами анализируемых металлов [53, 60].

В качестве объекта исследования нами был выбран эссенциальный элемент №12 - магний, так как он входит в состав лекарственных средств, используемых для профилактики и лечения многих заболеваний: в терапии инфаркта миокарда, инфекционных, гинекологических и других. Необходимость проведения оптимальной терапии препаратами магния с целью эффективного и индивидуального назначения, требует разработки более точных и чувствительных методик его определения в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека.

В связи с этим, представляется актуальным изучать механизм комплексо-образования магния с различными органическими лигандами для оптимизации фотометрического и хроматографического определения этого элемента в фармацевтическом и- биофармацевтическом анализе. Результаты такого подхода позволяют предложить новые, рациональные методики контроля качества, выпускаемых магнийсодержащих лекарственных средств.

ЦЕЛЬ И ЗАДА ЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью работы является разработка фотометрической и хроматографиче-ской методик определения магния в лекарственных формах и биологических жидкостях организма человека, основанных на способности катиона образовывать комплексные соединения полидентантного типа с органическими лигандами.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Изучить особенности хроматографического поведения ионов магния с учетом введения в подвижную фазу комплексообразующего модификатора.

2. Разработать методики определения магния, с использованием в качестве лигандов: ксилидилового синего, ЭДТА, 8 - оксихинолина, пентаметин-дибарбитуровой кислоты.

3. Изучить возможность применения разработанных методик для определения содержания ионизированного магния в лекарственных формах и биологических жидкостях.

4. На основании полученных экспериментальных данных, провести сравнительную оценку разработанных методик определения магния.

5. Исследовать уровень содержания магния в биологических жидкостях организма человека для выявления групп эндемического риска.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

На основании проведенных экспериментальных исследований установлены оптимальные условия определения магния методами фотометрии и ВЭЖХ, в различных объектах, что позволяет повысить точность и экспрессность анализа.

Разработаны методики его определения, основанные на реакциях хелато-образования: с ксилидиловым синим, ЭДТА, 8 - оксихинолином, пентаметин-дибарбитуровой кислотой, в лекарственных формах и биопробах.

В результате проведенных исследований доказана возможность применения разработанных методик для анализа магния в магнийсодержащих препаратах («Магнерот», «Панангин») и биологических жидкостях организма человека (плазма, эритроциты, моча).

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ

Реакции хелатообразования ионов магния с ксилидиловым синим, ЭДТА, 8 - оксихинолином, пентаметиндибарбитуровой кислотой положены в основу разработанных методик его качественного и количественного определения методами фотометрии и ВЭЖХ. Разработанные методики определения магния в лекарственных формах дают возможность повысить контроль качества магнийсодержащих лекарственных средств в процессе их промышленного производства.

Предлагаемые нами способы количественного определения ионов магния, в плазме, эритроцитах, моче позволяют использовать их в клинических исследованиях с целью проведения контроля электролитного баланса и выявлении эндемических заболеваний.

Разработанные методики определения рекомендованы и могут быть использованы в научных исследованиях и учебном процессе при изучении неорганической, аналитической и фармацевтической химии студентами, аспирантами и научными работниками.

ВНЕДРЕНИЕ РЕЗУЛЬ ТА TOB РАБОТЫ

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

Способы качественного и количественного определения магния в биологических объектах: в AHO «Липецкий городской лечебно - оздоровительный Центр» (акт №26 от 29. 11. 2002.); в медико-санитарную часть г. Железногорска инфекционное отделение (акт №24 от 01. 11. 2002.); в Курский областной онкологический диспансер (акт №113/03 от 01.11.2002.); в Курскую городскую клиническую инфекционную больницу им. H.A. Семашко (акт № 016 от 25. 10. 2002.).

СВЯЗЬ ИССЛЕДОВАНИЙ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Представленные результаты исследований относятся к теме — заданию «Разработка новых, совершенствование и унификация существующих методов исследования лекарственных веществ», включенных в проблему «Фармация». Диссертация выполнена в соответствии с планом научно - исследовательских работ Курского государственного медицинского университета по проблеме «Фармация», номер государственной регистрации 01 .2.00 107782.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объектов исследования были использованы соединения магния: хлорид, сульфат и ацетат. Лекарственные формы: таблетки "Магнерот", драже "Панангин", "Магния сульфат" для инъекций 25% раствор. Все используемые препараты включены в Государственный Реестр лекарственных средств 1998 г. и соответствуют требованиям нормативной документации. В работе использовались биологические жидкости организма человека (плазма, эритроциты, моча).

В ходе проведенных исследований были использованы методы фотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии, потенциометрии.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертационной работы доложены на научно-практической конференции Курского государственного медицинского университета, посвященной тридцатипятилетию фармацевтического факультета (г. Курск, 2001г.), на 67-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых (г. Курск 2002 г.), на IX и X Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство (Москва 2002 и 2003 г.г.).

ПУБЛИКАЦИИ ПО РАБОТЕ

По материалам диссертационных исследований опубликовано 7 работ, в том числе 1 работа - в центральной печати.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ

Диссертационная работа изложена на 145 страницах машинописного текста, содержит 43 таблицы и 25 рисунков, состоит из введения, пяти глав, включая обзор литературы, выводов, списка литературы, включающего 156 источников, в том числе 71 работа зарубежных авторов.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Изучены условия образования комплексного соединения ксилиди-лового синего с магнием. Оптимальные значения диапазона рН при проведении реакций комплексообразования составляют 11 - 12, при этом наблюдается образование устойчивого хелата. Стабильность полученного соединения возрастает с 60 до 120 минут, то есть в 2 раза.

2. Разработана фотометрическая методика количественного определения магния в субстанциях ( магния хлорид, магния сульфат и магния ацетат ) и лекарственных препаратах «Магнерот» и «Панангин». Относительная ошибка определения не превышает 1,13 %.

3. Показана возможность использования разработанной фотометрической методики для определения концентрации ионизированного магния в плазме крови. Установлено, что среднее значение концентрация ионизированного магния для плазмы крови соответствует 0,83 ± 0,07 ммоль/л, а относительная ошибка определения для модельных смесей составляет 3,68 %.

4. Изучено хроматографическое поведение магнийсодержащих комплексов методом обращенно - фазовой ВЭЖХ. Доказано существование линейной зависимости между значением коэффициента емкости и количеством органического модификатора в подвижной фазе, что говорит о едином механизме сорбции в .данных условиях и позволяет прогнозировать оптимальный состав элюента.

5. Разработаны методики качественного и количественного определения магния в субстанциях и лекарственных формах методом ВЭЖХ (обращенно - фазный вариант). Установлено, что относительная ошибка определения магния в исследуемых образцах не превышает 1,04 %.

6. Показана возможность использования хроматографической методики определения ионизированного магния в плазме, эритроцитах и моче. Для плазмы среднее значение концентрации составляет 0,82±0,07 ммоль/л, эритроцитов - 1,68±0,03 ммоль/л, суточной мочи - 3,78±0,06 ммоль/л. Полученные результаты показывают наличие умеренной корреляции ( г ~ 0,6 ).

7. Проведена сравнительная оценка фотометрической и ВЭЖХ (об-ращенно — фазный вариант) методик по воспроизводимости. Установлено, что при исследовании объектов биологического происхождения ВЭЖХ методика является более воспроизводимой по сравнению с фотометрической, то есть она не отягощена систематической ошибкой. Чувствительность определения составляет 0,03 мкг. в 10 мкл. пробы.

8. Разработанный способ определения содержания магния был положен в основу клинико - диагностических исследований. С использованием разработанного способа определено содержание ионизированного магния в биожидкостях больных вирусным гепатитом, после приема препарата «Магнерот». Относительная ошибка определения для плазмы составила 9,34%, эритроцитов - 9,02%, мочи - 8,52%.

Заключение

1. Проведен сравнительный анализ существующих методов определения магния в лекарственных формах и биологических жидкостях.

2. Выявлено, что методики количественного анализа магния в лекарственных формах и биологических пробах, пригодных для целей фармацевтического анализа, имеют существенные недостатки: низкую селективность, универсальность и экспрессность.

3. Обоснованы определенные преимущества использования методов фотометрии и ВЭЖХ в анализе изучаемого биогенного элемента.

4. Установлено, что недостаточно изучены условия хроматографиче-ского поведения магнийсодержащих комплексов при их анализе в обращенно -фазном варианте ВЭЖХ.

Глава II Экспериментальная часть

Разработка способа определения магния в лекарственных формах и биологических жидкостях с использованием фотоэлектроколориметрии

Фотометрические методы относятся к числу наиболее давно используемых для определения микроколичеств веществ. Данные методы широко применяются, и позволяют решать многие аналитические задачи. При использовании фотометрии чувствительность определения составляет (0,01 — 100) -10" % для твердых образцов, что имеет большое значение при определении неорганических ионов.

Исследования, проведенные в последние несколько десятилетий, показали, что возможности фотометрических методов далеко не исчерпаны. В первую очередь следует отметить работы, посвященные фотометрическому определению разнолигандных комплексов, результаты которых нашли применение в клинической и фармацевтической практике [13, 104].

При фотометрическом определении неорганических веществ выделяют два основных типа разнолигандных комплексов, а именно: 1. Комплексы, со смешанными лигандами. 2. Ионные ассоциаты. Комплексы, относящиеся к первой группе, представляют собой разнолигандные комплексы металла с различными красителями. При их образовании наблюдаются батохромные и гипер-хромные изменения спектра, что повышает контрастность и соответственно, чувствительность, при определении иона металла [37, 105].

Свойства разнолигандных комплексов меняются неаддитивно, что дает дополнительные преимущества, при определении смеси катионов в биологических пробах. Например, при образовании разнолигандных комплексов экстра-гируемость и фотометрические характеристики комплексов разных ионов меняются по-разному. Это позволяет в несколько раз увеличить избирательность и чувствительность метода.

Реагенты, используемые при определении можно разделить на две основные группы: 1 - образующие с магнием окрашенные, растворимые в воде комплексы. 2 - образующие окрашенные соединения адсорбционного типа. Методы определения с реагентами первой группы отличаются высокой чувствительностью и дают хорошо воспроизводимые результаты [20, 115].

Нами для определения ионов исследуемого элемента за основу был взят общепринятый метод определения ионизированного магния, используемый в фармацевтической и клинической практике. Реагент, входящий в его состав относится к соединениям 1 типа, образующих окрашенные, растворимые в воде комплексы. Однако при использовании этого метода можно выделить ряд недостатков, такие как: длительное время инкубации, короткий срок стабильности, влияние света на комплексообразующую способность и др.

Исходя из этого, мы разработали новую модификацию методики определения ионов М§ , в основу которой положено образование окрашенного комплекса с красителем ксилидиловым синим {4 - окси - 3 - [2 - окси - 3 - (2,4 кси-лилкарбамил) - нафтилазо] бензол и его сульфокислотой} (магон 1 или 2). Структурная формула комплексов представлена на рисунке 1.

Рисунок 1

Структурные формулы комплексов Ме2+ с ксилидиловым синим

СН3

СН3

БОзШ

По данным литературы [79, 107] в щелочных растворах магон 1 или 2 дает с магнием пурпурное окрашивание. Образующийся окрашенный комплекс является стабильным в узком диапазоне значений рН рабочего раствора, что резко ограничивает универсальность методики при работе с биожидкостями. В связи с этим нами было проведено исследование по оптимизации условий ком-плексообразования ионов магния с ксилидиловым синим, с учетом возможности изменения рН анализируемых образцов.

2.1. Влияние значений рН раствора на образование устойчивых окрашенных комплексов с ионами магния

Влияние значений рН раствора на образующийся окрашенный комплекс с изучаемым нами катионом выражается в различных формах, однако, в большинстве случаев оно сводится к разрушению или изменению структуры соединения, в зависимости от рН среды. Иногда это способствует образованию ок

I ^ I рашенных комплексов с посторонними ионами (Си , Мп ), присутствующими в растворе, обусловливает изменение растворимости окрашенных соединений, влияет на состояние окислительно-восстановительного взаимодействия и т.д.

Поэтому, в ходе дальнейшего эксперимента нами исследовалась устойчивость образующегося комплекса в зависимости от рН раствора.

Для определения ионов магния мы использовали реагент, содержащий водный раствор ксилидилового синего 0,01 ммоль/л в различных буферных системах, со следующим диапазоном значений водородного показателя: гид-рофталатный (рН 3-6), фосфатный (рН 4-8), гликоколевый (рН 9-12,9), являющийся слабой органической кислотой и проявляющий индикаторные свойства. В реакциях комплексообразования такой реагент способен изменять свою окраску и разрушаться с изменением концентрации ионов водорода. Это связано с состоянием равновесия, в котором кислотная (молекулярная) форма реагента -индикатора НЯ отличается по структуре и окраске от солевой формы К- этого же реагента. При повышении рН раствора происходит более полное превращение кислотной формы реагента в солевую. Понижение рН раствора приводит к увеличению концентрации слабой кислоты. Таким образом, несоблюдение постоянства рН среды вызывает изменение интенсивности окраски комплекса и самого раствора, а так же разрушение комплексного соединения. Следовательно, при использовании реагентов, проявляющих индикаторные свойства, реакции образования окрашенных соединений следует проводить при строго определенном значении рН.

В ходе эксперимента мы готовили указанные выше буферные растворы и смешивали с водным раствором ксилидилового синего в определенных объемных соотношениях с учетом рН получаемой среды. После чего в полученные смеси вносили известное количество ионов магния и определяли оптическую плотность растворов. Для разнолигандных комплексов состава МЩШ оптимальный интервал значений рН раствора определяется максимальным значением его условной константы устойчивости.

2.2. Исследование оптимальных условий лабораторного определения ионов магния

Магний и его соединения находятся в тканях, главным образом во внутриклеточном пространстве. В биологических жидкостях и тканях организма он находится как в виде иона, так и в связанном с белками состоянии. Основная часть магния, содержащаяся в крови, находится в свободной ионизированной форме. Поэтому для определения количественного содержания исследуемого макроэлемента в лабораторных условиях применяют различные физико - химические методы анализа, например, фотометрию, ВЭЖХ и другие, приведенные в главе I. В связи с этим нами была поставлена задача: изучить возможность количественного определения ионизированного магния с целью контроля его содержания в основных биожидкостях организма. Для повышения чувствительности и избирательности фотометрического определения исследуемого катиона необходимо оптимизировать условия его хелатообразования с органическим лигандом - ксилидиловым синим. Поэтому следует определить интервал значений рН среды, при которых образуется устойчивый, окрашенный комплекс, стабильность полученного комплекса, а так же время его образования.

2.2.1. Изучение влияния рН на образование и время стабильности комплекса ксилидилового синего с магнием

В эксперименте нами использовался колориметр фотоэлектрический концентрационный КФК 2-МП. В результате проведенных исследований мы исследовали максимум спектров поглощения исследуемого хелата, который составил 540 нм. Зависимость оптической плотности от длины волны представлена на рисунке 2.

Рисунок 2

Зависимость оптической плотности от длины волны (концентрация ионов магния 1,18 ммоль/л)

Комплекс -о- Реагент

Для исследования брали точную навеску соли магния, с содержанием иона магния 49,188 ммоль. Навеску количественно переносили в мерную колбу на 100 мл, растворяли в свежеперегнанной бидистиллированной воде, перемешивали, доводили объем до метки. После чего измеряли значение рН рабочего раствора на иономере универсальном ЭВ-74, рН раствора составил 5,6 для всех изучаемых соединений. В качестве анализируемых веществ, использовались соли магния, характеристики которых приведены в таблице 1.