Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.00) на тему:ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА ПРИ РАЗРАБОТКЕ И ИССЛЕДОВАНИИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

На правах рукописи

КОНДАКОВ СЕРГЕЙ ЭМИЛЬЕВИЧ

ОБОСНОВАНИЕ МЕТОДОЛОГИИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НЕСПЕЦИФИЧЕСКОГО БИОСЕНСОРА ПРИ РАЗРАБОТКЕ И ИССЛЕДОВАНИИ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ

15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела, 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ ,

- 1 ОКТ 7ПП0

диссертации на соискание ученой степени ¿иио

доктора фармацевтических наук

Москва 2009

003478147

Работа выполнена на кафедре химической кинетики государственного учебно-научного учреждения Химический факультет Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Научный консультант:

Заведующий лаборатории технологии готовых лекарственных форм. НИИ Фармакологии им В.В.Закусова РАМН, доктор фармацевтических наук, профессор Алексеев Константин Викторович

Официальные оппоненты:

Руководитель проекта ЗАО «ТТ-Стандарт»,

доктор фармацевтических наук, профессор Акашкина Людмила Владимировна Профессор медико-биологического факультета Ставропольского государственного университета,

доктор фармацевтических наук, профессор Кузякова Людмила Михайловна Главный кардиолог ФМБА МЗСЗ РФ, руководитель кардиологического центра, доктор медицинских наук, профессор Возовиков Игорь Николаевич

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия

Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «_30_» _октября_ 2009 г. в _14_ часов на заседании Диссертационного совета Д 212.203.19 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов Федерального агентства по образованию» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая д.8, корп.1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов Федерального агентства по образованию» (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

Автореферат разослан "___" _сентября_ 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор фармацевтических наук, профессор

И.В.Косова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В конце XX - начале XXI вв. системы здравоохранения развитых и развивающихся стран мира столкнулись с рядом проблем, связанных с лекарственными средствами (ЛС), прежде всего - с проблемой качества ЛС. Для решения этой проблемы специалисты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) выработали критерии, соблюдение которых обеспечивает потребительское качество ЛС на всех этапах его обращения - от изыскания и разработки до потребления - это критерии безопасности, эффективности, фармацевтического качества (соответствие требованиям нормативных документов - НД), доступности. Как следствие, в фармацевтической отрасли на международном уровне получила признание и стала интенсивно внедряться система стандартов (GLP, GCP, GMP и др.), направленных на обеспечение качества как создаваемых, так и уже освоенных промышленностью ЛС.

Проводимая гармонизация российской нормативно-правовой базы в области разработки и аттестации ЛС с международной способствует тому, что стоимость работ по проведению токсикологических исследований потенциальных фармацевтических препаратов на лабораторных животных резко возрастает, поэтому сокращение испытаний за счет предварительного отбора потенциальных кандидатов в ЛС на начальном этапе крайне желательно. Следовательно, уменьшение сроков и стоимости при разработке инновационных ЛС за счет создания современных методологических подходов к предварительному скринингу токсичности и биологической активности синтезируемых и выделяемых биологически активных веществ (БАВ) является крайне актуальной задачей.

Отмеченные тенденции побудили российских и зарубежных ученых искать пути и способы оптимизации процесса создания ЛС. В частности, российские ученые Лопатин П.В., Барабанов Л.Е. изучили организационные и методологические аспекты разработки новых ЛС; Краснокутский А.Б., Щавлинский А.Н., Валь Е.В., Тихонова Ю.А., Колипова Ю.В. и другие исследовали экономические аспекты инновационной фармации. Вместе с тем, за рамками выполненных в новой России исследований остались такие научные ' проблемы, как разработка новых, более экономичных способов изыскания и совершенствование методов оценки фармацевтических субстанций и препаратов.

Среди перспективных подходов в данном направлении особого внимания разработчиков ЛС заслуживает использование для фармацевтических целей биосенсоров - биологических детекторов (ткань, клетка, микроорганизм, биомолекула и др.), способных определенным, функциональным образом реагировать на исследуемый фактор (например, химическое вещество). На современном этапе в России использование биосенсоров для создания и оценки новых ЛС не является приоритетным направлением исследований. За рубежом активно исследуется возможность применения биосеисоров для функционального скрининга БАВ, прогностического скрининга с целыо направленного синтеза и определения действия БАВ, а также прогнозирования их токсичности без

проведения испытаний на лабораторных животных (Dickson M., 2004; DiMasi J.A., 2003,2007; Fischer-Fodor E„ 2008).

Однако теоретическое обоснование и методологические подходы к использованию клеточных биосенсоров в инновационной фармации до настоящего времени не разработаны, в частности, не изучена возможность применения клеток крови человека в качестве биосенсора для направленного конструирования JIC.

Другим перспективным направлением использования биосенсоров в фармации является скрининг готовых JIC. Действующая система сертификации не позволяет гарантировать в полном объеме безопасность JIC, поступающих в аптечную сеть. В настоящее время в соответствии с решением Межведомственной комиссии Совета Безопасности РФ от 24.10.2001г. №3 Минздрав России совместно с заинтересованными министерствами и ведомствами ведет поиск и разработку методов для внедрения скрининговой оценки JIC. Эти методы не должны заменять фармакопейные методы анализа, их задача - быстро и с меньшими затратами выявлять фальсифицированные и некачественные J1C.

В связи с этим приобрел актуальность вопрос о разработке теоретических основ и новых методических принципов использования неспецифических биосенсоров для создания и оценки фармацевтических препаратов без применения лабораторных животных. Отсутствие единой методологии использования неспецифических биосенсоров является сдерживающим фактором для широкого внедрения данной технологии в различные области фармации.

Вышеизложенное обусловило выбор темы, цели и задач исследования.

Цель настоящей работы - проведение комплексных теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию методологии применения неспецифических биосенсоров при разработке и исследовании инновационных фармацевтических препаратов на примере использования в качестве биосенсора показателя скорости оседания эритроцитов.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи:

• проанализировать состояние проблемы использования неспецифических биосенсоров в фармации и медицине и сформировать ее концептуальную основу (понятийный аппарат);

• разработать алгоритм и аппаратурное оформление получения биосенсорной характеристики на основе процесса оседания крови;

•выявить закономерности поведения иеспецифического биосенсора на основе процесса оседания крови в зависимости от внешних факторов (физических, химических, биохимических, временных), которые необходимо учитывать при проведении фармацевтического скрининга, для получения воспроизводимых результатов;

• разработать математическую модель процесса седиментации эритроцитов как неспецифического биосенсора, позволяющую связать внутренние процессы межклеточного взаимодействия с процессом оседания;

•разработать и статистически доказать критерии воздействия на исследуемый биосенсор с целью применения создаваемой методологии при разработке новых фармацевтических препаратов;

• исследовать возможности применения разрабатываемой методологии для исследования стабильности характеристик выпускаемых JIC;

• апробировать методологию неспецифического биосенсора при разработке инновационных J1C;

•разработать для сконструированных препаратов соответствующие НД и внедрить их в фармацевтическое производство.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально подтверждена эффективность и перспективность нового научного направления в фармации - применения неспецифических биосенсоров при разработке и исследовании J1C (на примере эритроцитов как неспецифического биосенсора и его характеристик - скорости и динамики оседания эритроцитов).

Теоретически обоснована и разработана методология использования неспецифического биосенсора при создании новых JTC, включающая:

• концептуальные основы (разработан понятийный аппарат; выявлены закономерности поведения неспецифического биосенсора в зависимости от внешних факторов, которые необходимо учитывать при проведении фармацевтического скрининга; разработана математическая модель процесса седиментации эритроцитов для прогнозирования количественного биосенсорного отклика при фармацевтическом скрининге);

• методические основы (комплекс критериев оценки функционального воздействия биологически активных веществ и соединений на биосенсор; критерии достоверности биосенсориого отклика на воздействие лекарственного вещества (в составе лекарственного моно- и комплексного препарата); комплекс методик оценки лекарственных субстанций и препаратов с использованием неспецифических биосенсоров, в том числе методика оценки биофармацевтической эффективности лекарственного препарата, методика оценки стабильности некоторых характеристик производства Л С, алгоритм-экспресс-скрининга лекарственных веществ, при создании новых JIC, методика оценки индивидуального терапевтического действия JIC);

• методологическую блок-схему, обосновывающую применение неспецифических биосенсоров на доклиническом этапе создания JIC;

• метод и аппаратно-программный комплекс для долговременной регистрации динамических характеристик реакции оседания эритроцитов как неспецифического биосенсора (РОЭ-графия).

На основе комплекса представлений о процессе оседания цельной крови как высокочувствительной биосенсорной системы теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования методологии неспецифических биосенсоров для фармацевтического скрининга при создании оригинальных J1C разных классов: противоопухолевых, противотуберкулезных и

метаболитных. Предложены состав и технологии получения, дана биофармацевтическая характеристика четырех инновационных ЛС.

Реализация предлагаемых методологических подходов в области создания противоопухолевых препаратов позволила провести скрининг синтезированных платиновых металлокомплексов, предсказать пониженную токсичность нескольких соединений, разработать технологию синтеза и предложить для практического использования новый фармацевтический препарат на основе водорастворимого комплекса цисплатина. В области противотуберкулезных препаратов - разработать и предложить новое лекарственное средство на основе изониазида и цветочной пыльцы обножки, обладающую лучшей переносимостью по сравнению с изониазидом, и новый способ синтеза противотуберкулезного препарата «Феназид» с повышенной растворимостью в воде. В области метаболитных препаратов - предсказать оптимальную концентрацию ЛВ, разработать состав и технологию производства инновационного инъекционного ветеринарного препарата, предназначенного для стимуляции защитных сил организма при интоксикациях и нарушениях функций ферментных систем.

Подтверждена принципиальная возможность использования модификации предложенной методологий неспецифических биосенсоров для скрининга лекарственных препаратов, а также для контроля стабильности и биологической активности выпускаемых ЛС.

На основе фундаментальных исследований, проведенных для создания методологии использования неспецифических биосенсоров в фармации, были получены важные научные результаты для смежных областей знаний. Изучение динамики оседания эритроцитов позволило усовершенствовать диагностику физиологического состояния человека. С учетом представлений о поведении цельной крови как индивидуальной биосенсорной системы человека исследовано влияние пищевых аллергенов на- процесс оседания эритроцитов, что закладывает основы индивидуальной фармации в части индивидуального подбора питания (устранения из питания продуктов, вызывающих аллергии разного типа). На основе изучения физических факторов, влияющих на реологические свойства крови, впервые показана принципиальная возможность инструментальной оценки влияния геомагнитной обстановки на человека, что может быть использовано для создания технологии контроля состояния здоровья кардиологических больных в дни геомагнитной активности. Разработанные биосенсорные подходы позволили обосновать несколько новых способов очистки воды и растворов и применение активированных вод в лечебно-профилактических целях.

Принципиальная новизна полученных научных результатов подтверждена 10 патентами РФ и 5 заявками на патент РФ.

Практическая значимость работы. Предложенные методологические подходы к разработке оригинальных ЛС с использованием неспецифических биосенсоров на основе реакции оседания клеток крови позволяют существенно сократить стоимость и сроки создания препаратов на первом этапе доклинических исследований путем направленного синтеза и отбора химических соединений за счет предварительного скрининга. Применение предложенной методики интегрированной оценки воздействия на клетки крови позволяет разработчикам в

короткие сроки создавать эффективные и конкурентоспособные оригинальные ЛС.

Полученные на примере клеток крови фундаментальные данные о существовании активных коллоидных систем, меняющих свои реологические свойства в зависимости от биохимичесих реакций, протекающих в системе под воздействием фармацевтических препаратов, вносят существенный вклад в современные представления химии, биологии и медицины, а прикладные аспекты этих знаний - в развитие фармацевтической химии и технологии.

На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

• состав и технология производства инъекционной формы инновационного противоопухолевого препарата «Платизид» (лабораторный регламент на производство ООО «Цитостарт», акты апробации от 02.2009);

• способ синтеза препарата для лечения туберкулеза «Феназид» обеспечивающий его повышенную биодоступность (лабораторный регламент на производство ООО «Комелис», акты апробации 11.2008);

• состав и оптимизированные технологические параметры производства комплексного препарата для лечения туберкулеза «Пергазид» в твердых желатиновых капсулах (лабораторный регламент на производство ООО «Комелис», акты апробации 12.2008);

• состав инъекционной формы ветеринарного препарата на основе внутренних метаболитов «Эльвита-Удивит», предназначенный для стимуляции защитных сил организма при интоксикациях, нарушениях ферментных систем (ТУ 9337-001-85676454-2008, Рег.уд. № ПВР-2-10.8/002341 от 17.03.2009г.);

• технология производства инъекционной формы инновационного ветеринарного препарата на основе внутренних'метаболитов «Эльвита-Удивит» (лабораторный регламент на производство ООО «Алвита», акт апробации 04.2009)

• разработаны и представлены в ФРУ í íf!')(".\ 11I Росздравнадзора с целью регистрации: ФСП «Феназид-моно» капсулы; ФСП «Пергазид» капсулы;

• разработана и представлена в ФГУ ВГНКИ Россельхознадзора с целью регистрации: ФСП «Платизид» раствор.

Высокая эффективность применения разработанного ветеринарного ЛС позволила рекомендовать его для внедрения в промышленное сельскохозяйственное производство (Методические рекомендации по применению препарата «Эльвита» для сельскохозяйственных животных, пушных зверей, птиц и домашних животных /МР МСХ РФ. - СПб., 2009 г.).

Отдельные фрагменты выполненной работы используются в учебном процессе ГОУ Санкт-Петербургская академия ветеринарной медицины им. Урбана при изучении дисциплин химия, фармация и эпизотология (акт внедрения).

Положения, выносимые на защиту:

•разработанная методология использования реакции оседания клеток крови в качестве неспецифического биосенсора для создания инновационных ЛС;

•разработанная приборная и методическая база использования динамического показателя оседания клеток крови в качестве биосенсора. Исследованные временные, физические и физико-химические факторы, влияющие на использование предложенного биосенсора в фармацевтическом скрининге;

•установленные и статистически обоснованные критерии воздействия исследуемого фармацевтического препарата на процесс оседания клеточной массы; выявленные границы применимости предложенного биосенсора; разработанная модель активного коллоида, показывающая принципиальный механизм воздействия исследуемого фармацевтического вещества на биосенсорную характеристику - процесс оседания клеток крови;

•результаты, показывающие принципиальную возможность разработки, на основе методологии неспецифических биосенсоров, метода контроля стабильности технологии производства фармацевтических препаратов и метода сравнения биоэквивалентности JIC, выпускаемых разными производителями на основе одной фармацевтической субстанции;

•результаты практического использования предложенной методологии на примере разработки противотуберкулезных, противоопухолевых и метаболитных фармацевтических препаратов, находящихся на разной стадии внедрения, от стадии синтеза действующего начала до разработки технологии готовой лекарственной формы.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на межкафедральной конференции специальных кафедр медицинского факультета и факультета повышения квалификации медицинских работников Российского университета дружбы народов (июнь 2009); на 9 международных конгрессах, конференциях и симпозиумах: Гурвичевской конференции «Неравновесные и когерентные системы в биологии, биофизике и биотехнологии» (Москва, 1994, 1999), Пущинском симпозиуме «Связь биологических и физико-химических процессов с космическими и гелио-геофизическими факторами (Пущино, 1996), конференциях Биомедприбор-98 (Москва, 1998) и «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000), конгрессе по биоэлектрографии (С.-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002); на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), Всероссийском научном совещании «Высокоорганизованные каталитические системы» (Москва, 2000); на научной конференции МГУ «Ломоносовские чтения» (Москва, 1999, 2000); на 7 зарубежных конгрессах, конференциях и симпозиумах, в том числе конгрессах по биомедицинской оптике «BiOS Europe» и BiOS (США, 1997, 1998, 2000), Крымском семинаре «Космическая экология и ноосфера» (Украина, 1997, 1999, 2001), конференции «Новая наука о сознании» (Словения, 2000).

На 26-м Международном Салоне изобретений (Швейцария, 1998) созданная на основе результатов исследования медико-диагностическая аппаратура была удостоена большой серебряной медали.

Связь задач исследования с проблемным планом научно-исследовательских работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР государственного учебно-научного учреждения Химический

s

факультет Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова (номер госрегистрации темы № 01.930.0 04727, номер госрегистрации ГАСНТИ 02 0202 225 0320).

Личное участие автора. Основная часть исследований (более 75% общего объема) выполнена лично автором диссертационной работы. Во всех работах, выполненных с соавторами, автору принадлежит постановка задачи, концепция основных методов, анализ полученных результатов, непосредственное участие во всех проведенных исследованиях.

Публикации по теме работы. Основное содержание работы отражено в 52 научных публикациях, в том числе в 12 статьях в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 16 патентах Российской Федерации.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 7 глав теоретических и экспериментальных исследований, заключения и выводов. Изложена на 299 страницах машинописного текста в компьютерном наборе,

содержит _ рисунков и _ таблиц. Указатель литературы включает 472

источника, в том числе 251 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Применение бносенсоров в медицине и фармации (обзор литературы)

Анализ отечественной и зарубежной литературы показал, что существует ряд предпосылок создания новых ЛС - социально-политические, медицинские, научные, экономические, нормативные и др. Все они в определенной степени способствовали возникновению и становлению во второй половине XX в. новой фармацевтической науки «инновационная фармация» (термин предложен Лопатиным П.В., Барабановым Л.Е., 2008). Под инновационной фармацией понимается мультидисциплинарная научно-практическая область в сфере обращения ЛС, которая направлена на изыскание, разработку и исследование инновационных ЛС. Инновационные ЛС - класс ЛС, обладающих принципиально новыми или модифицированными медицинскими, фармацевтическими и потребительскими характеристиками, благодаря которым улучшается качество лечения пациентов и качество их жизни, связанное со здоровьем (Коржавых Э.А., Дремова Н.Б, 2006).

Как свидетельствуют данные литературы, основными затратными стадиями в многоэтапном процессе создания инновационных ЛС являются доклинические стадии изучения (прогнозирования) биологической активности вещества, его токсикологических свойств и специфической биологической активности. На этих стадиях высока вероятность получения отрицательных результатов по тем веществам и соединениям, на предшествующие исследования которых уже были потрачены средства.

В связи с этим особую значимость приобретает развитие и совершенствование методов предварительного скрининга, позволяющих сократить количество БАВ, отобранных для испытаний, и соответственно удешевить стоимость вывода нового ЛС на рынок. Литературные данные свидетельствуют, что среди таких методов весьма перспективным представляется

метод, основанный на биосенсорном механизме взаимодействия БАВ с клетками, тканями, системами организма человека.

На современном этапе развития биосенсорики использование ее достижений в российской науке и практике наиболее представлено в области экологического нормирования вредных воздействий и диагностики экологического качества природных экосистем. Первые работы, оценивающие возможность использования биосенсоров (на основе одноклеточных организмов) для характеристики токсических и фармакологических свойств БАВ, в нашей стране появились в конце 1990-х гг. (Дассайе Ч.Р., 1996; Балабаньян В.Ю., 1998; Храмченкова Т.А. с соавт., 2000 и др.). Современные зарубежные исследователи в области фармации, обсуждая перспективы развития клеточных биосенсоров, в качестве приоритетного направления исследований рассматривают разработку новых биосенсорных технологий для качественно нового уровня выявления биологической активности соединений, начиная с ранних стадий синтеза или выделения из природных источников до получения нового ЛС (Dickson M., Gagnon J.P., 2004; Kairys V. et al., 2006; Tecon R., van der Meer J.R., 2006 и др.)

Обобщение теоретических и экспериментальных данных литературы о возможностях биосенсоров позволяет заключить, что применение биосенсоров для направленного конструирования ЛС очень перспективно, но находится в России на начальной стадии накопления экспериментальной информации. Применение клеток крови человека в качестве биосенсора для направленного конструирования ЛС практически неизвестно. Разработка методологических подходов и теоретическое обоснование использования клеточных биосенсоров в инновационной фармации позволит решать одну из важнейших задач фармацевтической технологии по созданию ЛС на основе ранее неизвестных фактов и закономерностей.

Материалы и методы исследования

Синтезы новых фармацевтических препаратов на основе металлокомплексных соединений платины, железа и изониазида осуществляли методами препаративной органической химии. ЯМР Н1- и С13-спектры снимали на приборе Bruker Solid-State DNP-NMR Spectrometer 263 GHz AVANCE™ III (400 Мгц) в ДМСО-de и CDC13, внутренний стандарт ГМДС (0,05 м.д. от ТМС); ИК-спектры - на спектрометрах Specord-75IR и Specord-M80 в вазелиновом масле и в виде прессованных таблеток КВг; УФ-спектры - на спектрофотометре Shimadzu UV-2401(PC). Термогравиметрический анализ образцов проводили на приборе Intertech SDTQ-100, на приборной базе Химического факультета МГУ. Исследования образцов при помощи гамма-резонансной спектроскопии (мессбауэровской спектроскопии) проводили на приборе фирмы WissEL в ИХФ им. Н.Н.Семенова РАН.

Материалы и реактивы. Для проведения химических синтезов использовали реактивы категории не ниже аналитической, приобретенные у ведущих химических фирм (Serva, Sigma, Aldrich, Merck, ÍCN, и др.). В биосенсорных исследованиях использовались фармацевтические субстанции и препараты, материалы и вспомогательные вещества, которые соответствовали по

качественным показателям и количественному содержанию требованиям НД (ГФ СССР X и XI изд., отдельных фармакопейных статей, ГОСТ, ОСТ, ТУ). Биологический материал получали для исследований обезличенным и проверенным на наличие инфекций из ряда медицинских учреждений г.Москвы.

Основные методы при работе с лабораторными животными. При проведении токсикологических испытаний разработанных новых фармацевтических препаратов все исследования выполнялись в соответствии с действующими «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» и «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных». Эксперименты проводились на базе НИЦ токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов ФМБА МЗСЗ РФ (НИЦ ТБП) на мышах линии BALB/c-Nude (самки), поставляемых НПП «Питомник лабораторных животных» ИБХ РАН им. акад. М.М.Шемякина и Ю.А.Овчинникова. Все животные имели сопроводительные документы о состоянии здоровья: сертификат здоровья животных, ветеринарная справку и ветеринарное свидетельство.

Условия культивирования и манипуляции с клетками опухолей и бактериальными культурами. Все исследования с использованием специальных культур клеток и микобактерий туберкулеза проводились сертифицированными специалистами, согласно правил GLP. В работе на базе НИЦ ТБП использовали перевиваемые опухоли лимфоидной лейкемии L1210, меланомы В-16 и аденокарциномы молочной железы Са755. Противотуберкулезную активность разработанных препаратов исследовали на базе Московского городского центра борьбы с туберкулезом.

Обработку полученных результатов осуществляли с использованием стандартного программного обеспечения. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили с помощью программных пакетов EXCEL, Origin 6.0 и Statistica 5.0 для Windows 5.0 с вычислением среднего квадратичного отклонения, стандартной ошибки, доверительного интервала. При оценке степени достоверности различий средних данных использовали г-критерий Стьюдента.

Теоретическое обоснование применения неспецнфнческих биосенсоров для исследования лекарственных субстанций и препаратов

На данном этапе исследования предусматривалось решение следующих задач: формирование понятийного аппарата в области использования клеточного биосенсора для фармацевтического скрининга; разработка аппаратно-программного обеспечения для исследований поведения эритроцитов как неспецифического биосенсора для фармацевтических целей; выявление степени и характера влияния различных факторов на неспецифический биосенсор.

В процессе решения первой задачи на основании логического анализа существующих научных представлений о биосенсорах было установлено, что концептуальную основу разрабатываемой нами методологии образуют понятия: «биосенсор», «клеточный биосенсор», «биосенсорный стимул», «биосенсорный отклик», «неспецифический биосенсор», «эритроцит», «скорость оседания

эритроцитов». В целях настоящего исследования приняты следующие рабочие определения этих понятий:

• биосенсор - биологический детектор в виде микроорганизма, ткани, клетки или биомолекулы, действие которого основано на его специфической реакции на определенный, анализируемый фактор, при этом характер и выраженность реакции функционально связаны с мощностью (концентрацией, силой) или иной характеристикой анализируемого фактора;

• клеточный биосенсор - биосенсор в виде клеток биологической ткани или одноклеточного организма;

• неспецифический биосенсор - биосенсор, позволяющий на основании измерения разных его параметров идентифицировать различные химические воздействия;

• биосенсорный стимул - вещество или соединение, воздействующее на биосенсор;

• биосенсорный отклик - регистрируемая реакция биосенсора на воздействие вещества или соединения;

• эри-фоцит — безъядерный форменный элемент крови, содержащий гемоглобин; красная кровяная клетка;

• скорость оседания эритроцитов (СОЭ) - показатель, отражающий изменение физико-химических свойств крови и измеряемый величиной столба плазмы, освобождающейся от эритроцитов при их оседании из цитратной смеси в специальной пипетке (как правило, за 1 час).

С учетом того, что методология использования небспецифического биосенсора на основе эритроцитов разрабатывается впервые, сочтено целесообразным на данном этапе исследования ориентировать ее не на всю область создания ЛС, а на первые два этапа разработки нового препарата (рис. 1).

О § В ¿у

Хлкнкчеш? йеспедмшда

Флч Ш

ар

у л. ■

ССР

Внгврмяе я чромаодство

ОМР ) ^

Рисунок 1 - Этапы разработки фармацевтического препарата и место разрабатываемой методологии неспецифических бносенсоров (обозначено стрелкой).

Исходя из представлений о реакции оседании крови как системы, обладающей собственным метаболизмом, установили, что динамика процесса оседания эритроцитов будет отражать ее свойства значительно полнее, чем среднее значение скорости, измеренное через 1 час после начала оседания. Для исследования динамики оседания эритроцитов нами было разработано соответствующее аппаратно-программное обеспечение.

Схема аппаратно-программного комплекса для регистрации динамики оседания эритроцитов (динамики оседания крови - ДОК) приведена на рис. 2 и 3.

Разработанное программное обеспечение позволяет последовательно определять положение границ плазма/клетки крови одновременно в 9 образцах, записывать через равные промежутки времени информацию о процессе оседания крови в капилляре, визуализировать данные и сохранять данные в базе данных. Так как граница между оседающими красными клетками и плазмой не является строго определенной и характеризуется определенной степенью размытости (рис. 2), то математически эта позиция при расчете положения границы (« ) была определена как величина среднего взвешенного распределения сигнала по фронту, отделяющему непрозрачный столб красной крови и чистой плазмы. Определены чувствительность прибора и погрешность метода при измерении положения границы (±0,02 мм) и моментальных скоростей ее движения (±0,8 мм/час).

Анализ экспериментальных данных по детальной ДОК позволил выявить более глубокие закономерности протекания этого процесса, на основе которого в дальнейшем были сформулированы критерии создания биосенсорного подхода для фармацевтического скрининга, с использованием скорости оседания как функции отклика.

Рисунок 2 - Аппаратно-программный комплекс для регистрации СОЭ. 1-осветитель, 2 - держатель, 3 - капилляр с кровью, 4 - маска/щель, 5 - объектив, 6 -ГОС - матрица, 7 - кожух, 8 - ПК с программным обеспечением

Рисунок 3 - Схематическое изображение границы красные клетки/плазма и принцип

определения ее взвешенного среднего, " . 11, -высота в точке «¡» фронта, Д1Л - разность в интенсивности света между точками «¡» и «¡-1»

Полученные экспериментальные данные существенно повысили информативность стандартного теста СОЭ, что наряду с задачами настоящего исследования позволило предложить данный метод для использования в практической медицине. Спектральный анализ колебаний, выполненный для основных этапов ДОК здоровых доноров, показал хорошо выраженные немногочисленные основные частоты, В случае анализа ДОК патологической крови спектр частот изменяется и зависит от нозологии. Наличие характерных частот, полученных спектральным анализом колебаний моментальных значений скорости движения границы плазма/клетки, указывает на поведение крови как целостной кооперативной системы.

Для систематизации факторов, влияющих на поведение неспецифического биосенсора, все исследованные факторы были разделены на физические, физико-химические (биологические) и временные.

Влияние сильного магнитного поля на реакцию оседания эритроцитов изучали, помещая образец крови донора с антикоагулянтом, с установленным диагнозом ИБС, в резонатор ЭПР спектрометра Varían ЕЗ на 2 часа ¡ (напряженность магнитного поля ~ 2000Гс). Установлено, что воздействие | сильным магнитным полем замедляет оседание. Воздействие рентгеновским ' излучением на образец крови в дозе достаточной для стерилизации объекта ( (рентгеновская трубкой 5BXB6-W, 50 кВт, 80мА, 10 минут, доза ~ 0.5-1 кГр) J обнаруживает полное устранение неспецифических воздействий. Образец крови ¡ оседает как классическая коллоидная система. Изучение влияние слабого [ магнитного поля на ДОК в дни с повышенным геомагнитным фоном позволило | экспериментально показать, что изменение геомагнитной обстановки оказывает I влияние на реологические показатели оседания крови. f

В результате исследования влияния температуры проведения реакции на j показатель СОЭ установлено, что если кровь подвергнуть тепловому шоку I (нагрев крови до 44°С на 1-2 мин), то клетки оседают как классическая j коллоидная система практически с постоянной скоростью.

Эксперименты по изучению воспроизводимости результатов ДОК показали, ¡ что если кровь берется в одно и то же время суток и анализ проводится строго в i одинаковых условиях, то при одновременной постановке нескольких капилляров ¡ с кровью кривые ДОК практически совпадают. Несоблюдение этих условий l приводит к методологическим ошибкам, так как наблюдается зависимость СОЭ от | объема клеточной массы: при уменьшении столбика крови СОЭ увеличивается. | Сравнение ДОК одного и того же донора в экспериментах с более длительными | промежутками времени (несколько месяцев) показывает сохранение стабильности показателей оседания крови при сохранении стабильности физиологического | состояния. I

Эксперименты по изучению изменения показателя СОЭ в зависимости от J времени начала постановки реакции показали, что картина ДОК крови донора через несколько часов хранения напоминает картину оседания патологической J крови (рис. 4). " I

Влияние добавления БАВ на СОЭ изучали, изменяя концентрацию внутренних метаболитов в образце крови (рис. 5).

Установлено, что все добавляемые БАВ имели пороговые концентрации, I при которых БАВ оказывали такое же действие на оседание эритроцитов, как J" чистый физраствор. Для перекиси эта величина составляла около 0,01%, для | глюкозы - 0,001%, для метилглиоксаля - 10"6%. Кроме того, эффект воздействия добавленных БАВ на параметры оседания крови проявлялся лишь через Г некоторое время после инкубации крови до забора ее в пипетки (приблизительно j 1 час), что характерно для ферментативных процессов. 1

Полученные данные показывают, что оседание эритроцитов является! многостадийным процессом, зависящим не только от физико-химических свойств| системы, но и от протекания биохимических реакций при сохранении)

метаболической активности форменных элементов крови. Воздействие любым из способов, вызывающих гибель клеток, убирает все неспецифические взаимодействия в системе и превращает процесс оседания крови в процесс оседания коллоидной системы. В случае использования процесса оседания крови в качестве биосенсора особое внимание при изучении воздействия неизвестного вещества на процесс оседания следует уделить вводимой концентрации вещества и предварительной пробоподготовке.

Рисунок 4 - Седиментограммы одного образца крови в зависимости от времени, прошедшего с момента получения образца. Сверху вниз выдержка (ч): 1; 2; 4; 6; 8; 10; 12. СОЭ за час сразу после забора - 12 мм (норма)

Рисунок 5 - Седиментация крови с добавками 1 - перекиси водорода (0.1%), 2 - О-глюкозы (0,1%), 3 - метилглиоксаля (0,001%), 4 -аликвотой физраствора, 5 - кровь без добавок в разное время. Высота столбиков соответствует величине столбика плазмы-

Разработка теоретико-методических подходов к оценке лекарственных субстанций и препаратов с использованием неспецифического биосенсора

Для формирования методических основ использования неспецифического биосенсора на начальных стадиях создания ЛС было необходимо разработать математическую модель процесса седиментации эритроцитов, обосновать статистически достоверные критерии воздействия фармацевтических препаратов на неспецифический биосенсор и на основе полученных данных разработать комплекс методик оценки фармацевтических субстанций и препаратов.

С целью объяснения возможности использования показателя ДОК в качестве биосенсора нами разработана базовая расчетная модель активной коллоидной системы, в которой свойства оседающих частиц меняются в процессе оседания. В качестве приближения нами взят процесс седиментации форменных элементов крови, при котором учитывались межклеточные взаимодействия, сопровождающие оседание. Все используемые в модели параметры основаны на

имеющихся на настоящий момент данных по биохимическим процессам, протекающим в цельной крови in vivo.

На рис.6 показаны расчетные седиментационные кривые при изменении относительного содержания лейкоцитов (белых клеток крови) при постоянном количестве эритроцитов. Полученные расчетные данные коррелируют с клинической практикой: при начале воспалительного процесса возрастает количество лейкоцитов в крови, что вызывает увеличение показателя СОЭ. При уменьшении количества белых клеток и неизменных параметрах расчета скорость седиментации системы уменьшается, что моделирует процесс воспаления, когда часть белых иммунокомпетентных клеток расходуются на фагоцитоз. На рис. 7 показаны расчетные кривые при изменении параметра взаимодействия лейкоцитов и эритроцитов в условиях неизменного состава форменных элементов крови. Данный вариант реализуется в случае целенаправленного воздействия на белые клетки крови или на скорость отдачи кислорода гемоглобином эритроцитов, что наблюдается как при возникновении аллергии, так и в случае изменения активности лейкоцитов при химическом воздействии на них исследуемым фармацевтическим препаратом.

Таким образом, предложенная базовая модель поведения крови как активной коллоидной системы, учитывающая процессы агрегации - дезагрегации эритроцитов и взаимодействия полученных структур с лейкоцитами, качественно описывает направления изменения показателя СОЭ, наблюдаемые в клинической практике, и демонстрирует возможность использования данного показателя в качестве биосенсорной характеристики при фармацевтическом скрининге.

Рисунок 6 - Эффект варьирования содержания белых клеток в крови. При увеличении доли белых клеток скорость оседания увеличивается

Время расчета, циклы

Рисунок 7 - Эффект варьирования вероятности деокснгеншацнн эритроцитов. Облегчение этого процесса приводит к ускорению оседания

Учитывая то, что параметры оседания крови при введении в кровь фармацевтического препарата вне организма коррелируют с изменением параметров оседания крови, полученной после введения того же препарата пациенту по медицинским показаниям [Буравлева, 2004], можно утверждать, что если будут разработаны статистически достоверные критерии оценки функционального воздействия фармацевтических препаратов на изучаемый

биосенсор, то реакция оседания эритроцитов будет пригодна для использования в качестве биосенсора in vitro, моделируя поведение изучаемого вещества in vivo. Тем самым открывается возможность использования данного подхода для создания методов индивидуального подбора фармацевтических препаратов и их дозировок или индивидуальной фармации.

Разработку статистически достоверных критериев воздействия фармацевтических препаратов на неспецифический биосенсор на основе процесса оседания эритроцитов проводили на массиве данных по воздействию 92 диагностических аллергенов на кровь 157 случайным образом отобранных доноров1. Контролем служил предварительно проведенный иммуноферментный анализ на явную (IgE) и скрытую (IgG) пищевую атлергию, проведенный на аналогичные антигены. Сравнительный анализ статистических параметров теста СОЭ, проведенный на данных по СОЭ для чистой крови и с добавлением фармацевтических препаратов - аллергенов (далее препараты), показал, что предлагаемый метод определения СОЭ чувствителен ко всем из 92 опробованных реактивов и данный параметр реакции может быть использован в качестве биосенсорной характеристики. Дисперсия среднего по выборке доноров значения СОЭ для «чистой крови» существенно превышает дисперсию персональных значений СОЭ по 92 препаратам, что указывает на необходимость пользоваться центрированными данными (разницей показаний между показателем биосенсора с фармпрепаратом и без него). Корреляция между воздействием различных препаратов на кровь доноров не обнаружена, что означает возможность применения разных образцов крови для выявления однотипных воздействий. Выявлено, что реактивы различаются между собой по степени зависимости вероятности отклика крови на их воздействие от среднего значения СОЭ «чистой» крови. Этот результат позволяет сформулировать критерии порогового воздействия на биосенсор, при котором воздействие однозначно фиксируется. Для безаппаратурного определения СОЭ разница между опытом и контролем больше 2 мм - сильная реакция (> 25), от 1 до 2 мм - средняя реакция, меньше 1 мм - нет реакции, причем максимально информативными являются измерения СОЭ через 60 минут.

Полученные закономерности и критерии позволяют сформулировать общую методологическую схему использования неспецифических биосенсоров для применения в экспериментальной фармации для практического применения в различных видах скрининга (табл. 1).

Предлагаемая схема полностью соответствует принятому в странах ЕС стандарту GLP (Good Laboratory Practice) и может быть использована на любом из этапов фармакологического скрининга от создания (изыскания) вещества до проведения доклинических испытаний in vivo.

Возможность практического применения разработанной методологии при изучении биоэквивалентности фармацевтических препаратов на основе одной субстанции оценивали на примере препаратов ацетилсалициловой кислоты (АСК). Препараты АСК в виде таблеток (7 образцов) и образец фармацевтической

1 На базе Института Экологической Реабилитации Человека (AHO), директор засл. врач РФ Розенталь B.M.

субстанции растворяли в физрастворе. Концентрация АСК при добавлении к биосенсору моделировала концентрацию фармпрепарата в кровеносном русле при его внутривенном введении из расчета на 5 л крови. Для каждого биосенсора вычислялось отклонение от контроля и в случае отличия более чем на 2 мм в ту или иную сторону фиксировалась сильная реакция (ряд 1), в случае отличия на 1 мм фиксировалась возможная реакция (ряд 2), в случае отличия на меньшую величину - отсутствие реакции (ряд 3) (рис. 8). Полученные усредненные данные по всем биосенсорам для каждого образца АСК представлены в виде столбчатой процентной диаграммы. Определенная спектрофотометрическим методом концентрация АСК в растворах всех исследуемых образцов находилась в пределах 8,6+0,7 мкг/мл. Следовательно, полученные различия в активности не связаны с концентрацией действующего начала.

Таблица 1 - Алгоритм использования неспецифических биосенсоров для фармацевтического скрининга

Этап Последовательность выполняемых действий

1 1—! Приготовление исходных фармацевтических препаратов (веществ) для исследования

1—I Приготовление исходной матрицы биосенсоров, обеспечивающих статистическую достоверность.

3 -G- |—[ Постановка реакции оседания эритроцитов на предварительно подготовленной матрице исследуемых веществ и контрольной матрице.

Получение первичных экспериментальных данных.

5 -U- Г-1 Переход от первичных данных к центрированным, усреднение полученных данных от разных биосенсоров для одного исследуемого соединения.

Получение функционального отклика воздействия конкретного препарата согласно установленным критериям.

7 ГП^ Сравнение полученных результатов с ожидаемыми.

Принятие решения в зависимости от цели исследования.

Одной из задач фармацевтической технологии является возможность внешнего (outdoor) контроля стабильности фармацевтического производства и выявления фальсифицированных JTC. Исследование возможности применения разработанной методологии неспецифического биосенсора для оценки биоэквивалентности разных партий одного фармацевтического препарата проведено на препарате ампициллин (Амкпициллин-Феррейн. ФСП 42-0053-61280). Используемая в исследованиях концентрация препарата моделировала его концентрацию в кровеносном русле при внутривенном введении из расчета на 5 л крови. Результаты обрабатывали, как описано ранее. Полученные усредненные данные (рис. 9) по всем биосенсорам для каждого образца представлены в виде столбчатой процентной диаграммы.

Из приведенных данных видно, что активность препарата из разных партий не является постоянной величиной. Этот эффект часто наблюдается при нестабильной работе штамма продуцента антибиотика.

Проведенные исследования и сформулированные критерии позволяют предложить методологическую схему для разработки оригинальных ЛС с использованием методологии неспецифических биосенсоров (рис. 10).

Рисунок 8 - Исследование бноэквнвалентности препаратов АСК разных производителей (1 - ОАО «Дальхимфарм», 2 - ЗАО «ПФК Обновление», 3 - ОАО «Фармстандарт-Лексредства», 4 - ОАО «Уралбиофарм», 5 -Аспирин®, (BAYER). 6 - субстанция, 7 - ЗАО «Меднсорб», 8 - ЗАО «Алтайвитамины»)

Рисунок 9 - Усредненные результаты по бносенсорно.чу отклику СОЭ на добавление фармацевтического препарата Ампициллин из разных партий

Ряд 3 - нет реакции, ряд 2 — нечеткая реакция, ряд 1 - сильная реакция

Применение разработанной методологии неспецифического биосеисора на примере конструирования новых противотуберкулезных препаратов

При лечении рецидивных больных туберкулезом одним из наиболее эффективных химически синтезируемых лекарственных препаратов первой линии является изониазид (гидразид изоникотиновой кислоты), обладающий в ряде случаев побочными нейро- и гепатотоксическими эффектами. В этой связи актуален синтез новых противотуберкулезных соединений на основе изониазида, не имеющих побочных эффектов.

Основным химическим подходом к снижению побочных эффектов изониазида является блокировка атомов водорода гидразинового фрагмента другими органическими группами или связывание гидразидной части в комплекс. В последние годы синтезирован новый отечественный фармацевтический препарат «Феназид» (ФСП 42-0038-2276-02, Фармасинтез ЗАО, «Феназид» (Изоникотиноилгидразин-0,1Ч) железа (2+) сульфат, дигидрат), представляющий собой хедатный комплекс двухвалентного железа и изониазида. В отличие от изониазида, основным путем его метаболизма является окисление, что и делает его менее токсичным. Мы предположили, что возможно создание новых фармацевтических препаратов на основе комплексообразования изониазида с биогенными металлами (рис. 11).

1 этап

2 этап

3 этап

4 этап

5 этап

6 этап

7 этап

8 этап

Анализ и обобщение литературных данных (включая патентные) по препаратам, применяемым для лечения конкретной нозологии, и биохимическим механизмам воздействия ЛС (molecular targeting).

Разработка технологии синтеза модифицированного соединения: а)выбор способа синтеза, б) получение препаратов, в) физико-химическое исследование

-L" 1-

Стандартизация растворов полученных препаратов и препарата сравнения по исследуемому показателю

Проведение скрининга с использованием биосенсоров и фармацевтических препаратов сравнения с известной токсичностью. Анализ полученных данных по разработанным динамическим критериям. Выбор препарата для дальнейшей модификации или проведения доклинических испытаний_

На испытания на лабораторных животных

Разработка технологии синтеза для наработки препарата. Изучение физико-химических свойств _препарата

Разработка лекарственной формы для проведения испытаний. Выбор вспомогательных веществ для создания лекарственной^юрмы._

Проведение 1 фазы доклинических испытаний выбранного препарата по сравнению с исходным соединением.

Анализ полученных данных и принятие решения на дальнейшие испытания или продолжение скрининга.

На модификацию

На дальнейший скрининг

На продолжение испытаний

Рисунок 10 - Методологическая схема разработки новых фармацевтических препаратов с использованием неспецифических бпосенсоров.

Воздействие солей металлов исследовались в диапазоне от 10"6 до 10"8 моль/л с шагом в 1 порядок. Стартовая концентрация металлов выбрана исходя из данных о среднем содержании металлов в сыворотке крови человека: медь 12-22 мкМ/л, железо в форме ферритина 15-200 мкМ/л - мужчины, 12-150 мкМ'л -женщины, марганец 72-250 нмоль/л, молибден 6-8 нмоль/л. Все эксперименты проводились таким образом, чтобы один образец крови охватывал все концентрации металлов одновременно (рис. 12).

Установлено, что с падением концентрации стимула (соль металла) биосенсорный ответ синхронно меняется непропорционатьно изменению концентрации. Сравнение полученных данных с известными показало, что токсичность Си и Мп действительно приблизительно одинакова, а токсичность железа — значительно меньше. Следовательно, биосенсорный ответ СОЭ на введение соли металла коррелирует с показателем токсичности соли металла.

Этап Алгоритм действии Описание цели этапа

1 - Приготовление растворов солей биогенных металлов (Ре, Си, Мп), с концентрациями металла в растворе ЮЛ 10 , 10"8 моль/л Приготовление исходных реактивов для исследования.

2 Подготовка 30 независимых образцов крови для биотестирования. Приготовление исходной матрицы биосенсоров, обеспечивающих статистическую достоверность для устранения индивидуальных особенностей биосенсоров.

3 Постановка реакции оседания эритроцитов на предварительно подготовленной матрице исследуемых веществ и контрольной матрице.

4 Получение первичных экспериментальных данных.

5 Переход от первичных данных к центрированным, усреднение данных, полученных от разных биосенсоров для одного исследуемого вещества.

1 Построение диаграмм биосенсорного отклика по разработанным критериям: сильная реакция > 2 мм 2 мм >средняя реакция > 1 мм Получение функционального отклика воздействия конкретного реактива согласно установленным критериям.

7 ' Сравнение полученных данных с известными данными по токсичности солей металлов в растворе Сравнение полученных результатов с ожидаемыми.

8 Принятие решения на синтез

Рисунок 11 - Обобщенный алгоритм использования неспецифических бносенсоров на примере скрининга токсичности солеи металлов предполагаемых для комплексообразования

Для исследования влияния физической формы металла на его взаимодействие с биосенсором проведено сравнительное изучение действия

наночастиц и раствора солей Си и Мп с одинаковой концентрацией металла, определенной методом атомно-эмиссионной спектрометрии (9,0±0.2 и 9,3±0.2 мкг/мл соответственно). Стабильные растворы ультрадисперсных частиц с размерами 33±6 нм Си и Мп, перенесенные в водный раствор, были испытаны в 2 концентрациях на 8 образцах биосенсоров. Различий между действием на биосенсор металлов в форме наночастиц и растворов солей в пределах ошибки эксперимента не наблюдается. Таким образом, применять методологию неспецифических биосенсоров для исследования агрегатного состояния металлов не представляется возможным.

Рисунок 12 - Биосенсорный ответ на добавление соли металла для ряда Ni, Cu, Мп, Fe для концентраций от 10 " до 10"8 моль/л Ряд 3 - нет реакции, ряд 2 - нечеткая реакция, ряд 1 - сильная реакция

Нами исследованы два различных технологических подхода, используемых в фармацевтической химии для решения задачи по разработке новых противотуберкулезных ЛС: 1) на примере модификации синтеза известного JIC «Феназид» получение вещества с новыми свойствами и 2) создание нового фармацевтического препарата со свойствами, аналогичными или превосходящими свойства изониазида, за счет использования вспомогательных веществ природного происхождения, имеющих в своем составе биогенные металлы.

Предположили, что если на этапе синтеза устранить возникновение полиядерных комплексов железа (мостиковых связей Fe-Fe и Fe-S04-Fe), наблюдаемых в промышленной субстанции «Феназид» (ФСП 42-0038-2276-02), то не изменяя химический состав, можно получить соединение с большей терапевтической активностью. Для решения этой задачи нами предложен синтетический подход к иммобилизации солей железа на носителе (слабом комплексообразователе), с последующим получением комплекса металла с изониазидом и его отмывкой от носителя. Внешний вид и выход получаемых в результате проведения реакции комплексов представлен в табл. 2.

Термогравиметрический анализ показал, что для всех полученных соединений при температуре 160±10°С происходит потеря массы, соответствующая отрыву молекулы воды, а при температуре 350±15ЭС - потеря

массы, соответствующая разложению комплекса на исходные соединения. Для оптимизации способа синтеза проведены исследования зависимости выхода продукта от концентрации различных вспомогательных веществ (ВВ). Показано, что оптимальная концентрация ВВ в растворе не должна превышать 5%.

Таблица 2 - Характеристика исталлоко.мплексов, полученных с помощью метода предварительной иммобилизации металла на вспомогательном веществе

Система Выход, % Внешний вид / стабильность

Ре ( Б-глюкоза 5% р-р 7 8±5% мелкокристаллический осадок красно-оранжевого цвета / стабилен на воздухе

Ре | О-фруктоза 1% р-р 79±6% мелкокристаллический осадок красно-оранжевого цвета / стабилен на воздухе

Ре | 0,5% ПВП 450 кДа 80±5% мелкокристаллический осадок красно-оранжевого цвета /стабилен на воздухе

Си (2+)| 0,5% ПВП 450 кДа 71 ±5% пластинчатые палочковидные зеленые кристаллы / меняют цвет на воздухе

Си (1+)| 0,5% ПВП 450 кДа 68±5% пластинчатые палочковидные кристаллы красно-оранжевого цвета / меняют цвет на воздухе

Мп(2+)| 0,5% ПВП 450 кДа 86±5% мелкокристаллический осадок красно-бурого цвета / стабилен на воздухе

Мессбауровский спектр комплексов железа с изониазидом, полученных первичной иммобилизацией солей железа на различных соединениях на первой стадии синтеза, представлен на рис. 13.

ИК-спектр полученного соединения в сравнении со спектром исходного изониазида (рис. 14) показывает, что комплексообразование металла с изониазидом наиболее всего проявляется в диапазоне 1000-1200 см"!, что соответствует полосе поглощения валентных частот сульфат иона. Полосы поглощения пиридинового кольца в области 1595-1495 см"1 не смещаются, что говорит об отсутствии координации изониазида через гетероатом азота кольца. Отчетливо видно смещение полосы приблизительно на 15 см"' поглощения и (С О) в области 1672 см"', что указывает на наличие координации молекулы изониазида по атому кислорода и атому азота гидразидной группы.

УФ-спектры синтезированного по новому способу феназида во всех концентрациях полностью соответствует показателям ФСП 42-0038-2276-02 «Феназид». Максимум поглощения фиксируется при 266±2 нм, а локальный минимум при 266±2 нм. Экспериментально полученная длина волны максимума поглощения равна 265,1 нм и близка к указанной в ФСП. В ЯМР 'Н-спектре полученного соединения,' по сравнению со спектром исходного изониазида наблюдается смещение сигналов ароматических протонов в более слабое поле, что указывает на образование нового соединения. Величина константы спин-спинового взаимодействия составляет 6,3 Гц, что на 1 Гц больше, чем у исходного лиганда. Изменение формы сигнала в области 4,5 ррм указывает на то, что координация атома железа прошла через концевую аминогруппу.

Элементный состав комплекса, определенный методом сжигания, показывает хорошее совпадение расчетного и экспериментального содержания элементов (табл. 3).

• ы"т~*\Г\Г' ------------- / <

—

N

*г

N 7 •Г-Г 4 ■' i •

-10 -5 0 5

Скорость ¡мм/с}

зго гго

ют тас зс

Рисунок 13 - Мессбауэровский спектр различных образцов комплекса железа с изониазидом

Рисунок 14 - ИК-спектр комплекса железа с изониазидом по сравнению со спектром чистого изониазида (таблетки смеси 0,0013 г вещества + 0,1012 г КВг)

Таблица 3 - Элементный анализ комплекса СбНцРеХзО-^'

Анализ С Н N Ке

Вычислено 22,15 3,88 12,92 17,23

Найдено 1 23,92 3.65 13,95 18,60

Найдено 2 23,09 3.85 12,50 17,98

«феназид» 23,04 4,13 ¡3,08 16,62

На основании имеющихся литературных и собственных экспериментальных данных предложена следующая структурная формула комплексного соединения железа с изониазидом, полученного предложенным способом синтеза:

Б04 *2Н20

Как указано в ФСП 42-0038-2276-02 «Феназид», промышленно производимый фармацевтический препарат практически нерастворим в воде.

Сравнительная характеристика ЛС, производимых по старому и новому способам синтеза, приведена в табл. 4.

Таблица 4 - Сравнительные характеристики препарата «Феназид», полученного старым и новым способом синтеза (по ФСП)

Показатель Метод Существующий препарат Новый препарат

Норма Норма

Описание Органолептиче-ский Желтовато-коричневый мелкокристаллический порошок без запаха Красно-оранжевый (коричневый) мелкокристаллический порошок без запаха

Растворимость ГФ XI Малорастворим в 0,1 М растворе хлористоводородной кислоты, допускается образование мутных растворов, практически нерастворим в воде и 95% сшгрте Растворим в воде. Растворим в 0,1М растворе хлористоводородной кислоты, допускается образование мутных растворов, слабо растворим в 95% спирте

Подлинность ИК-спектроско-пия, УФ-спек-троскопия, качественные реакции: на двухвалентное железо, на сульфаты Соответствует ФСП Соответствует ФСП

Количественное определение Спектрофотомет рический метод В пересчете на безводное вещество содержание феназида от 98 до 120%. Содержание изониазида не менее 46,5% и не более 48,5%, содержание железа (II) 18,9-19,7% В пересчете на безводное вещество содержание феназида от 98 до 120%. Содержание изониазида не менее 46,5% и не более 47,5%, содержание железа (И) 18,7-19,8%

Разработку нового фармацевтического препарата, названного нами «Пергазид», с терапевтическими свойствами, аналогичными или превосходящими свойства изониазида, проводили с использованием в качестве вспомогательного вещества цветочной пыльцы [ГОСТ 28887-90 Пыльца цветочная (обножка)]. Согласно ГОСТ, в составе пыльцы допускается 0,9-5,5% зольных элементов, которые содержат не менее 28 химических эссенциальных элементов: натрий, калий, никель, титан, ванадий, хром, фосфор, цинк, серебро, олово, галлий, стронций, барий, кремний, алюминий, магний, марганец, молибден, 'медь, кальций, железо и др.

Предположили, что при использовании в противотуберкулезном фармацевтическом препарате пыльцы обножки и изониазида можно получить терапевтическое воздействие, превышающее эффект от чистого изониазида. Проверку возможности получения комплексов металлов с изониазидом исходя из пыльцы-обножки провели, получив зольный остаток пыльцы сжиганием с

последующим растворением его в кислоте и комплексообразованием с изониазидом. В результате получен коричневый осадок, ИК-спектр которого (табл. 5) обнаружил широкую полосу, характерную для хелатного комплекса изониазид - металл.

Таблица 5 -Отнесение ИК-полосы поглощения валентных колебаний _ карбонильной группы в изонназиде_

Отнесение Изоникоти-ннлгидразин (INH) Fe(INH) Cu(INH) Mil (INH) £ металлов зольного остатка

V(CO),cm"' 1672 1650 1645 1640 1630-1660

Для удобства дальнейшей работы и получения сравнимых результатов при создании фармацевтического препарата использовали соотношение изониазид: пыльца 1:1 по массе. Острая токсичность ЛД50 фармацевтического препарата «Пергазид» в пересчете на содержащийся в композиции изониазид составила от 210 до 680 мг/кг (ЛД50 изониазида 188 мг/кг). Следовательно, разработанный фармацевтический препарат обладает лучшей переносимостью.

Препараты с противотуберкулезной активностью «Феназид-моно» и «Пергазид», содержащий природный компонент пыльцу - обножку, предложено выпускать в виде капсулированной лекарственной форме. Учитывая, что капсульные машины работают по принципу полного засыпания объема капсулы, было необходимо вводить вспомогательные вещества, которые улучшали бы технологические свойства капсулируемого лекарственного препарата.

Технологическая схема производства капсулированных лекарственных противотуберкулезных препаратов приведена-на рис. 15.

Изучение технологических характеристик препарата «Пергазид» со вспомогательными веществами (сахар-песок, лактоза, крахмал картофельный, аэросил, магния оксид, магния карбонат основной, кальция карбонат) по критериям влагопоглощения, сыпучести и угла естественного откоса, исходя из объемного соотношения ПТК/вещество = 3:1, моделирующего наполнение капсулы №4, показало, что наибольшее влияние на сыпучесть и влагопоглощение композиции оказывает высокодисперсный препарат диоксида кремния — аэросил: при добавлении 0,3-0,4% аэросила сыпучесть композиции повышается в 1,5 раза. В концентрации 2% аэросил способствует значительному снижению влагосорбционных свойств препарата, что позволяет получить композицию, стабильную при хранении даже в неблагоприятных условиях. С учетом необходимости полного заполнения капсулы проведены исследования по выбору наполнителя на основе определения скорости высвобождения свободного изониазида из капсул с различными наполнителями на приборе «врашающаяся корзинка» в воде очищенной и модельном желудочном соке. Установлено, что наилучшими характеристиками обладал магния карбонат основной.

BP 1.1. Санитарная обработка

производственных помещений

BP 1.2. Санитарная обработка оборудования BP 1. Санитарная подготовка производства

BP 1.3. Санитарная подготовка технологической одежды и Г Кт.

персонала

BP 1.4. Подготовка воздуха

h _1 _L_

BP 2.1. Прием и распределение сырья 1 BP 2. Подготовка сырья

BP 2.2. Просеивание сырья Кт.

BP3.I.

BP 5.2.

Смешивание сырья

Опудривание массы

BP4.I. Наполнение каспул.

BP 4.2. Отбраковка капсул

__£_

ПО 6 Некондиционные капсулы 1

для регенерации С

BP5.1. Фасовка в контурно-ячейковую упаковку

ВР5.2. Групповая упаковка, этикетирование

Отходы Сточные воды

Рисунок 15 - Технологическая схема производства препарата «Пергазид», капсулы (Кт- контроль технологический; Кх - контроль химический)

Разработанный нами в результате физико-химических, технологических и биофармацевтических исследований оптимальный состав капсульной формы противотуберкулезного фармацевтического препарата «Пергазид» приведен в табл. 6. При разработке технологии учитывали кристаллическое состояние порошков, потери при измельчении и количественное соотношение ингредиентов. Полученные на основе выработанного соотношения капсулы по внешнему виду отвечали требованиям ГФ XI, имели допустимые отклонения в ' массе содержимого отдельных капсул (до 5%) и время растворимости (до 20 мин.).

Таблица 6 - Состав препарата «Пергазид», капсулы

Наименование компонентов Содержание в одной капсуле, г

Пыльца-обножка 0,05

Изониазид 0,05

Магния карбонат основной 0,115

Аэроснл 0,015

Масса содержимого капсулы: 0,23

Сравнительное изучение бактериостатической активности разработанных фармацевтических препаратов проводили in vitro на культуре музейного штамма

микобактерий туберкулеза Нз7Ку. Феназид растворяли в диметилсульфоксиде. Все исследуемые концентрации готовили методом дробного разбавления жидкой питательной среды Мкддлбрук 7Н9. Оценку проводили по количеству микобактерий в полях зрения и интенсивности «косообразования» (табл. 7).

Таблица 7 - Сравнительная бактериостатическая активность феназнда и нзониазнда н разработанных препаратов феназид-моно и пергазнд на музейном штамме МДиЬегсиЬя^

Концентрация Бактериост атическая активность

С мкг / мл Изониазид Феназид Феназнд-м Пергазид

50,00 - - - -

25,00 ! ± -

12,50 - + + ±

6,25 - ++ ++ +

3.13 л. +++ +++ | ++

1,56 + +++ +++ | +++

Примечание: тест-штамм микобактерии, чувствительные к изониазиду. - - отсутствие роста, ± - единичный рост микобактерий, + - рост микобактерий от 1 до 10 колоний, ++ - рост микобактерий от 11 до 30 колоний, +++ - рост микобактерий от 31 до 100 колоний, образование «кос»

Установлено, что ЛС «Пергазид» в концентрации 20±4 мкг/мл обладает бактерицидным (40±5 мкг/мл у промышленного феназида), а в концентрации 2,5 и 5 мкг/мл - бактериостатическим действием в отношении чувствительных к изониазиду штаммов микобактерий туберкулеза. Это может быть объяснено тем, что входящие в состав пыльцы биогенные металлы в виде органических соединений обеспечивают их большую биодоступность, с другой стороны, в фармацевтический препарат входит свободный изониазид, что обеспечивает композиции промежуточное положение по активности между металлокомплексным соединением и чистым изониазидом. Аналогичные данные по активности препаратов получены на лабораторном штамме, устойчивом к действию изониазида. Активность промышленного и разработанного препарата на основе комплекса железа с изониазидом практически совпадает, а фармацевтический препарат «Пергазид» занимает промежуточное положение между чистым изониазидом и «Феназидом».

Применение методологии неспецифических биосенсоров на примере разработки новых противоопухолевых н антиметастатнческих препаратов на основе комплексов платины

В современной клинической практике при лечении опухолевых процессов широко используются фармацевтические препараты на основе комплексных соединений платины. Нами выдвинуто предположение, что наиболее перспективными для разработки новых противоопухолевых препаратов являются исследования в области синтеза новых и модификации известных фармацевтических препаратов, содержащих платину в различных степенях окисления и биотропный лиганд, содержащий в своей структуре пиридиновый

фрагмент. Это предположение основано на том, что производные изоникотиновой кислоты широко используются в любых метаболических процессах при клеточном делении, начиная от простейших.

Для проверки предположения нами синтезировано 12 комплексных соединений платины, содержащих пиридиновое кольцо с различными заместителями. Синтезированные металлокомплексы поступали на скрининг под номерами, без расшифровки химического состава. В качестве сравнения использовалась соединения с известной токсичностью К2Р1С16 (гексахлороплатинат калия) и цисплатин. Растворы комплексов перед скринингом нормировали по содержанию платины в растворе. В скрининговых опытах исследовали 5 концентраций, полученных дробным разбавлением исходной концентрации 7 мкг/мл платины в 2 раза. Исходя из данных, что степень выраженности реакции по отклонению от контроля коррелирует с общетоксическим воздействием на кровь, в результате проведенного скрининга отобраны 2 соединения четырехвалентной платины - бис(4-нитраминопиридин-М-) тетрахлороплатина и бис(диэтанолизоникотинамид-ЬГ| тетрахлороплатина - и комплекс цисплатина с изониазидом.

Синтез бис(4-нитраминопиридин-]М-) тетрахлороплатины (далее Б4НАП) исходя из 4-нитраминопиридина и дикалийгексахлорплатината, дает целевой продукт выходом 38±2%. Для повышения выхода нами разработана модифицированная схема синтеза исходя из платины и 4-аминопиридина, приводящая к получению целевого продукта с выходом 77±3%. Исходная и модифицированные схемы получения препарата представлены на рис. 16.

шо2

НЫОз

К2Р1С16

Рс

НКОз, НС1 Н3ИС16

| КНСОз 1

КгРгС16

мн.

N

| Ш03,Н2504

т

ХШОг

ч,

- 2 КС!

- Р1С!4 х 2

Р(С14 х 2

Рисунок 16 - Схема синтеза Б4НАП из 4-ам1шопнрпдш1а и гексахлороплатнната калия и (или) из плагины и 4-амнпопнрнднна

Строение комплекса доказано с помощью элементного анализа, ИК- и ЯМР-спектроскопии. В ИК-спектре полученного комплекса наблюдаются две компоненты связи РоС!, что указывает на то, что нами получен комплекс, имеющий цис-строение. На последнем этапе реакцией гексахлорплатината калия с 4-гатграминопиридином патучена цис-бис(4-нитраминопиридин-Кг) тетрахлороплатина

(IV) — желтое кристаллическое вещество, которое разлагается при температуре выше 180°С. Соединение хорошо растворяется в ДМСО, растворимость в системе ДМСО-вода 1:1 равна 1,25x10"2. Методом УФ-спектроскопии показано, что растворы комплекса в данной системе не изменяются в течение 25 дней. Комплекс очень плохо растворим в воде и в растворах ТВИН-80, что затрудняет работу с ним на биообъектах.

Синтез бис(диэтанолизоникотинамид-Н] тетрахлороплатины осуществляли трехстадийным способом (рис. 17).

СООН

COCI

SOCI2

HN(CH2CH2OH)2

CON(CH2CH2OH)2 K2PICI6

CON(CH2CH2OH)2

Р1СЦ х 2

N

-2KCI

Рисунок 17 -Синтез бис(дштанолнзош1котинамид-]Ч] тетрахлороплатины из нзоннкотиновой кислоты и гексахлороплатината калия

Целевой продукт представлял собой желтый кристаллический осадок с т. ил 178°С (разложение). Выход продукта по платине составил 56±3%. Комплекс идентифицирован с помощью ЯМР-спектроскопии и элементного анализа. Сигналы ЯМР-спектра комплекса отличались от спектра исходного лиганда 'Н(ДМСО-с),, 5, м.д. .7, Гц): 8,80 (д.дд, 2Н .7=6,7; ]РШ=28,6, Н (2), Н(6); 7,82 (д. 2Н 1=6,7, Н(3), Н(5); 3,56 (м, ЮН, - МСН,СН2ОН). Методом УФ- и ЯМР-спектроскопии исследована стабильность растворов синтезированных металлокомплексов. Показано, что растворы в диметилсульфоксиде и воде не претерпевают каких-либо химических превращений в течение 30 сут.

С целью экономии средств было решено осуществить дополнительный скрининг ранее отобранных соединений четырехвалентной платины, для уточнения их токсичности и выбора одного соединения для проведения доклинических испытаний на животных.

Скрининг проводили как описано ранее, используя для опытов предварительно отобранную донорскую кровь с показателем СОЭ за 1 час более 15 мм. Столбики на диаграмме (рис. 18) по реактивности представлены в порядке (слева направо): гексахлоро платинат калия, бис (4-нитраминопиридин-М-) тетрахлороплатина (далее Б4НАП), бис (диэтанолизоникотинамид-К) тетрахлорплатина.

30

0% .ь

: □ РядЗ ■ Ряд2 ■ О Ряд1

Рисунок 18 - Результаты дополнительных скринннговых исследований КтРЮб, бис(4-нитраминопиридин-!Ч-) тетрахлороплатнны и бис(диэтанолизоникотинамид-!У) тетрахлороплатины (ряд 3 - нет реакции, ряд 2 - нечеткая реакция, ряд 1 - сильная

реакция)

В результате нормирования на количество токсических реакций (реперное соединение - цисплатин) установлено, что Б4НАП по сравнению с бис(диэтанолизоникотинамид-Ы) тетрахлороплатиной обладает более слабой реактивностью - примерно на 14±6% и уступает цисплатину по выраженности реакции на 15%, что может говорить о меньшей токсичности синтезируемого соединения. Преимуществом Б4НАП являлся также выход конечного продукта, который составлял 77±3% против 56±3% у бис(диэтаполизоникотинамид-Ы) тетрахлороплатины.

Исследование противоопухолевой активности Б4НАП проводили на перевиваемых опухолях мышей; лимфоидной лейкемии 1Л210, аденокарциноме молочной железы Са755, меланоме В-16 (метастазирующая) и эпидермоидной карциноме легкого Льюис 1ХС (метастазирующая). Б4НАП вводили в виде раствора в 5% ДМСО (основные исследования). Препаратом сравнения служил Цисплатин-ЛЭНС (производства ЗАО Верофарм).

Установлено, что исследованная субстанция обладала меньшей токсичностью, чем препарат сравнения. При десятикратном внутрибрюшинном введении с интервалом 48 часов Б4НАП эффективен в дозах 6 и 8 мг/кг, Цисплатин-ЛЭНС в дозах 4 и 6 мг/кг оказывал токсическое действие (сокращал продолжительность жизни мышей с опухолями на 60-68 %).

На основе полученных данных рассчитали коэффициент корреляции между различными видами экспериментов. Для биосенсорного определения К~ (£ (число явных и средних реакций для цисплатина) / £ (число явных и средних реакций для Б4НАП )=М8/12~1,5. Для экспериментов на лабораторных животных - мышах линии ОВА/2 К~ (62,5 мг/кг) / (25 мг/кг) ~ 2,5. Следовательно, показатель, полученный в результате биосенсорного тестирования, правильно предсказывает коэффициент снижения токсичности исследуемого соединения.

В связи с тем, что проблема метастазирования опухолей является в онкологии одной из наиболее острых, было изучено подавление процессов

метастазирования. В контрольной группе животных метастазы в легких выявлены у 90% особей, в группах мышей, леченных Б4НАП в дозах 8,0 и 6,0 мг/кг - у 60% особей, среди леченных Б4НАП в дозе 4,0 мг/кг - у 90% особей. Количество метастазов на 1 мышь в группах, леченных Б4НАП в дозах 8,0 и 6,0 мг/кг, достоверно ниже, чем в контроле: соответственно, 3,00±0,37, 4,00±0,52 и 5,56±0,34. Индекс ингибирования метастазирования составлял 64% при введении Б4НАП в дозе 8,0 мг/кг и 52% при введении в дозе 6,0 мг/кг.

Таким образом, еще раз экспериментально подтверждено правило фармацевтической химии, что снижение общей токсичности любого платиносодержащего препарата ведет к снижению универсальности его действия. Противоопухолевый эффект на перевиваемой линии L1210 и на модели эпидермоидной карциномы легкого Льюис (LLC) не превышал противоопухолевй эффект препарата сравнения - Цисплатин-ЛЭНС. Однако экспериментальных данных о том, что снижая общую токсичность, можно получить антиметастатическую активность соединения, до сих пор не публиковалось.

Проверка возможности применения методологии неспецифических биосенсоров для разработки новых противоопухолевых препаратов проведена также на модификации известного фармацевтического препарата цисплатин внешнесферным лигандом изониазидом. В результате синтеза образуется водорастворимое соединение с выходом около 94±2% в виде стеклообразной плёнки светло-желтого цвета.

Строение и состав полученного комплексного соединения были доказаны методами УФ- и ЯМР- спектроскопии и элементного анализа. Спектр ЯМР 'Н синтезированного комплекса в смеси с изониазидом представлен на рис. 19.

В ЯМР 'Н-спектре полученного комплекса по сравнению со спектром исходного изониазида наблюдается смещение сигналов ароматических протонов в более слабое поле, что указывает на "образование нового соединения. Стабильность комплекса подтверждена сохранением ЯМР-спектра после выдерживания раствора комплекса на воздухе в течение года. Дополнительные исследования стабильности, проведенные путем нагревания раствора с комплексом до 80°С и пропускания раствора комплекса через колонку с силикагелем (Si02), элгоент - СНз0Н:Н20= 3:1, показали, что спектр соединения практически не изменяется, что указывает на возможность дополнительной очистки получаемого комплекса. Для элементного состава выявлено хорошее совпадение расчетного и экспериментального содержания элементов (табл. 8).

Совокупность полученных экспериментальных данных позволила предположить следующую структуру комплексного соединения, производного цисплатина (цис-диаминдихлорплатина) формулы: Pt(NH3)2Cl2*2L, где L = INH (изониазид, гидразид изоникотиновой кислоты) (рис. 20).

Дальнейшие исследования острой и специфической токсичности проводили в рамках 1 фазы доклинических исследований на базе ФГУН НИЦ ТБП ФМБА МЗ России, под предполагаемым торговым названием «Платизид». Так как субстанция неограниченно растворима в воде, разработана технологическая схема производства инъекционной формы препарата «Платизид» с концентрацией по

платине 20 мг/мл. Технологический процесс производства препарата «Платизид» приведен на рис. 21.

Рисунок 19 - Спектр ЯМР 'Н смеси изониазвд + комплекс (отнесения чистого нзониазида: 4,62 (с, 211, NII2), 7,73 (д, 2Н, 2СН, Ph), 8,70 (д, 2Н, 2СН, Ph), 10,08 (с, 1Н, NH)

Таблица 8 - Элементный анализ комплекса СцНгоСЬ^ОгРе

Анализ С н ! ei N Pt

Найдено 1(%): 25,48 3,96 16,13 12,80 32,29

Найдено 2(%): 25,18 3,70 14,00 14,86 33,01

Вычислено (%): 25,09 3,48 12,37 19,51 33,97

Токсикологическими экспериментами на мышах ВАЬВ/с-Мис1е определили, что для препарата платизид и препаратов сравнения оксалиплатин и карбо.платин при однократном внутривенном и последующем 5-кратном ежедневном внутрибрюшинном введении МТБ оксалиплатина находится на уровне 20,0 мг/кг, 1,05(, на уровне 30,0 мг/кг; МТБ карбоплатина - на уровне 80,0 мг/кг, ЬВзо на уровне 160,0 мг/кг; МТБ платизида - на уровне 48 мг/кг, ЬО30 на уровне 96,0 мг/кг. Коэффициенты кумуляции для платизида, оксалиплатина и карбоплатина в данном формате эксперимента составили 1,9; 1,5 и 1,6 соотвественно. С учетом погрешности оценок эксперимента эти величины можно считать близкими. Значения' всех трех коэффициентов говорят об отсутствии кумуляции токсического эффекта, для препарата платизид это наиболее выражено. По широте токсического действия платизид занимает промежуточное положение между оксалиплатином с минимальным показателем и карбоплатином - с максимальным. С учетом значений М'ГО/Шзо можно заключить, что по ряду основных параметров острой токсичности платизид занимает промежуточное положение между оксалиплатином и карбоплатином, что нехарактерно для действующего начата препарата платизид - цисплатина.

Полученные на экспериментальных животных данные практически совпадают с данными предварительного скрининга токсичности, проведенного

при помощи методологии неспецифического биосенсора на основе реакции оседания эритроцитов (табл. 9, рис. 22).

ВР 1.1. Подготовка помещений и оборудования г Подготовка производства

ВР 1.2. Приготовление дезинфицирующих растворов, санитарная обработка оборудования

ВР 1.3. Подготовка персонала и технологической одежды ВР 1. Кг.

ВР 1.4. Подготовка стерильной посуды, вспомогательных материалов

/ - _Л—

ВР2.1. Подготовка субстанции ВР 2. Подготовка сырья

ВР2.2. Подготовка воды для инъекций Кт.

V _._!=-

ТП3.1. Приготовление раствора препарата заданной концентрации

ТП 3.2. Стерилизующая фильтрация препарата

у-

ТП 4.1. Подготовка ампул

ТП 4.2. Наполнение и запайка ампул

ТП 4.3. Стерилизация ампул

ТП 4.4 Проверка ампул на герметичность

ТП 4.5. Маркировка выпущенной партии

г

ВР 8.1. Фасовка продукта

ВР 8.2. Упаковка, этикетирование

ТП.З. Приготовление раствора препарата

—1_и—

ТП. 4. От, К». Ампулирование

1_1

УМО Фасовка и упаковка ампул

_1

Готовая продукция

Выбросы в атмосферу

Сточные воды от промывки оборудования,

обработки помещений с

раствором моющего ср-ва

Потери раствора препарата на выделение платины

Вода от мойки

ампул в канализацию промстоков

Бой стекла на свалку

Выбросы в атмосферу (пары этил. спирта. С02)

Потери раствора препарата в канализацию промстоков

Лг

Бой ампул на свалку

На склад и карантинное хранение

Рисунок 21 - Технологическая блок-схема производства препарата «Платнзид»

Таблица 9 - Исходные и нормированные данные для препаратов платнзнд, оксалиплатин и карбоплатин по показателям МТБ, и суммарному бносенсорному воздействию (СБВ). Нормирование иа показатели оксалиплатнна

Показатель платизид оксалиплатин карбоплатин

MTD (мг/кг) 42 20 80

MTD норм. 2,1 1 4

LDso (мг/кг) 96 30 160

LD^o норм. 3,2 1 5,33

СБВ (кол-во) 31 47 18

СБВ норм. 1,72 1 j 2,61

ш.

у /•

* </ У

—*—мTD norm —■— LD50 norm СБВ norm

Рисунок 20 - Структурная формула разработанного фармацевтического препарата «Платнзнд»

Рисунок 22 - Нормированные на минимальный показатель коэффициенты MTD, LD5o и суммарного биосенсорного воздействия

Противоопухолевую активность платизида оценивали в экспериментах in vivo на опухоли НТ-29 (human colorectal adenocarcinoma), привитой подкожно иммунодефицитным мышам по критерию торможения роста опухоли, используя в качестве препарата сравнения оксалиплатин. Исследуемое вещество и препарат сравнения вводили в двух дозах: MTD и ХА MTD, кратность введения 1 раз в сут., курс введения 6 дней, суммарная курсовая доза 48,00 и 20,00, мг/кг, суточные дозы мг/кг 8,00 и 3,33 соответственно. Оба фармацевтических препарата -платизид и оксалиплатин - в целом показали невысокую эффективность. Однако по сравнению с эффективностью платины в исходном цисплатине эффективность платизида в несколько раз выше, использование более удобное.

Применение методологии неспецифических бносенсоров для разработки состава и технологии получения препарата на основе внутренних

метаболитов

Анализ литературных данных об изученных в настоящее время биохимических путях создания новых ЛС свидетельствует о том, что при разработке новых фармацевтических препаратов практически не используются кинетические аспекты управления биохимическими реакциями в организме, в частности, путем смещения кинетического равновесия за счет создания избытка промежуточного продукта на одном из этапов протекания реакции. В условиях in vitro этот подход хорошо известен, но его применение in vivo не описано.

Мы предположили, что изменяя концентрацию метаболитов, образующихся при протекании побочных реакций окисления глюкозы, можно сконструировать фармацевтический препарат, обеспечивающий нормализацию клеточного метаболизма (рис. 23).

Глюкоза -*• фруктозо-1,6-дифосфат (ФДФ)

^ (ТФИ)

ГАФ -► ДГАФ -► Метилглиоксаль .

ГАФ-ДГ

Фосфоенолпируват D-лактат

пк Шруват

i Цикл Кребса

Рисунок 23 - Биологическая трансформация глюкозы в организме

Условные обозначения: (ФДФ) - фруктозо-1,6-дифосфат, (ТФИ) - триозофосфат-изомераза, (ГАФ) - глицеральдегид-3-фосфат, (ДГАФ) - дигидроксиацетона-фосфат, (ГАФ-ДГ) -глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа, (ПК) - пируваткиназа, (ЛДГ) - лактатдегидрогеназа.

Согласно приведенной схеме биотрансформации, шестью основными продуктами побочных реакций являются альфа-дикарбониловые соединения, например, метилглиоксаль, который интенсивно синтезируется внутри клеток при любом вирусном заболевании и в опухолевых клетках (концентрация в норме 120±20 мкМ/г, при патологии 290±50 мкМ/г), причем при любых патологических процессах его концентрация возрастает непропорционально количеству других метаболитов воспаления. Такое биохимическое поведение характерно в основном для сигнальных молекул (гормонов). Таким образом, использование в

фармацевтическом препарате всех компонентов реакционной биохимической цепочки в подобранных концентрациях (глюкоза, метилглиоксаль и аминокислота - конечные продукты побочной реакции) приведет к реализации кинетического подхода к управлению реакцией окисления глюкозы, т.е. нормализует метаболизм.

Предложенная нами принципиальная алгоритмическая схема разработки ЛС с использованием методологии песпецифических биосенсоров в случае ее применения для разработки препаратов на основе внутренних метаболитов выглядит немного иначе (рис. 24).

1 этап Анализ и обобщение литературных данных (включая патентные) по биохимическим механизмам воздействия внутреннего метаболита в качестве будущего ЛС (molecular targeting).

J L-

2 этап Разработка технологии синтеза или выделения внутреннего метаболита (поиск источника сырья)

J L

3 этап Приготовление и исследование раствора, содержащего внутренний метаболит, в широком диапазоне концентпашш.

J L

4 этап Проведение скрининга с использованием разработанных критериев на статистически достоверном количестр£_айразцов крови.

1 1

5 этап Анализ полученныхданныхТго^разработанным динамическим критериям. Выбор максимально активных концентраций исрлеЛуемого метаболита

J U

6 этап Разработка технологии производства фармацевтического препарата. Разработка состава, формы выпуска и выбор вспомогательных веществ.

-

7 этап | Токсикологические испытания. I

¡ 1

8 этап Анализ полученных даниызпГпрннятне решения на дальнейшие испытанпя или продолжение скрининга.

Н>|

ÍT

Ú

На дальнейшие испытания и производство.

Рисунок 24 - Модифицированная алгоритмическая схема использования песпецифических биосенсоров при исследовании внутренних метаболитов

Принципиальным моментом схемы является определение наиболее активной концентрации Ь-лизина ' и метилглиоксаля с применением

неспецифического биосенсора (реакция оседания эритроцитов). Методика экспериментов и критерии оценки остались неизменными. Вещества исследовались в концентрациях от 10° до 1(У20 с шагом в 1 порядок. Все эксперименты проводились на 1 образце биосенсора со всеми исследуемыми концентрациями одновременно. Данные, полученные на 36 образцах крови, представлены на рис. 25.

Практический интерес представляет выявленная нами нелинейная зависимость воздействия определенных концентраций на процесс оседания клеток крови. Если предположить, что активность вещества, полученная при помощи биосенсора на основе СОЭ, будет соответствовать активности фармацевтического препарата в организме, то выбор действующей концентрации метилглиоксаля должен происходить в диапазоне 10 9-10"12 моль, а концентрации аминокислоты Ь-лизина - между 10"7 -10"10 моль. Состав предложенного препарата представлен в табл. 10. Действующее начало препарата -метилглиоксаль - используется в максимально эффективной концентрации, установленной на основе применения методологии неспецифических биосенсоров. Испытания разных концентраций Ъ-лизина не показали каких-либо принципиальных отличий в его применении. Поэтому действующая концентрация выбрана с учетом удобства приготовления.

Таблица 10 - Состав фармацевтического препарата «Эльвита-Удивит»

Компонент Концентрация нд

5% раствор В-декстрозы 1 л ФСП 42-2795-07

Метилглиоксаль 40% водный раствор. 1 мкд/л (10"12 моля/л) САБ №: 78-98-8

Ь-лизин 10% водный раствор 10 мкл/л (7* 10"ш моля/л) ВФС 42-592-92

1--ЛИЗИН

метилглиоксаль

50% 40% 30% 20% 10% 0% ■ 10е(-5)

О ЛдЗ вВад2 □ Ряд1

70% ] 60% ¡: 50% I 40% | 30% I

20% I 10% ;

Юе(-Ю) 10е(-15) 10е(-20)

10е(-5) Юе(-Ю) 10е(-15) 10е(-20)

концентрация (моль/литр)

Рисунок 25 - Концентрационные зависимости воздействия Ь-лизина и метилглиоксаля на процесс оседания эритроцитов (ряд 3 - нет реакции, ряд 2 - нечеткая реакция, ряд 1

- сильная реакция)

ВР 1.1. Санитарная обработка производственных помещений Санитарная подготовка производства к

ВР 1.2. Санитарная обработка оборудования ВР 1. Кт. Ч Отходы

ВР 1.3. Санитарная подготовка технологической одежды V

ВР 1.4. Подготовка воздуха

ВР 5.1.

ВР 5.2.

ВР 5.3

ВР 3.1. Мойка стеклянных пузырьков, резиновых крышек и 1 алюминиевых закаточных колпачков

ВР 3.2. Сушка и стерилизация пузырьков, крышек и колпачков

ВРЗ. Кг.

Получение воды очищенной

Подготовка тары

л_

ВР 4.1. Отмеривание жидкостей ВР 4. Подготовка сырья

ВР 4.2. Взвешивание порошков Кг.

Г

раствора метилглноксаля с концентрацией 10"1* моль/л

Приготовление маточного

раствора Ь-лизина с концентрацией 10'9 моль/л

Контроль биологической активности маточных растворов

Получение маточных растворов

ВР6.1. Приготовление 5% раствора глюкозы

ВР 6.2. Приготовление раствора метилглноксаля 10"12 моль/л на основе 5% раствора глюкозы

ВР6.3. Приготовление раствора Ышзина КГ" моль/л на основе раствора метилглноксаля 10'12 моль/л и 5% раствора глюкозы

ВР 6.4 Смешивание компонентов препарата

ВР 6.5. Стерилизующая фильтрация препарата

ВР6.6. Розлив препарата

ВР 6.7. Стерилизация препарата

ВР 7.1. Фасовка продукта

ВР 7.2. Упаковка, этикетирование

ТП.6. От, Кх.

Получение препарата

X

Фасовка и упаковка готовой продукции

Готовая продукция

Л V

Механические потери

Механические потери

Лг

Механические потери

На склад " карантинное хранение

Рисунок 26 - Технологическая блок-схема производства препарата «Эльвига - Удивит»

Отметим, что предложенная нами концентрация метилглноксаля (10"9-10"'2) в 103-107 раз меньше, чем концентрация нативного метилглноксаля в норме.

На основании разработанных методологических подходов к конструированию фармацевтических препаратов с использованием биосенсоров и технологических исследований составлена принципиальная блок-схема производства фармацевтических препаратов, которая позволяет рассматривать единые подходы к созданию технологии ЛС с действующим веществом в сверхмалых концентрациях.

Рассмотрим технологический процесс производства ■ разработанного препарата «Эльвита-У дивит» (рис. 26). Отличительной особенностью предлагаемой схемы технологического процесса является наличие стадии приготовления маточных растворов (Л'П.5) с концентрацией компонентов препарата, в 1000 раз большей, чем в конечном фармацевтическом препарате. Учитывая распространенность производства фармацевтического препарата 5% раствора D-декстрозы, производство препарата «Эльвита-Удивит» в случае необходимости может быть быстро организовано на любом фармацевтическом промышленном предприятии, путем добавления аликвот маточных растворов к исходному раствору на стадии розлива.

Сравнительное изучение токсичности разработанной фармацевтической композиции в виде инъекций проводили на белых беспородных мышах. Каждая доза препарата (50, 100, 200, 400 и 800 мг/кг в 5% водном растворе глюкозы) испытана на 12 животных (по 6 самцов и 6 самок). Животным контрольных групп вводили внутрибрюшинно соответствующий раствор глюкозы без добавок. В период наблюдения (14 дней) гибели не было, общее состояние животных опытных и контрольных групп не различалось.

Опытные партии препарата «Эльвита-Удивит», изготовленные ЗАО Фармаген, показали высокую эффективность его применения на продуктивных и непродуктивных животных при лечении ОРВИ, опухолевых процессов, бронхопневмоний и маститов. Все исследования подтверждены актами об испытаниях. В результате проведенных испытаний препарата обнаружены новые области его эффективного применения: при лечении хламидиоза, болезней конечностей крупного рогатого скота и вирусных заболеваний у пушных зверей; выработаны рекомендации по применению препарата в различных областях сельского хозяйства. В настоящее время препаратов для лечения суставных болезней в ветеринарной фармации практически не существует. По нашим данным острые воспаления при использовании препарата «Эльвита» хорошо поддаются лечению, наблюдается значительное улучшение состояния животных. При хронических воспалениях суставов наиболее целесообразно использовать препарат «Эльвита» для профилактики обострений, так как при осложненном течении болезни поражаются костные ткани, наступает дегенеративный процесс, который практически не поддается лечению.

Таким образом, в результате проведенных нами комплексных исследований поставленные задачи были решены, основная цель диссертационной работы -достигнута.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1.С применением логического и контент-анализа отечественной и зарубежной литературы констатировано недостаточное развитие проблемы использования неспецифических биосенсоров в российской фармации; обоснованы наиболее перспективные направления развития исследований в этой области и определены задачи, требующие первоочередного решения для оптимизации процесса создания инновационных ЛС.

2.На основе комплексного анализа проблемы разработаны методологические подходы и понятийный аппарат для использования показателя оседания клеток крови в качестве неспецифического биосенсора, для создания лекарственных препаратов, логическим стержнем которых является концепция комплексных исследований, начиная от стадии синтеза субстанции до соответствующих клинических исследований.

3.Разработаны алгоритм и оригинальная аппаратура, позволяющая автоматизировать процесс измерения динамики оседания клеток крови, визуализировать и сохранять информацию в базе данных.

4.На основании проведенных исследований динамики оседания клеток крови теоретически обоснована и экспериментально доказана кооперативность процессов, протекающих в оседающей клеточной массе, и получены характеристики процесса, позволяющие выявить степень воздействия вводимого исследуемого вещества; систематизированы факторы (физические, физико-химические, и временные), которые необходимо учитывать при проведении фармацевтического скрининга для получения воспроизводимых результатов, и определено их влияние на поведение неспецифического биосенсора.

5.Разработана математическая модель активного коллоида как неспецифического биосенсора,, позволяющая связать внутренние процессы межклеточного взаимодействия с макрохарактёриегикой - скоростью оседания эритроцитов. Предложенная модель позволяет численно моделировать биохимические процессы в оседающей массе и создать критерии использования процесса седиментации крови в качестве биосенсора.

6.Разработаны статистически достоверные кргггерии воздействия фармацевтических препаратов на исследуемый биосенсор, в том числе критерии наличия или отсутствия воздействия, а также критерий степени достоверности биосенсорного отклика.

7.На основа выявленных закономерностей ДОК, результатов математического моделирования процесса седиментации эритроцитов и комплекса критериев оценки воздействия БАВ на неспецифический биосенсор разработан алгоритм использования биосенсора для экспресс-скрининга БАВ. Настоящий алгоритм включает 8 этапов, полностью соответствует стандарту Надлежащей лабораторной практики (GLP) и может быть использован на любой из стадий доклинических исследований до проведения испытаний in vivo.

8.Экспериментально доказана принципиальная возможность разработки при помощи методологии неспецифических биосенсоров метода контроля стабильности технологии производства фармацевтических препаратов на одном и том же предприятии и метода сравнения биоэквивалентности фармацевтических

препаратов, выпускаемых разными производителями на основе одной фармацевтической субстанции.

9.Разработана методология использования неспецифического биосенсора при изыскании, разработке и исследовании новых ЛС. Соответствующая методологическая схема включает 8 этапов. Использование биосенсорной технологии предусмотрено на этапе 4 методологической схемы - выбора препарата предлагаемого для дальнейшей модификации или продолжения доклинических испытаний.

10. Практическая применимость разработанной методологии доказана на примере разработки новых инновационных фармацевтических препаратов и композиций для противотуберкулезных, противоопухолевых и метаболитных ЛС на различных этапах их создания. Все разработанные и внедренные в производство препараты защищены патентами на изобретение РФ.

11. Разработан новый способ синтеза противотуберкулезного фармацевтического препарата «Феназид» с пониженным содержанием мостиковых связей металла, что обеспечивает лучшую биодоступность.

12. Разработан состав и оптимизирована технология получения твердых желатиновых капсул противотуберкулезного препарата на основе изониазида и природной биологически активной субстанции пыльцы-обножки, обеспечивающей лучшую переносимость и противотуберкулезную активность изониазида.

13. Проведен скрининг синтезированных металлокомплексов на основе соединений платины, предсказана пониженная токсичность нескольких соединений; разработана технология синтеза и предложен для практического использования новый водорастворимый внешнесферный комплекс цисплатина с изониазидом для лечения опухолевых заболеваний.

14. Разработан оптимальный состав и технология инъекционного ветеринарного препарата «Эльвита-Удивит».

Публикации по теме диссертации

1. Кондаков, С.Э. Ультрадисперсные металлы в неводных растворителях - новый класс катализаторов-инициаторов присоединения полигалогеналканов по кратным связям /С.Э. Кондаков, В.В. Смирнов, Л.А. Тюрина //Докл. АН СССР. - 1992. - Т. 325, № 3. - С.536-539.

2. Kondaicov, S.E. Cryochemical synthesis of the giant magnesium clusters in amine media. /S.E. Kondakov, V.V. Smirnov //Bull. Soc. Chem. Belg. - 1994. - Vol. 103. - P.101-103.

3. Кондаков. С.Э. Химические и каталитические свойства ультрадисперсных частиц металлов (УДЧ), полученных путем совместной конденсации металлов с аминами. Взаимодействие с алканами. /С.Э. Кондаков, В.В. Смирнов //Вестн. Моск. ун-та. Сер.2. Химия. - 1995. - Т. 36, № 4. - С.328-331,

4. Воейков, В.Л. Нелинейные эффекты изменения скорости в реакции оседания эритроцитов как следствие метаболизма клеток крови /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев. С.Э. Кондаков, A.B. Пирогов //Тез. докл. IX междунар. школы по хим. кинетике. - Клязьма, 1997.-С.40.

5. Воейков, В.Л. Динамика оседания эритроцитов - новый метод анализа крови как целостной системы /В.Л. Воейков. Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев. С.Э. Кондаков и др.

//Космическая экология и ноосфера: Тез. докл. Крымского междунар. семинара (6-11 октября 1997 г., Партенит, Крым, Украина). - 1997. - С.102.

6. Воейков, В.Л. Динамика оседания эритроцитов - новый метод анализа крови как целостной системы /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков и др. //Фундаментальные науки и альтернативная медицина: Тез. докл. 1-го Междунар. симп. -(22-25 сентября 1997 г., Пущино). - Пущино, 1997. - С. 32.

7. Воейков, В.Л. Макрокинетическне зависимости изменений скорости в реакции оседания эритроцитов /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, A.B. Пирогов //Современная физическая химия: Тез. докл. IX Школы-симп. - (18-30 сентября 1997 г., Туапсе). - Туапсе, 1997. - С.42.

8. Воейков, В.Л. Нелинейные эффекты изменения скорости в реакции оседания эритроцитов /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, A.B. Пирогов //Современная физическая химия: Тез. докл. IX Школы-симп. - (18-30 сентября 1997 г., Туапсе). - Туапсе, 1997. - С.41.

9. Воейков, В.Л. Возможности использования динамики оседания форменных элементов крови в клинической практике /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, A.B. Пирогов //Современная физическая химия: Тез. докл. IX Школы-симп. - (18-30 сентября 1997 г., Туапсе). - Туапсе, 1997. - С.45.

10. Воейков, В.Л. Оседание эритроцитов в неразведенной крови - немонотонный динамический процесс /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э. Кондаков, A.B. Пирогов //Леонардо Да Винчи XX века: Тез. юбил. конф. РАЕН к 100 летию А.Л.Чижевского. - М., 1997. -С.55-56.

И.Воейков, В.Л. Компьютеризированный прибор для анализа динамики оседания красной крови и обоснование нового метода диагностики /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, С.Ю. Озерский //Междунар. конф. по биомедицинскому приборостроешио - Биомедприбор-98: Тез. докл. - (6-8 октября 1998, Москва). - М., ЗАО «ВНИИМП-ВИТА», 1998. - С. 107-109.

12. Воейков, В.Л. Немонотонные изменения скорости оседания эритроцитов в цельной крови. /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Копдаков //Докл. РАН. - 1998. - Т. 359, № 5. - С.1-5.

13. Kondakov, S.E. Dynamics of erythrocyte sedimentation rate as a new diagnostic tool. /S.E. Kondakov,V.L.Voeikov, Yu.I.Gurfinkel, A.Yu.Dmitriev //In: «Optical Diagnostics of Biological Fluids III»: S PIE Proc. - Vol. 3252. - San Jose (CA), 1998. - P.54-61.

14. Кондаков, С.Э. Биокинетические исследования цельной крови. Научные аспекты и клиническое применение. /С.Э.Кондаков, В.Л. Воейков, В.М. Розентадь //Ломоносовские чтения. Секция «Химия»: Тез. докл. науч. конф. - (26-28 апреля 1999 г., Москва). - М.: МГУ, 1999.-С.21

15. Voeikov, V.L. The new method of blood analysis - ESR-graphy - reveals nonlinear dynamics in the behavior of whole blood outside the organism / V.L. Voeikov, S.E.Kondakov, E.V.Buravleva //Science, Information, and Spirit: Proc. of the Intern. Scient. Congr. - (29 May-J June 1999, Saint Petersburg). - SPb.. 1999ю - P.38-39.

16. Voeikov, V.L. High-temporal resolution of red blood cells sedimentation dynamics reveals nonlinear and cooperative properties in whole blood /V.L. Voeikov, S.E.Kondakov et al. //Proc. of the 2-nd Intern. Alexander Gurwitsch Conf. - (6-10 Sep 1999, Moscow). - M.( 1999. - P.53-54.

17. Воейков. В.Л. Сканирующее устройство для регистрации динамики оседания красной крови и обоснование нового метода диагностики /В.Л. Воейков, С.Э.Кондаков, Ю.И. Гурфинкель //Оптические методы исследования потоков (ОМИП-99): Тез. докл. 5-й Междунар. науч.-технич. конф. - (23-25 июня 1999 г., Москва). - M., 1999. - С.54

18. Воейков, В.Л. Применение метода измерения динамики оседания крови в клинической практике /В.Л. Воейков. Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков //II Съезд биофизиков России: Тез. докл. - (23-27 августа 1999 г., Москва). - М., 1999. - Т. 2. - С.655-656.

19. Гурфинкель, Ю.И. Влияние магнитных бурь на динамику оседания крови больных ишемической болезнью сердца /Ю.И. Гурфинкель, В.Л. Воейков, С.Э.Кондаков и др. //Космическая экология и ноосфера: Тез. докл. Крымского Междунар. семинара. - (4-9 октября 1999 г., Партенит, Крым. - 1999. - С.6-7.

20. Кондаков, С.Э. РОЭ-графия: диагностика крови как биологической ткани /С.Э.Кондаков, Ю.С. Буларгина, Е.В. Буравлева, Ю.И. Гурфинкель и др. //Системный подход к вопросам анализа и управления биологическими объектами: Тез. докл. науч.-практ. конф. - (19-21 апреля 2000г.) - М.-С.-П., 2000. - С.46-48.

21. Розенталь, В.М. Питание как ведущий компонент экологической реабилитации: индивидуальная диета /В.М. Розенталь, В.И. Баранчиков, В.Л. Воейков, А.В. Волков, Ю.И. Кийко, С.Э.Кондаков, К.Н. Новиков //Системный подход к вопросам анализа и управления биологическими объектами: Тез. докл. науч.-практ. конф. - (19-21 апреля 2000г.) - М.-С.-П., 2000. - С.49-50.

22. Воейков, В.Л. Фундаментальные и прикладные аспекты поведения цельной крови человека вне организма / В.Л. Воейков, Ю.С. Буларгина, Е.В. Буравлева, Н.Д. Виленская. С.Э. Кондаков и др. //Слабые и сверхслабые излучения в биологии и медицине: Тез. II Междунар. конгр. - (3-7 июля 2000 г., Санкт-Петербург). - СПб., 2000. - С.32-33.

23. Гурфинкель, Ю.И. Изменение динамических параметров седиментации красной крови больных ишемической болезнью сердца в дни с высокой геомагнитной активностью /Ю.И. Гурфинкель, В.Л. Воейков, Е.В. Буравлева, С.Э.Кондаков и др. // Слабые и сверхслабые излучения в биологии и медицине: Тез. II Междунар. конгр. - (3-7 июля 2000 г., Санкт-Петербург). - СПб., 2000. - С.115-116.

24. Гурфинкель, Ю.И. Влияние геомагнитной активности на динамику седиментации красной крови больных ишемической болезнью сердца /Ю.И. Гурфинкель, В.Л. Воейков, Е.В. Буравлева, С.Э.Кондаков //Биомед. радиоэлектроника. - 2000. - № 4. - C.3-I2.

25. Voeikov, V.L. High-temporal resolution of red blood cells sedimentation dynamics reveals nonlinear and cooperative properties of whole blood /V.L. Voeikov, S.E.Kondakov, Yu.I. Gurfinkel et al. //Rivistadi Biologia/Biological Forum. -2000. - Vol. 93, № 1. - P.149-151.

26. Voeikov, V.L. Computerized video-enhanced high temporal resolution of erythrocytes sedimentation rate (ESR-graphy) reveals complex dynamic and self-organizing properties of whole blood / V.L. Voeikov, S.E.Kondakov, E.V. Buravleva et al. //Optical Diagnostics of Biological Fluids V: Proc. SPIE. - 2000. - Vol.3923(May). - P.32-43.

27. Voeikov, V.L. Non-equilibrium and coherent properties of whole blood revealed by analysis of its sedimentation behavior / V.L. Voeikov, Yu.S. Bulargina, E.V. Buravleva, S.E.Kondakov //Proc. of the 2nd Intern. Alexander Gurwitsch Conf. and Additional Contributions. - Moscow: Moscow University Press, 2000. - P.75-92.

28. Voeikov, V.L. Life of blood outside an organism: Fundamental properties and clinical applications /V.L. Voeikov, R. Asfaramov, Yu.S. Bulargina, E.V. Buravleva, S.E.Kondakov et al. //Information Society IS'2000 New Science of Consciousness: Proc. of the 3rd Intern. Multi-Conf. (Ljubljana, Slovenia). - Ljubljana, 2000. - P.21-24.

29. Розенталь, В.М. Роль подбора индивидуального питания в экологической реабилитации человека /В.М. Розенталь, В.Л. Воейков, А.В. Волков, С.Э.Кондаков, К.Н. Новиков //Экополис 2000: Экология и устойчивое развитие города: Мат-лы Ш-й Междунар. конф. -(24-25 ноября 2000 г., Москва). - М.: Изд-во РАМН, 2000. - С.243-247.

30. Gurfinkel, Yu.I. Effect of geomagnetic storms upon blood sedimentation dynamics in ischemic heart disease patients /Yu.I. Gurfinkel, V.L. Voeikov, S.E.Kondakov et al. //Proc. SPIE. - 2000. -Vol.4163. - P. 1-8.

31. Gurfinkel, Yu.I. Effect of geomagnetic storms on the erythrocyte sedimentation rate in ischemic patients/Y.I. Gurfinkel, V.L. Voeikov, E.V. Buravlyova, S.E.Kondakov //Crit. Rev. Biomed. Eng. - 2001. - Vol. 29, № 1. - P.65-76.

32. Кондаков, С.Э. Биосенсорные свойства крови /С.Э.Кондаков, В.М.Розенталь //Современная химическая физика: Тез. докл. XIII симпозиума. - Туапсе, 2001. - С. 135-136.

33. Кондаков, С.Э. Биосенсорные свойства крови. Использование кинетических параметров оседания форменных элементов крови для диагностики /С.Э.Кондакои //Современная химическая физика: Тез. докл. XIV симпозиума. - Туапсе, 2002. - С. 167.

34. Токарев, A.A. Компьютерное моделирование процесса оседания форменных элементов крови /А.А.Токарев,С.Э.Кондаков //Современная химическая физика: Тез. докл. XIV симпозиума. - Туапсе, 2002. - С.]56.

35. Розенталь, В.М. Индивидуальное питание и качество жизни здорового и больного человека /В.М.Розенталь, А.В.Волков, М.И.Орехов, С.Э.Копдаков и др. //Пути к здоровью нации 3-го тысячелетия: Тез. докл. 2 Всерос. форума. - (22-24.10.2002, Москва). -М., 2002. - С. 122.

36. Адинсков, Д.П. Особенности применения визуализации при расшифровке поточных клинических анализов /Д.П. Адинсков. С.Э.Копдаков, К.И. Чепырев //Графикон-2003: Тез. докл. Междунар. конф. - М: МГУ, 2003. - С.39(М).

37. Волков, A.B. Применение визуализации для оценки клинической эффективности индивидуальной програмы питания «Экомедтест» /A.B. Волков, С.Э. Кондаков, В.Л. Воейков //Графикон-2003: Тез. докл. Междунар. конф. - М.: МГУ, 2003. - С.40(М).

38. Кондаков, С.Э. Визуализации научного эксперимента при скрининговых исследованиях фармпрепаратов /С.Э. Кондаков //Графикоп-2003: Тез. докл. Междунар. конф. - М.: МГУ, 2003. - С.41(М).

39. Кондаков, С.Э. Исследование активности фармацевтических препаратов методом динамики оседания крови /С.Э. Коидаков //Тез. докл. XXII Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. - (Пансионат «Березки» МО, 2004). - М., 2004. - С.42.

40. Кондаков, С.Э. Использование динамического метода измерения оседания форменных элементов крови для направленного синтеза новых фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков, М.Я. Мельников //Тез. докл. XXII Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. - (Пансионат «Березки» МО, 2004). - М., 2004. - С.43.

41. Адинсков, Д.П. Динамика оседания эритроцитов как интегральный показатель состояния здоровья /Д.П. Адинсков, А.В.Волков, С.Э. Кондаков, Т.Ю. Телешева //Наука, Информация, Сознание: Мат-лы 8-го междунар. конгр. - (3-5.06.2004 г., Санкт-Петербург). - СПб.: СПбИТМО, 2004. - С. 168-171.

42. Кондаков, С.Э. Изучение общей и избирательной токсичности фармацевтических препаратов методом динамики оседания крови /С.Э. Кондаков //Тез. докл. XXIV Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. - (Пансионат «Березки» МО, 2006).-М., 2006.-С.41.

43. Кондаков, С.Э. Металлокомплексные противотуберкулёзные препараты: кинетика функционирования /С.Э.Кондаков, М.Е.Тамм //Тез. докл. XXIV Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. - (Пансионат «Березки» МО, 2006). - М., 2006. -С.43

44. Кондаков, С.Э. Использование кинетических параметров для конструирования новых фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2006: Тез. докл. Всерос. конф,-школы.-М.. 2006. -С.34.

45. Кондаков. С.Э. Применение неспецифических биосенсоров для быстрого скрининга общей и избирательной токсичности /С.Э. Кондаков, М.Я. Мельников //Современная химическая физика: Тез. докл. XIX Симпозиума. - Туапсе, 2007. - С. 135-136.

46. Кондаков, С.Э. Метод определения индивидуальной чувствительности к кормовым продуктам у мелких домашних и сельскохозяйственных животных /СЗ. Кондаков и др. //Методические указания Министерства сельского хозяйства РФ. - СПб., 2007. - 15 сл

47. Кондаков. С.Э. Применение неспецифических биосенсоров для быстрого скрининга общей и избирательной токсичности при синтезе металлокомплексов /С.Э. Кондаков, М.Я. Мельников //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2008: Тез. докл. 2 Всерос. конф.-школы. - Астрахань-Москва, 2007. -С.34.

48. Ершова, M.JI. Применение метода ИФА-ELISA для оценки иммуногенности многокомпонентных смесей на примере исследования кормов в ветеринарии /М.Л.Ершова, О.С.Прокопцева. И.В.Кондакова, С.Э.Кондаков //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2008: Тез. докл. 3 Всерос. конф.-шхолы. - Астрахань-Москва, 2008. - С.19.

49. Кондаков, С.Э. Методологические принципы использования кинетических подходов для конструирования новых фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2008: Тез. докл. 3 Всерос. конф.-школы. - Астрахань-Москва, 2008. - С.34.

50. Кондаков, С.Э. Седиментация форменных элементов крови. Модель активной коллоидной системы /С.Э. Кондаков. A.A. Токарев, M.5L Мельников //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. -2008. - Т. 48, № 4. - С.238-240.

51. Кондаков, С.Э. Применение неспецифических биосенсоров для контроля активности фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков, М.Я. Мельников, П.Н. Козаченко, К.В. Алексеев //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. - 2009. - Т. 50, № 4. - С. 153-156.

52. Ершова, M.J1. Применение неспецифических биосенсоров для создания фармацевтических композиций на основе внутренних метаболитов /М.Л.Ершова, С.Э.Кондаков, И.В.Кондакова и др. //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. - 2009. - (В печати).

Изобретения

1. Способ контроля физиологического состояния человека: пат. 2103672 РФ от 1998.01.27 /Воейков В.Л., Гурфинкель Ю.И., Дмитриев А.Ю., Кондаков С.Э.

2. Устройство для автоматической регистрации осаждения крови: пат. 2128945 РФ от 1999.04.20 /Воейков В.Л., Гурфинкель Ю.И., Дмитриев А.Ю., Кондаков С.Э.

3. Устройство для автоматической регистрации динамических характеристик протекания процесса: пат. 2129266 РФ от 1999.04.20 /Воейков В.Л., Гурфинкель Ю.И., Кондаков С.Э., Король O.A., Куфаль Г.А.

4. Способ диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам: пат. 2152616 РФ от 2000.06.10 /Баранчиков В.И., Воейков В.Л., Волков A.B., Кийко Ю.И., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Розенталь В.М.

5. Способ очистки воды от радикальных и ион-радикальных частиц: пат. 2167101 РФ от 2001.05.20 /Воейков В.Л., Волков A.B., Кондаков С.Э., Калинин А.К, Новиков К.Н., Розенталь В.М., Асфарамов Р.Р-О., Воейкова Т.А.

6. Устройство для очистки литьевой воды от радикальных и ион-радикальных частиц и ее кондиционирования: пат. 2179531 РФ от 2002.02.20 /Воейков В.Л., Волков A.B., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Розенталь В.М., Асфарамов Р.Р-О., Воейкова Т.А.

7. Способ обработки питьевой минеральной воды и напитков на ее основе: пат. 2218055 РФ от 2001.07.26 /Воейков В.Л., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Химич М.В.

8. Способ лечения и профилактики заболеваний: пат. 2200561 РФ от 2001Л 1.05 /Воейков В.Л., Волков A.B., Кондаков С.Э., Розенталь В.М.

9. Способ диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам: пат. 2216735 РФ от 2002.05.31 /Воейков В.Л., Волков A.B., Кондаков С.Э., Невзлин Л.Б., Розенталь В.М.

10. Способ коррекции и оптимизации системы питания для оздоровления организма: заявка на пат. РФ 2003129128 от 2003.10.01 /Воейков В.Л., Волков A.B., Кондаков С.Э., ТерехинаЛ.Э.

! 1. Триметилоламинометановая соль цис- бис- (4-нитраминопиридин-М) тетрахлорплатины (4+) и способ ее получения: пат. 2298556 РФ от 2005.11.17 /Федоров Б.С., Козуб Г.А., Фадеев М.А., Смирнов В.А., Мельников М.Я., Кондаков С.Э.

12. Противотуберкулезная фармацевтическая композиция: заявка на пат. РФ 2006119994 от 2006.06.12 /Кондакова Е.С., Литвинов В.И., Сельцовский П.П., Кондаков С.Э.

13. Комплекс цисплатина (цис-[диаминодихлорплатины (2+)]) с изониазидом и способ ее получения: заявка на пат. РФ 2008119510 от 2008.05.19 /Будынина Е.М., Тамм М.Е., Мельников М.Я., Кондаков С.Э.

14. Способ синтеза комплексного соединения железа (2+) с изониазидом: заявка иа пат. РФ 2008127162 от 2007.08.04 /Тамм М.Е., Литвинов В.И., Сельцовский П.П., Мельников М.Я., Кондаков С.Э.

15. Биологически активная композиция для нормализации клеточного метаболизма: заявка на пат. РФ 2008111852 от 2008.03.28 Жондаков С.Э., Ершова М.Л., Прокопцева О.С., Кондакова И.В., Кузьмин В.А., Короткина С.А., Святковский A.B., Кудрявцева A.B.

16. Способ скрининга лекарственных препаратов: заявка на пат. РФ 2008111853 ог 2008.03.28 /Кондаков С.Э., Прокопцева О.С.

Благодарности:

Выражаю искреннюю благодарность всем моим коллегам и соавторам за товарищескую помощь, активное обсуждение идей, планов и полученных результатов, а так же доброжелательную критику в процессе выполнения работы.

Отдельно хотелось бы поблагодарить: В.Н.Алдобаева, [Р.В.Боровик, Е.М.Будынину, Е.В.Буравлеву, В.Л.Воейкова, А.В.Волкова, Ю.И.Гурфинкеля, С.А.Даабуль, А.В.Демиденко, Н.Р.Дядищева, М.Л.Ершову, В.А.Кузьмина, С.А.Короткину, В.И.Налетова,. С.М.Невскую, О.С.Прокопцеву, В.М.Розенталя, П.П.Сельцовского, М.Е.Тамм, Т.Ю.Телешеву, А.А.Токарева, С.ФЛалкина.

Моя отдельная благодарность моим научным консультантам и учителям: Алексееву К.В., Мельникову М.Я. и ныне покойным Семенову H.H., Эммануэлю Н.М. и Смирнову В.В.

Моя специальная благодарность моей супруге И.В.Кондаковой и дочерям Александре и Екатерине за их долготерпение и поддержку, без которой эта работа не могла бы состояться.

Кондаков Сергей Эмильевич (Россия)

Обоснование методологии использования неспецифического биосенсора при разработке и исследовании фармацевтических препаратов

Диссертационное исследование посвящено обоснованию методологии использования неспецифических биосенсоров при разработке и исследовании фармацевтических препаратов. В качестве неспецифического биосенсора рассматривается реакция оседания клеток крови. Предложенная методология может быть использована для сокращения и удешевления отбора фармацевтически активных веществ на этапе доклинических исследований. Показано практическое применение разработанной методологии для создания противотуберкулезных, противоопухолевых и метаболитных инновационных фармацевтических препаратов. Показано практическое применение методологии неспецифических биосенсоров в других областях фармации при исследовании выпускаемых фармацевтических препаратов.

Kondakov Sergey Emil'evich (Russia)

The grounds of nonspecific biosensors methodology application to the pharmaceuticals development and investigations

Dissertation research is devoted to creation of nonspecific biosensors methodology application to the active pharmacological substances development and drug investigations. Dynamics of the erythrocyte sedimentation rate was study as the nonspecific biosensor characteristic. Practical application of the methodology was shown on the basis of innovative antituberculosis, antitumor and metabolic pharmaceutical substances creation. The developed approaches and methodology of nonspecific biosensors are useful for other areas of pharmacy for the investigation of manufactured drugs.

Подписано в печать •¡б'ЯЗ. 2009 года. Заказ № ■ Формат 60х90/16. Усл. печ. л. ^ О ■ Тираж ^¿70 экз. Отпечатано на ризографе в отделе оперативной печати и информации Химического факультета МГУ.

Актуальность темы. В конце XX - начале XXI вв. системы здравоохранения развитых и развивающихся стран мира столкнулись с рядом проблем, связанных с лекарственными средствами (J1C), прежде всего — с проблемой качества JIC. Для решения этой проблемы специалисты Всемирной организации здравоохранения (ВОЗ) выработали критерии, соблюдение которых обеспечивает потребительское качество JIC на всех этапах его обращения - от изыскания и разработки до потребления - это критерии безопасности, эффективности, фармацевтического качества (соответствие требованиям нормативных документов - НД), доступности. Как следствие, в фармацевтической отрасли на международном уровне получила признание и стала интенсивно внедряться система стандартов (GLP, GCP, GMP и др.), направленных на обеспечение качества как создаваемых, так и уже освоенных промышленностью J1C.

Проводимая гармонизация российской нормативно-правовой базы в области разработки и аттестации JIC с международной способствует тому, что стоимость работ по проведению токсикологических исследований потенциальных фармацевтических препаратов на лабораторных животных резко возрастает, поэтому сокращение испытаний за счет предварительного отбора потенциальных кандидатов в JIC на начальном этапе крайне желательно [1,2]. Следовательно, уменьшение сроков и стоимости при разработке инновационных JIC за счет создания современных методологических подходов к предварительному скринингу токсичности и биологической активности, синтезируемых и выделяемых биологически активных веществ (БАВ) является крайне актуальной задачей. Определение, инновационный, или оригинальный, препарат (бренд) было дано Европейским агентством по оценке медицинских продуктов (ЕМЕА) - это новая активная субстанция или уже известный фармакологический продукт при новом показании к его применению [3].

Отмеченные тенденции побудили российских и зарубежных ученых искать пути и способы оптимизации процесса создания JIC. В частности, российские ученые Лопатин П.В., Барабанов JI.E. изучили организационные и методологические аспекты разработки новых JIC [4,5]; Краснокутский А.Б., Коржавых Э.А., Мошкова JI.B., Щавлинский А.Н., Валь Е.В., Тихонова Ю.А., Колипова Ю.В. и другие дали определение и исследовали правовые и экономические аспекты инновационной фармации [6, 7, 8, 9, 10, 11]. Вместе с тем, за рамками выполненных в новой России исследований остались такие научные проблемы, как разработка новых, более экономичных способов изыскания и совершенствование методов оценки фармацевтических субстанций и препаратов.

Среди перспективных подходов в данном направлении особого внимания1 разработчиков JIC заслуживает использование для фармацевтических целей биосенсоров - биологических детекторов (ткань, клетка, микроорганизм, биомолекула и др.), способных определенным, функциональным образом реагировать на исследуемый фактор (например, химическое вещество). На современном этапе в России использование биосенсоров для создания и оценки новых JIC не является приоритетным' направлением исследований. За рубежом активно исследуется возможность применения биосенсоров для функционального скрининга БАВ, прогностического скрининга с целью направленного синтеза и определения действия БАВ, а также прогнозирования их токсичности без проведения испытаний на лабораторных животных (DiMasi J.А., 2003, 2007 и др.) [12].

Однако теоретическое обоснование и методологические подходы к использованию клеточных биосенсоров в инновационной фармации до настоящего времени не разработаны, в частности, не изучена возможность применения клеток крови человека в качестве биосенсора для направленного конструирования J1C.

Другим перспективным направлением использования биосенсоров в фармации является скрининг готовых J1C. Действующая система сертификации не позволяет гарантировать в полном объеме безопасность JIC, поступающих в аптечную сеть. В настоящее время в соответствии с решением Межведомственной комиссии Совета Безопасности РФ от 24.10.2001г. №3 Минздрав России совместно с заинтересованными министерствами и ведомствами ведет поиск и разработку методов для внедрения скрининговой оценки JIC. Эти методы не должны заменять фармакопейные методы анализа, их задача — быстро и с меньшими затратами выявлять фальсифицированные и некачественные JIC.

В связи с этим приобрел актуальность вопрос о разработке теоретических основ и новых методических принципов использования неспецифических биосенсоров для создания и оценки фармацевтических препаратов без применения лабораторных животных. Отсутствие единой методологии использования неспецифических биосенсоров . является сдерживающим фактором для широкого внедрения данной технологии в различные области фармации.

Вышеизложенное обусловило выбор темы, цели и задач исследования.

Цель и задачи исследования

Цель настоящей работы - проведение комплексных теоретических и экспериментальных исследований по обоснованию методологии применения неспецифических биосенсоров при разработке и исследовании инновационных фармацевтических препаратов на примере использования в качестве биосенсора показателя скорости оседания эритроцитов:

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие основные задачи:

• проанализировать состояние проблемы использования неспецифических биосенсоров в фармации и медицине и сформировать ее концептуальную основу (понятийный аппарат);

• разработать алгоритм и аппаратурное оформление получения биосенсорной характеристики на основе процесса оседания крови;

• выявить закономерности поведения неспецифического биосенсора на основе процесса оседания крови в зависимости от внешних факторов (физических, химических, биохимических, временных), которые необходимо учитывать при проведении фармацевтического скрининга, для получения воспроизводимых результатов;

• разработать математическую модель процесса седиментации эритроцитов как неспецифического биосенсора, позволяющую связать внутренние процессы межклеточного взаимодействия с процессом оседания;

• разработать и статистически доказать критерии воздействия на исследуемый биосенсор с целью применения создаваемой методологии при разработке новых фармацевтических препаратов;

• исследовать возможности применения разрабатываемой методологии для исследования стабильности характеристик выпускаемых'ЛС;

• апробировать методологию неспецифического биосенсора при разработке инновационных ЛС;

• разработать для сконструированных препаратов соответствующие НД и внедрить их в фармацевтическое производство.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. В результате проведенных исследований теоретически обоснована и экспериментально подтверждена эффективность и перспективность нового научного направления в фармации - применения неспецифических биосенсоров при разработке и исследовании ЛС (на примере эритроцитов как неспецифического биосенсора и его характеристик - скорости и динамики оседания эритроцитов).

Теоретически обоснована и разработана методология использования неспецифического биосенсора при создании новых ЛС, включающая:

• концептуальные основы (разработан понятийный аппарат; выявлены закономерности поведения неспецифического биосенсора в зависимости от внешних факторов, которые необходимо учитывать при проведении фармацевтического скрининга; разработана математическая модель процесса седиментации эритроцитов для прогнозирования количественного биосенсорного отклика при фармацевтическом скрининге);

• методические основы (комплекс критериев оценки функционального воздействия биологически активных веществ и соединений на биосенсор; критерии достоверности биосенсорного отклика на воздействие лекарственного вещества (в составе лекарственного моно- и комплексного препарата); комплекс методик оценки лекарственных субстанций и препаратов с использованием неспецифических биосенсоров, в том числе методика оценки биофармацевтической эффективности лекарственного препарата, методика оценки стабильности некоторых характеристик производства J1C, алгоритм экспресс-скрининга лекарственных веществ, при создании новых JIC, методика оценки индивидуального терапевтического действия JIC);

• методологическую блок-схему, обосновывающую применение неспецифических биосенсоров на доклиническом этапе создания J1C;

• метод и аппаратно-программный комплекс для долговременной регистрации динамических характеристик реакции оседания эритроцитов как неспецифического биосенсора (РОЭ-графия).

На основе комплекса представлений о процессе оседания цельной крови как высокочувствительной биосенсорной системы теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность использования методологии неспецифических биосенсоров для* фармацевтического скрининга при создании оригинальных JIC разных классов: противоопухолевых, противотуберкулезных и метаболитных. Предложены состав и технологии получения, дана биофармацевтическая характеристика четырех инновационных J1C.

Реализация предлагаемых методологических подходов в области создания противоопухолевых препаратов позволила провести скрининг синтезированных платиновых металлокомплексов, предсказать пониженную токсичность нескольких соединений, разработать технологию синтеза и предложить для практического использования новый фармацевтический препарат на основе водорастворимого комплекса цисплатина. В области противотуберкулезных препаратов - разработать и предложить новое лекарственное средство на основе изониазида и цветочной пыльцы обножки, обладающую лучшей переносимостью по сравнению с изониазидом, и новый способ синтеза противотуберкулезного препарата «Феназид» с повышенной растворимостью в воде. В области метаболитных препаратов - предсказать оптимальную концентрацию J1B, разработать состав и технологию производства инновационного инъекционного ветеринарного препарата, предназначенного для стимуляции защитных сил организма при интоксикациях и нарушениях функций ферментных систем.

Подтверждена принципиальная возможность использования модификации предложенной методологии неспецифических биосенсоров для скрининга лекарственных препаратов, а также для контроля стабильности и биологической активности выпускаемых JIC.

На основе фундаментальных исследований, проведенных для создания методологии использования неспецифических биосенсоров в фармации, были получены важные научные результаты для смежных областей знаний. Изучение динамики оседания эритроцитов позволило' усовершенствовать диагностику физиологического состояния человека. С учетом представлений о поведении цельной крови как индивидуальной биосенсорной системы человека исследовано влияние пищевых аллергенов на процесс оседания эритроцитов, что закладывает основы индивидуальной фармации в части индивидуального подбора питания (устранения из питания продуктов, вызывающих аллергии разного типа). На основе изучения физических факторов, влияющих на реологические свойства крови, впервые показана принципиальная возможность инструментальной оценки влияния геомагнитной обстановки на человека, что может быть использовано для создания технологии контроля состояния здоровья кардиологических больных в дни геомагнитной активности. Разработанные биосенсорные подходы позволили обосновать несколько новых способов очистки воды и растворов и применение.активированных вод в лечебно-профилактических целях.

Принципиальная новизна полученных научных результатов подтверждена 10 патентами,РФ и 6 заявками на.патент РФ.

Практическая^ значимость работы; Предложенные методологические подходы,к разработке оригинальных JIG с использованием неспецифических биосснсоров на основе реакции оседания? клеток крови позволяют существенно сократить стоимость и сроки; создания препаратов, на первом этапе доклинических исследований путем направленного синтеза и отбора химических соединений за счет предварительного скрининга. Применение предложенной методики: интегрированной * оценки, воздействия, на клетки; крови позволяет разработчикам в короткие сроки создавать эффективные и конкурентоспособные оригинальные JIG.

Полученные наг примере клеток крови- фундаментальные данные: о существовании-активных коллоидных; систем^ меняющих свои реологические свойства в- зависимости от биохимичесих реакций, протекающих в? системе; под-:воздействием» фармацевтических препаратов; вносят существенный вклад в современные представлениям химии, биологии, и медицины^ а, прикладные аспекты этих знаний - вфазвитие фармацевтической;химиши технологии:, На;основании проведенных исследований:разработаны и внедрены: • < состав- и технология производства'; инъекционной формы инновационного противоопухолевого^ препарата» «Платизид» (лабораторный регламент на производство 000 «Цитостарт», акт апробацииют 02:2009); способ синтеза препарата? для лечения туберкулеза, «Феназид» обеспечивающий*его повышенную биодоступность, (лабораторный регламент на производство ООО «Комелис», акт апробации 11.2008);

••• состав, и оптимизированные технологические, параметры производства! комплексного препарата для лечения туберкулеза «Пергазид» в твердых желатиновых капсулах (лабораторный- регламент на производство ООО «Комелис», акт. апробации 12.2008);

• состав инъекционной формы ветеринарного препарата на основе внутренних метаболитов «Эльвита-У дивит», предназначенный для стимуляции защитных сил организма при интоксикациях, нарушениях ферментных систем (ТУ 9337-001-85676454-2008, Рег.уд. № ПВР-2-10.8/002341 от 17.03.2009г.);

• технология производства инъекционной формы инновационного ветеринарного препарата на основе внутренних метаболитов «Эльвита-Удивит» (лабораторный регламент на производство ООО «Алвита», акт апробации 04.2009)

• разработаны и представлены в ФГУ НЦЭСМП Росздравнадзора с целью регистрации: ФСП «Феназид-моно» капсулы; ФСП «Пергазид» капсулы;

• разработана и представлена в ФГУ ВГНКИ Россельхознадзора с целью регистрации: ФСП «Платизид» раствор.

Высокая эффективность применения разработанного ветеринарного JIC позволила рекомендовать его для внедрения в промышленное сельскохозяйственное производство (Методические рекомендации по применению препарата «Эльвита» для сельскохозяйственных животных, пушных зверей, птиц и домашних животных /MP МСХ РФ. - СПб., 2009 г.).

Отдельные фрагменты выполненной работы используются в учебном процессе ГОУ Санкт-Петербургская академия ветеринарной медицины им. Урбана при изучении дисциплин химия, фармация и эпизотология (акт внедрения).

На защиту выносятся:

• разработанная методология использования реакции оседания клеток крови в качестве неспецифического биосенсора для создания инновационных JIC;

• разработанная- приборная и методическая база использования динамического показателя оседания клеток крови в качестве биосенсора. Исследованные временные, физические и физико-химические факторы, влияющие на использование предложенного биосенсора в фармацевтическом скрининге;

• установленные и статистически обоснованные критерии воздействия исследуемого фармацевтического препарата на процесс оседания клеточной массы; выявленные границы применимости предложенного биосенсора; разработанная модель активного коллоида, показывающая принципиальный механизм воздействия исследуемого фармацевтического вещества на биосенсорную характеристику - процесс оседания клеток крови;

• результаты, показывающие принципиальную возможность разработки, на основе методологии неспецифических биосенсоров, метода контроля стабильности технологии производства фармацевтических препаратов и метода сравнения биоэквивалентности J1C, выпускаемых разными производителями на основе одной фармацевтической субстанции;

• результаты практического использования предложенной методологии на примере разработки противотуберкулезных, противоопухолевых и метаболитных фармацевтических препаратов, находящихся на разной стадии внедрения, от стадии синтеза действующего начала до разработки технологии готовой лекарственной формы.

Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены на межкафедральной конференции специальных кафедр медицинского факультета и факультета повышения квалификации медицинских работников Российского университета дружбы народов (июнь 2009); на 9 международных конгрессах, конференциях и симпозиумах: Гурвичевской конференции «Неравновесные и когерентные системы в биологии, биофизике и биотехнологии» (Москва, 1994, 1999), Пущинском симпозиуме «Связь биологических и физико-химических процессов с космическими и гелио-геофизическими факторами (Пущино, 1996), конференциях Биомедприбор-98 (Москва, 1998) и «Биохимическая физика на рубеже столетий» (Москва, 2000), конгрессе по биоэлектрографии (С.-Петербург, 1999, 2000, 2001, 2002); на II Съезде биофизиков России (Москва, 1999), Всероссийском научном совещании «Высокоорганизованные каталитические системы» (Москва, 2000); на научной конференции МГУ «Ломоносовские чтения» (Москва, 1999, 2000); на 7 зарубежных конгрессах, конференциях и симпозиумах, в том числе конгрессах по биомедицинской оптике «BiOS Europe» и BiOS (США, 1997, 1998, 2000), Крымском семинаре «Космическая экология и ноосфера» (Украина, 1997, 1999, 2001), конференции «Новая наука о сознании» (Словения, 2000).

На 26-м Международном Салоне изобретений (Швейцария, 1998) созданная на основе результатов исследования медико-диагностическая аппаратура была удостоена большой серебряной медали.

Основное содержание работы отражено в 52 научных публикациях, в том числе в 12 статьях в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК, и 16 патентах Российской Федерации.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР государственного учебно-научного учреждения Химический факультет Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова (номер госрегистрации темы № 01.930.0 04727, номер госрегистрации ГАСНТИ 02 0202 225 0320). Тема диссертации утверждена на заседании Ученого совета химического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова «»200г.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, аналитического обзора литературы по проблеме (1 глава), материалов и методов исследований (2 глава), изложения результатов исследований (главы 3-7), заключения, выводов, указателя

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. С применением логического и контент-анализа отечественной и зарубежной литературы констатировано недостаточное развитие проблемы использования неспецифических биосенсоров в российской фармации; обоснованы наиболее перспективные направления развития исследований в этой области и определены задачи, требующие первоочередного решения для оптимизации процесса создания инновационных J1C.

2. На основе комплексного анализа проблемы разработаны методологические подходы и понятийный аппарат для использования показателя оседания клеток крови в качестве неспецифического биосенсора, для создания лекарственных препаратов, логическим стержнем которых является концепция комплексных исследований, начиная от стадии синтеза субстанции до соответствующих клинических исследований.

3. Разработаны алгоритм и оригинальная аппаратура, позволяющая автоматизировать процесс измерения динамики оседания клеток крови, визуализировать и сохранять информацию в базе данных.

4. На основании проведенных исследований динамики оседания клеток крови теоретически обоснована и экспериментально доказана кооперативность процессов, протекающих в оседающей клеточной массе, и получены характеристики процесса, позволяющие выявить степень воздействия вводимого исследуемого вещества; систематизированы факторы (физические, физико-химические, и временные), которые необходимо учитывать при проведении фармацевтического скрининга для получения воспроизводимых результатов, и определено их влияние на поведение неспецифического биосенсора.

5. Разработана математическая модель активного коллоида как неспецифического биосенсора, позволяющая связать внутренние процессы межклеточного взаимодействия с макрохарактеристикой - скоростью оседания эритроцитов. Предложенная модель позволяет численно моделировать биохимические процессы в оседающей массе и создать критерии использования процесса седиментации крови в качестве биосенсора.

6. Разработаны статистически достоверные критерии воздействия фармацевтических препаратов на исследуемый биосенсор, в том числе критерии наличия или отсутствия воздействия, а также критерий степени достоверности биосенсорного отклика.

7. На основе выявленных закономерностей ДОК, результатов математического моделирования процесса седиментации эритроцитов и комплекса критериев оценки воздействия БАВ на неспецифический биосенсор разработан алгоритм использования биосенсора для экспресс-скрининга БАВ. Настоящий алгоритм включает 8 этапов, полностью соответствует стандарту Надлежащей лабораторной практики (GLP) и может быть использован на любой из стадий доклинических исследований до проведения испытаний in vivo.

8. Экспериментально доказана принципиальная возможность разработки при помощи методологии неспецифических биосенсоров метода контроля стабильности технологии производства фармацевтических- препаратов на одном и том же предприятии и метода сравнения биоэквивалентности фармацевтических препаратов, выпускаемых разными производителями на основе одной фармацевтической субстанции.

9. Разработана методология использования неспецифического биосенсора при изыскании, разработке и исследовании новых JIC. Соответствующая методологическая схема включает 8 этапов. Использование биосенсорной технологии предусмотрено на этапе 4 методологической схемы - выбора препарата предлагаемого для дальнейшей модификации или продолжения доклинических испытаний.

10. Практическая применимость разработанной методологии доказана на примере разработки новых инновационных фармацевтических препаратов и композиций для противотуберкулезных, противоопухолевых и метаболитных

JIC на различных этапах их создания. Все разработанные и внедренные в производство препараты защищены патентами на изобретение РФ.

11. Разработан новый способ синтеза противотуберкулезного фармацевтического препарата «Феназид» с пониженным содержанием мостиковых связей металла, что обеспечивает лучшую биодоступность.

12. Разработан состав и оптимизирована технология получения твердых желатиновых капсул противотуберкулезного препарата на основе изониазида и природной биологически активной субстанции пыльцы-обножки, обеспечивающей лучшую переносимость и противотуберкулезную активность изониазида.

13. Проведен скрининг синтезированных металлокомплексов на основе соединений платины, предсказана пониженная токсичность нескольких соединений; разработана технология синтеза и предложен для практического использования новый водорастворимый внешнесферный комплекс цисплатина с изониазидом для лечения опухолевых заболеваний.

14. С помощью предложенной методологии разработан оптимальный состав инъекционного ветеринарного препарата «Эльвита-Удивит». Определены оптимальные концентрации действующего начала инновационного JIC обеспечивающие наилучший терапевтический эффект, подтвержденный клинической практикой при лечении вирусных заболеваний животных. Разработана и внедрена технология производства препарата.

СОБСТВЕННЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кондаков, С.Э. Ультрадисперсные металлы в неводных растворителях -новый класс катализаторов-инициаторов присоединения полигалогеналканов по кратным связям /С.Э. Кондаков, В.В. Смирнов, JI.A. Тюрина //Докл. АН СССР. - 1992. - Т. 325, № 3. - С.536-539.

2. Kondakov, S.E. Cryochemical synthesis of the giant magnesium clusters in amine media. /S.E. Kondakov, Y.V. Smirnov //Bull. Soc. Chem. Belg. - 1994. -Vol. 103.-P.101-103.

3. Кондаков, С.Э. Химические и каталитические свойства ультрадисперсных частиц металлов (УДЧ), полученных путем совместной конденсации металлов с аминами. Взаимодействие с алканами. /С.Э. Кондаков, В.В. Смирнов //Вестн. Моск. ун-та. Сер.2. Химия. - 1995. - Т. 36, № 4. - С.328-331.

4. Воейков, B.JI. Нелинейные эффекты изменения скорости в реакции оседания эритроцитов как следствие метаболизма клеток крови /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э. Кондаков, А.В. Пирогов //Тез. докл. IX междунар. школы по хим. кинетике. - Клязьма, 1997. - С.40.

5. Воейков, B.JI. Динамика оседания эритроцитов — новый метод анализа крови как целостной системы /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э. Кондаков и др. //Космическая экология и ноосфера: Тез. докл. Крымского междунар. семинара (6-11 октября 1997 г., Партенит, Крым, Украина). - 1997. - С. 102.

6. Воейков, B.JI. Динамика оседания эритроцитов - новый метод анализа крови как целостной системы /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков и др. //Фундаментальные науки и альтернативная медицина: Тез. докл. 1-го Междунар. симп. - (22-25 сентября 1997 г., Пущино). - Пущино, 1997. - С. 32.

7. Воейков, B.JI. Макрокинетические зависимости изменений скорости в реакции оседания эритроцитов /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, А.В. Пирогов //Современная физическая химия: Тез. докл. IX Школы-симп. - (18-30 сентября 1997 г., Туапсе). - Туапсе, 1997.-С.42.

8. Воейков, B.JI. Нелинейные эффекты изменения скорости в реакции оседания эритроцитов /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, А.В. Пирогов //Современная физическая химия: Тез. докл. IX Школы-симп. - (18-30 сентября 1997 г., Туапсе). - Туапсе, 1997. - С.41.

9. Воейков, B.JI. Возможности использования динамики оседания форменных элементов крови в клинической практике /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, А.В. Пирогов //Современная физическая химия: Тез. докл. IX Школы-симп. - (18-30 сентября 1997 г., Туапсе). -Туапсе, 1997.-С.45.

Ю.Воейков, B.JI. Оседание эритроцитов в неразведенной крови -немонотонный динамический процесс /B.JI. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э. Кондаков, А.В. Пирогов //Леонардо Да Винчи XX века: Тез. юбил. конф. РАЕН к 100 летию А.Л.Чижевского. - М., 1997. -С.55-56.

П.Воейков, B.J1. Компьютеризированный прибор для анализа динамики оседания красной крови и обоснование нового метода диагностики /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков, С.Ю. Озерский //Междунар. конф. по биомедицинскому приборостроению -Биомедприбор-98: Тез. докл. - (6-8 октября 1998, Москва). - М., ЗАО «ВНИИМП-ВИТА», 1998. - С. 107-109.

12.Воейков, В.Л. Немонотонные изменения скорости оседания эритроцитов в цельной крови. /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков //Докл. РАН. - 1998. - Т. 359, № 5. - С. 1-5.

13.Kondakov, S.E. Dynamics of erythrocyte sedimentation rate as a new diagnostic tool. /S.E. Kondakov,V.L.Voeikov, Yu.I.Gurfinkel, A.Yu.Dmitriev //In: «Optical Diagnostics of Biological Fluids III»: SPIE Proc. - Vol. 3252. - San Jose (CA),

1998. -P.54-61.

14.Кондаков, С.Э. Биокинетические исследования цельной крови. Научные аспекты и клиническое применение. /С.Э.Кондаков, В.Л. Воейков, В.М. Розенталь //Ломоносовские чтения. Секция «Химия»: Тез. докл. науч. конф. - (26-28 апреля 1999 г., Москва). - М.: МГУ, 1999. - С.21

15.Voeikov, V.L. The new method of blood analysis - ESR-graphy - reveals nonlinear dynamics in the behavior of whole blood outside the organism / V.L. Voeikov, S.E.Kondakov, E.V.Buravleva //Science, Information, and Spirit: Proc. of the Intern. Scient. Congr. - (29 May-1 June 1999, Saint Petersburg). -SPb., 1999ю - P.38-39.

16.Voeikov, V.L. High-temporal resolution of red blood cells sedimentation dynamics reveals non-linear and cooperative properties in whole blood /V.L. Voeikov, S.E.Kondakov et al. //Proc. of the 2-nd Intern. Alexander Gurwitsch Conf. - (6-10 Sep 1999, Moscow). - M., 1999. - P.53-54.

17.Воейков, В.Л. Сканирующее устройство для регистрации динамики оседания красной крови и обоснование нового метода диагностики /В.Л. Воейков, С.Э.Кондаков, Ю.И. Гурфинкель //Оптические методы исследования потоков (ОМИП-99): Тез. докл. 5-й Междунар. науч.-технич. конф. - (23-25 июня 1999 г., Москва). - М., 1999. - С.54

18.Воейков, В.Л. Применение метода измерения динамики оседания крови в клинической практике /В.Л. Воейков, Ю.И. Гурфинкель, А.Ю. Дмитриев, С.Э.Кондаков //II Съезд биофизиков России: Тез. докл. - (23-27 августа 1999 г., Москва). - М., 1999. - Т. 2. - С.655-656.

19.Гурфинкель, Ю.И. Влияние магнитных бурь на динамику оседания крови больных ишемической болезнью сердца /Ю.И. Гурфинкель, В.Л. Воейков, С.Э.Кондаков и др. //Космическая экология и ноосфера: Тез. докл. Крымского Междунар. семинара. - (4-9 октября 1999 г., Партенит, Крым.

1999. - С.6-7.

20.Кондаков, С.Э. РОЭ-графия: диагностика крови как биологической ткани /С.Э.Кондаков, Ю.С. Буларгина, Е.В. Буравлева, Ю.И. Гурфинкель и др. //Системный подход к вопросам анализа и управления биологическими объектами: Тез. докл. науч.-практ. конф. - (19-21 апреля 2000г.) - М.-С.-П., 2000. - С.46-48.

21.Розеиталь, В.М. Питание как ведущий компонент экологической реабилитации: индивидуальная диета /В.М. Розенталь, В.И. Баранчиков,

B.JI. Воейков, А.В. Волков, Ю.И. Кийко, С.Э.Кондаков, К.Н. Новиков //Системный подход к вопросам анализа и управления биологическими объектами: Тез. докл. науч.-практ. конф. - (19-21 апреля 2000г.) - М.-С.-П., 2000. - С.49-50.

22.Воейков, B.J1. Фундаментальные и прикладные аспекты поведения цельной крови человека вне организма / B.JI. Воейков, Ю.С. Буларгина, Е.В. Буравлева, Н.Д. Виленская, С.Э. Кондаков и др. //Слабые и сверхслабые излучения в биологии и медицине: Тез. II Междунар. конгр. - (3-7 июля 2000 г., Санкт-Петербург). - СПб., 2000. - С.32-33.

23.Гурфинкель, Ю.И. Изменение динамических параметров седиментации красной крови больных ишемической болезнью сердца в дни с высокой геомагнитной активностью /Ю.И. Гурфинкель, B.JI. Воейков, Е.В. Буравлева, С.Э.Кондаков и др. // Слабые и сверхслабые излучения в биологии и медицине: Тез. II Междунар. конгр. - (3-7 июля 2000 г., Санкт-Петербург). - СПб., 2000. - С. 115-116.

24.Гурфинкель, Ю.И. Влияние геомагнитной активности на динамику седиментации красной крови больных ишемической болезнью сердца /Ю.И. Гурфинкель, B.JI. Воейков, Е.В. Буравлева, С.Э.Кондаков //Биомед. радиоэлектроника. - 2000. - № 4. - С.3-12.

25.Voeikov, V.L. High-temporal resolution of red blood cells sedimentation dynamics reveals non-linear and cooperative properties of whole blood /V.L. Voeikov, S.E.Kondakov, Yu.I. Gurfinkel et al. //Rivista di Biologia /Biological Forum. -2000. - Vol. 93, № 1. - P. 149-151.

26.Voeikov, V.L. Computerized video-enhanced high temporal resolution of erythrocytes sedimentation rate (ESR-graphy) reveals complex dynamic and self-organizing properties of whole blood / V.L. Voeikov, S.E.Kondakov, E.V. Buravleva et al. //Optical Diagnostics of Biological Fluids V: Proc. SPIE. - 2000. - Vol.3923(May). - P.32-43.

27. Voeikov, V.L. Non-equilibrium and coherent properties of whole blood revealed by analysis of its sedimentation behavior / V.L. Voeikov, Yu.S. Bulargina, E.V. Buravleva, S.E.Kondakov //Proc. of the 2nd Intern. Alexander Gurwitsch Conf. and Additional Contributions. - Moscow: Moscow University Press, 2000. -P.75-92.

28. Voeikov, V.L. Life of blood outside an organism: Fundamental properties and clinical applications /V.L. Voeikov, R. Asfaramov, Yu.S. Bulargina, E.V. Buravleva, S.E.Kondakov et al. //Information Society IS'2000 New Science of Consciousness: Proc. of the 3rd Intern. Multi-Conf. (Ljubljana, Slovenia). -Ljubljana, 2000. - P.21-24.

29.Розенталь, В.М. Роль подбора индивидуального питания в экологической реабилитации человека /В.М. Розенталь, B.JI. Воейков, А.В. Волков,

C.Э.Кондаков, К.Н. Новиков //Экополис 2000: Экология и устойчивое развитие города: Мат-лы III-й Междунар. конф. - (24-25 ноября 2000 г., Москва). - М.: Изд-во РАМН, 2000. - С.243-247.

30.Gurfinkel, Yu.I. Effect of geomagnetic storms upon blood sedimentation dynamics in ischemic heart disease patients /Yu.I. Gurfinkel, V.L. Voeikov, S.E.Kondakov et al. //Proc. SPIE. - 2000. - Vol. 4163. - P.l-8.

31. Gurfinkel, Yu.I. Effect of geomagnetic storms on the erythrocyte sedimentation rate in ischemic patients /Y.I. Gurfinkel, V.L. Voeikov, E.V. Buravlyova, S.E.Kondakov //Crit. Rev. Biomed. Eng. - 2001. - Vol. 29, № 1. - P.65-76.

32.Кондаков, С.Э. Биосенсорные свойства крови /С.Э.Кондаков,

B.М.Розенталь //Современная химическая физика: Тез. докл. XIII симпозиума. - Туапсе, 2001. - С. 135-136.

33.Кондаков, С.Э. Биосенсорные свойства крови. Использование кинетических параметров оседания форменных элементов крови для диагностики /С.Э.Кондаков //Современная химическая физика: Тез. докл. XIV симпозиума. - Туапсе, 2002. - С. 167.

34. Токарев, А. А. Компьютерное моделирование процесса оседания форменных элементов крови /А.А.Токарев,С.Э.Кондаков //Современная химическая физика: Тез. докл. XIV симпозиума. - Туапсе, 2002. - С.156.

35.Розенталь, В.М. Индивидуальное питание и качество жизни здорового и больного человека /В.М.Розенталь, А.В.Волков, М.И.Орехов,

C.Э.Кондаков и др. //Пути к здоровью нации 3-го тысячелетия: Тез. докл. 2 Всерос. форума. - (22-24.10.2002, Москва). - М., 2002. - С.122.

36. Адинсков, Д.П. Особенности применения визуализации при расшифровке поточных клинических анализов /Д.П. Адинсков, С.Э.Кондаков, К.И. Чепырев //Графикон-2003: Тез. докл. Междунар. конф. - М.: МГУ, 2003. -С.39(М).

37.Волков, А.В. Применение визуализации для оценки клинической эффективности индивидуальной програмы питания «Экомедтест» /А.В. Волков, С.Э. Кондаков, B.JI. Воейков //Графикон-2003: Тез. докл. Междунар. конф. - М.: МГУ, 2003. - С.40(М).

38.Кондаков, С.Э. Визуализации научного эксперимента при скрининговых исследованиях фармпрепаратов /С.Э. Кондаков //Графикон-2003: Тез. докл. Междунар. конф. - М.: МГУ, 2003. - С.41(М).

39.Кондаков, С.Э. Исследование активности фармацевтических препаратов методом динамики оседания крови /С.Э. Кондаков //Тез. докл. XXII Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. -(Пансионат «Березки» МО, 2004). - М., 2004. - С.42.

40.Кондаков, С.Э. Использование динамического метода измерения оседания форменных элементов крови для направленного синтеза новых фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков, М.Я. Мельников //Тез. докл. XXII Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. - (Пансионат «Березки» МО, 2004). - М., 2004. - С.43.

41.Адинсков, Д.П. Динамика оседания эритроцитов как интегральный показатель состояния здоровья /Д.П. Адинсков, А.В.Волков, С.Э. Кондаков, Т.Ю. Телешева //Наука, Информация, Сознание: Мат-лы 8-го между нар. конгр. - (3-5.06.2004 г., Санкт-Петербург). - СПб.: СПбИТМО, 2004.-С.168-171.

42.Кондаков, С.Э. Изучение общей и избирательной токсичности фармацевтических препаратов методом динамики оседания крови /С.Э. Кондаков //Тез. докл. XXIV Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. - (Пансионат «Березки» МО, 2006). - М., 2006. -С.41.

43.Кондаков, С.Э. Металлокомплексные противотуберкулёзные препараты: кинетика функционирования /С.Э.Кондаков, М.Е.Тамм //Тез. докл. XXIV Всерос. школы-симпозиума молодых ученых по химической кинетике. -(Пансионат «Березки» МО, 2006). - М., 2006. - С.43

44. Кондаков, С.Э. Использование кинетических параметров для конструирования новых фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2006: Тез. докл. Всерос. конф.-школы. - М., 2006. - С.34.

45.Кондаков, С.Э. Применение неспецифических биосенсоров для быстрого скрининга общей и избирательной токсичности /С.Э. Кондаков, М.Я. Мельников //Современная химическая физика: Тез. докл. XIX Симпозиума. - Туапсе, 2007. - С.135-136.

46.Кондаков, С.Э. Метод определения индивидуальной чувствительности к кормовым продуктам у мелких домашних и сельскохозяйственных животных /С.Э. Кондаков и др. //Методические указания Министерства сельского хозяйства РФ. - СПб., 2007. - 15 о,

47.Кондаков, С.Э. Применение неспецифических биосенсоров для быстрого скрининга общей и избирательной токсичности при синтезе металлокомплексов /С.Э. Кондаков, М.Я. Мельников //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2008: Тез. докл. 2 Всерос. конф.-школы. - Астрахань-Москва, 2007. - С.34.

48.Ершова, M.JI. Применение метода HOA-ELISA для оценки иммуногенности многокомпонентных смесей на примере исследования кормов в ветеринарии /М.Л.Ершова, О.С.Прокопцева, И.В.Кондакова, С.Э.Кондаков //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2008: Тез. докл. 3 Всерос. конф.-школы. -Астрахань-Москва, 2008. - С. 19.

49.Кондаков, С.Э. Методологические принципы использования кинетических подходов для конструирования новых фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков //Высокореакционные интермедиаты химических реакций и биологических процессов Chemlnt 2008: Тез. докл. 3 Всерос. конф.-школы. -Астрахань-Москва, 2008. - С.34.

50.Кондаков, С.Э. Седиментация форменных элементов крови. Модель активной коллоидной системы /С.Э. Кондаков, А.А. Токарев, М.Я. Мельников //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. - 2008. - Т. 48, № 4. - С.238-240.

51.Кондаков, С.Э. Применение неспецифических биосенсоров для контроля активности фармацевтических препаратов /С.Э. Кондаков, М.Я.

Мельников, П.Н. Козаченко, К.В. Алексеев //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. -2009.-Т. 50, № 4. — С.153-156. 52.Ершова, М.Л. Применение неспецифических биосенсоров для создания фармацевтических композиций на основе внутренних метаболитов /М.Л.Ершова, С.Э.Кондаков, И.В.Кондакова и др. //Вестник МГУ. Сер. 2. Химия. - 2009. - (В печати). Изобретения

1. Способ контроля физиологического состояния человека: пат. 2103672 РФ от 1998.01.27 /Воейков В.Л., Гурфинкель Ю.И., Дмитриев А.Ю., Кондаков С.Э.

2. Устройство для автоматической регистрации осаждения крови: пат. 2128945 РФ от 1999.04.20 /Воейков В.Л., Гурфинкель Ю.И., Дмитриев

A.Ю., Кондаков С.Э.

3. Устройство для автоматической регистрации динамических характеристик протекания процесса: пат. 2129266 РФ от 1999.04.20 /Воейков В.Л., Гурфинкель Ю.И., Кондаков С.Э., Король О.А., Куфаль Г.А.

4. Способ диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам: пат. 2152616 РФ от 2000.06.10 /Баранчиков В.И., Воейков В.Л., Волков А.В., Кийко Ю.И., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Розенталь В.М.

5. Способ очистки воды от радикальных и ион-радикальных частиц: пат. 2167101 РФ от 2001.05.20 /Воейков В.Л., Волков А.В., Кондаков С.Э., Калинин А.И., Новиков К.Н., Розенталь В.М., Асфарамов Р.Р-О., Воейкова Т.А.

6. Устройство для очистки питьевой воды от радикальных и ион-радикальных частиц и ее кондиционирования: пат. 2179531 РФ от 2002.02.20 /Воейков

B.Л., Волков А.В., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Розенталь В.М., Асфарамов Р.Р-О., Воейкова Т.А.

7. Способ обработки питьевой минеральной воды и напитков на ее основе: пат. 2218055 РФ от 2001.07.26 /Воейков В.Л., Кондаков С.Э., Новиков К.Н., Химич М.В.

8. Способ лечения и профилактики заболеваний: пат. 2200561 РФ от 2001.11.05 /Воейков В.Л., Волков А.В., Кондаков С.Э., Розенталь В.М.

9. Способ диагностики индивидуальной чувствительности организма к пищевым продуктам: пат. 2216735 РФ от 2002.05.31 /Воейков В.Л., Волков А.В., Кондаков С.Э., Невзлин Л.Б., Розенталь В.М.

10.Способ коррекции и оптимизации системы питания для оздоровления организма: заявка на пат. РФ 2003129128 от 2003.10.01 /Воейков В.Л., Волков А.В., Кондаков С.Э., Терехина Л.Э.

П.Триметилоламинометановая соль цис- бис- (4-нитраминопиридин-М) тетрахлорплатины (4+) и способ ее получения: пат. 2298556 РФ от 2005.11.17 /Федоров Б.С., Козуб Г.А., Фадеев М.А., Смирнов В.А., Мельников М.Я., Кондаков С.Э.

12.Противотуберкулезная фармацевтическая композиция: заявка на пат. РФ 2006119994 от 2006.06.12 /Кондакова Е.С., Литвинов В.И., Сельцовский П.П., Кондаков С.Э.

13.Комплекс цисплатина (цис-[диаминодихлорплатины (2+)]) с изониазидом и способ ее получения: заявка на пат. РФ 2008119510 от 2008.05.19 /Будынина Е.М., Тамм М.Е., Мельников М.Я., Кондаков С.Э.

14.Способ синтеза комплексного соединения железа (2+) с изониазидом: заявка на пат. РФ 2008127162 от 2007.08.04 /Тамм М.Е., Литвинов В.И., Сельцовский П.П., Мельников М.Я., Кондаков С.Э.

15.Биологически активная композиция для нормализации клеточного метаболизма: заявка на пат. РФ 2008111852 от 2008.03.28 /Кондаков С.Э., Ершова М.Л., Прокопцева О.С., Кондакова И.В., Кузьмин В.А., Короткина С.А., Святковский А.В., Кудрявцева А.В.

16.Способ скрининга лекарственных препаратов: заявка на пат. РФ 2008111853 от 2008.03.28 /Кондаков С.Э., Прокопцева О.С.

Благодарности:

Выражаю искреннюю благодарность всем моим коллегам и соавторам за товарищескую помощь, активное обсуждение идей, планов и полученных результатов, а так же доброжелательную критику в процессе работы. Отдельно хотелось бы поблагодарить: В.Н.Алдобаева, Е.М.Будынину, Е.В.Буравлеву, В.Л.Воейкова, А.В.Волкова, Ю.И.Гурфинкеля, С.А.Даабуль, А.В.Демиденко, Н.Р.Дядищева, М.Л.Ершову, М.А.Земляницина, В.А.Кузьмина, С.А.Короткину, В.И.Налетова, С.М.Невскую, О.С.Прокопцеву,

B.М.Розенталя, П.П.Сельцовского, М.Е.Тамм, Т.Ю.Телешеву, А.А.Токарева,

C.Ф.Чалкина.

Моя отдельная благодарность моим научным консультантам и учителям: Алексееву К.В., Мельникову М.Я. и ныне покойным Семенову Н.Н., Эммануэлю Н.М. и Смирнову В.В.

Моя специальная благодарность моей супруге И.В.Кондаковой и дочерям Александре и Екатерине за их долготерпение и поддержку, без которой эта работа не могла бы состояться. выполнения Р.В.Боровик,

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Обобщая проведенные исследования и заглядывая немного вперед можно выделить несколько принципиальных моментов.

Развитие науки во многом определяется уровнем доступной измерительной техники. Конец прошлого столетия ознаменовался появлением новой области науки - биосенсирование. К сожалению, уже через несколько лет, под этим названием стали понимать только электронные устройства, а все внимание уделять высокоселективным специфическим биосенсорам. Классическое определение биосенсора - изучение ответа объекта биологического происхождения в ответ на стимул, было забыто. Но шло время и взгляды исследователей опять повернулись к неспецифическим биосенсорам, на основе живых систем. Оказалось, что измерение более одной одного показателя, от одной биосистемы, позволяет создать прообраз «электронного носа» и с использованием математических методов кластерного анализа четко определить происхождение анализируемого продукта, например кофе [Золотов 2007]. Исследования по поиску адекватных биомоделей на основе неспецифических взаимодействий ведутся во многих промышленно развитых странах мира.

В этой связи, представленная работа носит системный характер. Использование анализа крови для индивидуальной диагностики известно уже несколько веков, но решение обратной задачи - переход от частного (индивидуального) к общему - практически никем не исследовалось. В представленной работе сделана попытка решения обратной задачи -превратить кровь в биосенсор, исследуя ответ одного из его показателей разными методами. Предложенное направление исследований закладывает фундаментальные и методологические основы нового направления фармации, которое коротко можно обозначить целенаправленная фармация.

Дальнейшие исследования в этом направлении могут позволить совершить качественный рывок в различных областях знаний. Например, использование данной методологии при анализе белково-углеродных вытяжек из продуктов питания уже служит основой для разработки индивидуальной диеты, приводящей к восстановлению неспецифического иммунитета и как следствие нормализации веса в медицине. С другой стороны, изменяя критерий отбора можно решать другую задачу, добиваться повышения привеса на единицу корма в промышленном животноводстве.

Использование данного подхода для исследования препаратов с одним действующим началом из аптечной сети демонстрирует возможность применения* данной методологии для создания в будущем быстрого, практически безапаратурного способа контроля биоэквивалентности препаратов и как следствие выявления подделок. С другой немного изменив методические подходы и исследуя воздействие однотипных фармацевтических препаратов на кровь одного пациента, можно разработать методологию о индивидуального подбора лекарственных препаратов, по критерию минимальной индивидуальной токсичности.

Однако наиболее интересным и востребованным в ближайшем будущем, с точки зрения автора, будет применение обоснованной в работе методологии для разработки новых фармацевтических препаратов. Используя характеристики известного препарата как реперную точку и проводя его химическую модификацию используя предложенную методологию удается резко сократить временные и финансовые затраты на скрининг биологической активности нового вещества экспериментально предсказывая степень его общей токсичности и в ряде случаев специфическую активности вещества. Именно поэтому представленная рукопись полностью соответствует критериям специальностей 15.00.01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела и 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия и автор смеет надеяться, что она окажется полезным при дальнейшем развитии фармацевтической химии и фармацевтической технологии и других смежных областей науки.

253