Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Разработка и изучение биологической активности фармацевтической композиции на основе соли цинка (II) и глицина

На правах рукописи

(

Балышев Александр Владимирович

Разработка и изучение биологической активности фармацевтической композиции на основе соли цинка (II) и глицина

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2005

Работа выполнена на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета Российского университета дружбы народов

Научный руководитель: доктор биологических наук

А.В. Сыроешкин

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

А.С.Берлянд С Ж Цыбанов

Ведущая организация:

Государственное учреждение "Научно-исследовательский центр токсикологии и гигиенической регламентации биопрепаратов"

совета Д 212.203.13 при Российском университете дружбы народов по адресу. 117198, Москва, ул. Миклухо-Маклая, д $

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу'

117198, Москва, ул Миклухо-Маклая, д.б Автореферат разослан « 2005 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Защита диссертации состоится «20» _ 2005 г в ^ час. на заседании диссертационного

доктор фармацевтических наук, доцент

Г П Лагуткина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы в развитых странах мира, в том числе и в России активно развивается медицинская микроэлеменгология (Сусликов В Л, 2000; Oberrleas D., 2002; Скальный А.В, 2003) Коррекция микроэлементного статуса позволяет существенно улучшать состояние больных при разнообразных заболеваниях с трудом поддающихся химиотерапии, что связано с особенностью метаболизма микроэлементов, а именно постоянством микроэлементных профилей здорового организма (Cook A. et al, 2005; Bnindtland G H , 2000)

Одним из наиболее значимых микроэлементов, используемых для коррекции микроэлементного статуса является цинк. С одной стороны, сульфат цинка практически не токсичен, с другой стороны, хорошо известно применение солей цинка в качестве антагонистов к меди, хрому, кадмию. Важность коррекции микроэлементного статуса с участием цинка обусловлена распространением цинк-дефицитных состояний, а также его влиянием на предотвращение иммунодефицитов и стимуляцию синтеза антител при инфекционных болезнях (Авцын А.П, 1991; Hadden J.W, 199S; Rahman М. et al, 2005).

Оценка нарушения микроэлементного гомеостаза при различных заболеваниях и его коррекция микроэлементами - позволяет говорить о новом подходе к лечению, и это особенно важно там, где аллопатическая медицина, использующая препараты органической природы, недостаточно эффективна Одним из таких заболеваний является туберкулез, от которого ежегодно в мире умирает около 3 млн человек, несмотря на колоссальные средства направляемые на профилактику и лечение данного заболевания (WHO, 2004) Это в первую очередь связано с возникновением мультирезистентных штаммов микобактерий, а также с возможностью формирования полицеллюлярных, ультрамелких и L-форм Mycobacteria tuberculosis, обладающих повышенной устойчивостью к антибактериальной терапии и действию факторов клеточного иммунитета.

Нашей группой было показано, что внесение в среду культивирования М tuberculosis ионов цинка влияет на процессы их формообразования - отмечается увеличение количества одиночных форм возбудителя за счет снижения полицеллюлярных и практически полного исчезновение ультрамелких форм (Матвеева И С и др, 2003, Сыроешкин A.B. и др, 2002) Так же обнаружено, что среди координационных соединений металлов (кобальта, никеля, меди и цинка), обладающих бактериостатической активностью в отношении М tuberculosis, наиболее эффективными являются препараты, содержащие цинк (Круду В. Н., 2000) На существенное усиление стандартной антнмикобактериальной терапии при добавлении хелатов цинка указывают и работы Карьяди (Karjadi Е. et al, 2002) Биологическая активность комбинированных препаратов часто проявляется неаддитивно, что свидетельствует об особой важности тщательного подхода к выбору хелатирующего агента. С учетом возможности коррекции микроэлементного метаболизма при использовании соединений цинка, эффективного влияния на процессы формообразования микобактерий туберкулеза с целью увеличения их доступности для воздействия факторов клеточного иммунитета (с их одновременной стимуляцией) и антибактериальной терапии нам представлялось весьма актуальным разработать и изучить действие цинк-содержащей фармацевтической композиции

РОС. НлМн^Н^ЛННАЯ

Цель работы. Создание новой высокоэффективной, нетоксичной 7п2+-содержашей фармацевтической композиции, предотвращающей образование нефагоцитируемых колониальных и ультрамелких форм микобактерий туберкулеза и стимулирующей активность факторов клеточного иммунитета Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи

1 Разработать состав фармацевтической композиции (ФК) на основе водных растворов Zn2' и хелатирующего агента.

2 Изучить биологическую активность ФК и ее компонентов с помощью клеточного биосенсора по данным аррениусовских параметров кинетики гибели.

3 Определить действие ФК на некоторые факторы клеточного иммунитета в опытах на лабораторных животных.

4 Исследовать наличие лечебно-профилактической активности разрабатываемой ФК при инфицировании лабораторных животных микобактериями туберкулеза

5 Разработать методику пробоподготовки органов и тканей животных для последующего микроэлементного анализа методом атомно-абсорбционной спектрометрии с зеемановской коррекцией фона

6. Определить микроэлементные профили органов и тканей у здоровых, инфицированных М tuberculosis животных и животных, прошедших курс лечения разработанной ФК

7. Разработать на примере изучаемой ФК лазерный экспресс-метод стандартизации и контроля качества жидких лекарственных средств (JIC).

Научная новизна.

Теоретически обосновано конструирование фармацевтической композиции, включающей сульфат цинка и глицин, а также воду с измененным изотопным составом. Экспериментально подтверждено ее лечебно-профилактическое действие при инфицировании лабораторных животных микобактериями туберкулеза. Изучена биологическая активность разработанной фармацевтической композиции с помощью клеточного биосенсора по данным аррениусовских параметров кинетики гибели Выявлено, что примеиение ФК вызывает триггерное усиление неспецифической резистентности клеточного биосенсора, тогда как индивидуальное действие компонентов подчиняется стандартной аррениусовской зависимости Показана трехкратная активация естественных киллеров при применении данной ФК Разработана новая методика пробоподготовки органов и тканей животных с применением жидкого азота для последующего микроэлементного анализа с использованием зеемановской атомно-адсорбционной спектрометрии

Впервые проанализирована взаимосвязь полученных данных по изменению микроэлементного состава (Al, Cr, Mn, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb, Se, Fe) органов и тканей животных с наличием возбудителя туберкулеза.

Получены микроэлементные профили, характеризующие ткани и органы животных в здоровом и инфицированном состоянии

Подана патентная заявка на разработанную ФК, как средство для профилактики и дополнительной химиотерапии туберкулеза (патентная заявка № 2004135345/15(038452) от 03 12 2004 Положительное решение ФИПС от 26.01 05 )

Практическая значимость работы:

Полученные в ходе проведенной исследовательской работы результаты могут быть использованы при разработке новых схем профилактики и лечения туберкулеза, поскольку разработанная композиции влияет на процессы межпопуляционных переходов и формообразования микобактерий туберкулеза, способствуя увеличению их доступности к действию иммунной системы (с одновременной ее стимуляцией) и стандартной химиотерапии.

Установленные изменения микроэлементных профилей органов и тканей инфицированных животных (печень, кровь, легкие), в комплексе с другими показателями могут быть использованы при диагностических исследованиях на туберкулез

Разработан экспресс-метод стандартизации и контроля качества растворов ЛС по определению размерных спектров супранадмолекулярных (СНМ) комплексов воды на основе лазерной дифракции.

Методика стандартизации растворов ЛС внедрена в учебный процесс (специальность фармацевтическая химия) кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН.

Основные положения, выносимые на защиту:

1 Разработанная фармацевтическая композиция на основе сульфата цинка, глицина и воды с измененным изотопным составом демонстрирует выраженный триггерный эффект на клеточном биосенсоре, свидетельствующий о неспецифической активации защитных свойств эукариотической клетки, за счет синергитического действия компонентов

2 Микроэлементные профили в органах и тканях лабораторных мышей инфицированных микобактериями туберкулеза могут служить маркером заболевания животных

3 Разработанная фармацевтическая композиция стимулирует активность естественных киллеров, являющихся одним из факторов клеточного иммунитета и снижает вероятность инфицирования лабораторных животных микобактериями туберкулеза.

4. Разработанный лазерный экспресс-метод анализа растворов путем определения размерных спектров СНМ комплексов воды может быть использован для стандартизации и контроля качества растворов лекарственных средств.

Апробация работы: Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях. Итоговая конференция СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2003), XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2004), 1 Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биоэлементы» (Оренбург, 2004), V международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), 1-ый съезд РОСМЭМ «Актуальные вопросы медицинской элементологии» (Москва, 2004), XI Международная конференция «Новые медицинские технологии и квантовая медицина» (Москва, 200$) Публикации: по теме диссертации опубликовано 12 печатных работ

Структура н объем диссертации Диссертационная работа изложена на ^страницах н состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, методы исследования, результаты исследований,

обсуждение результатов, заключение, выводы, библиографический список источников, из них £f»a русском и Y/^на иностранных языках) и приложения. Работа содержит таблиц,^// рисунков

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы ■ методы исследования В процессе разработки и исследований ФК использованы лекарственные вещества, разрешенные к медицинскому применению и отвечающие требованиям действующей нормативной документации глицин (ВФС 42-599-92, НД 42-11253-00), сульфат цинка (ФС 738). При приготовлении растворов ФК использовали бидистилированную воду, а также воду с измененным соотношением преггий/дейтерий.

Исследования биологической активности ФК проводили на клеточном биосенсоре с использованием свободноживущей инфузории Spirostumum ambigua, позволяющем получать диаграммы «Доза-Ответ» («Концентрация-Время жизни») и зависимости времени жизни от температуры (Быканова С.Н.идр., 2003)

Определение активности естественных киллеров (ЕК). ЕК являются фактором клеточного иммунитета и опосредуют один из основных цитотоксических эффекторных механизмов, направленных на элиминирование антигенно измененных клеток Активность ЕК изучали на кроликах породы Шиншилла массой 3,0 - 3,5 кг (25 голов), согласно стандартной методике (Рыкова М.П и др, 1981)

Штамм «Academia» Mycobacteria tuberculosa был получен из НИИ фтизиопульмонологии (г. Москва) Клетки М. tuberculosis выращивали в 200 мл среды Сатона с добавлением бычьего сывороточного альбумина, глюкозы и NaCl в присутствии 0,05% Tween-80 с перемешиванием (150-200 об ./мин.) (Шлеева М.О. и др., 2003)

Для изучения влияния исследуемой композиции на развитие микобактерий туберкулеза in vivo использовали лабораторных животных: а) белых мышей стадного разведения обоего пола массой 1924 г (60 голов); б) морских свинок обоего пола массой 240-270 г (20 голов) Животных инфицировали внутрибрюшинно инъекцией (по 0,05 мл) культуры М tuberculosis, которую отбирали в конце логарифмической фазы роста при концентрации клеток 10' клУмл

Выявление и идентификацию М. tuberculosis в тканях животных проводили методом гнездовой полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием внутренних и внешних праймеров производства НПО НАРВАК, Москва (ТУ 9388-040-00008064-99)

Содержание микроэлементов в образцах определяли на атомно-адсорбционном спектрометре «SpectrAA-800» с электротермической атомизацией и эффектом Зеемана по протоколу фирмы "Varían" с модификациями по результатам международной интеркалибрации с лабораторией MEL МАГАТЭ (Монако). Источником излучения служили одноэлементные лампы полого катода SpectrAA фирмы "Vanan" (Матвеева И С. и др. 2003).

Пробоподготовка образцов для определения микроэлементного анализа. Сразу после умерщвления животных отбирали органы и ткань и замораживали в жидком азоте Затем их измельчали в тефлоновом гомогенизаторе с добавлением жидкого азота, готовили навеску 0,5-1 г и инкубировали в 5 мл царской водки в течении 1 суток в тефлоновых бомбах Минерализацию образцов проводили под давлением в микроволновой печи MDS2000 при следующем режиме' 2 мин 20 сек - при 80% мощности, 5 мин - при ! 00% мощности

Размерные спектры супранадмолекулярных комплексов годных растворов лекарственных средств определяли с помощью лазерного малоуглового измерителя дисперсности (particle sizer) Malvern 3600 Ее с маломощным гелий-неоновым лазером, излучающим монохроматический пучок света (lmx=633 им), проходящий через экспериментальную ячейку с последующей фокусировкой дифракционной картины на мультиэлементном фотоэлектрическом детекторе Расчет размерных спектров производился на основе встроенного программного обеспечения фирмы "Malvern" по результатам обработки пяти тысяч мгновенных дифракционных изображений.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 1. Обоснование выбора соли Zb (II) н хелатирующего агента (глицин) в качестве основных компонентов фармацевтической композиции.

Явление изменчивости микобактерий туберкулеза было обнаружено вскоре после их открытия Уже в 1888 г. Мечников сообщил, что в культурах, кроме типичных палочек Коха, встречаются полиморфные формы микроорганизмов в виде коротких, соединенных попарно звеньев и гигантских образований с колбовидными разветвлениями. Затем появились сообщения о возможности существовании у микобактерий туберкулеза фильтрующихся форм (Fontes J , 1910) Было установлено, что ультрамелки формы и L-формы обладают повышенной устойчивостью к химиотерапии и могут реверсировать палочковидные формы (Земская ЗС и др., 1984, Дорожкова И.Р. и др., 1995) Образован»-полицеллюлярных, колониальных форм для многих микроорганизмов является общей адаптивно' реакцией на неблагоприятные внешние воздействия, включая и химиотерапию (Бухарин О.В., 1999) Межсубпопуляционными видоизменениями М tuberculosis некоторые авторы объясняют неэффективность, как иммунитета, так и лекарственной терапии при этом заболевании (Сыроешкин А В и др., 2002;

В нашей группе было показано, что при культивировании М tuberculosis полицеллюлярным колониальным формам принадлежит на определенных стадиях развития до 90% биомассы клеток. Внесение в среду культивирования Zn2* приводило к изменению массовых соотношений субпопуляций в полиморфной культуре М tuberculosis и перераспределению биомассы в сторону образования одиночных палочковидных форм Кроме десятикратного снижения количества колониальных, полицеллюлярных форм, также происходило практически полное исчезновение ультрамелких форм (Матвеева И.О. и др. 2002).

Изменения соотношений форм микобактерий туберкулеза сопряжены с изменениями

концентрации металлов, в частности цинка, в клеточной биомассе Межсубпопуляционные переходы

можно схематично описать как квазихимическую реакцию (схема 1).

Схема 1. Изменение субпопуляционного состава культуры микобактерий туберкулеза при внесении в среду культивирования комплекса, включающего сульфат цинка и глицин до концентраций I мМ и 20 мМ. V -ультрамелкие формы (<0,5 мкм), С -одиночные формы (4-8 мкм), PC -полицеллюлярные формы (80 мкм).

В соответствии со вторым законом термодинамики и следующим из него принципом Ле-Шателье возможно осуществлять влияние на процессы формообразования, сдвигая "равновесие" в сторону образования "С-форм". Так, внесение в среду инкубации Zn;* будет влиять на межсубпопуляционные переходы М. tuberculosis в сторону смещения к одиночным палочковидным формам, более доступным для фагоцитоза и лекарственной терапии Это указывает на перспективность применения сульфата цинка для профилактики и повышения эффективности антибактериальной химиотерапии туберкулеза Именно соль цинка (II) (а не иных металлов способствующих указанному смещению равновесия согласно схеме 1) выбрана потому, что сульфат цинка практически не токсичен (Авцын А.П 1991, Сусликов В Л., 2000) На основе схемы 1 в соответствии с кинетической теорией межпопуляционных клеточных переходов (Сыроешкии A.B. и др., 2001, 2002) нами проведено моделирование изменения численности палочковидных форм микобактерий после инфицирования при различных концентрациях цинка При значениях кинетических констант межсубпопуляционных переходов полученных в результате работы нашей группы (Березинская T.J1. и др., 2004) возможно значительное снижение концентрации возбудителя на тридцатый день после инфицирования при трехкратном увеличении поступления цинка в организм.

Известно, что чаще всего в группу риска по туберкулезу попадают люди получающие недостаточное питание (Хоменко А Г., 1996), а следовательно испытывающие как дефицит витаминов, так и микроэлементов, в частности цинка (Dai С., 1998). Роль цинка в настоящее время достаточно хорошо изучена. Цинк входит в структуру активного центра нескольких сотен металлоферментов (Авцын А.П. и др. 1991). Цинк жизненно важен для функционирования тимуса и нормального состояния иммунной системы организма, препятствует возникновению иммунодефицнгов, стимулирует синтез антител (van Heugten Е. et al, 2003; Ferencík M, 2004). Вместе с тем, хорошо известно, что при непосредственном введении соли цинка в организм большая часть ее выводится (Сусликов В.Л., 2000). В настоящей работе для улучшения биодоступности сульфата цинка в качестве лиганда был выбран глицин. Глицин применяется в медицине как антистрессовое, ноотропное, нормализующее обменные процессы средство, а также в качестве хелатирующего агента в ряде лекарственных препаратов (Марри Р., Мейес П., 1993; Комисарова И.А. и др., 2003, РЛС, 2004). Он является метаболитом широкого спектра действия, естественным тормозным медиатором и участвует в синтезе глутатиона, который модулирует работу иммунной системы (Солдатенков А.Т и др., 2001). В водном растворе цинк вступает с глицином в реакции комплексообразования, среди которых наиболее значимо образование цинк-глицинового комплекса в стехиометрии 1.1. Исследования индивидуального и комбинированного действия сульфата цинка и глицина в нашей группе (Быканова С.Н и др, 2003, Балышев А.В и др, 2004) с помощью клеточного биосенсора показали, что оптимальные концентрации сульфата цинка и глицина в водном растворе составляют I мМ и 20 мМ соответственно При таком соотношении концентраций добавленных веществ в водном растворе присутствуют комплекс Zn Gly, свободный Zn?+ , свободный глицин в равновесных концентрациях 999,8 мкМ, 0,2 мкМ и 19 мМ соответственно Такое соотношение равновесных форм приводит к развитию сильнейшей неаддитивной активации неспецифической резистентности эукариотической клетки.

/./. Неаддитивные эффекты при комбинированном действии сульфата цинка и глицина на клеточный биосенсор

В практике исследования токсичности лекарственных средств широко применяются диаграммы «Доза-Ответ» (Плетенева Т.В, 1993). Для изучения исследуемой композиции использовали клеточный биосенсор Spirostomum ambigua, который применяется и для изучения биологической активности компонентов лекарственных препаратов, демонстрируя высокую корреляцию результатов биотестирования с клинической практикой (Быканова С Н. и др., 2003). Кинетическая схема взаимодействия лиганд-индуцируемой гибели S ambigua имеет следующий вид (схема 2):

Схема 2. Кинетическое взаимодействия клеточного биосенсора с низкомолекулярными яигандами. С - клетка. CL - клетка после связывания с лигандом; L - лиганд произвольной структуры; /„ - частот клеточного перехода C-L.—DC; К, - константа равновесия связывания лиганда; С - мертвая клетка. /, ¡Ai, где r¡-время жизни клетки.

На рис. 1 приведены результаты, свидетельствующие о возникновении сильное

антагонистического эффекта при комбинированном действии глицина и ионов цинка. Начальный участок (вставка на правом графике (рис. !)) подчиняется аррениусовской зависимости и может бьггь описан по схеме 2, где в качестве L выступает координационный комплекс Zn2* с глицином После достижения значений температуры в 29 °С начинается триггерное усиление выживаемости S ambigua, проявляющееся в многократном увеличении продолжительности жизни клеток Эти данные косвенно указывают на то, что применение комбинированного препарата глицина и солей цинка (помимо уже известного фармакологического действия каждой из субстанций) провоцирует появление неаддидитных эффектов, что указывает на возможность дополнительного усиления неспецифической резистентности и адаптационных свойств клеток человека

«I w J3 I _ ,

t, С НХКУТ к

Рис.1. Температурная зависимость кинетики комбинированного действия глицина (20 мМ) и

сульфата цинка (I мМ) на S. ambigua. На правом графике - линеаризация начального участка зависимости.

Известно, что вода и органические соединения с измененным соотношением протий/дейтерий широко применяются в настоящее время в фармации. D;0 используется в терапии раковых опухолей, в высоких концентрациях предотвращает солевую и этанольную гипергензию, снижает мутагенность лекарственных препаратов, усиливает действие антибиотических реагентов и инсектицидов (Kushner DJ. et at, 1999) Вода, обедненная по содержанию дейтерия («легкая» вода, deuterium depleted water), также проявляет целую гамму лечебных эффектов от противораковых до иммуномодулирующих Для млекопитающих и человека D20 малотоксична, и оказывает заметное действие лишь при концентрации более 20% от всей воды в организме (Foerstel Н, 1980) Однако, до сих пор окончательно не выяснено играет ли дейтерий эссенциалькую роль в функционировании живого организма (клетки) или является лишь примесным элементом (Somlyai G etal, 1993).

При определении роли дейтерия в жизнедеятельности эукариотической клетки нами было установлено, что зависимость времени жизни клеточного биосенсора от содержания дейтерия в воде (в интервалах от 0 до 99%) имеет колоколообразную форму с явно выраженными зонами угнетения жизнедеятельности как при избытке, так и при недостатке последнего (рис 2) Полученные результаты свидетельствуют о необходимости дейтерия для обеспечения нормального функционирования клетки Кроме того, было показано, что с помощью изменения соотношения H/D, возможно управление субпопуляционным составом полиморфной бактериальной культуры (Сыроешкин А.В и др., 2002).

D, ррт

Рис. 2. Диаграмма «Концентрация D в воде» - «Время жизни S. ambigua». 100% соответствует 55 ±5 минутам (28 'С).

Внесение в исследуемую композицию 1% D20 смещало триггерный эффект при комбинированном действии Zn!*H глицина в область более низких температур с 33 "С до 28 "С (рис 3)

i Рис.3. Температурная зависимость кинетики комбинированного действия ¿лицина(20 мМ),

сульфата цинка (I мМ) и Dfi (!%) на S. ambigua. На правом графике - линеаризация начального i' участка зависимости.

В табл 1 приведены значения энергий активации (Еа) индивидуальных веществ и фармацевтической композиции ('Еа и 3Еа - для участков температурной зависимости до и после максимума, соответственно), в том числе при внесении в композицию 1% DiO Данные энерги активации получены при линеаризации двух ветвей каждой кривой (рис 1, 3) Значения Еа неаддитивш что является свидетельством действия смеси свободного Zn2*, свободного Gly и комплекса Zn3+ Gly, a i< каждого отдельного компонента Из полученных данных (табл 1) видно, что при добавлении 1% D¡< снижается энергетический барьер (уменьшается Е,) второй стадии кинетической схемы Таким образов сумма представленных результатов указывает на увеличение неспецифической резистентности эукариотической клетки и открывает перспективу изменения соотношения D/H для усиления действия соли Zn (II) с глицином.

Табл. 1 Значения энергии активации кинетики клеточных переходов S. ambigua

ВЕЩЕСТВО НАЗВАНИЕ ЭНЕРГИЯ АКТИВАЦИИ КЛЕТОЧНЫХ ПЕРЕХОДОВ Ел, кДж/моль

'Е. Еа

индивидуальные вещества* (Бмканова С Н и др, 2003) сульфат цинка 225±5 Стадия отсутствует

глицин 110±5 Стадия отсутствует

комбинация веществ сульфат цинка с глицином 95±4 270±6

сульфат цинка с глицином и 1% 020 150±5 250±5

'Концентрации сульфат цинка - I мМ, глицин -20 мМ

Мы предположили, что усиление неспецифической резистентности эукариотической клетки при применении комбинированного препарата (гпБО) + С1у) усилит резистентность и адаптационные свойства одной из разновидностей лимфоцитов - естественных киллеров, опосредующих один из

основных цитотоксических эффекторных механизмов, направленных на элиминирование антигенно измененных клеток

1.2. Влияние исследуемой ФКна активацию естественных киллеров.

Естественные киллеры являются одним из главных клеточных компонентов участвующем в защитных реакциях организма против М tuberculosis особенно на ранних этапах туберкулезной инфекции (Бпум Б , 2002; Chackerian А е* al, 2002; Gansert J et al, 2003) В ответ на действие иотерлейкина 12 (ИЛ-12), продуцируемого рядом иммунных клеток, ЕК вырабатывают у - интерферон, что позволяет быстро активировать антимикобактериальную активность макрофагов, еще до экспансии и дифференциации специфических Т-лимфоцигов (Sugavara I et al, 2002, Dieli F et al, 2003) Особенно важно то, что лишь активированные макрофаги обладают способностью убивать поглощенные ими М tuberculosis, тогда как в неактивированных макрофагах микобактерии быстро размножаются. Цитоплазма этих макрофагов представляет собой благоприятную "среду" для подобного размножения микобактерий (Блум Б , 2002, Leemans J С et al, 2005) Таким образом, неактивированные макрофаги являются своеобразным "депо" для развития и распространения инфекции (Dannenberg Т , 1994)

Для изучения действия фармацевтической композиции на иммунную систему, в частности активность естественных киллеров, был поставлен следующий эксперимент на кроликах породы Шиншилла Опытные группы кроликов получали по 150 мл в течение пяти суток ФК или один из ее компонентов- ZnSO«, глицин или D2O перорально Контрольная группа животных не получала препаратов Через 5 суток у опытных и контрольных кроликов отбирали пробы крови по 20 мл и определяли активность ЕК. Результаты экспериментов показали, что прием изучаемой композиции приводит к трехкратному увеличению активности ЕК, в то время как употребление только раствора сульфата цинка приводило к увеличению активности ЕК в два, а глицина - в полтора раза, D20 -фактически не оказывал активирующего влияния (Рис 4)

Рис 4. Влияние фармацевтической композиции и отдельных компонентов на активность

естественных киллеров у кроликов (п - 25).

"Концентрации- сульфат цинка -1 мМ, глицин -20 мМ. П20 - 1 %

Таким образом, фармацевтическая композиция обладает более эффективным иммуностимулирующим действием, чем каждый из компонентов в отдельности

контрольная 7л группа

Gly D,0 ФК

2. Изучение лечебно-профилактического действия ФК пря инфицировании Mycobacterium tuberculosis в модельных экспериментах с лабораторными животными.

Поскольку, применение комплекса сульфата цинка с глицином вызывает усиление неспецифической резистентности зукариотической клетки, увеличивает активность естественных киллеров, и обладает выраженным влиянием на формообразование при развитии культуры микобактерий туберкулеза, предотвращая образование ультрамелких и колониальных форм, нами было сделано предположение о возможном лечебно-профилактическом действии данной ФК

Лечебно-профилактическое действие ФК изучали на 60 белых мышах С этой целью их разделили на четыре группы Первая (20 голов) - была заражена М tuberculosis Вторая (20 голов) - была заражена М tuberculosis и получала ФК в количестве 1 мл в сутки Третья (10 голов) - получала ФК. Четвертая группа (10 голов) - контрольная Для заражения (инъекция по 0,05 мл культуры внутрибрюшинно) использовали бактериальную культуру в конце логарифмической фазы роста при концентрации клеток 10* кл./мл После декапигации мышей (на 30 день с момента заражения) для дальнейших исследований (микроэлементный состав, наличие возбудителя) у них отбирали кровь, печень и легкие

Данные, представленные в таблице 2, свидетельствуют о том, что ФК обладает лечебно-профилактическими свойствами, препятствуя развитию микобактерий туберкулеза при инфицирование животных Так в крови и легких инфицированных мышей возбудитель М tuberculosis определял) соответственно у 60% и 10% животных. У мышей, получавших заявляемую композицию, М tuberculosis i крови и органах не обнаружили

Табл. 2. Наличие М. tuberculosis в органах и тканях инфицированных мышей (п = 60) по данным ПЦР.

Группы мышей Исследуемые материалы

КРОВЬ ЛЕГКИЕ ПЕЧЕНЬ

Опытная, получавшая препарат 0 0 0

Контрольная, не получавшая препарат 60% 10% 0

3. Изменения содержания микроэлементов в органах и тканях инфицированных животных

Известно, что риску заболевания туберкулезом наиболее часто подвержены лица страдающие дефицитом макро-, микроэлементов и витаминов (Хоменко А Г, 1996, Dai G , 1998; Karjadi Е el al, 2002). Перед нами была поставлена задача исследовать изменения микроэлементного состава в органах и тканях инфицированных белых мышей как возможного дополнительного маркера заболевания Органы и ткани для элементного анализа были выбраны по различной их тропности к возбудителю туберкулеза

При изучении микроэлементного состава (Al, Cr, Mn, Ni, Си, Zn, Cd, Pb, Se, Fe) в органах и тканях мышей было установлено, что у инфицированных животных после заражения происходят существенные изменения микроэлементных профилей (рис 5)

Щ---ш

в

в

е- -а

.V

0 1 м.

15

щ—щ

9

•V

в—@

Рис. 5. Микроэлементные профили крови мышей. А - контрольная группа, В -инфицированная, С - инфицированная плюс ФК

Причем содержание марганца в крови и легких падает (рис. 6, 7) до значений ниже предела обнаружения (0,005 мкг/г).

На рисунках 6, 7, 8 показаны только те микроэлементы, концентрация которых изменилась при инфицировании.

0,6

§ 0,4

г

од

-¡; 3

ё 2

и2 1

о

400 300 200 100 о

К К+ФК И И+ФК

К К+ФК И И+ФК

|Си| ».09 0,06 0,03 0,00

К К+ФК И И+ФК

К К+ФК И И+ФК

Рис.6. Содержание микроэлачентов в легких мышей на 1 г нашивной ткани (н=60, р=0,9Х)

К К+ФК И И+ФК

к К+ФК И И+ФК

Рис. 7. Содержание микроэлементов в крови мышей па 1 г нашивной ткани (п-60, р=0,95)

К 6 £

45

30

15

К К+ФК И И+ФК

К К+ФК И И+ФК

К К+ФК И И+ФК

Рис.8. Содержание микроэлементов в печени мышей на I г нашивной ткани (п*60, р=0,95)

13

Кроме марганца в крови животных наиболее выражены изменения по следующим микроэлементам- Fe, Al, Сг (их содержание снизилось в два, четыре и в два с половиной раза соответственно), Си (содержание увеличилось в два раза). Se у инфицированных животных остается без изменений, однако, следует отметить трехкратный рост этого микроэлемента после приема ФК инфицированными мышами В печени возросло содержание Cu, Zn (в два раза), Al (в три раза). В легких увеличилось содержание Си (в три раза), а снизилось содержание Fe, Cd (в три и два раза) Прием препарата практически не влияет на микроэлементный состав в органах и тканях здоровых животных, тогда как у инфицированных не леченых животных происходят более существенные изменения, а именно, концентрация Мп в крови и легких резко упала (ниже предела обнаружения, рис. 6, 7)

Таким образом, прием ФК позволяет предотвратить как изменения микроэлементного состава, так и развитие М. tuberculosis

Полученные данные по биологической активности исследуемого комплекса (активация неспецифической резистентности клеточного биосенсора, увеличение активности лимфоцитов (естественных киллеров), влияние на формообразование в культуре микобактерий туберкулеза, профилактическое действие при инфицировании животных), позволяют сделать вывод о перспективности применения данного комплекса в медицинской практике В связи с этим возникает вопрос о возможном методе стандартизации и контроля качества данного препарата.

4. Разработка нового экспресс-метода стандартизация жидких лекарственных средств на примере разрабатываемой фармацевтической композиции.

Все увеличивающееся количество лекарственных средств и их производителей на отечественном фармацевтическом рынке требует внедрения в фармацию новых методов стандартизации, контроля качества и определения их подлинности В настоящее время в фармации для этого довольно успешно применяются стандартные химические, физические, или физико-химические методы (ГФ XI, 1989) Основным их недостатком является невозможность проведения данных анализов в условиях обычной (непроизводственной) аптеки, наличие специального персонала, а также относительная длительность и трудоемкость анализов Для решения данной проблемы нами был предложен новый экспресс-медод определения подлинности и контроля качества на основе лазерной дифракции для растворов лекарственных средств

При работе с жидкими лекарственными формами, в частности с водными и водно-спиртовыми растворами нами было выдвинуто предположение об образовании водой фрактальных структур построенных из осциллирующих супранадмолекулярных комплексов воды, которые специфичны для различных видов растворов (Смирнов А Н и др, 2004) С целью подтверждения такой гипотезы была изучена картина амплитудно-фазовой модуляции лазерного излучения (Х=бЗЗ им), возникающая при прохождении лазерного луча через водную среду Были обнаружены супранадмолекулярные (СНМ) комплексы упорядоченной воды с размерами от 1 до 100 мкм и временами релаксации свыше 10 секунд, чередующимися с менее упорядоченными участками Применение лазерной интерферометрии позволило визуализировать динамику образования, осцилляции и движения СНМ комплексов Были получены размерные спектры 1-100 мкм СНМ комплексов при помощи лазерного малоуглового измерителя

дисперсности Эти данные позволили рассматривать водные и водноспиртовые растворы как своеобразные гетерогенные системы.

При изучении разработанной нами фармацевтической композиции было обнаружено, что как компоненты, так и сама фармацевтическая композиция имеют характерные размерные спектры СНМ комплексов с соответствующими максимумами распределения (рис. 9), что позволяет говорить о возможности применения метода анализа СНМ-комплексов для предварительной экспресс-диагностики растворов ЛС.

Метод исследования дисперсных систем на основе рассеяние лазерного света под малым углом (Low Angle Laser Light Scattering, LALLS) прост, быстр по исполнению, наиболее удобен по пробоподготовке, обработке и трактовке результатов в виде гистограмм численного и объемного распределений (размерных спектров) Наличие супранадмолекулярной структуры воды позволяет использовать это свойство для определения подлинности и контроля качества водных или водноспиртовых растворов лекарственных препаратов Настоящий способ относится к методам анализа жидких и растворимых веществ. Способ может быть использован для предварительного определения подлинности одно- и многокомпонентных растворов. Так для I мМ раствора сульфата цинка максимум размерных спектров СНМ - комплексов составлял 100 мкм, для раствора 1 мМ сульфатом цинка с 20 мМ глицином 5 мкм, а для фармацевтической композиции 100 и 30 мкм (рис 9)

размер, мкм

Рис.9. Размерные спектры СНМ комплексов, образуемые: А-1 мМ сульфатом цинка. В - I мМ сульфатом цинка и 20 мМ раствором глицина. С - I мМ сульфатам цинка, 20 мМ раствором глицина, I% Dfi

Основными его достоинствами для описания гомогенных систем является следующее' возможность установление взаимно однозначных соответствий «вид раствора - вид размерных спектров» на основе данных о размерных спектрах, удельной площади поверхности (m!/cmj) дисперсной фазы, и ее объемной концентрации. Для данного метода разработаны фирменные приборы, удобное математическое обеспечение Себестоимость анализа с помощью данного метода минимальна, так как обусловлена только стоимостью расходных материалов рутинно применяемых в любой лаборатории. Время анализа одной пробы и обработки результатов измерения - в пределах трех минут Лазерная дифракция - это единственный метод, не требующий калибровки Метод является недеструктивным (образец сохраняется после исследования)

Заключение

При изучении развития микобактерий туберкулеза установлено, что при росте культуры образуются как полицеллюлярные, так и ультрамелкие формы (Матвеева И.С и др, 2002), обладающие повышенной устойчивостью к иммунному ответу и химиотерапии. Была установлена возможность влияния на процессы формообразования культуры путем внесение в среду культивирования некоторых микроэлементов, в частности цинка (II), что приводило к перераспределению биомассы микобактерий в сторону одиночных форм При исследовании комбинированной биологической активности сульфата цинка с глицином было подобрано соотношение их концентраций, вызывающее триггерное усиление неспецифической резистентности клеточного биосенсора, и показано ее альтерирование при использовании воды с измененным изотопным составом Также было выявлено, что данная композиция дополнительно усиливает резистентность и адаптационные свойства одной из разновидности лимфоцитов - естественных киллеров, отвечающих за защитные реакции против М tuberculosis на ранних этапах туберкулезной инфекции.

Выраженное влияние на формообразование при развитии культуры микобактерий туберкулеза, а именно предотвращение образований ультрамелких и колониальных форм и иммуностимулирующие действие позволили предположить, что прием данной ФК будет препятствовать инфицированию микобактериями туберкулеза человека (животных) Лечебно-профилактическое действие ФК при инфицировании М tuberculosis было подтверждено на моделях с лабораторными животными

При исследовании микроэлементного составом (Al, Cr, Mn, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb, Se, Fe) в органах и тканях мышей было показано, что у инфицированных животных после заражения происходят существенные изменения микроэлементных профилей, что может быть использовано в комплексе с другими показателями при диагностических исследованиях на туберкулез.

Разработанный в процессе выполнения исследований способ анализа растворов ЛС (на примере изучаемой ФК) с определением размерных спектров СИМ комплексов может служить экспресс - методом их стандартизации и контроля качества

Выводы

1 Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена лечебно-профилактическая активность фармацевтической композиции на основе соли цинка (II) и глицина при инфицировании М tuberculosis

2 Пероральный прием разработанной фармацевтической композиции снижает вероятность развития микобактерий туберкулеза в организме животных при экспериментальном заражении в группе мышей принимавших фармацевтическую композицию не было выявлено случаев инфицирования, тогда как в контрольной группе выявлено заражение 60% животных

3. Инфицирование микобактериями туберкулеза приводит к выраженному изменению микроэлементных профилей (Al, Cr, Mn, Ni, Cu, Zn, Cd, Pb, Se, Fe), причем у инфицированных мышей в крови и легких концентрация Мп падает ниже предела обнаружения (>0,05 мкг)

4 Пероральный прием разработанной фармацевтической композиции предотвращает изменение микроэлементных профилей легких, крови и печени при экспериментальном заражении мышей микобактериями туберкулеза.

5 Применение фармацевтической композиции вызывает триггерное усиление неспецифической резистентности клеточного биосенсора Spirostomum ambigua к лиганд-индуцируемой гибели

6 Разработанная фармацевтическая композиция усиливает активность естественных киллеров, являющихся одним из решающих клеточных компонентов в защитных реакциях против М tuberculosis на ранних этапах инфицирования, в три раза

7 Разработана методика пробоподготовки органов и тканей животных с диспергированием замороженного материала в жидком азоте для последующего микроэлементного анализа

8. Разработанный способ анализа на основе лазерной дифракции растворов лекарственных средств путем определения размерных спектров супранадмолекулярных комплексов может служить экспресс - методом их стандартизации и контроля качества

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1 Балышев А В , Попов П.И. Разработка и применение нового метода стандартизации и контроля качеств жидких лекарственных препаратов гетерогенной природы на основе лазерной дифракции. //Итоговая конференция СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины». 21 -25 апреля 2003 г.. Тезисы докладов. - М . Издательство РУДН, 2003. - С 11-12

2 Смирнов А Н , Лапшин В Б , Балышев А.В , Лебедев И.М , Сыроешкин А.В Супранадмолекулярные комплексы воды // Электронный журнал "Исследовано в России", 38, С. 413-421, - 2004. http://ihurnal.apc.rii«m.ru/arlii.'les/2004/038.pclf

3 Смирнов А Н , Лапшин В Б , Балышев А В , Попов П И , Лебедев И.М , Сыроешкин А В Кооперативное анизотропное движение дисперсной фазы в водных растворах. // Электронный журнал "Исследовано в России", 39, С 422-426, - 2004. http://zhuinal.api'.rebrn.ru/at liclcs/2004/039.p«Jf

4 Балышев А В , Каприльянц А С , Березинская Т Л , Шлеева М О , Матвеева И С , Лебедев И М , Гаврилова М.М , Плетенева Т В , Сыроешкин А.В Новое лекарственное средство для предотвращения развития нефагоцитируемых колониальных форм Mycobacteria tuberculosis И XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» Тезисы докладов - 19-23 апреля 2004 -М,2004 - С. 421

5 Балышев А В , Плетенева Т.В , Гребенникова Т В., Каприльянц А С , Сыроешкин А.В К вопросу о разработке нового противотуберкулезного 7п2*-содержащего препарата // Вестник ОГУ Приложение «Биоэлементология» - 2004.- №4 - С 13-14

6 Сыроешкин А В Попов П И , Балышев А В , Карпов О В , Лесников Е В , Смирнов А Н , Лебедев И М , Плетенева Т В Определение подлинности и контроль качества ЛВ гетерогенной природы с помощью лазерного МИД //Хим фарм журнал -2004 -Т 38. № П -С 43-48

7 Балышев А В, Плетенева Т В, Гребенникова Т В, Сыроешкин А В Влияние исследуемой фармацевтической композиции на основе комплекса 7.п!* с глицином на выработку естественных

киллеров. // Материалы V международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" -21 -23 октября 2004 - Москва, Издательство РУДН, 2004. - С.36.

8 Балышев A.B., Гребенникова Т В., Сыроешкин А.В Обоснование противотуберкулезного действия нового ^'-содержащего препарата (микроэлементные профили, клеточный иммунитет, неспецифнческая резистентность) // Микроэлементы в медицине. - 2004. - T.S. №4. - С 6-8

9. Балышев A.B., Попов П И. Изучение размерных спектров лекарственных форм. // XI международная конференция "Новые медицинские технологии и квантовая медицина". 24-27 января 2005.: Сборник трудов конференции - М.- Ассоциация "Квантовая медицина",- 2005. - С. 221-222.

10. Балышев A.B., Тимаков А.А , Гаврилова М.М., Смирнов А Н , Матвеева И С, Лебедев И.М, Лапшин В.Б., Сыроешкин А В. Биологическая активность воды с измененным соотношением H/D: является ли дейтерий компонентом минерального питания? Вестник РУДН. Сер Фармация. - 2004. - №4 (28) - С 262-268.

11. Балышев А.В, Гребенникова Т.В, Плетенева Т.В, Коломин В.Ю., Сыроешкин A.B. Фармацевтическая композиция для профилактики и дополнительной химиотерапии туберкулеза Патентная заявка № 2004135345/15(038452) от 03 12 2004. Положительное решение ФИПС от 26.01 05.

12. Смирнов А.Н., Лапшин ВБ, Балышев А.В, Лебедев И.М., Гончарук ВВ., Сыроешкин AB Гигантские гетерофазные кластеры воды. // Химия и технология воды - 2005 - № 2 - С. 25-47

Балышев Александр Владимирович (Россия) Разработка я изучение биологической активности фармацевтической композиции на основе соли

цинка (II) н глнцнна

В работе приведены теоретические и экспериментальные подходы к конструированию фармацевтической композиции на основе соли цинка (II) и глицина Исследована биологическая активность цинк-глициновой композиции с помощью клеточного биосенсора по данным аррениусовских параметров кинетики гибели, ее влияние на иммунитет, микроэлементные профили тканей и органов Изучены изменения элементных профилей при экспериментальном туберкулезе На основе цинк-глициновой композиции обоснована возможность создания препарата, обладающего лечебно-профилактическими свойствами, что было подтверждено в моделях с лабораторными животными Предложен новый метод экспресс-диагностики жидких лекарственных средств на примере изучаемой композиции

Balyshev V. Alexander (Russia) Development and research of biological activity of pharmaceutical composition on the basis of the salt of the zinc (П) and glycine

In the thesis theoretical and experimental approaches are resulted in designing of the pharmaceutical composition on the basis of the salt of the zinc (II) and glycine Biological activity of the composition of zinc (II) and glycine is investigated by using of the cellular biosensor control based on the data of the kinetic parameters of the cellular transitions, so as the influence of the developed composition on the immunity and on the trace elements' profile of tissues and organs The changes of elements' profile are investigated on the experimental tuberculosis. The opportunity of the creation of the preparation possessing treatment-and-prophylactic properties on a basis of the composition of the zinc (II) and glycine is proved, such an activity is confirmed in models with laboratory animals So the new method of express diagnostics of liquid medical products is offered using the example of the developed composition.

Подписано в печать^, О У- ^Формат 60x84/16. Тираж 400 экз. Усл. леч. л. А. Заказ 33 $.

Типография Издательства РУДН 117923, ГСП-1, г. Москва, ул. Орджоникидзе, д. 3

РНБ Русский фонд

2005-4 46284

Актуальность темы.

В последние годы в развитых странах мира, в том числе и в России активно развивается медицинская микроэлементология [32, 39, 46]. Коррекция микроэлементного статуса позволяет существенно улучшать состояние больных при разнообразных заболеваниях с трудом поддающихся химиотерапии, что связано с особенностью метаболизма микроэлементов, а именно постоянством микроэлементных профилей здорового организма [2, 42, 139].

Одним из наиболее значимых микроэлементов, используемых для коррекции микроэлементного статуса является цинк. С одной стороны, сульфат цинка практически не токсичен, с другой стороны, хорошо известно применение солей цинка в качестве антагонистов к меди, хрому, кадмию. Важность коррекции микроэлементного статуса с участием цинка обусловлена распространением цинк-дефицитных состояний, а также его влиянием на предотвращение иммунодефицитов и стимуляцию синтеза антител при инфекционных болезнях [1, 28, 95, 139].

Оценка нарушения микроэлементного гомеостаза при различных заболеваниях и его коррекция микроэлементами - позволяет говорить о новом подходе к лечению, и это особенно важно там, где аллопатическая медицина, использующая препараты органической природы, недостаточно эффективна. Одним из таких заболеваний является туберкулез, от которого ежегодно в мире умирает около 3 млн. человек, несмотря на колоссальные средства направляемые на профилактику и лечение данного заболевания [138]. Это в первую очередь связано с возникновением мультирезистентных штаммов микобактерий, а также с возможностью формирования полицеллюлярных, ультрамелких и L-форм Mycobacteria tuberculosis, обладающих повышенной устойчивостью к антибактериальной терапии и действию факторов клеточного иммунитета.

Нашей группой было показано, что внесение в среду культивирования М. tuberculosis ионов цинка влияет на процессы их формообразования - отмечается увеличение количества одиночных форм возбудителя за счет снижения полицеллюлярных и практически полного исчезновение ультрамелких форм [30, 49]. Так же обнаружено, что среди координационных соединений металлов (кобальта, никеля, меди и цинка), обладающих бактериостатической активностью в отношении М. tuberculosis, наиболее эффективными являются препараты, содержащие цинк [26]. На существенное усиление стандартной антимикобактериальной терапии при добавлении хелатов цинка указывают и работы Карьяди [102-104]. Биологическая активность комбинированных препаратов часто проявляется неаддитивно, что свидетельствует об особой важности тщательного подхода к выбору хелатирующего агента. С учетом возможности коррекции микроэлементного метаболизма при использовании соединений цинка, эффективного влияния на процессы формообразования микобактерий туберкулеза с целью увеличения их доступности для воздействия факторов клеточного иммунитета (с их одновременной стимуляцией) и антибактериальной терапии нам представлялось весьма актуальным разработать и изучить действие цинк-содержащей фармацевтической композиции.

Цель работы.

Создание новой высокоэффективной, нетоксичной 2п2+-содержащей фармацевтической композиции, предотвращающей образование нефагоцитируемых колониальных и ультрамелких форм микобактерий туберкулеза и стимулирующей активность факторов клеточного иммунитета.

Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:

1. Разработать состав фармацевтической композиции (ФК) на основе водных растворов Zn2+ и хелатирующего агента.

2. Изучить биологическую активность ФК и ее компонентов с помощью клеточного биосенсора по данным аррениусовских параметров кинетики гибели.

3. Определить действие ФК на некоторые факторы клеточного иммунитета в опытах на лабораторных животных.

4. Исследовать наличие лечебно-профилактической активности разрабатываемой ФК при инфицировании лабораторных животных микобактериями туберкулеза.

5. Разработать методику пробоподготовки органов и тканей животных для последующего микроэлементного анализа методом атомно-абсорбционной спектрометрии с зеемановской коррекцией фона.

6. Определить микроэлементные профили органов и тканей у здоровых, инфицированных М. tuberculosis животных и животных, прошедших курс лечения разработанной ФК.

7. Разработать на примере изучаемой ФК лазерный экспресс-метод стандартизации и контроля качества жидких лекарственных средств (ЛС).

Научная новизна.

Теоретически обосновано конструирование фармацевтической композиции, включающей сульфат цинка и глицин, а также воду с измененным изотопным составом. Экспериментально подтверждено ее лечебно-профилактическое действие при инфицировании лабораторных животных микобактериями туберкулеза.

Изучена биологическая активность разработанной фармацевтической композиции с помощью клеточного биосенсора по данным аррениусовских параметров кинетики гибели. Выявлено, что применение ФК вызывает триггерное усиление неспецифической резистентности клеточного биосенсора, тогда как индивидуальное действие компонентов подчиняется стандартной аррениусовской зависимости.

Показана трехкратная активация естественных киллеров при применении данной

ФК.

Разработана новая методика пробоподготовки органов и тканей животных с применением жидкого азота для последующего микроэлементного анализа с использованием зеемановской атомно-адсорбционной спектрометрии.

Впервые проанализирована взаимосвязь полученных данных по изменению микроэлементного состава (Al, Cr, Mn, Ni, Си, Zn, Cd, Pb, Se, Fe) органов и тканей животных с наличием возбудителя туберкулеза.

Получены микроэлементные профили, характеризующие ткани и органы животных в здоровом и инфицированном состоянии.

Подана патентная заявка на разработанную ФК, как средство для профилактики и дополнительной химиотерапии туберкулеза (патентная заявка № 2004135345/15(038452) от 03.12 2004. Положительное решение ФИПС от 26.01.05.).

Практическая значимость работы:

Полученные в ходе проведенной исследовательской работы результаты могут быть использованы при разработке новых схем профилактики и лечения туберкулеза, поскольку разработанная композиция влияет на процессы межпопуляционных переходов и формообразования микобактерий туберкулеза, способствуя увеличению их доступности к действию иммунной системы (с одновременной ее стимуляцией) и стандартной химиотерапии.

Установленные изменения микроэлементных профилей органов и тканей инфицированных животных (печень, кровь, легкие), в комплексе с другими показателями могут быть использованы при диагностических исследованиях на туберкулез.

Разработан экспресс-метод стандартизации и контроля качества растворов ЛС по определению размерных спектров супранадмолекулярных (СНМ) комплексов воды на основе лазерной дифракции.

Методика стандартизации растворов ЛС внедрена в учебный процесс (специальность фармацевтическая химия) кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДЫ.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанная фармацевтическая композиция на основе сульфата цинка, глицина и воды с измененным изотопным составом демонстрирует выраженный триггерный эффект на клеточном биосенсоре, свидетельствующий о неспецифической активации защитных свойств эукариотической клетки, за счет синергитического действия компонентов.

2. Микроэлементные профили в органах и тканях лабораторных мышей инфицированных микобактериями туберкулеза могут служить маркером заболевания животных.

3. Разработанная фармацевтическая композиция стимулирует активность естественных киллеров, являющихся одним из факторов клеточного иммунитета и снижает вероятность инфицирования лабораторных животных микобактериями туберкулеза.

4. Разработанный лазерный экспресс-метод анализа растворов путем определения размерных спектров СНМ комплексов воды может быть использован для стандартизации и контроля качества растворов лекарственных средств.

Апробация работы:

Основные результаты диссертационной работы доложены и обсуждены на конференциях: Итоговая конференция СНО медицинского факультета РУДН «Клинические и теоретические аспекты современной медицины» (Москва, 2003), XI Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» (Москва, 2004), I Всероссийская научно-практическая конференция с международным участием «Биоэлементы» (Оренбург, 2004), V международная научно-практическая конференция «Здоровье и образование в XXI веке» (Москва, 2004), 1-ый съезд РОСМЭМ «Актуальные вопросы медицинской элементологии» (Москва, 2004), XI Международная конференция «Новые медицинские технологии и квантовая медицина» (Москва, 2005).

выводы

1. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена лечебно-профилактическая активность фармацевтической композиции на основе соли цинка (II) и глицина при инфицировании М. tuberculosis.

2. Пероральный прием разработанной фармацевтической композиции снижает вероятность развития микобактерий туберкулеза в организме животных при экспериментальном заражении: в группе мышей принимавших фармацевтическую композицию не было выявлено случаев инфицирования, тогда как в контрольной группе выявлено заражение 60% животных.

3. Инфицирование микобактериями туберкулеза приводит к выраженному изменению микроэлементных профилей (Al, Cr, Mn, Ni, Си, Zn, Cd, Pb, Se, Fe), причем у инфицированных мышей в крови и легких концентрация Мп падает ниже предела обнаружения (>0,05 мкг).

4. Пероральный прием разработанной фармацевтической композиции предотвращает изменение микроэлементных профилей легких, крови и печени при экспериментальном заражении мышей микобактериями туберкулеза.

5. Применение фармацевтической композиции вызывает триггерное усиление неспецифической резистентности клеточного биосенсора Spirostomum ambigua к лиганд-индуцируемой гибели.

6. Разработанная фармацевтическая композиция усиливает активность естественных киллеров, являющихся одним из решающих клеточных компонентов в защитных реакциях против М. tuberculosis на ранних этапах инфицирования, в три раза.

7. Разработана методика пробоподготовки органов и тканей животных с диспергированием замороженного материала в жидком азоте для последующего микроэлементного анализа.

8. Разработанный способ анализа на основе лазерной дифракции растворов лекарственных средств путем определения размерных спектров супранадмолекулярных комплексов может служить экспресс - методом их стандартизации и контроля качества.

Заключение

При изучении развития микобактерий туберкулеза установлено, что при росте культуры образуются как полицеллюлярные, так и ультрамелкие формы [30], обладающие повышенной устойчивостью к иммунному ответу и химиотерапии. Была установлена возможность влияния на процессы формообразования культуры путем внесение в среду культивирования некоторых микроэлементов, в частности цинка (И), что приводило к перераспределению биомассы микобактерий в сторону одиночных форм. При исследовании комбинированной биологической активности сульфата цинка с глицином было подобрано соотношение их концентраций, вызывающее триггерное усиление неспецифической резистентности клеточного биосенсора, и показано ее альтерирование при использовании воды с измененным изотопным составом. Также было выявлено, что данная композиция дополнительно усиливает резистентность и адаптационные свойства одной из разновидности лимфоцитов - естественных киллеров, отвечающих за защитные реакции против М. tuberculosis на ранних этапах туберкулезной инфекции.

Выраженное влияние на формообразование при развитии культуры микобактерий туберкулеза, а именно предотвращение образований ультрамелких и колониальных форм и иммуностимулирующие действие позволили предположить, что прием данной ФК будет препятствовать инфицированию микобактериями туберкулеза человека (животных). Лечебно-профилактическое действие ФК при инфицировании М. tuberculosis было подтверждено на моделях с лабораторными животными.

При исследовании микроэлементного составом (Al, Cr, Mn, Ni, Си, Zn, Cd, Pb, Se, Fe) в органах и тканях мышей было показано, что у инфицированных животных после заражения происходят существенные изменения микроэлементных профилей, что может быть использовано в комплексе с другими показателями при диагностических исследованиях на туберкулез.

Разработанный в процессе выполнения исследований способ анализа растворов JIC (на примере изучаемой ФК) с определением размерных спектров СНМ комплексов может служить экспресс - методом их стандартизации и контроля качества.