Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Количественное определение ингибиторов АПФ спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия вольтамперометрическим методом

На правах рукописи

□0305361Э

КОМАРОВА ЕВГЕНИЯ НИКОЛАЕВНА

1--"""

КОЛИЧЕСТВЕННОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИНГИБИТОРОВ АИФ СПИРАПРИЛА ГИДРОХЛОРИДА И ФОЗИНОПРИЛА НАТРИЯ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ

МЕТОДОМ

Специальность 15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пермь - 2007

003053619

Работа выполнена в ГУ НИИ кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук, г. Томск

Научный руководитель: кандидат фармацевтических наук,

Терентьева Светлана Владимировна

Научный консультант' доктор медицинских наук,

профессор Гарганеева Алла Анатольевна

Официальные оппоненты доктор фармацевтических наук,

профессор Хомов Юрий Александрович

Ведущая организация ГОУ ВПО «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 27 февраля 2007 года в 900 часов на заседании Диссертационного Совета Д208 068.01 при ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия по адресу: 614990, ГСП-277, г. Пермь, ул.Ленина, 48.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО «Пермской госудаственной фармацевтической академии» по адресу: 614070, г. Пермь, ул. Крупской, 46

Автореферат разослан «24» января 2007 года Ученый секретарь

доктор фармацевтических наук, профессор Кобелева Татьяна Юрьевна

диссертационного совета

Метелёва Е.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы для лечения хронической сердечной недостаточности в клиническую практику повсеместно внедряются новые группы лекарственных средств и, в первую очередь, ингибиторы ан-гиотензинпревращающего фермента (АПФ), считающиеся препаратами первой линии при лечении данной патологии. Особого внимания заслуживают их новые формы пролонгированного действия с двойным путем выведения, к которым относятся спираприла гидрохлорид и фозиноприла натрий Не будет преувеличением сказать, что при назначении любого лекарственного вещества, а особенно кардиопрепаратов перед врачом стоит самая важная задача -корректно подобрать терапевтическую дозу, которая является залогом не только успешной, но и безопасной терапии. Ни одно крупное научное исследование по установлению влияния лекарственных веществ на организм не обходится без рассмотрения их фармакокинетических характеристик, особенно на стадии доклинических и клинических испытаний Именно такие работы позволяют расширить показания к назначению лекарственных препаратов и помогают клиницистам создавать оптимальные алгоритмы их использования

Для определения лекарственных веществ в биологических средах требуется применения высокочувствительных, избирательных, экспрессных и недорогостоящих методов анализа, к которым относится вольтамперометриче-ский метод, нашедший широкое применение при изучении объектов окружающей среды, продуктов питания, лекарственных веществ.

Обзор литературных данных показал, что ингибиторы АПФ количественно определяют, главным образом, высокоэффективной жидкостной хроматографией и спектрофотометрией (В В.Писарев, 2005, F. Belal 2000) в то время как применение электрохимических методов, имеющих ряд преимуществ в анализе данных веществ, характеризуются малой изученностью

Цель и задачи. Целью диссертационной работы явилась разработка методик количественного определения ингибиторов АПФ спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия вольтамперометрическим методом и проведение на их основе фармакокинетических исследований с целью оптимизации тактики лечения пациентов с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточно стью.

Для достяжения поставленной цели требовалось решить следующие задачи

1. Подобрать оптимальные условия для количественного определения ингибиторов АПФ спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия и разработать на их основе вольтамперометрические методики в модельных растворах и биологических средах

2 Предложить схему пробоподготовки биологических объектов.

3. Сравнить результаты определения лекарственных веществ в сыворотке крови, полученные методами вольтамперометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

4 Провести сравнительное фармакокинетическое исследование спира-прила гидрохлорида и фозиноприла натрия для пациентов с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью

5. Выявить влияние курсового применения лекарственных препаратов на динамику ангиотензина II и инсулина

Научная новизна.

Впервые обнаружена способность спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия участвовать в электрохимических процессах, протекающих на поверхности золотого и графитового электродов, соответственно, с образованием осадка, электрорастворение которого приводит к появлению пика на поляризационной кривой.

Подобраны условия для вольтамперометрического количественного определения ингибиторов АПФ спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия, на основе которых разработаны методики в модельных растворах и биологических средах

Впервые вольтамперометрическим методом проведены фармакокинети-ческие исследования препаратов спираприла гидрохлорида в виде таблетиро-ванной лекарственной формы «Квадроприл» и фозиноприла натрия в виде таблетированной лекарственной формы «Моноприл» для группы пациентов с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью и рассчитаны основные фармакокинетические параметры.

Впервые проанализировано влияние курсового применения лекарственных препаратов на динамику ангиотензина II и инсулина методом вольтамперометрии

Практическая значимость и внедрение результатов исследования.

Разработанные методики количественного определения ингибиторов АПФ спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия в биологических объектах вольтамперометрическим методом, рекомендованы для использования в клинико-диагностических лабораториях лечебных учреждений для проведения фармакокинетических исследований, а также в учебном процессе кафедр фармацевтической химии

Методики внедрены в практическую деятельность клинико-диагностической лаборатории ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН.

Методика количественного определения ингибитора АПФ спираприла гидрохлорида внедрена в курс лекций и практических занятий кафедры фармацевтической химии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава».

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на V Международном конгрессе молодых ученых и специалистов

«Науки о человеке» (20-21 мая, 2004 года, г. Томск), XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (18-22 апреля, 2005 года г. Москва), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (18-19 мая 2005 года, Новосибирск), VI ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности (7-9 декабря 2005 года, Москва), региональной конференции «Актуальные проблемы фармакотерапии с позиций доказательной медицины» (1415 ноября 2006 года, Томск).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ, из них 2 статьи в центральной печати, патент на изобретение. № 2280860 от 27 июля 2006 г «Способ определения спираприла гддрохлорида методом инверсионной вольтамперометрии» и решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2005112825/28(014794) «Способ определения фозиноприла натрия методом инверсионной вольтамперометрии»..

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 38 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, посвященных результатам исследования, выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 148 источник, из которых 68 иностранных авторов.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Государственного учреждения Научно-исследовательского института кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

На защиту диссертации выносятся следующие положения:

• результаты экспериментальных исследований по разработке экспресс-методик количественного определения спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия в стандартных растворах и биологических объектах вольт-амперометрическим методом на приборе ТА-2 производства ООО НЛП «Техноаналит», г Томск,

• результаты сравнительного определения спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия в сыворотке крови, полученные методами вольтамперометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии;

• фармакокинетические характеристики ингибиторов АПФ спираприла гидрохлорида в виде таблетированной лекарственной формы «Квадро-прил» и фозиноприла натрия в виде таблетированной лекарствнной формы «Моноприл» для группы пациентов с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью, рассчитанные методом одночастевой модели при вне-сосудистом способе введения;

• результаты динамики концентрации ангиотензина II и инсулина в процессе курсового применения препаратов «Квадроприл» и «Моноприл».

Основное содержание работы

В обзоре литературы (первая глава) рассмотрены группы лекарственных веществ, применяемых при лечении хронической сердечной недостаточности, более подробно описаны фармакокинетические характеристики ингибиторов АПФ пролонгированного действия с двойным путем выведения спира-прила гидрохлорид и фозиноприл натрия Рассмотрены особенности фарма-кокинетики лекарственных веществ при сердечной недостаточности Описаны физико-химические методы количественного определения ингибиторов АПФ в биологических объектах.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования

В третьей и четвертой главах изложены результаты разработки методик количественного определения спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия в модельных растворах с перенесением на биологические объекты и предложением возможного механизма протекания электрохимических реакций на индикаторных электродах

С целью выявления специфичности разработанных вольтамперометри-ческих методик на лекарственные вещества в пятой главе преведены результаты их сравнительного определения двумя методами, вольтамперометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Описаны методики выделения лекарственных веществ и их метаболитов из сыворотки крови методом тонкослойной хроматографии с анализом электрохимической активности последних в подобранных условиях. Рассмотрена степень влияния ангиотензи-на II и инсулина на аналитические сигналы спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия

Шестая глава отражает результаты фармакокинетических испытаний спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия с одновременным определением инсулина и ангиотензина И в каждой фармакокинетической точке.

Объект и методы исследования

В качестве объекта исследования для подбора оптимальных условий электролиза использованы'

1) субстанция спираприла гидрохлорида [7 — [И — [1 (8) - этоксикарбо-нил - 3 - фенилпропил] - (8) - аланил] — 1,4- дигиа - 7 - азаспиро [4, 4] но-нан - 8 (Б) - карбоксильной кислоты гидрохлорид моногидрат], М.м. 521 08 г/моль, с содержанием действующего вещества 99,9 %, предоставленная фармацевтической фирмой Арцнеймитгельверк Дрезден Гмбх (Германия), рис 1.

2) субстанция фозиноприл натрия [1(5*(Я*)],2а,4р] - 4 - циклогексил -1 - [[[2-метил - 1 - (1 - оксипропокси)пропокси](4 - фенилбутил)фосфонил] - ацетил] — Ь — пролина натриевая соль, М.м 585,65 г/моль, с содержанием действующего вещества 99,8 %, предоставленная фармацевтической фирмой Бристол - Майерс Сквибб, (Италия), рис 2

н5с2-0-с^ * Ч сщ

"V У /О

?н2-сн2 н о й \

>

• НС1 • н2о

(8) (Я)

(8)

он

Рис. 1. Структурная формула спираприла гидрохлорида

Рис. 2. Структурная формула фозиноприла натрия

3) образцы сывороток крови пациентов, находящихся на стационарном лечении в отделении сердечной недостаточности ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН

Экспериментальные данные получены на полуавтоматическом анализаторе ТА - 2 (ООО НПП «Техноаналит», г. Томск) с программным обеспечением в комплекте с 1ВМ-совместимым компьютером К автоматическому анализатору прилагаются ячейки со встроенными электродами.

В работе использованы ртутно-пленочный, стеклоуглеродный, графитовый, платиновый и золотой электроды. Электрод сравнения — хлор-серебряный (А§ / AgCl).

Источником информации служили поляризационные кривые.

В эксперименте использовали кварцевую посуду, пластиковые стаканчики, стеклянные колбы для приготовления растворов.

В качестве фоновых электролитов исследовали растворы: Бриттона-Робинсона; хлоридов натрия, калия, лития, кальция; сульфатов и нитратов натрия, калия, аммония, и ряд других растворов квалификации ос ч. и х.ч.

Растворы стандартных образцов и фоновых электролитов готовили на воде бидистиллированной согласно ГФ XI, Вып. 1.

Для количественного определения анализируемых веществ в модельных системах использовали метод стандартных добавок, согласно которому, концентрацию определяемого вещества рассчитывали по формуле'

I -С, ■V ■V

пробы добавки добавки мпнерализта 6 пробе ~ 7Т " _/ \.у 7и 'ГДе

\ пробас-добавгой прооа) алнкеоты навесш

I пробы - высота пика элемента на кривой пробы, мкА; Сдобаеки — концентрация аттестованного раствора, мг/л;

Vдобавки - объем добавки, мл, ^минерализа та — объем минерализата, мл;

I проба с-добавкой - высота пика элемента на кривой пробы с добавкой, мкА; Ущшквоты - объём аликвоты, мл;

Мнавеет — величина навески, г или мл.

Сравнительное исследование количественного содержания лекарственных веществ методом высокоэффективной жидкостной хроматографии проводили на микроколоночном хроматографе «Милихром А - 02» с УФ-детектором на базе ЗАО Института Хроматографии «ЭкоНова» (г. Новосибирск)

Каждое из приведенных цифровых значений является средним из трех-шести измерений. Статистическую обработку результатов выполнили согласно методики, описанной в ГФХ1, Вып. 1.

Подбор условий вольтамперометрического определения спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия в модельном растворе стандартного образца

В ходе эксперимента подобрали оптимальные условия вольтамперометрического определения спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия на приборном комплексе ТА-2 ООО НЛП «Техноаналит», г. Томск Проведя развертку вольтамперограмм в катодном и анодном направлениях, пришли к выводу о целесообразности использования метода анодной вольтамперомет-рии, вследствие того, что в данном направлении сигналы определяемых веществ более выражены, тогда как при катодном варианте развертки линия фона загрязнена посторонними шумами

В качестве индикаторных для определения спираприла гидрохлорида выбраны золотой, для фозиноприла натрия — графитовый электроды. Оптимальными фоновыми электролитами признаны растворы: калия хлорида с концентрацией 0,005 моль/л, приготовленный на 0,015 моль/л растворе натрия гидрокарбоната (рН 9) для определения спираприла гидрохлорида и 0,01 моль/л раствор натрия нитрита (рН 6) для определения фозиноприла натрия

В более концентрированных растворах не наблюдали прироста от добавки при наличии большого остаточного тока, тогда как разбавление приводило к неустойчивости фонов во времени Выбранные концентрации обеспечивали минимальный остаточный ток и максимальную величину аналитических сигналов. Экспериментальным путем установили оптимальное значение потенциала электролиза, составляющее (—1,7 В) для определения спираприла гидрохлорида и для фозиноприла натрия — (1,0) В.

Для определения оптимального времени электролиза с целью получения более выраженного сигнала апробировали область значений данного показателя от 15 до 450 с Высота сигнала возрастала пропорционально времени пропускания до 240 с при накоплении спираприла гидрохлорида на золотом и до 270 с при концентрировании фозиноприла натрия на графитовом элек-тодах. При этом достигали максимального значения величины тока растворения накопленных осадков с поверхности золотого и графитового электродов, а также хорошей воспроизводимости результатов.

При времени накопления менее установленных значений величина тока растворения не достигала максимального значения, что снижало чувствительность определения исследуемых веществ При увеличении времени накопления происходило насыщение осадка на электроде, аналитический сигнал искажался, и затруднялась обработка вольтамперограмм.

Важным этапом в подборе условий электролиза является определение границ развертки. Данный параметр установили при постоянстве конечного потенциала, соответствующего потенциалу электролиза Для спираприла гидрохлорида оптимальная область развертки потенциала соответствовала значению от (- 1,7) до 1,0 В, а для фозиноприла натрия от (- 0,5) В до 1,5 В.

Изменение данных значений в более отрицательную область приводило к размыванию пика, расширение же области увеличивало предельный ток, что затрудняло обработку сигнала.

Наряду с имеющимися параметрами экспериментальным путем определили рациональную скорость развертки потенциала, равную 25 мВ/с для определения спираприла гидрохлорида и 70 мВ/с для определения фозиноприла натрия.

При замедлении или увеличении скорости развертки потенцииала граничь! аналитического сигнала становились нечеткими, что затрудняло обработку поляризационных кривых.

Подобранные условия (табл. 1) позволили регистрировать на индикаторных электродах четко воспроизводимые аналитические сигналы в виде вольтамперометрических кривых (рис. 3).

При построении зависимости силы тока в цепи от концентрации лекарственных веществ в датчике было показано, что сила тока возрастала до определенного момента, а затем уменьшалась. Подобная зависимость характерна для веществ органической природы и связана с тем, что их крупные молекулы постепенно занимают активные центры электрода, уменьшая, тем самым его рабочую поверхность.

/ / * // 1 Л'/

'.X

А Б

Рис 3. Вид вольтамперометрических кривых для раствора

стандартного образца спираприла гидрохлорида (А) фози-ноприла натрия (Б) при подобранных условиях

1 - линия фона;

2 - волътамперограмма, соответствующая пробе (0,01 мп),

3 — волътамперограмма, соответствующая пробе с добавкой (0,02 мл)

Таблица 1

Условия вольтамперометрического определения

Наименование показателя Спираприла г/хл Фозиноприл натрия

Вид вольтамперометрии анодная анодная

Вид развертки Постоянно-токовая Постоянно-токовая с дифференциацией

Индикаторный электрод золотой графитовый

Фоновт-тй электролит 0,005 моль/л раствор калия хлорида, приготовленный на 0,015 моль/л растворе натрия гидрокарбоната (рН=9) 0,01 моль/л раствор натрия нитрита (рН=6)

Время электролиза (Т), с 240 270

Потенциал электролиза (Е), В -1,7 1,0

Скорость развертки потенциала (\\0, мВ/с 25 70

Границы развертки потенциала, В от - 1,7 до 1,0 от -0,5 до 1,5

Диапазон сигнала вещества, В от (-0,5) до (-0,3) от 0,5 до 0,9

Линейная зависимость величины силы тока от концентрации лекарственных веществ в водных растворах имела прямолинейный характер в интервале концентраций от 10"6 до 10"3 мг/л.

С целью проверки воспроизводимости результатов определения лекарственных веществ по разработанным методикам провели тест «введено - найдено» для ста двадцати проб с концентрацией 993; 99,3; 9,93; 0,993; 0,0993 и 0,0993 мг/л для спираприла гидрохлорида и концентрацией 995; 99,5, 9,95; 0,995; 0,0995 и 0,0995 мг/л для фозиноприла натрия, по двадцать проб для каждой концентрации.

Для этого в пластиковый (кварцевый) стаканчик емкостью 40 (20) мл помещали 20 (10) мл фонового раствора

Для исключения мешающего влияния кислорода раствор деаэрировали азотом и проводили электролиз при подобранных условиях. Фиксировали вольтамперограммы при постоянно-токовых формах развертки потенциалов при выбранной скорости Отсутствие пиков на поляризационной кривой свидетельствовало о чистоте фона. Затем добавляли 0,01 мл стандартного раствора лекарственного вещества определенной концентрации, перемешивали и проводили электрохимическое накопление при тех же условиях.

Аналитический сигнал лекарственных веществ регистрировали как пробу в диапазоне потенциалов от (— 0,5) до (- 0,3) В для спираприла гидрохлорида и от 0,5 до 0,9 В для фозиноприла натрия (рис. 3)

В качестве внутреннего стандарта использовали такое же количество раствора лекарственного вещества и высоту суммарного сигнала замеряли как пробу с добавкой Время единичного анализа не превышало 25 мин Полученные результаты подвергли статистической обработке (табл. 2)

Погрешность методик составила не более 6 %, что соответствует погрешности вольтамперометрического метода Минимальная определяемая концентрация лекарственных веществ составила 1 нг/л.

Таблица 2

Результаты теста «введено — найдено» при количественном определении ле-

карственных веществ в модельных растворах

Спираприла гидрохлорид (концентрация от 993 до 993-10"5 мг/л) Фозиноприла натрий (концентрация от 995 до 995 10"' мг/л)

Хср, мг/л я* Б, % Хср, мг/л Эх Е, %

992,39 1,146 5,7 994,40 3,42 0,72

99,27 0,118 2,49 99,48 0,3813 0,8

9,92 5,57- 10"2 1,17 9,94 12,37 10"2 2,59

0,992 5,668 10"4 1,19 9,948 2,47-10"3 5,18

9,929- 10"2 2,32- 10"* 0,49 9,946- 10"2 5,42- 10" 1,14

9,928- 10~3 2,26 10"6 4,75 9,946- 10"3 1,41 • 10"4 2,97

Примечание: £ число степеней свободы - 19; Р, доверительная вероятность - 95 (Р; 8), критерий Стьюдента (табл) - 2,09

Таким образом, в результате выполненных исследований выявлена способность и подобраны рациональные условия концентрирования спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия на поверхности золотого и графитового электродов, соответственно, сопровождающиеся регистрацией сигнала вещества на вольтамперограмме.

Установленные параметры методик дают возможность с достаточно высокой чувствительностью и экспрессностью определять содержание лекарственных веществ в модельных растворах вольтамперометрическим методом, что в дальнейшем позволяет перенести их на биологические объекты.

Подбор условий определения исследуемых веществ в биологических средах

Важным этапом при перенесении электрохимической методики, разработанной в модельных растворах, на биологические объекты является выявление сигнала вещества на вольтамперограмме в присутствии биологической пробы, в частности, сыворотки крови. Для этого в электрохимическую ячейку поместили 5 мкл сыворотки крови и измерили величину силы тока в нулевой точке, затем прибавляли по 10 мкл раствора стандартного образца лекарственного вещества с параллельным измерением силы тока в ячейке. Результаты показали, что в присутствии сыворотки крови в объеме 5-50 мкл диапазон определяемых концентраций как для спираприла гидрохлорида, так и для фозиноприла натрия сохраняется и носит прямолинейный характер. При этом зависимость силы тока аналитического сигнала от концентрации лекарственныхвеществ в сыворотке крови располагается чуть ниже таковой в модельных растворах Данный факт, вероятно, обусловлен незначительным влиянием белков крови на величину аналитического сигнала.

С целью возможного усиления аналитического сигнала и осаждения белков сыворотки крови использовали реагенты: раствор серной кислоты; 10 % раствор цинка сульфата совместно с 0,5 моль/л раствором натрия гидрокси-да, 10 % раствор натрия вольфрамата с 0,1 моль/л раствором серной кислоты; 10% раствор трихлоруксусной кислоты. Было установлено, что использование дополнительных веществ, привлекло за собой исчезновение аналитических сигналов лекарственных веществ.

Таблица 3

Результаты теста «введено - найдено» количественного определения лекар-

ственных веществ в биологических объектах

Спираприла гидрохлорид (концентрация 0,5 и 0,1 мг/л) Фозиноприла натрий (концентрация 0,5 и 0 1 мг/л)

Хер, мг/л вх Е, % ХсР, мг/л Эх е, %

4,955 10"' 6,20- 10"' 2,83 4,979 10"1 1,69 10"1 7.6

9,912 • 10~2 3,841 10"3 8,76 9,925 10~2 1,802- КГ1 4,1

Примечание (£, число степеней свободы, — 9, Р, доверительная вероятность, - 95 %; 1 (Р; Б), критерий Стьюдента (табл), - 2,09)

Таким образом, пришли к заключению о целесообразности определения лекарственных веществ в нативной сыворотке крови без использования дополнительной пробоподготовки Оценку достоверности полученных результатов выполнили методом «введено—найдено» Относительная ошибка определения спираприла г/хл и фозиноприла натрия в биологических объектах составила не более 9 % (табл. 3).

Выявление специфичности разработанных методик

Выделение .метаболитов лекарственных веществ методом тонкослойной хроматографии с анализом их электрохимической активности

С целью установления специфичности разработанных вольтамперомет-рических методик количественного определения спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия в сыворотке крови проведено хроматографическое выделение лекарственных веществ и суммы их метаболитов с последующим электрохимическим исследованием последних в подобранных условиях. Хроматографическому разделению подвергали надосадочную жидкость образцов сывороток крови, полученных в процессе фармакокинетических исследований.

Для анализа биологических образцов, содержащих спираприла гидрохлорид, хроматографический анализ выполняли на пластинках «Мегск» (15 х 10 см) слой силикагеля 60 F254 R, в системах растворителей' метанол -вода - 98% уксусная кислота (60 30.10), вещества детектировали в фильтрованном УФ-свете. Образцы сывороток крови, содержащие фозиноприл натрия, хроматографировали на готовых пластинках с силикагелем 60 F254 R, 20x10 см фирмы «Мегск» в системе растворителей метанол - ацетатный буфер (60:40) с последующей детекцией в йодной камере с просматриванием в фильтрованном УФ-свете при длине волны 254 нм. На линию старта хрома-тографической пластинки наносили дозатором по 0,005 мл стандартного раствора лекарственного вещества (стандартный раствор спираприла гидрохлорида имеет значение Rf 0,6, стандартный раствор фозиноприла натрия имеет значение Rf 0,8) и 0,05 мл сконцентрированной нативной сыворотки крови Пятна веществ снимали с тонкого слоя, используя метанол, и подвергали электрохимическому исследованию В качестве контроля использовали элю-ат с сорбента, на котором отсутствовали какие-либо пятна веществ.

Результаты элекрохимического исследования показали, что предполагаемые метаболиты лекарственных веществ, в подобных условиях вольтам-перометрического определения являются электрохимически нейтральными, тогда как стандартные образцы и соответствующие им компоненты исследуемых сывороток крови, снятые с тонкого слоя, проявили ожидаемую электрохимическую активность, что доказывает специфичность разработанных методик.

Анализ сывороток крови методом высокоэффективной жидкостной хроматогра фии

Для валидадии разработанных вольтамперометрических методик определенна кардиопрепаратов в крови сочли целесообразным провести независимый параллельный контроль полученных нами результатов в сравнении с другим методом. Для итого использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии, наиболее часто используемый в клинических лабораториях.

Рис, 4. Результаты сравнительного определения спираприла гидрохлорида (А) и фозиноприла натрия (Б) в сыворотке крови двумя методами: высокоэффективной жидкостной хроматографией (Ряд I} и вольтам-перометрическим (Ряд 2)

Перед началом анализа сыворотку крови (3-4 мл) очищали от белков раствором серной кислоты, а липиды экстрагировали гексаном. Смесь центр ифугировал и но 20 минут и отделяли органическую фазу и осадок Н ад оса-до 41-гую жидкость сгущали до объема сыворотки 0,5-0,2 мл и проводили анализ.

Для количественного определения спираприла гидрохлорида использовали колонку, заполненную силикагелем Сепарон SGX С18 (5 мкм) или аналогичную, диаметр и длина колонки 2,0 х 120 мм. Подвижная фаза -метанол:вода (60:40), значение рН 3,0 (доводили 85% фосфорной кислотой). Вводимый объем: 20 мкл сыворотки очищенной. Скорость потока: 2,0 мл/мин, время удерживания спираприла гидрохлорида 5,8 минут. УФ-детектция при длине волны 217 нм.

Содержание фозиноприла натрия в сыворотке крови оценивали в сравнении с внешним стандартом на основе автоматической интеграции площадей пиков. Анализ проводили на колонке Силасорб С18 диаметр и длина колонки 3,0 х 150 мм, Подвижная фаза: метанол:ацетат аммония (50:50), значение рН 5. Вводимый объем: 20 мкл Скорость потока: 1,5 мл/мин, время удерживания фозиноприла натрия 5,0 минут. УФ-детектция при длине волне 220 нм.

Результаты сравнительного количественного анализа можно считать сопоставимыми, так как при анализе последовательных фармакокинетических точек динамика и максимумы концентрации лекарственных веществ совпадали (рис. 4). Более высокие количественные показатели, полученные методом вольтамперометрии, можно объяснить простотой пробоподготовки, тогда как осаждение белков и экстракция липидов рядом растворителей с различной полярностью может повлиять на содержание лекарственных веществ в сыворотке крови.

Результаты фармакокинетических испытаний спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия с одновременным определением содержания ангиотензина II и инсулина в каждой фармакокинетической точке

Для математического моделирования фармакокинетических процессов организм, как правило, представляют в виде одной или нескольких частей, ограниченных проницаемой мембраной, в которых равномерно распределно лекарственное средство. Наиболее пригодной для анализа концентрации препарата в крови, плазме и сыворотке является одночастевая модель, при которой организм представляется в виде единой, гомогенной камеры. Данная схема была выбрана за основу при проведении фармакокинетических исследований спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия (рис 5).

^эл

Место введения препарата

Кровь

Элиминация

Рис. 5 Математическая одночастевая модель фармакокинетического процесса при внутрисосудистом способе введения

Определение фармакокинетических параметров лекарственных веществ и оптимизация терапии являлись целью проводимых исследований. Данный фрагмент научной работы выполнен совместно с отделением сердечной недостаточности ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН (руководитель отделения - д.м.н, профессор А.Т. Тепляков), под руководством д м н., профессора А.А. Гарганеевой.

Фармакокинетика спираприла гидрохлорида изучена для таблетирован-ной лекарственной формы «Квадроприл» в начальной терапевтической дозе от 0,75 до 3 мг и фозиноприла натрия в виде таблетированной формы «Мо-ноприл» от 2,5 до 7,5 мг. Дозы лекарственных препаратов подобраны клиницистами с учетом исходного уровня артериального давления, проводимой мочегонной терапии, реакции организма пациента на стартовую дозу Объектом исследования являлись сыворотки крови для спираприла гидрохлорида 11 пациентов и для фозиноприла натрия 10 пациентов мужского пола, в возрасте от 40 до 66 лет, массой тела 58 - 82 кг, с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью Кровь отбирали из вены предплечья в сухие,

чистые пробирки через определенные интервалы - времени для спираприла гидрохлорвда через 15, 30, 60, 90, 120, 240, 480, 1440 минут, 3, 14, 28, 56 суток, для фозиноприла натрия - через 15, 30, 60, 120, 180, 360, 480, 1440 минут, 3, 14, 28, 56, 78 суток после приема препаратов, затем центрифугировали в течение 10 минут. После проведения пробоподготовки образцы сразу анализировали методом вольтамперометрии с накоплением. Содержание лекарственных веществ находили методом добавок

По данным точкам восстановили ход всей зависимости концентрации спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия в крови от времени (фарма-кокинетический профиль). Данные сравнительных фармакокинетических исследований для спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия представлены в таблице 4

Таблица 4

Сравнение фармакокинетических характеристик спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия

Фармакокине-тические характеристики Спираприла гидрохлорид (препарат «Квадроприл») в средней дозе 1,57±0,43 мг Фозиноприл натрия (препарат «Моноприл») в средней дозе 3,3±0,5 мг

ТУ* 335,67±32,60 306,00±11,50

Tmax 109,50±20,50 159,00±18,00

Kei, мин"1 0,48±0,02 0,26±0,03

Koi, мин1 0,42±0,03 0,16±0,05

Cs, мг/л 0,40±0,02 0,69±0,09

CCD, мг/л 0,26±0,01 0,64±0,02

Cef, МГ/Л 0,18±0,05 0,19±0,06

стах, мг/л 0,38±0,02 0,73±0,09

Со, мг/л 0,25±0,03 0,31±0,02

6,40±0,60 5,40±0,50

CLT, л/мин 0,02±0,005 0,99±0,03

Т,ч 2,90±0,30 4,38±0,50

Он. мг 4,50±1,50 7,10±2,10

Опод> 2,30±0,50 2,27±0,90

S 2,42±0,20 3,78±0,60

Полученные значения позволяют говорить о похожей фармакокинетике лекарственных веществ, что подтверждают литературные данные (Б А Сидоренко 2000, Р УЛЭич5, 1999), но при этом есть и различия так, спираприла гидрохлорид почти на 50 минут всасывается быстрее, чем фозиноприл натрия, к тому же он более длительно циркулирует в биологических жидкостях за счет существенно меньшего значения показателя клиренса по сравнению с фозиноприлом при одинаковых значениях объема распределения, кроме того, для обоих препа-

Концентрация янгиотен--1ПНЯ II,

иг/мл

0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 144«

Время, мин

Рис. 6. Динамика ангиотензина II в крови в течение суток при приеме препарата «Квадроприл» в средней дозе 1,75 мг

Концентрация 12 ангиотензина П, нг/ил 10

120 240 360 480

600 720 840 Время, мин

960 1080 1200 1320 1440

Рис. 7. Динамика ангиотензина II в крови в течение суток при приеме препарата «Моноприл» в средней дозе 3,3 мг

ратов наблюдается более медленное всасывание на 30-60 минут, превышающие значения описанные в литературе.

Анализ фармакокинетических характеристик говорит об эффективности проводимой терапии, так как Сер находится в коридоре безопасности (Сэф< Сср< Се).

На основе полученных фармакокинетических данных с учетом особенностей всасывания, распределения и выведения лекарственных веществ при хронической сердечной недостаточности были рассчитаны Бн для препарата «Квадроприл» — 4,5 мг, Эпод - 2,3 мг, и для препарата «Моноприл» Бн - 7,1 мг, Бпод - 2,27 мг.

С целью проверки эффективности проводимой терапии препаратами «Квадроприл» и «Моноприл» исследовали влияние лекарственных веществ на динамику ангиотензина II в крови в одинаковых фармакокинетических точках вольтамперометрическим методом.

Методика заключалась в электрохимическом концентрировании ангиотензина II на графитовом электроде. Фоновым раствором являлся 0,01 моль/л раствор аммония фосфата двузамещенного, подкисленный винной кислотой до рН 3. Условия электролиза: граница развертки потенциала от (- 1,5) до 1,5 В, скорость развертки — 50 мВ/с, квадратно-волновая форма развертки потенциала, амплитуда импульса - 5 мВ, частота - 20 Гц

Полученные результаты позволяют говорить о том, что для спираприла гидрохлорида максимальное снижение уровня ангиотензина II наступает уже через 2 часа, в то время как для фозиноприла натрия этот период более длительный и составляет 4 часа (рис. 6, 7) В целом же, оба препарата снижают уровень ангиотензина II в течение суток практически одинаково' для спираприла гидрохлорида на 40%, для фозиноприла натрия на 35 %. В течение 8 недельной терапии уровень ангиотензина II при приеме «Квадроприла» уменьшился на 60%, а при приеме «Моноприла» - на 80% по сравнению с исходными значениями и достигло пределов нормы.

Полученные данные концентрации ангиотензина II, согласуются с фар-макодинамическими показателями, предоставленными клиницистами Так, снижение уровня артериального давления для обоих препаратов наблюдается уже в течение первого часа после приема лекарственных средств внутрь и достигает максимального значения через 2-6 часов. Для спираприла гидрохлорида выявлена прямая зависимость между повышением его концентрации и понижением уровня ангиотензина II в крови Для фозиноприла натрия такой зависимости не наблюдалось, скорее, напротив, что говорит о высокой активности метаболита - фозиноприлата.

В литературе (В.В Якусевич, 2000; Р.ТаШ,1998) имеются данные о том, что ингибиторы АПФ не только не влияют на углеводный обмен, но даже оказывают положительное действие на него (улучшают усвояемость глюкозы), при этом не встречаются описания влияния препаратов этой группы на уровень инсулина

Концентрация

инсулина в сыворотке крови, 1а -МЕ/мл

14 -

4

О 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440

Время, мин

Рис 8. Динамика инсулина при приеме препарата «Квадроприл» в средней дозе 1,75 мг

Концентрация 16 инсулина

14

в сыворотке крови, МЕ/мл

г ... |

к 1 - |

1

0 120 240 360 480 600 720 840 960 1080 1200 1320 1440 Время, мин

Рис 9. Динамика инсулина при приеме препарата «Моноприл» в средней дозе 3,3 мг

В связи с тем, что в исследовании принимали участие 10% пациентов с сопутствующим заболеванием сахарный диабет и 18% пациентов с нарушением толерантности к глюкозе, сочли необходимым проверить влияние спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия на уровень инсулина Методику определения инсулина в сыворотке крови проводили на фоновом электролите 0,01 моль/л растворе калия хлорида, подкисленного винной кислотой до рН 3,0, в качестве индикаторного электрода использовали ртутно-пленочный. Условия электролиза: потенциал электролиза - (—1,3) В, границы развертки потенциала - от 0,2 до (- 1,3) В; скорость развертки - 50 мВ/с, вид развертки - постоянно-токовая.

В результате терапии обоими препаратами не наблюдали резких колебаний концентрации гормона от приема лекарственных препаратов, практически у всех пациентов этот уровень находился в пределах физиологической нормы (рис. 8,9), и лишь для двух пациентов (№ 10 (Ч.) и №7 (3 )), имеющих в анамнезе сахарный диабет, эти показатели были значительно ниже физиологических значений.

Для пациента № 2 (К.М.Н.), напротив, на резкое снижение уровня ангио-тензина II и компенсаторную активациию симпато-адреналовой системы, произошло повышение уровня инсулина.

Таким образом, в результате проведенного исследования были установлены особенности фармакокинетики спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия с одновременным влиянием их на динамику ангиотензина II и инсулина в процессе курсовой терапии Полученные результаты дополнили фармакодинамические характеристики лекарственных веществ для группы пациентов с хронической сердечной недостаточностью.

ВЫВОДЫ

1. Изучено электрохимическое поведение спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия на золотом и графитовом электродах, соответственно, и подобранны оптимальные условия их электролиза на вольтамперометриче-ском анализаторе ТА-2 ООО НПП «Техноаналит», г. Томск (состав и рН фонового электролита; потенциал и время электролиза; границы и скорость развертки потенциала) Полученные четкие сигналы анализируемых веществ на вольтамперограммах, позволили разработать методики их количественного определения в модельных растворах (погрешность не превышает 6%)

2. Выявлено незначительное влияние компонентов крови на величину аналитических сигналов лекарственных веществ, что позволяет проводить анализ биологического объекта без предварительной пробоподготовки (не требуется осаждения белков и экстракции липидов). Минимально определяемая концентрация лекарственных веществ составила 1 нг/л Погрешность разработанных методик не превышает 9 %.

3. Метаболиты лекарственных веществ, выделенные с тонкого слоя сорбента, не проявили электрохимическую активность при подобранных условиях, в то время как вещества, ^ которых совпал с Я) веществ-свидетелей,

показали на вольтамперограмме характерные пики, что свидетельствует о селективности разработанных методик.

5. Результаты сравнительного количественного анализа лекарственных веществ методами высокоэффективной жидкостной хроматографии и вольт-амперометрии, можно считать сопоставимыми, так как при анализе последовательных фармакокинетических точек динамика и максимумы концентрации исследуемых веществ совпадали. Более высокие количественные показатели, полученные методом вольтамперометрии, можно объяснить простотой пробоподготовки, тогда как многостадийное экстракционное выделение рядом растворителей с различной полярностью подразумевает значительные потери лекарственного вещества при смене растворителя.

6. Расчет основных фармакокинетических параметров препаратов «Квад-роприл» и «Моноприл» для группы пациентов с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной сердечной недостаточностью показал необходимость увеличения терапевтической дозы для обоих лекарственных веществ, так, для спираприла гидрохлорида доза начальная составляет 4,5 мг, а для фозиноприла натрия -7,1 мг.

7. Установлено, что препараты «Квадроприл» и «Моноприл» снижают содержание в крови ангиотензина II в течение суток на 40 % и 35 %, а при восьминедельной терапии на 60 и 80%, соответственно, без влияния на уровень инсулина.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Способ определения спираприла гидрохлорида методом инверсионной вольтамперометрии / С В.Терентьева, А.С.Комарова, Е Н.Комарова. Е Г.Поздняков, Е.А. Ивановская // Патент на изобретение № 2280860 от 27 июля 2006 г.

2. Способ определения фозиноприла натрия методом инверсионной вольт-

амперометрии / С В.Терентьева, Е.Н.Комарова, Е.А Ивановская, P.C. Карпов // Приоритет от апреля 2005 г., регистрационный № 2005112825/28; входяпдай номер 014794

3. Способ определения ангиотензина II методом инверсионной вольтампе-

рометрии / С.В.Терешъева, Е.Н Комарова, Т.И Андреева, Е.А.Ивановская, А.М Гусакова, Р.С.Карпов // Патент на изобретение № 2260797 от 20 сентября 2005 г

4. Комарова Е Н Изучение фармакокинетики квадроприла (спираприла гид-

рохлорида) методом вольтамперометрии/ Е.Н Комарова, С В.Терентьева, А.А.Гарганеева // Сибирский медицинский журнал. - 2006. - № 4. - С. 47 -49.

5. Вольтамперометрическая методика определение ангиотензина II в крови/

С.В.Терешъева, Е Н.Комарова, Т.Н.Сапожникова, А.Т.Тепляков, Е.А. Ивановская, Т.И.Андреева // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. -Т.40, №12. - С. 54-56.

6. Инверсионная вольтамперометрия ангиотенизина II / Е Н Комарова. С.В Терентьева, Т И. Андреева // Рациональное использование лекарств:

Материалы российской научно-практической конференции (10 — 12 марта 2004 года, Пермь) - 2004. - С 54 - 55.

7. Вольтамперометрическое определение ангиотензина II / Е Н Комарова. С В Терентьева //Сборник статей молодых ученых и специалистов. Науки о человеке, г. Томск, СибГМУ - 2004 - С. 55 - 56.

8. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики моноприла у пациентов с

хронической сердечной недостаточностью / Е Н.Комарова. С В. Терентьева, А.Т.Тепляков, А А.Гарганеева, В.Л.Нилогов // Сердечная недостаточность 2005. Материалы VI ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности, г Москва - 2005 - С. 11

9. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики квадроприла у пациентов

с хронической сердечной недостаточностью / С.В Терентьева, А.С Комарова, Е Н Комарова. А Т Тепляков, А. А Гарганеева, В JI Нилогов // Сердечная недостаточность 2005' Материалы VI ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности, г. Москва - 2005. - С. 11

10. Изучение фармакокинетики фозиноприла натрия и спираприла гидрохлорида / Е.Н Комарова, С.В.Терентьева. В.Л.Нилогов, А А.Гарганеева // Современные проблемы фармакологии и фармации: Материалы Всероссийской научно-практической конференции, г Новосибирск. - 2005 -С. 135-137.

11. Изучение фармакокинетики беназеприла гидрохлорида и спираприла гидрохлорида / Е Н Комарова. С В Чернышева, С В Терентьева, А.С.Комарова, В Л.Нилогов, В Д.Аптекарь, А А Гаргенеева, А Т. Тепляков // Тезисы докладов XII Российского национального конгресса «Человек и Лекарство», г Москва - 2005. - С. 415

12. Изучение фармакокинетики моноприла и квадроприла / Е Н Комарова. С.В.Терентьева, А А.Гарганеева // Региональная конференция «Актуальные проблемы фармакотерапии с позиций доказательной медицины», г. Томск. - 2006.-С 15.

Подписано к печати 19 01.07. Формат 60x84/16 Бумага "Классика" Печать RISO. Усл.печ л. 1,28. Уч.-изд.л. 1,16.

Заказ 12. Тираж 100 экз. ioutuktioVto 634050, г. Томск, пр Ленина, 30

Не будет преувеличением сказать, что артериальная гипертония <АГ) и хроническая сердечная недостаточность (ХСН) самые актуальные проблемы современной кардиологии. По данным последних отечественных исследований ЭПОХА (эпидемиологическое обследование больных А17ХСН в реальной практике) [601, распространенность АГ среди всех слоев населения составила 39.7%, а аналогичные показатели для ХСН составляют от 23 до 11.7 % (в зависимости от тяжести заболевания). Другими словами, гипертонией и/или ХСН страдает каждый второй или третий житель нашей страны, и это число постоянно растет

Серьезность ситуации с сердечной недостаточностью (СН) усугубляется крайне неблагоприятным прогнозом: ежегодная смертность при этой патологии колеблется от 10 до 20 что составляет около 500000 случаев в год [69], кроме того, высокий уровень ннвалнднзацни пациентов работоспособного возраста с ХСН наносит существенный ущерб государствам, подрывая их экономический рост.

Таким образом, сложившаяся эпидемиологическая картина заболеваемости и смертности при ХСН ставит вопросы патогенеза, диагностики и лечения данного заболевания в ряд наиболее актуальных проблем современной кардиологии.

В последние годы для лечения ХСН в клиническую практику повсеместно внедряются новые группы лекарственных препаратов (ЛП) и в первую очередь ингибиторы ангиотеи^ннпревращающего фермента (АПФ), считающиеся препаратами выбора при лечении данной патологии, связанной как с систолической, так н днастолн ческой дисфункциями левого желудочка (ЛЖ), вне зависимости от наличия или выраженности клинических проявлений [5, 8, 20. 26, 48, 52, 66, 67, 108|. Особого внимания заслуживают их новые формы пролонгированного действия с двойным путем выведения, к которым относятся спнраприла гидрохлорид н фозиноприла натрий 12,19,30, 71, 78, 116, 117].

При выборе оптимальной тактики лечения ХСН необходимо принимать во внимание индивидуальные особенности организма, возраст, образ жизни и сопутствующие заболевания [7,43,74]. Известно, что стандартная дозировка лекарственного вещества (ЛВ) не всегда позволяет достичь желаемого результата» а в некоторых случаях» наряду с положительным эффектом, вызывает обширные побочные явления, поэтому проведение фармакокииетических исследований с терапевтическим мониторингом содержания лекарственных средств в биологических средах организма (сыворотке или плазме крови, слюне, моче и т.д.), является одним из основных способов оптимизации индивидуальной терапии, что особенно важно для больных с заболеваниями печенн и почек, при комбинированном применении лекарств, неясных причин их неэффективности или плохой переносимости.

Изучение фармакокннетики стало возможным благодаря внедрению в медицинскую практику высокочувствительных методов определения концентрации лекарственных веществ (ЛВ) в биологических средах; хроматографа ческнх, радионммунных, фермектохммнческнх, сиектрофотометрнческнх, колориметрических, электрохимических [10, 14, 16, 18,23,28,61,64].

В последнее время растет популярность электрохимических методов, в частности, аольтамперометрин, которая нашла широкое применение при анализе объектов окружающей ереды, продуктов питания. ЛВ [4, 15, 22, 24, 37,42,44,47, 54,55, 56,59, 71, 77, 80],

Несложное и недорогое лабораторное оборудование, более легкая по сравнению с другими методами пробоподготовка, высокая чувствительность, делают вольтамперометрню очень перспективным для количественного определения ЛВ как в стандартных растворах, так и в биологических средах [83,86, 132, 133,144, 148].

Методики определения ЛВ вольтам перометри чес ким методом, позволяют проводить скрннннгоныс исследования для каждого пациента, помогая врачу при подборе оптимальной терапевтической дозы с учетом особенностей организма.

Таким образом, разработка методик количественного определения современных нигнбнроров АПФ спирал рила гидрохлорида н фознноприла натрия, а так же проведение на их основе фармакокинетнческих исследований для группы пациентов с постанфарктной дисфункцией ЛЖ, ассоциированной с умеренно выраженной ХСН, позволит не только расширить показания к назначению данных лекарственных средств, создать оптимальные алгоритмы их использования для дайной группы пациентов, но и во многом реализовать идею индивидуального подхода при подборе терапии в каждом конкретном случае.

Цель работы.

Разработать методики количественного определения ингибиторов АПФ спнрапрнла гидрохлорида и фознноприла натрия вольтампсрометрнческнм методом и провести на их основе фармакокинетические исследования с целью оптимизации тактики лечения пациентов с постннфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью.

Задачи исследования*

1. Подобрать оптимальные условия для количественного определения ингибиторов АПФ спнрапрнла гндрохларида и фознноприла и атрия и разработать на их основе вольтам перометрическнс методики в модельных растворах и биологических средах.

2. Предложить схему пробоиодготовки биологических объектов.

3. Сравнить результаты определения лекарственных веществ в сыворотке крови, полученные методами вольтамперометрин и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

4. Провести сравнительное фармакокинетическое исследование спирапрнла гндрохлорида и фочиноприла натрня для пациентов с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью.

5. Выявить влияние курсового применения лекарственных препаратов на динамику ангиотензнна П и инсулина.

Научная новизна.

Впервые обнаружена способность спирапрнла гндрохлорида и фозиноприла натрия участвовать в электрохимических процессах, протекающих на поверхности золотого и графитового электродов, соответственно, с образованием осадка, электрорастворсние которого приводит к появлению пика на поляризационной кривой.

Подобраны условия для вольтамперометрического количественного определения ингибиторов АПФ спирапрнла гидрохлорида н фозиноприла натрня. на основе которых разработаны методики в модельных растворах н биологических средах.

Впервые вольтампсромстрнческим методом проведены фармакокинетические исследования препаратов спирапрнла гидрохлорнда в виде таблетнрованиой лекарственной формы «Квадропрнл» н фозиноприла натрия в виде таблетнрованной лекарственной формы «Моноприл» для группы пациентов с постнифарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью и рассчитаны основные фармакокннетичсские параметры.

Впервые проанализировано влияние курсового применения лекарственных препаратов на динамику ангнотензина II н инсулина методом вольтамперометрии.

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Государственного учреждения Научно-исследовательского института кардиологии Томского научного центра Сибирского отделения Российской академии медицинских наук.

Практическая значимость и внедрен не результатов исследования.

Разработанные методики количественного определения ингибитора АПФ спнралрияа гндрохлорида и фознноприла натрия н модельных растворах и биологических средах методом инверсионной вольтамперомстрнн рекомендованы для использования в клинико-диагностических лабораториях, в учебном процессе кафедр фармацевтической химии.

Методики внедрены в практическую деятельность клинико-диагностической лаборатории ГУ НИИ кардиологии ТНЦ СО РАМН,

Методика количественного определения ингибитора АПФ спнрапрнла гндрохлорида внедрена в курс лекций и практических занятий в учебном процессе кафедры фармацевтической химии ГОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет Росздрава».

На защиту днссертацнн выносятся следующие положения:

• результаты зкепери ментальных исследований по разработке экспресс-методик количественного определения спнрапрнла гндрохлорида и фознноприла натрия а стандартных растворах и биологических объектах вольтам п ерометрнческнм методом на приборе ТА-2 производства ООО НЛП «Техноаяалит», г. Томск;

• результаты сравнительного определения спнрапрнла гндрохлорида и фознноприла натрия в сыворотке крови, полученные методами вольтамперометрни и высокоэффективной жидкостной хроматографии;

• фармакокинетичеенгие характеристики ингибиторов АПФ спнрапрнла гндрохлорида в виде таблетированной лекарственной формы «Квадропрнл» и фозиноприла натрия в виде таблетированной лекарствнной формы «Моноприл» для группы пациентов с постннфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной хронической сердечной недостаточностью, рассчитанные методом одночастевой модели при внесоеуднстом способе введения;

• результаты динамики концентрации ангиотензнна II и инсулина в процессе курсового применения препаратов «Квадропрнл» и «Моноприл»,

Апробация работы*

Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на V международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (20-21 мая, 2004 года, г, Томск), ХП Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (18-22 апреля, 2005 года г. Москва), Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (18*19 мая 2005 года, Новосибирск), VI ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности (7-9 декабря 2005 года, Москва), региональной конференции «Актуальные проблемы фармакотерапии, с позиций доказательной медицины» (14 -15 ноября 2006 года, Томск).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 работ, из которых 2 статьи в центральной печати, патент на изобретение № 2280860 от 27 июля 2006 г «Способ определения спнрапрнла гидрохлорида методом инверсионной вольтамперомегрин» и решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2005112825/28(014794) «Способ определения фозинопрнла натрия методом инверсионной вольтамперометрии».

Структура н объем диссертации.

Диссертационная работа изложена на 129 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц н 38 рисунков, состоит из введения, обзора литературы, 5 глав, посвященных результатам исследования, выводов, списка литературы и приложений. Библиографический указатель включает 148 источников, из которых 68 зарубежных.

выводы

1. Изучено электрохимическое поведение спирапрнла гндрохлорида н фозиноприла натрия на золотом и графитовом электродах, соответственно, н подобранны оптимальные условия их электролиза на вольтамперомстрнческом анализаторе ТА-2 ООО НГОТ «Техноаналнг» (состав и рН фонового электролита; потенциал и время электролиза; границы н скорость развертки потенциала}. Полученные четкие сигналы анализируемых веществ на вольтам перо граммах, позволили разработать методики нх количественного определения в модельных растворах (погрешность не превышает 6%).

2. Выявлено незначительное влияние компонентов крови на величину аналитических сигналов лекарственных веществ, что позволяет проводить анализ биологического объекта без предварительной пробоподготовки (не требуется осаждения белков и экстракции липидов). Минимально определяемая конце итрация лекарственных веществ I кг/л. Погрешность разработанных методик не превышает 9 %.

3. Метаболиты лекарственных веществ, выделенные с тонкого слоя сорбента, не проявили электрохимическую активность при подобранных условиях, в то время как вещества, которых совпал с В* веществ-свидетелей. показали на вольтамперограмме характерные пики, что говорит о селективности разработанных методик.

5- Результаты сравнительного количественного анализа лекарственных веществ методами высокоэффективной жидкостной хроматографии н вольтамперометрнн, можно считать сопоставимыми, так как прн анализе последовательных фармакокннетическнх точек динамика и максимумы концентрации исследуемых веществ совпадали. Более высокие количественные показатели, полученные методом вольтамперомегрин, можно объяснить простотой проболодютовки, тогда как многостадийное экстракционное выделение рядом растворителей с различной полярностью подразумевает значительные потерн лекарственного вещества прн смене растворителя.

6, Расчет основных фармахокннетнческнх параметров препаратов «Квадропрнл» и «Моноприл» для группы пациентов с постинфарктной дисфункцией левого желудочка, ассоциированной с умеренно выраженной ХСИ, показал необходимость увеличения терапевтической дозы для обоих лекарственных веществ, так для спнраприла гндрохлорида доза начальная составляет 4,5 мг, а для фозкнопрнла натрия - 7,1 мг.

1. Установлено, «по препараты «Квадропрнл»» н «Моноприл» снижают содержание в кроен ангнотензнна 11 в течение суток на 40 % н 35 %, а прн восьминедельной терапии на 60 н 80%, соответственно, без влияния на уровень инсулина.