Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Перспективы использования вольтамперометрии в анализе сердечно-сосудистых лекарственных средств (контроль качества и фармакокинетика)

005012666

V

ТЕРЕНТЬЕВА Светлана Владимировна

ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВОЛЬТАМПЕРОМЕГРИИ В АНАЛИЗЕ СЕРДЕЧНО-СОСУДИСТЫХ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ (КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА И ФАРМАКОКИНЕТИКА)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

1 2 МА? 2012

Москва - 2012

005012666

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России (г. Новосибирск) и ГУ НИИ кардиологии СО РАМН (г. Томск)

Научные консультанты: доктор фармацевтических наук, профессор

Ивановская Елена Алексеевна доктор медицинских наук, профессор Попов Сергей Валентинович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Черкасова Ольга Гавриловна

доктор фармацевтических наук, профессор Сокольская Татьяна Александровна

доктор фармацевтических наук Ковалева Елена Леонардовна

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Самарский государственный

медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Защита состоится ££ р^ 2012 г. в на заседании Диссертационного

Совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московской государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 119019, г.Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московской государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова Минздравсоцразвития России по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49

Автореферат разослан « » 02 2012 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета Д.208.040.09, доктор фармацевтических наук, профессор

Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время в России зарегистрировано и внесено в Государственный реестр порядка 3000 лекарственных средств, ежегодно их список пополняется на 200 - 300 наименований; вместе с тем, каждый год из списка разрешенных для клинического применения исключают 100 - 200 препаратов, чаще всего по причине высокой токсичности и широте побочных эффектов. На сегодняшний день лекарственные средства в качестве монотерапии используют редко, в основном в виде сочетаний, иногда в одной лекарственной форме, что усиливает терапевтический эффект и увеличивает число побочных реакций (Ю.Б. Белоусов, 2002; И.И. Мирошниченко, 2002).

В связи с этим, актуальным становится поиск и выбор современных высокочувствительных методов контроля качества лекарственных средств, при этом оптимальным является тот, который осуществляет детекцию по фармакологически активной группе, пригоден для анализа лекарственного средства в растворе стандартного образца, лекарственных формах и биологических жидкостях. Поскольку в оказании фармакологического эффекта непосредственно задействованы эндогенные электрохимические процессы, следует обратить внимание на электрохимические методы анализа, в частности, вольтамперометрию, используемую в настоящее время для контроля состояния окружающей среды, лекарственных средств, исследования физиологических процессов в организме и способную обеспечить определение значительного числа как неорганических, так и органических веществ. Она характеризуется высокой чувствительностью и селективностью, быстротой отклика на изменение состава анализируемого объекта, легкостью автоматизации и возможностью дистанционного управления, не требует дорогостоящего аналитического оборудования и может применяться в лабораторных, производственных и полевых условиях. Нижняя граница определяемых концентраций при линейном изменении потенциала индикаторного электрода в классической вольтамперометрии составляет 10 - 10 моль/л, для ее снижения до Ю-8 - 10"7 моль/л используют усовершенствованные инструментальные варианты: переменнотоковую и дифференциальную импульсную.

Особый интерес представляет изучение возможности использования вольтамперометрии для анализа сердечно-сосудистых препаратов, как наиболее обширной части рынка всех лекарственных средств.

Цель и задачи исследования

Целью настоящего исследования являлось обоснование целесообразности использования вольтамперометрии для контроля качества и изучения фармакокинетики сердечно-сосудистых лекарственных средств на примере амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола. Исследование возможности использования вольтамперометрии в анализе эндогенных полипептидов на примере инсулина и ангиотензина И.

Для достижения поставленной цели требовалось решить следующие задачи:

- выполнить квантово-химические расчеты структуры амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола;

- разработать вольтамперометрические методики количественного определения лекарственных средств в модельных растворах стандартного образца;

- предложить валидированные условия количественного определения лекарственных средств в лекарственных формах;

- изучить возможность использования методик количественного анализа лекарственных средств в сыворотке крови и предложить схему пробоподготовки анализируемых образцов крови;

- провести сравнительные фармакокинетические исследования сердечно-сосудистых лекарственных средств вольтамперометриче-ским методом в сравнении с высокоэффективной жидкостной хроматографией;

- исследовать возможность использования вольтмаперометрии в анализе эндогенных полипептидов (инсулина и ангиотензина II).

Научная новизна

С помощью квантово-химических расчетов структур амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, выполненных методом РМ-3, впервые получены соответствующие значения энергий ионизации атомов, на основании чего дано заключение о вероятном механизме электродного процесса.

Впервые в мировой практике: • обнаружена способность и показана возможность амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола и ангиотензина II участвовать в процессах, протекающих на поверхности стационарных электродов с

образованием малодиссоциированных соединений, электрорастворение которых приводит к появлению сигнала на вольтамперной кривой с параметрами, являющимися качественной и количественной характеристикой определяемого вещества. Получены патенты: «Вольтамперометрический способ количественного определения нибентана»; «Способ определения амиодарона (кордарона) методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения спираприла гидрохлорида методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения беназеприла гидрохлорида (лотензина) методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения фозиноприла натрия методом инверсионной вольтамперометрии»; «Способ определения карведилола методом инверсионной вольтамперометрии»;

• показана возможность и разработаны эффективные, экономичные и экологически безопасные технологии количественного определения сердечно-сосудистых средств в лекарственных формах вольтамперометрическим методом;

• предложены методики пробоподготовки образцов сыворотки крови, содержащих амиодарон, нибентан, спираприла гидрохлорид, фози-ноприл натрий, беназеприла гидрохлорид и карведилол для целей вольтамперометрического исследования;

• вольтамперометрическим методом проведены сравнительные фарма-кокинетические исследования амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола на базе отделения хирургического лечения сложных нарушения ритма сердца и электрокардиостимуляции (научный руководитель отделения д.м.н., профессор Попов C.B.) и отделения сердечной недостаточности (научный руководитель отделения д.м.н., профессор Тепляков А.Т.) ГУ НИИ кардиологии СО РАМН и установлены основные фармакокинетические параметры;

• предложены методические подходы к определению соединений полипептидной структуры в биологических образцах вольтамперометрическим методом;

• предложены вольтамперометрические экспресс-методики определения гормонов: инсулина и ангиотензина II в сыворотке крови для целей изучения влияния лекарственных средств на организм человека: «Вольтамперометрический способ определения инсулина»; «Способ определения ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии».

Практическая значимость результатов исследования

Разработаны методики количественного определения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназепри-ла гидрохлорида, карведилола, инсулина и ангиотензина II в модельных растворах, лекарственных формах и сыворотке крови вольтампе-рометрическим методом, защищенные патентом Российской Федерации и внедренные в практическую деятельность;

Рассчитаны основные фармакокинетические показатели нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, полученные с использованием вольтамперо-метрии и установлена степень влияния сопутствующих заболеваний на фармакокинетику указанных препаратов;

Разработанные методики вольтамперометрического определения лекарственных средств и полипептидов используются в работе ГУ НИИ кардиологии СО РАМН, ЗАО «Вектор-Медика», ГУ Новосибирского института органической химии им. H.H. Ворожцова (НИОХ СО РАН), ФГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени E.H. Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», Государственного научного учреждения «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» СО Российской академии сельскохозяйственных наук, что подтверждено актами внедрения.

Связь темы диссертации с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России и г. Новосибирск: «Системные механизмы действия ксенобиотиков на организм и разработка новых фармакологических препаратов» № гос. регистрации 01.2.00709495, код ВНТИЦ 0203042450323 и ГУ НИИ кардиологии СО РАМН, г. Томск.

Положения, выносимые на защиту:

- исследование электрохимического поведения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола и соответствующие квантово-химические расчеты;

- разработка методик вольтамперометрического количественного определения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, в

раствора стандартного образца, модельных смесях, лекарственных формах и сыворотке крови;

- оценка валидности предлагаемых вольтамперометрических методик;

- методические подходы к количественному определению эндогенных полипептидов инсулина и ангиотензина II в сыворотке крови вольтамперометрическим методом;

- получение фармакокинетических характеристик амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола вольтамперометрическим методом у пациентов с сердечно-сосудистой патологией.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Коммуникативная технология наркологии и психиатрии» (Новосибирск, 2002); научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004); международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), VI Ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности «Сердечная недостаточность 2005» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Новосибирск, 2005). Первом съезде кардиологов Сибирского Федерального Округа (Томск, 2005), региональной конференция «Актуальные проблемы фармакотерапии с позиций доказательной медицины» (Томск, 2006).

Личный вклад автора: для получения результатов, изложенных в диссертации, автор лично изучил электрохимические свойства амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола, инсулина, ангиотензина II вольтамперометрическим методом и разработал методики количественного определения перечисленных веществ в растворах стандартных образцов, модельных смесях и биологических средах, выполнил вали-дацию предложенных методик с использованием спектрофотометрии и ВЭЖХ, провел фармакокинетические исследования и рассчитал фар-макокинетические параметры сердечно-сосудистых лекарственных средств с участием 59 пациентов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 34 работы, в том числе 8 патентов и 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 335 страницах машинописного текста, включая 107 таблиц и 81 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, семи глав, посвященных экспериментальным исследованиям, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает 297 источников, из которых 147 на иностранных языках.

Во введении обоснована актуальность изучаемой проблемы, сформулированы основная цель и задачи исследования, научная новизна, практическая значимость полученных результатов.

В обзоре литературы (первая глава) рассмотрены вопросы современного состояния терапии сердечно-сосудистых заболеваний препаратами различных классов. Приведен обзор методов анализа нибен-тана, амиодарона, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, бе-назеприла гидрохлорида и карведилола. Рассмотрены вопросы физиологической роли и методов анализа полипептидных гормонов: инсулина и ангиотензина II.

Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследования.

В третьей главе отражены результаты квантово-химического исследования нибентана и амиодарона спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола.

Четвертая глава посвящена разработке вольтамперометрических методик количественного определения лекарственных средств в растворах стандартных образцов.

В пятой главе продемонстрированы результаты подбора условий количественного определения лекарственных средств в модельных смесях и лекарственных формах, и валидация методик с использованием спектрофотометрии и высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Шестая глава посвящена подбору условий определения лекарственных и веществ в сыворотке крови вольтамперометрическим экспресс-методом и фармакокинетическим испытаниям лекарственных средств, валидации полученных результатов с применением высокоэффективной жидкостной хроматографии.

В седьмой главе изложены результаты изучения электрохимической активности гормонов: инсулина и ангиотензина II, разработке методик их определения в модельных растворах и сыворотке крови. Представлены результаты сравнительного определения инсулина в сы-

воротке крови, полученные электрохимически, с радиоиммунным методом и динамикой концентрации глюкозы после сахарной нагрузки, которые статистически обработаны в соответствии с Приказом МЗ РФ № 45 от 07.02.2000 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения российской федерации». Составлены контрольные карты определения инсулина и ангиотензина II в сыворотке крови.

В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований: патенты и акты внедрения.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В качестве объекта исследования для подбора оптимальных условий электролиза использованы субстанции:

1) нибентана [(К,8)-4-Нитро-К-[1-фенил-5-(диэтиламино)-пентил]-бензамида гидрохлорид] с содержанием действующего вещества 99,9 %, предоставленная ГУПУХЛС - ВНИХФИ г. Москва, (серия 020301, произведено 03.2001);

2) амиодарона [(2-Бутил-3-бензофуранил)-[[4-(2-диэтиламино)-этокси]-3,5-дийодфенил]-метанона гидрохлорид], предоставленного компанией KRKA (d.d., Novo mesto, Slovenia в сотрудничестве с Sanofi Pharma, France), с содержанием действующего вещества 99,9 %.

3) спираприла гидрохлорида [7-|Ж1(8)-этоксикарбонил-3-фенилпропил]-(8)-аланил]-1,4-дитиа-7-азаспиро[4,4]нонан-8(8>-карбоксильной кислоты гидрохлорид моногидрат], с содержанием действующего вещества 99,9 %, предоставленная фармацевтической фирмой Арцнеймиттельверк Дрезден Гмбх, Германия;

4) фозиноприл натрия [1(8*(К*)],2а,4РН-циклогексил-1-[[[2-метил-1-(1-оксипропокси)пропокси](4-фенилбутил)фосфонил]-ацетил]-Ь-пролина натриевая соль, с содержанием действующего вещества 99,9 %, предоставленная фармацевтической фирмой Бристол-Майерс Сквибб, Щвейцария;

5) беназеприла гидрохлорида 3-[([1-этоксикарбонил-3-фенил-(1 S)]-пропил) амино]-2,3,4-тетрагидро-2-оксо-1Н-1-(3 8)-бензазепин-1-уксусной кислоты гидрохлорид, с содержанием действующего вещества 99,9 %, предоставленной фирмой-изготовителем Novartis Farmacéutica S.A., Barbera, Испания;

6) карведилола [({±})-1-(9Н-Карбазол-4-илокси)-3-[[2-(2-метокси фенокси)этил]амино]пропан-2-ол], с содержанием действующего вещества 99,6 %, предоставленный ОАО «Химфармкомбинат «Акрихин», Россия.

7) инсулина (26,8 МЕ/мг производства ICN Biomedicals Inc., USA (США), Lot 12584-58-6;

8) ангиотензина II (Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe) (фирмы Sigma, Германия), Lot. 70 К 5138.

Для изучения влияния компонентов лекарственной формы на параметры вольтамперометрического анализа использовали инъекционные лекарственные формы «Нибентан» и «Кордарон», таблетирован-ные лекарственные формы «Кордарон», «Амиодарон», «Квадроприл», «Фозикард», «Моноприл», «Лотензин», «Дилатренд», «Карведилол», «Акридилол».

Растворы стандартных образцов готовили на воде бидистиллиро-ванной, для приготовления раствора инсулина в воде, с целью повышения растворимости, добавляли 0,1 моль/л раствор хлороводородной кислоты.

Экспериментальные данные получали на полуавтоматическом анализаторе ТА-2 (ООО НПП «Техноаналит», г. Томск) с программным обеспечением в комплекте с IBM-совместимым компьютером PENTIUM и монитором HYUNDAI. К автоматическому анализатору прилагаются ячейки со встроенными электродами. Источником информации служили вольтамперные кривые.

В работе использовали ртутно-пленочный, стекло-углеродный, графитовый, графитовый с золотым напылением и золотой электроды. Стекло-углеродный, графитовый и золотой электроды представляют собой полые фторопластовые стержни с запакованной под вакуумом медной проволокой с прикрепленным к ней серебряным стержнем, выполняющим функции проводника и служащим для закрепления электрода в приборе, а также соответствующей рабочей поверхностью, которая погружается в датчик. Электродом сравнения служил хлор-серебряный (Ag/AgCl).

В эксперименте использовали кварцевую посуду, пластиковые стаканчики, стеклянные колбы для приготовления растворов. В качестве фоновых электролитов исследовали растворы: Бритгона-Робинсона (рН 5,02; 4,35); хлоридов натрия, калия, лития, кальция; сульфатов и нитратов натрия, калия, аммония, и ряда других растворов квалификации ос.ч. и х.ч. Приготовление стандартных и фоновых растворов проводили общепринятыми методами.

Для количественного определения анализируемых веществ в модельных растворах использовали метод стандартных добавок, согласно которому, концентрацию определяемого вещества рассчитывали по формуле:

1 С ■V

__пробы добавки аликвоты_

" "/><»>? ~ 77 Г/ Г7/ >

\ проба ■сдобавкой проба ) добавки

где ¡„рост - высота пика элемента на кривой пробы, мкА;

сшот, ~ концентрация аттестованного раствора, мг/л;

Vдобавки - объем добавки, мл;

^пробас-добавкой - высота пика элемента на кривой пробы с добавкой, мкА;

„„,„,, - объем аликвоты, мл.

Каждое из приведенных цифровых значений является средним из шести измерений.

Каждый эксперимент выполнен в соответствии со следующей схемой: из программного обеспечения вольтамперометрического анализа запускали приложение, соответствующее наименованию вещества, на которое разрабатывали методику. После загрузки приложения из окна графического интерфейса открывали команду главного меню «Методика», где устанавливали следующие параметры: порядок фильтрации сигнала, количество повторов серии (2 - 5), подготовительные стадии, которые подразумевали потенциал, время пропускания газообразного азота и процесс успокоения раствора. Кроме того, для проведения анализа указывали форму, время, границы и вид развертки потенциала (возможен вариант обратного хода). Программное обеспечение подразумевает сохранение выбранных параметров. После того как все параметры программы были заданы, приступали непосредственно к процессу электролиза, для этого в три стеклянных или пласти-

новых стаканчика объемом 20 или 40 мл, соответственно, помещали по 10 или 20 мл фонового электролита и запускали программу электролиза. При этом раствор предварительно перемешивали газообразным азотом с содержанием кислорода не более 0,001 % в течение определенного времени, затем наступала стадия успокоения, и только после этого прибор фиксировал вольтамперограмму на экране монитора. Отсутствие посторонних сигналов на линии фона свидетельствовало о его чистоте. Затем в стаканчики добавляли исследуемый образец и вновь запускали программу электролиза.

Расчет квантово-химических параметров определяемых веществ произведен полуэмпирическим методом с помощью программы РМ -3 (RMS 0,1) на кафедре органической химии и технологии органического синтеза Национального исследовательского Томского политехнического университета доцентом кафедры, к.х.н., Беляниным M.JI. (заведующий кафедрой д.х.н., профессор Филимонов В.Д.), за что выражаю искреннюю признательность и благодарность.

Для валидации разработанных электрохимических методик сыворотки, содержащие лекарственные вещества проанализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на микроколоночном жидкостном хроматографе «Милихром А-02» на базе ЗАО Института Хроматографии «ЭкоНова» (г. Новосибирск) в режиме градиентного элюирования с многоволновой детекцией. Многоволновая фотометрическая детекция повышала надежность идентификации препарата в пробе. Использование микроколоночного варианта высокоэффективной жидкостной хроматографии позволила снизить расход растворителей и сделать анализ более экономичным.

Пробоподготовка сыворотки крови

В первую очередь сыворотку (3-4 мл) очищали от мешающих компонентов: белков и липидов. Белки осаждали раствором серной кислоты с последующем центрифугированием при 1500 об/мин на протяжении 20 мин. Надосадочную жидкость экстрагировали гексаном (выделение липидов) и центрифугировали 20 мин, органическую фазу отделяли. Определение лекарственных веществ проводили в очищенной плазме, которую предварительно сгущали до 0,2 - 0,5 мл.

3 4 5

Рис. 1. Хроматограммы спираприла гидрохлорида

а) хроматограмма стандартного раствора спираприла;

б) хроматограмма сыворотки крови.

71__Jk

Рис. 2. Хроматограммы фозиноприла натрия

а) хроматограмма стандартного раствора фозиноприла натрия;

б) хроматограмма сыворотки крови.

Анализ спираприла гидрохлорида методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

1. Стандартный раствор спираприла гидрохлорида ОД мг/л приготавливали с использованием подвижной фазы.

2. Хроматографическая система. Для анализа на хроматографе «Мил-лихром А-02» использовали колонку, заполненную силикагелем Се-парон SGX С18 (5 мкм), диаметр и длина колонки 2,0 х 120 мм. Подвижная фаза: метанол - вода (60 : 40), значение рН 3,0 (доводили 85 % фосфорной кислотой). Вводимый объем: 20 мкл сыворотки очищенной. Скорость потока: 2,0 мл/мин, время удерживания спираприла гидрохлорида 5,8 минут. Время пробега 10 минут. УФ-детекция при длине волны 217 нм.

3. Содержание спираприла гидрохлорида оценивали по методу внешнего стандарта с использованием автоматической интеграции площадей пиков (рис. 1). Путем сравнения хроматограмм испытуемых растворов с хроматограммами стандартного раствора.

Методика анализа фозиноприла натрия высокоэффективной жидкостной хроматографией

1. Стандартный раствор фозиноприла натрия приготавливали с использованием подвижной фазы.

2. Хроматографическая система. Для определения фозиноприла натрия в субстанции используют колонку, заполненную силикагелем окта-децилированным R (5 мкм) «Ватере Резолв Силика», диаметр и длина колонки 3,9 х 150 мм. Для определении фозиноприла на приборе «Миллихром А-02» использовали колонку Силасорб С18 диаметр и длина колонки 3,0x150 мм. Подвижная фаза: метанол-ацетат аммония (50 : 50), значение рН 5. Вводимый объем: 20 мкл. Скорость потока: 1,5 мл/мин, время удерживания фозиноприла натрия 5 минут. УФ-детекция при длине волне 220 нм.

3. Оценивали содержание фозиноприла натрия по методу внешнего стандарта с использованием автоматической интеграции площадей пиков (рис. 2). Путем сравнения хроматограмм испытуемых растворов с хроматограммами стандартного раствора.

Методика анализа беназеприла гидрохлорида высокоэффективной жидкостной хроматографией

1. Стандартный образец беназеприла гидрохлорида 0,1 мг/л приготавливали с использованием подвижной фазы.

2. Условия хроматографирования: для анализа на хроматографе «Миллихром А-02» использовали колонку Силасорб С18 диаметр и длина колонки 3,0 х 150 мм. . Подвижная фаза: метанол - вода (60 : 40), значение рН 3,0 (доводили 85 % фосфорной кислотой). Вводимый объем: 20 мкл сыворотки очищенной. Скорость потока: 2,0 мл/мин, время удерживания беназеприла гидрохлорида 5,8 минут. Время пробега 10 минут. УФ-детекция при длине волны 217 нм

3. Оценивали содержание беназеприла гидрохлорида в сыворотке крови по методу внешнего стандарта с использованием автоматической интеграции площадей пиков (рис. 3). Путем сравнения хроматограмм испытуемых растворов с хроматограммами стандартного раствора.

В 7

В

Рис. 3. Хроматограммы беназеприла гидрохлорида

а) хроматограмма фона

б) хроматограмма стандартного раствора беназеприла;

в) хроматограмма сыворотки крови.

JL

L

В

Рис. 4. Хроматограммы карведилола

а) хроматограмма фона

б) хроматограмма стандартного раствора карведилола;

в) хроматограмма сыворотки крови.

Методика анализа карведилола высокоэффективной жидкостной хроматографией

1. Стандартный раствор карведилола приготавливали с использованием подвижной фазы.

2. Условия хроматографирования: для анализа на хроматографе «Миллихром А-02» использовали колонку, Силасорб С18 диаметр и длина колонки 3,0x150 мм. Подвижная фаза: ацетонитрил и 0,1

моль/л раствор однозамещенного фосфата натрия в соотношении 48 : 52 по объему, значение pH доведено до значения 3,7 с помощью 85 % раствора фосфорной кислоты. Вводимый объем: 20 мкл. Скорость потока: 0,8 мл/мин, время удерживания карведилола 40,0 минут. УФ-детекция при длине волне 223 нм. 3. Оценивали содержание карведилола в сыворотке крови по методу внешнего стандарта с использованием автоматической интеграции площадей пиков (рис. 4). Путем сравнения хроматограмм испытуемых растворов с хроматограммами стандартного раствора.

Для проверки результатов определения гормонов провели определение инсулина в крови с использованием набора «INSULIN RIA DSL - 1600» (Diagnostic Systems Laboratories, Inc.; Corporate Headqarters, 445 Medical Center Blvd.; Webster, Texas 77598-4217 USA; Revision date: July 27, 1999) на базе лаборатории радио-нуклидных методов анализа ГУ НИИ кардиологии СО РАМН к.м.н. Макаровой Е.В. под руководством д.м.н. чл.-корр. РАМН Лишманова Ю.Б.

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами.

РЕЗУЛЬТАТЫ КВАНТОВО-ХИМИЧЕСКОГО ИССЛЕДОВАНИЯ МОЛЕКУЛ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ

Для теоретического обоснования электрохимической активности, выявления электрохимичепски-активных функциональных групп и конформационных особенностей исследуемых кардиопрепаратов выполнены квантово-химические расчеты структуры молекул нибента-на, амиодарона, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, бена-зеприла гидрохлорида и карведилола.

При расчете распределения электронных плотностей между всеми атомами, входящими в состав молекул, установлено, что в структуре нибентана наибольшей электрохимической активностью обладает нит-рогруппа, а также карбонильный фрагмент амидной функциональной группы, отсюда можно предположить, что вероятный механизм электрохимического процесса соответствует предлагаемому Manuel M. Baizer и Henning Lynd (1988), что и было подтверждено в Гл.4.

При исследовании структуры амиодарона обнаружено, что основное участие в электрохимическом процессе будет принимать карбонильный фрагмент, высокое напряжение данной связи обусловлено

значительной разницей в величине электронной плотности углерода и кислорода (0,410 в сравнении с -0,309), что не согласуется с нашими первоначальными предположениями по высокой вольтамперной активности ковалентно-связанного йода в бензольном кольце, активность которого уступает таковой в связи (— С -О -) и (> С = С <). Исходя из полученных результатов, можно предположить возможные механизмы реакций, проходящих на электродах. Первой стадией электровосстановления кратных связей С=С, С=0 может быть образование ион-радикалов:

С = г + ё-> С — 77

где Ъ соответствует О. Протонизация такого ион-радикала приводит к образованию свободного радикала:

с —г + е — с — т

При дальнейшем восстановлении:

С — П + Н+ — с — 7А\

Образующиеся при электродных процессах ионы би-радикалы благодаря своей высокой реакционной способности вступают в многочисленные реакции, главными из которых являются димеризации, дис-пропорционирования, взаимодействие с материалом электрода и т.д.

Относительно ковалентно связанного йода можно предположить что восстановление будет происходить по механизму замены атома галогена на водород, протекающему в различных условиях: как на ртути, так и на платине, как в водных, так и в неводных средах по следующему механизму, согласующемуся со схемой, предложенной для гетероа-томов:

ЫХ + 2ё + Н+ -» 1Ш + Х~

При подборе условий электрохимического анализа амиодарона, ориентированных на выявление лекарственного вещества по карбонильной группе, в соответствии с литературными данными (Органическая электрохимия, 1988) необходимо использование графитового или стеклоуглеродного индикаторного электрода и щелочной рН среды, что в целом совпадает с условиями анализа по ковалентно-связанному йоду. Можно также предположить, что весь фрагмент молекулы препарата электрохимически активен именно в щелочной среде, причем в качестве рабочего электрода следует апробировать графитовый, стекло-углеродный и ртутно-пленочный.

При расчете распределения электронных плотностей между всеми атомами, входящими в состав молекул ингибиторов ангиотензинпрев-ращающего фермента: спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия

и беназеприла гидрохлорида установлено, что в структуре спираприла гидрохлорида наибольшей электрохимической активностью обладают карбоксильная группа, присоединенная к пирролидиновому циклу через атом углерода, далее по убыванию: карбонильная группа и карбонильный фрагмент в сложноэфирной группе. Для фозиноприла натрия наиболее электрохимически активными являются: фрагмент фосфи-нильной группы, далее по убыванию карбоксильная группа, карбонильный фрагмент сложно-эфирной группы, карбонильная группа. В беназеприла гидрохлориде наибольшей электрохимической активностью обладают карбамидная, карбоксильная и сложно-эфирная группы. Исходя из полученных результатов по расчетам распределения электронной плотности в перечисленных лекарственных средствах, пришли к заключению, что механизм электродного процесса соответствует реакции, подобной реакции Гофера-Места, при которой карбоксильная группа замешается гидроксильной с образованием спирта и выделением углерода диоксида, и реакции Кольбе. Поскольку карбоксильная группа обладает повышенной реакционной способностью, полученные нами экспериментальные данные (Гл. 4) говорят в пользу протекания электрохимического процесса по карбоксильной группе по механизму Гофера-Места.

По данным квантово-химического анализа фозиноприла натрия, наибольшей электрохимической активностью обладает фрагмент фос-финильной группы (фосфиновой), но механизмов анодного окисления в литературных источниках не приведено (Я.И. Турьян, 1980; Органическая электрохимия, 1988), описаны лишь анодные процессы трех координированного атома фосфора в фосфорорганических соединениях с образованием катион-радикалов различной степени стабильности с дальнейшим образованием димерного катион-радикала, окисление которого дает соли дифосфония, в молекуле которых два положительно заряженных атома фосфора непосредственно связаны между собой. По своей структуре молекула фозиноприла напоминает фосфолипид, в котором имеются полярные (карбонильные и карбоксильные группы) и неполярные группы (фенилбутиловый фрагмент, циклогексан), а также остаток фосфиновой кислоты (вместо остатка фосфорной). Вероятно, этим объясняется его способность проникать в жировые ткани, что коррелирует с полученными нами данными о кумуляции фозиноприла натрия (Гл. 6).

При расчете распределения электронных плотностей между всеми атомами, входящими в состав молекулы карведилола, установлено, что

наиболее электрохимически активными являются: гидроксильная группа и атом кислорода алкилоксифенильной группы. Анализируя литературные данные, можно сделать предположение, что в подобных условиях при электрохимическом окислении гидроксильной группы, потенциал электролиза смещается в более положительную область, при этом на индикаторном электроде в водной среде образуется катион-радикал, который, теряя протон и электрон, образует карбениевый ион, образующий впоследствии оксогруппу. При этом в молекуле происходит перераспределение электронной плотности, соответственно, изменение полярности и геометрии молекулы, поэтому она начинает адсорбироваться на индикаторном электроде.

Полученные результаты квантово-химического анализа использованы нами в Гл. 4 для разработки вольтамперометрических методик.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗРАБОТКИ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ В РАСТВОРЕ СТАНДАРТНОГО ОБРАЗЦА

Начальным этапом в разработке методики количественного определения лекарственных средств являлся выбор оптимальных условий обнаружения аналитического сигнала. Принимая во внимание результаты квантово-химического анализа (Гл. 3), где была выявлена высокая электрохимическая активность определенных функциональных групп, экспериментально подобрали условия электрохимического анализа: состав и рН фонового электролита, природу рабочего электрода, время и потенциал электролиза, границы и форму развертки потенциала (табл. 1). Сигналы лекарственных средств регистрировали преимущественно в положительной области потенциалов (рис. 6), за исключением спираприла гидрохлорида. Сигналы амиодарона, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола регистрировали в области 0,2 - 0,7 В, нибентан, ввиду присутствия в структуре молекулы нитрогруппы, определяли 1,5 - 2 В в виде двух сигналов. Минимальная определяемая концентрация лекарственных веществ составила 1 пг/л.

Таблица 1

ОПТИМАЛЬНЫЕ УСЛОВИЯ ЭЛЕКТРОЛИЗА ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ

"~~\Вещество Параметр АМИОДАРОН НИБЕНТАН КАРВЕДИ-ЛОЛ СПИРАПРИЛА ГИДРОХЛОРИД ФОЗИНОПРИЛ НАТРИЯ БЕНАЗЕПРИЛА ГИДРОХЛОРИД

Фоновый электролит 0,005 моль/л раствор NH4NO3 в 0,015 моль/л растворе NaHCCb 0,01 моль/л раствор KCl 0,005 моль/л раствор KCl 0,01 моль/л раствор NaN03 0,005 моль/л раствор (NH4)2HP04

рн 9,0 6,5 - 7,0 3,0 3,0 6,0 6,0 - 7,0

Потенциал электролиза, В - 1,20 2,20 - 0,40 - 0,40 1,00 - 1,30

Время электролиза, с 300 180 210 210 270 210

Границы развёртки потенциала, В (- 1,20) 0,70 2,20 (-1,50) (-0,4) 1,50 (-0,4) 1,50 (- 0,50) 1,50 (-1,30) -> 1,50

Форма развёртки потенциала Ступенчатая Квадратно-волновая Постоянно-токовая

Скорость развёртки потенциала, мВ/с 70 50 150 25 70 50

Д Е

Рис. 6. Вид вольтамперометрических кривых для раствора стандартного образца нибентана (А), аимодарона (Б), спираприла гидрохлорида (В), фозиноприла натрия (Г), беназеприла гидрохлорида (Д), карведилола (Е) в подобранных условиях

1 - линия фона;

2 - вольтамперограмма, соответствующая пробе (0,01 мл);

3 - вольтамперограмма, соответствующая пробе с добавкой (0,02 мл).

Зависимость силы тока в цепи от концентрации лекарственных веществ в датчике носила линейный характер до определенного момента, а затем резко уменьшалась. Данная особенность характерна для веществ органической природы и связана с тем, что их крупные молекулы постепенно занимают активные центры электрода, уменьшая тем самым его рабочую поверхность.

С целью проверки воспроизводимости результатов определения лекарственных средств по разработанным методикам поставили тест «введено - найдено» для ста двадцати проб с концентрацией около 1000; 100; 10; 1; 0,1 и 0,01 мг/л, по двадцать проб для каждой концентрации. Полученные результаты подвергли статистической обработке. Погрешность всех методик составила не более 10%, что соответствует погрешности вольтамперометрического метода, причем коэффициент Стьюдента, полученный расчетным путем, практически во всех случаях не превышал табличный, исключение составило определение нибентана в концентрации 0,01 мг/л, которое отягощено систематической ошибкой в 1,21%.

Таким образом, в результате проведенных исследований выявлена способность и подобраны рациональные условия концентрирования лекарственных средств на поверхности рабочих электродов, сопровождающиеся регистрацией сигнала вещества на вольтамперограмме.

Установленные параметры методики дали возможность с высокой чувствительностью и экспрессностью определять содержание лекарственных средств в модельных растворах лекарственных форм вольтам-перометрическим методом, что в дальнейшем позволило перенести разработанные методики на модельные смеси, лекарственные формы и биологические среды.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАЗРАБОТКИ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИХ МЕТОДИК КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ В МОДЕЛЬНЫХ СМЕСЯХ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ

Поскольку вольтамперометрический метод анализа характеризуется высокой чувствительностью, избирательностью и экспрессностью, представляло интерес изучить возможность его использования для количественного определения действующих веществ в лекарственных формах.

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА, СОДЕРЖАЩИМСЯ В НАВЕСКЕ ДЛЯ ПРИГОТОВЛЕНИЯ МОДЕЛЬНОГО РАСТВОРА, И ОПРЕДЕЛЕННЫМ ВОЛЬТАМ-ПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДОМ (Г = 8; I [(Р; при Р = 95%] = 2,23)

№ Исследуемый образец модельного раствора X У ъ (АЬ) а (Да) 'о г

1. нибентана для инъекций 0,110 г 0,113 г 1,018 (0,009) 0,0001 (0,001) 5,439 • 1<Г7 0,001 0,999

2. амиодарона для инъекций 90,15 мг 91,10 мг 0,993 (0,020) 1,600 (2,216) 3,580 1,050 0,999

3. амиодарона, приготовленного из смеси для таблетирования 275,00 мг 275,56 мг 0,997 (0,024) 1,473 (7,316) 23,061 3,452 0,999

4. спираприла гидрохлорида, приготовленного из смеси для таблетирования 5,50 мг 5,62 мг 0,995 (0,056) 0,147 (0,347) 5,175 ■ 10"2 0,164 0,997

5. фозиноприла натрия, приготовленного из смеси для таблетирования 22,60 мг 22,64 мг 0,997 (0,016) 0,117 (0,440) 11,010-10"2 0,207 0,999

6. беназеприла гидрохлорида, приготовленной из смеси для таблетирования 22,60 мг 22,64 мг 1,006 (0,016) 0,098 (0,431) 10,604 • 10~2 0,202 0,999

7. карведилола, приготовленного из смеси для таблетирования 22,60 мг 22,67 мг 0,998 (0,018) 0,121 (0,485) 13,386- ю-2 0,229 0,999

Таблица 3

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ НИБЕНТАНА В ИНЪЕКЦИОННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ ДЛЯ ИНФУЗИЙ, ОПРЕДЕЛЕННЫМ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ И ВОЛЬТАМПЕ-РОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ (Г= 8; I [(Р; при Р = 95 %] = 2,23)

№ Фирма-изготовитель X У ъ (АЪ) а (Да) *о2 г

1. 1 % в ампулах по 2 мл (ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ), Россия, серия 200902 9,600 мг 9,827 мг 0,964 (0,049) 0,573 (0,472) 3,009- Ю-4 0,230 0,998

2. 1 % в ампулах по 2 мл (ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ), Россия, серия 241002 9,951 мг 10,041 мг 1,031 (0,095) 0,217 (0,945) 1,407- Ю-4 0,431 0,993

3. 1 % в ампулах по 2 мл (ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ), Россия, серия 261002 10,029 мг 10,262 мг 0,977 (0,111) 0,468 (1,114) 4,988-10"4 0,537 0,990

Таблица 4

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ АМИОДАРОНА В ИНЪЕКЦИОННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ ДЛЯ ИНФУЗИЙ 150 мг в 3 мл, ОПРЕДЕЛЕННЫМ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ И ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ (f=8; t [(Р; f) при Р = 95%] = 2,23)

№ Фирма-изготовитель X 7 b (Ab) а (Да) *о2 г

1. «Санофи-Авентис Франс», Франция, серия 1442, № 6 51,565 54,835 0,774 (0,103) 14,932 (5,324) 4,724 • ю-2 3,236 0,986

2. «Санофи-Авентис Франс», Франция, серия 1538, №6 48,630 52,670 1,113 (0,091) 1,458 (4,448) 5,695 -10~2 1,880 0,995

3. «Санофи-Авентис Франс», Франция, серия 50,085 52,420 1,024 1,128 1,056- 1,670 0,996

1541, №6 (0,073) (3,636) КГ1

4. «Санофи-Авентис Франс», Франция, серия 1616, № 6 50,305 52,595 1,056 (0,103) 0,546 (5,167) 1,516- ю-2 2,300 0,992

Таблица 5

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ АМИОДАРОНА В ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ, ОПРЕДЕЛЕННЫМ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ И ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕ-

СКИМ МЕТОДАМИ (£= 8; I [(Р; 0 при Р = 95 %] = 2,23)

№ Фирма-изготовитель X У b (дь) а (да) 4 Sx г

1. «АМИОДАРОН 200 мг» (№30, серия 110510, ЗАО «Северная Звезда», Россия) 201,72 206,91 0,953 (0,073) 14,766 (14,823) 1,975 • ю-2 7,319 0,995

2. «КОРДАРОН 200 мг» (№30, серия 0V010, «Санофи-Авентис Франс», Венгрия) 202,40 206,38 0,876 (0,081) 28,989 (16,338) 6,948 • ю-2 8,767 0,993

3. «КОРДАРОН 200 мг» (№30, серия 1084, «Санофи-Авентис Франс», Франция) 201,30 204,67 0,119 (0,081) 23,890 (16,338) 3,274 • ю-2 10,867 0,990

4. «КОРДАРОН 200 мг» (№30, серия 1085, «Санофи-Авентис Франс», Франция) 193,96 197,10 0,957 (0,045) 11,498 (8,651) 4,764 ■ ю-3 4,252 0,998

5. «КОРДАРОН 200 мг» (№30, серия 1086, «Санофи-Авентис Франс», Франция) 199,64 201,88 1,045 (0,118) 6,691 (23,629) 1,788 • 10-3 10,637 0,990

6. «КОРДАРОН 200 мг» (№30, серия 1087, «Санофи-Авентис Франс», Франция) 200,12 203,35 0,950 (0,111) 13,147 (22,212) 1,727 • ю-2 10,991 0,989

7. «АМИОДАРОН 200 мг» (№ 10, серия 90608, ОАО «Органика», Россия) 200,23 204,46 0,954 (0,099) 13,468 (19,805) 1,104 • ю-2 9,765 0,991

8. «АМИОДАРОН 200 мг» (№30, серия 0090110, ОАО «Органика», Россия) 198,02 202,18 1,026 (0,080) 1,073 (15,854) 2,845 • ю-2 7,265 0,995

9. «АМИОДАРОН 200 мг» (№30, серия 0481108, ОАО «Органика», Россия) 200,30 204,61 0,987 (0,067) 6,970 (13,515) 2,929 • 10"3 6,442 0,996

10. «АМИОДАРОН 200 мг» (№30, серия 0491108, ОАО «Органика», Россия) 201,19 203,50 0,966 (0,037) 9,068 (7,483) 1,681 • ю-3 3,642 0,999

11. «АМИОДАРОН 200 мг» (№ 30, серия 0531108, ОАО «Органика», Россия) 201,64 203,18 1,022 (0,067) 2,950 (13,453) 5,875 • ю-3 6,189 0,997

Таблица 6

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ СПИРАПРИЛА ГИДРОХЛОРИДА В ТАБ-ЛЕТИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ «КВАДРОПРИЛ 6 мг, № 30», ОПРЕДЕЛЕННЫМ ВЭЖХ И ВОЛЬТ-АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ ($= 8; I [(Р; 1) при Р = 95 %] = 2,23)

№ Фирма-изготовитель X У Ь (дЬ) а (Да) «х г

1. Серия 9С001, «Клоке Фарма-Сервис ГмбХ», Германия 5,831 мг 6,044 мг 1,003 (0,035) 0,198 (0,203) 2,616-10~5 0,095 0,999

2. Серия 9С005, «Клоке Фарма-Сервис ГмбХ», Германия 6,051 мг 6,272 мг 0,996 (0,058) 0,244 (0,348) 3,615 • ю-5 0,164 0,997

3. Серия 9С005, «Клоке Фарма-Сервис ГмбХ», Германия 6,080 мг 6,177 мг 0,958 (0,073) 0,352 (0, 443) 8,393 • 105 0,218 0,995

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ ФОЗИНОПРИЛА НАТРИЯ В ТАБЛЕТИРО-ВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ, ОПРЕДЕЛЕННЫМ ВЭЖХ И ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ

(Г= 8; I [(Р; 0 при Р = 95 %] = 2,23)

№ Фирма-изготовитель X У b (дб) а (Да) 4 г

1. «МОНОПРИЛ 10 мг» (№ 10, серия 7026093, ООО «Серл Фарма», Россия) 10,004 мг 10,035 мг 0,994 (0,048) 0,088 (0,477) 1,115-10-5 0,225 0,998

2. «МОНОПРИЛ 10 мг» (№28, серия 9В48025, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 9,986 мг 10,033 мг 0,986 (0,048) 0,190 (0,477) 2,532 • 1<Г5 0,281 0,997

3. «МОНОПРИЛ 10 мг» (№28, серия 9К54650, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 9,967 мг 10,002 мг 1,016 (0,048) 0,121 (0,477) 2,979 • ю-5 0,256 0,997

4. «МОНОПРИЛ 10 мг» (№28, серия 9Ь50963, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 9,976 мг 10,028 мг 1,015 (0,062) 0,101 (0,620) 1,927- ю-5 0,287 0,997

5. «МОНОПРИЛ 10 мг» (№28, серия 9Ь50966, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 9,973 мг 10,005 мг 0,993 (0,067) 0,105 (0,671) 1,985 • ю-5 0,318 0,996

6. «МОНОПРИЛ 20 мг» (№20, серия 9Ь48530, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 19,992 мг 20,043 мг 0,987 (0,050) 0,317 (0,999) 3,472 ■ 105 0,476 0,998

7. «МОНОПРИЛ 20 мг» (№ 20, серия 9Ь48530, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 19,981 мг 20,052 мг 1,006 (0,043) 0,054 (0,850) 1,nolo5 0,397 0,999

8. «МОНОПРИЛ 20 мг» (№ 28, серия 0064054, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 19,930 мг 20,008 мг 0,970 (0,074) 0,678 (1,468) 1,812-i<r5 0,712 0,995

9. «МОНОПРИЛ 20 мг» (№ 28, серия 9Ь47543, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 19,996 мг 20,085 мг 0,994 (0,049) 0,211 (0,981) 1,114-10"5 0,464 0,998

10. «МОНОПРИЛ 20 мг» (№ 28, серия 9Ь52407, 19,982 20,035 1,022 0,380 2,452 • 0,591 0,997

«Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) мг мг (0,064) (1,283) 1(Г4

11. «МОНОПРИЛ 20 мг» (№ 28, серия 9Ь54033, «Бристол - Майерс Сквибб С.р.Л.», Италия) 19,986 мг 20,019 мг 0,982 (0,088) 0,395 (1,760) 4,994 • 10"5 0,843 0,994

12. «ФОЗИКАРД 5 мг» (№ 28, серия 1199421209, АО «Актавис», Исландия) 5,039 мг 5,060 мг 1,101 (0,118) 0,488 (0,589) 7,699 ■ 10'5 0,251 0,990

13. «ФОЗИКАРД 5 мг» (№ 28, серия 1236970510, АО «Актавис», Исландия) 5,039 мг 5,062 мг 0,927 (0,095) 0,393 (0,481) 1,918- ю-5 0,244 0,992

14. «ФОЗИКАРД 10 мг» (№28, серия 1236970510, АО «Актавис», Исландия) 9,994 мг 10,032 мг 0,975 (0,067) 0,292 (0,668) 1,835 • ю-5 0,322 0,996

15. «ФОЗИКАРД 10 мг» (№28, серия 1236940510, АО «Актавис», Исландия) 9,963 мг 10,021 мг 0,993 (0,042) 0,747 (0,423) 7,544 • 10"6 0,214 0,998

16. «ФОЗИКАРД 10 мг» (№28, серия 1236950510, АО «Актавис», Исландия) 9,997 мг 10,018 мг 0,995 (0,062) 0,069 (0,617) 1,121 • ю-5 0,292 0,997

17. «ФОЗИКАРД 20 мг» (№28, серия 1168840709, АО «Актавис», Исландия) 20,032 мг 20,063 мг 0,987 (0,058) 0,300 (1,152) 1,088 ■ ю-5 0,549 0,997

18. «ФОЗИКАРД 20 мг» (№28, серия 1181600909, АО «Актавис», Исландия) 20,019 мг 20,023 мг 0,977 (0,056) 0,224 (1,143 1,036 • ю-5 0,501 0,998

19. «ФОЗИКАРД 20 мг» (№ 28, серия 1230050410, АО «Актавис», Исландия) 20,020 мг 20,070 мг 1,029 (0,059) 0,531 (1,182) 2,173 • 10 5 0,540 0,997

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ БЕНАЗЕПРИЛА ГИДРОХЛОРИДА В ТАБ-ЛЕТИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ «ЛОТЕНЗИН 20 мг, №28», ОПРЕДЕЛЕННЫМ ВЭЖХ И ВОЛЬТ-АМПЕРОМЕТРИЧЕСКИМ МЕТОДАМИ (Г= 8; I [(Р; при Р = 95 %] = 2,23)

№ Фирма-изготовитель X У Ь О) а (да) г

1. Серия 5М56510, «НовартисФарма С.п.А.», Италия 20,012 мг 20,063 мг 0,996 (0,041) 0,124 (0,822) 1,120 • ю-5 0,388 0,999

2. Серия 5М56530, «НовартисФарма С.п.А.», Италия 20,030 мг 20,125 мг 1,012 (0,105) 0,143 (2,102) 2,790 • КГ1 0,991 0,999

3. Серия 5М56580, «НовартисФарма С.п.А.», Италия 20,241 мг 20,256 мг 0,997 (0,043) 0,281 (0,872) 3,052 • 10"4 0,412 0,999

Таблица 9

ПАРАМЕТРЫ ЛИНЕЙНОЙ ЗАВИСИМОСТИ МЕЖДУ КОЛИЧЕСТВОМ КВАДРОПРИЛА В ТАБЛЕТИРОВАННОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЕ, ОПРЕДЕЛЕННЫМ СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ И ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИЧЕ-

СКИМ МЕТОДАМИ ^=8; I [(Р; 0 при Р = 95%] = 2,23)

№ Фирма-изготовитель X У Ь (ДЬ) а (да) -о2 г

1. «ДИЛАТРЕНД 12,5 мг» (№30, серия М1076В01, «Ф. Хоффман - Ля Рош Лтд», Италия) 12,533 мг 12,584 мг 0,980 (0,031) 0,308 (0,391) 8,869 • Ю^6 0,188 0,999

2. «ДИЛАТРЕНД 25 мг» (№30, серия М1112В01, «Ф. Хоффман - Ля Рош Лтд», Италия) 24,890 мг 25,130 мг 0,976 (0,034) 0,827 (0,859) 8,713 • КГ4 0,414 0,999

3. «ДИЛАТРЕНД 25 мг» (№30, серия М1125В01, 24,425 25,560 1,005 0,015 6,540 • 0,745 0,997

«Ф. Хоффман - Ля Рош Лтд», Италия) мг мг (0,065) (1,591) ю-4

4. «ДИЛАТРЕНД 25 мг» (№30, серия М1125В01, «Ф. Хоффман — Ля Рош Лтд», Италия) 25,030 мг 25,085 мг 0,976 (0,069) 0,655 (1,735) 2,618 • ю-4 0,836 0,996

5. «ДИЛАТРЕНД 25 мг» (№30, серия М1147В01, «Ф. Хоффман — Ля Рош Лтд», Италия) 25,020 мг 25,190 мг 1,286 (0,126) 6,979 (3,151) 1,786-10^ 1,153 0,992

6. «КАРВЕДИЛОЛ 0,0125 г» (№ 30, серия 090908, ЗАО «Макиз-ФАРМА», Россия) 12,519 мг 12,565 мг 1,037 (0,062) 0,412 (0,779) 2,469 • 10"5 0,354 0,997

7. «КАРВЕДИЛОЛ 25 мг» (№30, серия 040710, ЗАО «Вертекс», Россия) 25,055 мг 25,210 мг 0,978 (0,105) 0,719 (2,643) 2,735 • 10"4 1,272 0,991

8. «АКРИДИЛОЛ 6,25 мг» (№30, серия 10808, ОАО «Акрихин ХФК», Россия) 6,100 мг 6,345 мг 0,963 (0,042) 0,471 (0,254) 1,887-10^ 0,124 0,998

9. «АКРИДИЛОЛ 12,5 мг» (№30, серия 10210, ОАО «Акрихин ХФК», Россия) 12,524 мг 12,563 мг 0,971 (0,040) 0,402 (0,503) 8,498 • ю-6 0,243 0,999

10. «АКРИДИЛОЛ 12,5 мг» (№ 30, серия 20410, ОАО «Акрихин ХФК», Россия) 12,475 мг 12,545 мг 1,000 (0,083) 1,035 (0,503) 2,500 • 10"5 0,487 0,995

11. «АКРИДИЛОЛ 12,5 мг» (№30, серия 30610, ОАО «Акрихин ХФК», Россия) 12,486 мг 12,566 мг 0,971 (0,063) 0,441 (0,787) 2,211 • 10~5 0,381 0,997

12. «АКРИДИЛОЛ 25 мг» (№ 30, серия 10410, ОАО «Акрихин ХФК», Россия) 24,980 мг 25,225 мг 0,955 (0,078) 1,357 (1,950) 2,340 • 10^ 0,960 0,995

13. «АКРИДИЛОЛ 25 мг» (№ 30, серия 10410, ОАО «Акрихин ХФК», Россия) 24,920 мг 25,220 мг 0,965 (0,117) 1,165 (2,910) 5,924 • ю-4 1,418 0,988

14. «АКРИДИЛОЛ 25 мг» (№ 30, серия 61209, ОАО «Акрихин ХФК», Россия) 24,725 мг 25,025 мг 0,093 (0,117) 2,295 (2,910) 5,651 • 10"4 1,122 0,993

Данный раздел работы состоял из следующих этапов:

1. Приготовление модельных смесей, соответствующих составу лекарственной формы, с последующим вольтамперометрическим определением лекарственного средства в присутствии вспомогательных веществ и статистической оценкой параметров линейной зависимости между массой навески и определенным количеством лекарственного средства (Табл. 2). Для всех лекарственных средств (нибентана, амиодарона, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназе-прила гидрохлорида и карведилола) было показано, что предлагаемые электрохимические методики обладают специфичностью, избирательностью, точностью, чувствительностью, воспроизводимостью и линейностью, при этом для выполнения анализа не потребовалось отделения действующего вещества от сопутствующих компонентов лекарственной формы путем фильтрования, достаточно было использовать растворитель, пригодный для растворения определяемого вещества с последующим проведением анализа в мутных растворах.

2. На втором этапе сравнивали результаты анализа исследуемых лекарственных средств в лекарственных формах вольтамперометрическим и фармакопейным методами. При анализе лекарственных форм с нибентаном, амиодароном и карведилолом в качестве стандартного использован метод спектрофотометрии в УФ-области, для исследования спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия и беназеприла гидрохлорида применяли метод высокоэффективной жидкостной хроматографии. Данный этап исследования выполнили на примере 57 серий лекарственных форм (Табл. 3 - 9).

Таким образом, пришли к заключению, что результаты, полученные при количественном определении лекарственных средств вольтамперометрическим методом коррелируют с результатами, полученными с использованием методов, рекомендованных нормативной документацией, коэффициент корреляции во всех случаях был не ниже, чем 0,98. Следовательно, представляло интерес использование вольтамперомет-рической методики для анализа лекарственных форм.

Подбор условий количественного определения лекарственных веществ в лекарственных формах, отличающегося специфичностью, точностью, воспроизводимостью и чувствительностью - сложный многостадийный процесс, каждый этап которого отвечает за возможности методики в определении качества изготовленной лекарственной формы. Проведенные нами исследования продемонстрировали точность предлагаемых вольтамперометрических методик на примере установления

параметров линейной зависимости при анализе модельных смесей с переменным количеством лекарственных средств. Воспроизводимость вольтамперометрических методик анализа была доказана при выполнении анализа каждой серии лекарственной формы в десяти повторно-стях. Специфичность методики подтверждена наличием линейной зависимости между количеством определенного лекарственного вещества и его фактическим содержанием в модельной смеси и лекарственной форме, а также выраженной корреляцией с результатами, полученными с использованием фармакопейных методик. Высокая чувствительность вольтамперометрических методик наглядно показана при исследовании модельных образцов и лекарственных форм с минимальным содержанием лекарственного средства.

РЕЗУЛЬТАТЫ ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ

На начальном этапе исследования адаптировали предлагаемые нами методики количественного определения лекарственных средств применительно к сыворотке крови. В результате проведенной работы установили, что при анализе нибентана, амиодарона и беназеприла гидрохлорида требуется дополнительная пробоподготовка сыворотки крови, тогда как спираприла гидрохлорид, фозиноприл натрия и карведилол целесообразно анализировать непосредственно в нативной сыворотке крови.

В работе изучена фармакокинетика 1 % раствора нибентана в виде инъекционной лекарственной формы. Объектом исследования являлась сыворотка крови пациентов мужского пола, в возрасте от 37 до 64 лет с диагнозом фибрилляции предсердий, доставленных в лечебное учреждение по скорой помощи. Раствор нибентана вводили болюсно в разовой дозе 10 мг, под строгим мониторингом ЭКГ. Кровь отбирали из вены предплечья в сухие, чистые пробирки через определенные интервалы времени (5, 10, 15, 20, 30, 45, 60, 90 мин) после введения препарата. Полученную кровь центрифугировали в течение 10 мин, проводили пробоподготовку и сразу анализировали методом катодной вольтамперометрии с накоплением. Содержание нибентана в анализируемых образцах находили методом добавок. По данным точкам восстановили ход всей зависимости концентрации нибентана в крови от времени, представленной на рисунке 7А.

Анализируя полученные результаты, можно прийти к заключению, что выбранная одночастевая модель адекватно оценивает фармакокинетику нибентана, так как объем распределения препарата не превышает 3,17 л, следовательно, основная масса вещества находится в кровяном русле и мало распределяется по тканям организма. Из литературных данных известно, что оптимальной является величина Сер, установившаяся в интервале так называемого «коридора безопасности» - Сэф < Сер < С8. Исходя из полученных фармакокинетических данных, пациентов можно разделить на две группы, к первой - относятся те, у которых начальная дозировка препарата (Он) составляет 10,0-16,0 мг, вторая группа характеризуется величиной (Ои) в пределах 20,0 - 40,0 мг, при поддерживающей дозе (Опод), находящейся в пределах 3,5 - 8,0, практически для всех пациентов, за исключением пациента № 3, у которого поддерживающая доза составляет 0,93 мг, что можно объяснить высоким значением периода полувыведения (0,203 ч), клиренс данного препарата практически не зависит от индивидуальных особенностей организма. Полученные фармакокинетические параметры согласуются с литературными данными (В.В. Чистяков и соавт., 2006). По результатам фармакокинетических испытаний можно сделать вывод о том, что фармакологический эффект нибентана обусловлен как самим препаратом, так и его метаболитами, что подтверждают литературные источники (В.В. Чистяков и соавт., 2006), кроме того, соединение активно и прочно связывается с белками крови, так как его концентрация через 5 мин после введения уменьшается в 1,5-2 раза. Фармакокинетическое и фармакодинамическое различие в продолжительности действия нибентана (1,5 и 8 ч, соответственно) может свидетельствовать о том, что в процессе быстрой биотрансформации (1,5 ч) выделяются активные метаболиты, действующие более продолжительно (до 8 ч) и не проявляющие электрохимической активности в подобранных условиях эксперимента. В связи с этим, терапию нибентаном рекомендуется проводить под постоянным мониторным контролем ЭКГ.

Динамику концентрации амиодарона в крови изучили при одновременном внутривенном и пероральном введении под строгим мониторингом ЭКГ, что соответствует схеме лечения данным препаратом, при этом достигается максимальное насыщение организма, сопровождающееся ярко-выраженным терапевтическим эффектом. Внутривенное введение проводили инфузионно в дозе 300 мг, таблетированная лекарственная форма содержала 200 мг

лекарственного вещества. Поскольку терапию проводили одновременно инъекционной и таблетированной лекарственными формами, не представлялось возможным рассчитать фармакокинетические параметры с использованием классического алгоритма, поэтому приняли во внимание исключительно сведения по достижению терапевтической концентрации и времени полувсасывания в сочетании с полувыведением, при этом терапевтическая концентрация амиодарона в крови составила 0,5 - 2 мг/л. Суммарные данные по суточной динамике амиодарона для каждого пациента, представлены на рисунке 7Б. Анализ графиков показывает, что практически на всех кривых присутствуют три максимума различной степени выраженности, при этом первый максимум характеризуется резким подъемом и резким спуском. Второй максимум в шести из восьми случаев присутствует в виде волны или плеча, исключение составляют пациенты № 5 и № 6, где второй максимум более выражен по сравнению с первым и имеет такие же резкие подъем и спуск, что обусловлено повторным введением лекарственного вещества, так как ранее введенная доза была элиминирована из организма наполовину и более. Третий максимум присутствует в виде пика или волны с резким подъемом и пологим спуском, причем по времени он совпадает практически для всех пациентов. Исключение составляют пациенты № 4 и № 7, для которых данный эффект соответствует пятичасовой точке и сочетается со слабой выраженностью второго максимума.

Разработанные методики количественного определения спираприла гидрохлорида и фозиноприла натрия и беназеприла гидрохлорида в сыворотке крови, позволили провести фармакокинетические исследования лекарственных веществ для группы пациентов с хронической сердечной недостаточностью. В настоящее время препараты активно применяют при лечении данной патологии. В соответствии с инструкциями по применению данных лекарственных средств рекомендуемые средние терапевтические дозы при лечении сердечной недостаточности для спираприла гидрохлорида составляют от 3 до 6 мг, для фозиноприла натрия от 10 до 40 мг, для беназеприла гидрохлорида 5-20 мг. В клиническом эксперименте с учетом исходного уровня артериального давления и проводимой мочегонной терапией начальные дозы препаратов подбирали индивидуально: для спираприла гидрохлорида - от 0,75 до 3 мг, для фозиноприла натрия - от 2,5 до 7,5 мг, для беназеприла гидрохлорида

5 мг. В фармакокинетические исследования для спираприла гидрохлорида и беназеприла гидрохлорида было включено по 11 пациентов и 10 - для фозиноприла натрия. После приема препаратов в виде таблетированных лекарственных форм забор крови осуществляли до и через определенные интервалы времени для спираприла гидрохлорида (15, 30, 60, 90, 120, 240, 480, 1440 минут, 2, 14, 28, 56 сутки), для фозиноприла натрия (15, 30, 60, 120, 180, 360, 480, 720, 1440 минут, 3, 14, 28, 56 сутки), для беназеприла гидрохлорида (15, 30, 60, 90 мин, 2, 4, 8, 24 ч). Полученную сыворотку анализировали вольтамперометрическим методом.

На рисунке 8А представлены фармакокинетические кривые (фармакокинетический профиль) концентрации спираприла гидрохлорида в определенные интервалы времени у каждого отдельного пациента, описывающие основные фармакокинетические процессы, происходящие с исследуемым препаратам. Анализируя полученные результаты, можно прийти к заключению, что константа элиминации у всех пациентов находится в узком промежутке значений, то есть мало зависит от индивидуальных особенностей организма за исключением пациента № 3, который находился в прединфарктном состоянии (эпизод инфаркта через день после фармакокинетических исследований). Кроме того, в зависимости от индивидуальных особенностей организма, препарат может находиться или в кровяном русле (объем распределения не превышает 5 л, пациенты №3, №4, №5, №8, №10, №11), или распределяться по тканям организма (пациенты № 1, № 2, № 6, № 7, № 9). Для двух пациентов (№ 5, № 7) величина ССр попадает в интервал безопасности. Однако для большинства участвовавших в исследовании (испытуемые № 1, №2, №6, №10, № 11) наблюдали быстрое выведение препарата и достижение уровня концентрации ниже минимального эффективного за счет малой величины 1т или высокой Уй, что означает низкую эффективность терапии в предложенной дозировке. Для пациентов № 3, № 4, № 8, № 9, напротив, установился высокий уровень концентрации препарата, выше максимально допустимого, то есть в данном случае высока вероятность возникновения токсических явлений. Исходя из полученных фармакокинетических данных, пациентов можно разделить на две группы, к первой - относятся те, у которых начальная дозировка препарата (Бн) составляет 1 - 6 мг, вторая группа характеризуется величиной (Бн) в пределах 10 - 11 мг, в свою очередь, отсюда поддерживающая доза (Бпод) практически у всех пациентов соответствует 0,69 - 3,00 мг и только у вышеупомяну-

того пациента № 3 - 8,13 мг. Максимальную концентрацию спира-прила гидрохлорида наблюдали на 109 минуте, что по своим абсолютным значениям несколько превышает соответствующие показатели, представленные в литературе, причем у пациента № 8 отмечали самое медленное достижение максимальной концентрации - через 240 мин. Вместе с тем, установленные нами количественные параметры не противоречат особенностям всасывания лекарственных препаратов в слизистой ЖКТ при сердечной недостаточности. Время полуэлиминации спираприла гидрохлорида в среднем по группе составляет 3,89 ч, причем у пациента № 8 процесс элиминации протекает атипично, с задержкой лекарственного вещества. Объем распределения лекарственного препарата колеблется в широком диапазоне у различных пациентов (от 1,52 до 25,72 литра), но при этом наибольшие вариации показателя наблюдались у пациентов со 2 ФК ХСН (по КУНА) (№ 1 и № 9), а наименьшие у больного с 4 ФК ХСН (№ 8).

Фармакокинетический профиль препарата «Моноприл» (фозиноприлат натрия) для каждого пациента представлен на рисунке 8Б. При анализе средних фармакокинетических показателей для группы пациентов с хронической сердечной недостаточностью, перенесших инфаркт миокарда, мы их также разделили на две группы, к первой - отнесли тех, у которых начальная дозировка препарата фн) составляет 2 - 7 мг, вторая группа характеризуется величиной (Оц) в пределах 11-20 мг. Среднее значение по группе (Бн) соответствовало 7,1 мг при поддерживающей дозе (БПОд) 2,27 мг. Константа элиминации у всех пациентов находится в узком промежутке значений, то есть мало зависит от индивидуальных особенностей организма, средний результат по группе 0,26 ч~ , при этом у половины пациентов основная масса препарата находится в кровяном русле (объем распределения не превышает 5 л, пациенты №1, №4, №6, № 7, № 9). Отмечено, что для большинства участвовавших в исследовании (испытуемые №1, №2, №6, №10, №11) наблюдали быстрое выведение препарата и достижение уровня концентрации ниже минимального эффективного за счет малой величины или высокой что означает низкую эффективность лекарственного средства в предложенной дозировке. Максимальная концентрация ЛВ (1тах ) для фозиноприла натрия достигает своего наивысшего значения на 160 минуте наблюдения, причем у трех пациентов № 3, №7 и №10 наблюдается самое медленное достижение максимальной концентрации - через 360 мин.

Концентрация нибен-ТЛН51 в сыворотке крови,

МГ/'Л

10

8 6 4 2 0

2«

4«

60

80 100

Время, мин

1хч IIII «411 4,3

рация

амиода- 4

рока в сыворотке крови. мг/Л .3

2.5 2

1,5 1

0.5 0

г" / \ : Д|1||1|И||

----------~------ — — — -

V /X ..................................Ж...........................^ч^....................................

........д

.........................................

8 10 Время, ч

В

Рис. 7. Фармакокинетические кривые нибентана (А), амиодарона (Б) и карведилола (В)

1000 12 СЮ 1-400

Время, мин

Кондейт ряция спира-пр ила гндро-

х. 1«»р иди, г»пг 'л

1,6

1,2

О ,6 о,а. о,2 о

Ш

А

Рис. 8. Фармакокинетические кривые спираприла гидрохлорида (А), фозиноприла натрия (Б) и беназеприла гидрохлорида (В)

Концентрация беназеприла г/хл в крови.

~2С 840 £»60 1080 12 ОО 1-ЫО

Вргом, мни

Концент-1»1ЦИМ ф01НН0-

пр ИЛ;1 НИТ1ЖЯ, 1

количественные параметры не противоречат особенностям всасывания лекарственных препаратов в слизистой ЖКТ при сердечной недостаточности. Время полуэлиминации фозиноприла натрия в среднем по группе составляет 3,94 ч. Объем распределения лекарственного препарата колебался достаточно в широком диапазоне у различных пациентов (от 1,4 до 16,2 литра), но при этом наибольшие вариации показателя наблюдали у пациентов № 2 и № 3 (III - IV ФК по NYHA), а наименьшие у № 6 и № 9 (II - III ФК по NYHA).

Фармакокинетический профиль таблетированной лекарственной формы «Лотензин» (беназеприла гидрохлорид) представлен на рисунке 8В. Исходя из полученных результатов, концентрация беназеприла гидрохлорида в крови после однократного приема внутрь достигает максимума через 90,00 ± 10,80 мин, период полувыведения препарата из организма составляет 5,51 ± 0,70 ч. На основе усредненных значений фармакокинетических параметров пришли к заключению, что для данной группы пациентов динамика концентрации беназеприла гидрохлорида характеризуется высокой скоростью всасывания 21,12 ± 4,40 мин и выведения 5,51 ± 0,70 ч, в сочетании с низкой способностью распределения по тканям организма (объем распределения 2,84 ± 0,35 л), что приводит к низкой величине средней стационарной концентрации препарата в крови 4,99 ± 1,13 нг/л. Практически для всех пациентов величина ССр не попадает в интервал «коридора безопасности». Период полувыведения беназеприла гидрохлорида, рассчитанный общепринятым способом, составил 7,9 ± 2,0 ч. Значение эффективной концентрации СЭф составило в среднем 9,45 ± 1,20 нг/мл, токсической концентрации Cs - 19,62 ± 2,07 нг/мл. Общий клиренс лотензина (С1,) равен 5,41 ± 1,10 мл/мин. Исходя из полученных фармакокинетических данных, оптимальная начальная дозировка препарата (Dh) составляет 8,28-10,18 мг, поддерживающая 5,84 - 7,36 мг.

Динамику карведилола изучали при пероральном введении в виде таблетированной лекарственной формы «Акридилол». Объектом исследования являлась сыворотка крови 11 пациентов мужского пола в возрасте 47-71 г., массой тела 60 - 105 кг с диагнозом ишемической болезни сердца II ФК ХСН (по NYHA) в сочетании с сахарным диабетом различных стадий. Фармакокинетический профиль препарата «Акридилол» для каждого пациента представлен на рисунке 7В. Из полученных данных следует, что максимальная концентрация карведилола в сыворотке крови наблюдается через 2,0 ± 0,63 ч. У двух

пациентов с замедленным всасыванием время достижения максимума составило 3 ч, в то время как, у пациентов № 2 и № 10 оно не превышало 1 ч. Практически для всех пациентов, за исключением № 8, величина Сер не попадает в так называемый «коридор безопасности». Это может быть связано с тем, что для данной группы пациентов динамика карведилола на основе усредненных значений фармакокинетических параметров, характеризуется высокой скоростью всасывания [(23,43 ± 12,63) • 10~3 мин4] и выведения [(437,91 ±

—3 —1

149,79) • 10 мин ], в сочетании с высокой способностью распределения по тканям организма (объем распределения 112,81 ± 26,95 л), что приводит к низкой величине средней стационарной концентрации препарата в крови 18,85 ± 5,58 нг/л. Значение эффективной концентрации СЭФ составило в среднем 21,04 + 4,3 нг/л, токсической концентрации Cs - 39,2 + 10,3 нг/л, максимальной концентрации Стах - 41,23 + 10,8 нг/л. Период полувыведения карведилола, рассчитанный общепринятым способом, составил 1,73 ± 0,40 ч, за исключением пациентов: № 4, № 8 и № 9, у которых наблюдали замедленное выведение препарата (10,37 - 16,11 ч), а также пациента № 2, период полувыведения у которого составил 1,95 ч, что связано с сопутствующими заболеваниями желудочно-кишечного тракта и почек, общий клиренс карведилола (Clt) не зависит от индивидуальных особенностей организма и равен 48,93 + 19,17 мл/мин. Исходя из полученных фармакокинетических данных начальная дозировка препарата (Dh) составляет 13,66 - 31,07 мг, при поддерживающей дозе (Опод), находящейся в пределах 7,17 - 12,77 мг.

Исходя из полученных результатов фармакокинетического исследования лекарственных средств вольтамперометрическим методом, можно придти к заключению об их соответствии с данными полученными другими методами и представленными в литературе.

ИЗУЧЕНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ ВОЛЬТАМ-ПЕРОМЕТРИЧЕСКОГО ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЭНДОГЕННЫХ ПЕПТИДОВ В БИОЖИДКОСТЯХ

В данном разделе работы в соответствии со стандартной схемой (Гл. 4) подобраны оптимальные условия определения инсулина (9А) и ангиотензина II (9Б) в модельных растворах и сыворотке крови (рис 9, табл. 10).

А Б

Рис. 9. Вольтамперограммы раствора инсулина (А) и ангиотензина II (В)

I

Таблица 10

УСЛОВИЯ ЭЛЕКТРОХИМИЧЕСКОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСУЛИНА И АНГИОТЕНЗИНА II В МОДЕЛЬНЫХ РАСТВОРАХ

Параметр определения Инсулин Ангиотензин II

Потенциал электролиза (-1,45) В (-1,50) В

Время электролиза 150 с 330 с

Скорость развертки вольтамперограммы 50 мВ/с 200 - 300 мВ/с

Форма развертки вольтамперограммы Постоянно-токовая

Минимально определяемые концентрации инсулина и ангиотензина II соотавили 0,01 пг/л.

Валидацию подобранных условий выполнили с использованием внутреннего стандарта, для чего провели по двадцать параллельных определений инсулина в концентрации 10"4 и Ю-5 мг/л, результаты которых статистически обработали с использованием коэффициента Стьюдента. При этом установили, что относительная погрешность среднего результата не превышает 0,5 %, отдельной варианты - 3 % и соответствует погрешности вольтамперометрического метода. Аналогичный тест для ангиотензина II состоял из двадцати параллельных определений в концентрации Ю-4, 10~5 и Ю-6 мг/л. В данном случае относительная погрешность среднего результата не превышала 1,5 %, а отдельной варианты - 6 %, что также соответствует погрешности вольтамперометрического метода. В свою очередь. Значение коэффициента Стьюдента, полученное расчетным путем для всех выборок, не превышало табличное.

Подобранные условия вольтамперометрического определения инсулина и ангиотензина II позволили выявить наличие прямолинейной зависимости силы тока в цепи от концентрации исследуемых вещества в электролитической ячейке в концентрации 1(Г*, Ю-5 и Ю-6 мг/л, что соответствует содержанию данных полипептидов в сыворотке крови.

Экспериментально установленные условия электрохимического анализа инсулина и ангиотензина II в растворах стандартного образ-цапозволили с высокой чувствительностью и экспрессностью определить микроколичества указанных полипептидов в биологических средах, при этом установили, что анализ целесообразно выполнять непосредственно в нативной сыворотке крови, изменения параметров вольтамперометрического анализа не требуется.

Валидацю разработанной вольтамперометрической методики определения инсулина в крови выполнили путем независимого параллельного контроля полученных результатов в сравнении с радиоиммунным и одновременным построением сахарной кривой (тест, отражающий биологическую активность инсулина и являющийся наиболее часто используемым в клинических лабораториях). Сравнение результатов, полученных двумя методами, показало, что отклонения в цифровых значениях не превышают коэффициента вариации. Исключения, имевшие место в 16 точках из 56 связаны, по нашему мнению, с тем что вольтамперометрическое исследование кон-

центрации инсулина выполняли непосредственно после забора крови, тогда как радиоиммунный анализ проводили после предварительной заморозки исследуемых образцов.

Для оценки возможности введения предлагаемых вольтамерометрических методик определения инсулина и ангиотензина II в клиническую лабораторную практику в соответствии с приказом МЗРФ от 07.02.2000 г. № 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения» проведен анализ двадцати образцов нормальной (непатологической) сыворотки крови (содержание глюкозы 4,8 ммоль/л) с составлением контрольной карты для каждого полипептида. Данный тест необходим для оценки систематической погрешности и общей воспроизводимости результатов.

По двадцати результатам рассчитали величину среднего значения (I: 2,0АЛ0~лш1л и 17,86 пг/мл), дисперсию (Б2: 9,96-Ю"10 и 1,50), величину среднеквадратичного отклонения (8: 32,16-10~5 и 1,22) и коэффициент вариации (СУ: 15,47 и 6,86 %) для инсулина и ангиотензина II, соответственно. Для данных выборок рассчитаны контрольные пределы: х ± 1 8, х ± 2 Б, х ± 3 Б, при этом не наблюдали значений, выходящих за пределы ± 3 Б, что свидетельствует о статистической достоверности полученных результатов и их воспроизводимости, следовательно, предлагаемые вольтамперометрические методики количественного определения инсулина и ангиотензина II могут представлять интерес в плане проведения лабораторных клинических анализов. По сравнению со стандартными методами предлагаемые вольтамперометрические методики менее затратны, хорошо воспроизводимы, соответствуют требованиям экспресс-анализа и пригодны для единичных определений.

ВЫВОДЫ

1. Выполнены квантово-химические расчеты структуры нибентана, амиодарона, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола и выявлены наиболее электрохимически активные группы: нибентан (нитрогруппа, карбонильный фрагмент амидной группы); амиодарон (карбонильная группа, бензофурановый цикл, ковалентно-связанный йод); спираприла гидрохлорид (карбоксильная группа,

карбонильная группа и карбонильный фрагмент сложно-эфирной группы); фозиноприл натрия (фосфинильная, карбоксильная, карбамидная и сложно-эфирная группы); беназеприла гидрохлорид (карбамидная, карбоксильная и сложно-эфирная группы); карведилол (гидроксильная, метокси- и фенокси-группы).

2. Впервые изучено электрохимическое поведение лекарственных средств в модельных растворах на электродах: нибентан и амиодарон - на стеклоуглеродном; фозиноприл натрия - на графитовом; спи-раприла гидрохлорид и беназеприла гидрохлорид - на золотом; карведилол - на графитовом с золотым напылением и установлена минимально-определяемая концентрация. Специфичность, точность, воспроизводимость и линейность разработанных методик подтверждена на основе статистической обработки с использованием коэффициента Стьюдента и оценки параметров линейной зависимости.

3. Впервые предложены электрохимические условия количественного определения лекарственных средств в лекарственных формах, которые валидированы на основе фармакопейных методик спектрофотометрического определения в УФ-области и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Экспериментально доказано, что предлагаемые нами методики характеризуются специфичностью и простотой пробоподготовки, которая исключает стадию фильтрования и отделения лекарственного средства от вспомогательных веществ.

4. Изучено электрохимическое поведение гормонов полипептидной структуры: инсулина на ртутно-пленочном электроде и ангиотензина II - на графитовом электроде. Получены поляризационные кривые инсулина и ангиотензина II, пригодные для аналитических целей и установлена минимально-определяемая концентрация в 1 пг/л. Установлено, что количество аминокислот в полипептидной цепи влияет на выбор варианта анализа электрохимическим методом, так, инсулин целесообразно определять катодной вольтамперометрией без накопления, а ангиотензин II, представляющий октапептид, - инверсионной вольтамперометрией.

5. Предложены оптимальные условия определения лекарственных веществ в сыворотке крови с использованием пробоподготовки. Для амиодарона предложен новый способ осаждения белков - 10 % раствором цинка сульфата. Методики определения лекарственных средств в сыворотке крови валидированы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

6. Выбранные условия вольтамиерометрического определения позволили провести фармакокинетические исследования нибентана и амиодарона, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназе-прила гидрохлорида и карведилола, результаты которых используются в работе ГУ НИИ кардиологии СО РАМН, ЗАО «Вектор-Медика», ГУ Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова (НИОХ СО РАН), ФГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени E.H. Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» СО Российской академии сельскохозяйственных наук, что подтверждено актами внедрения.

7. Разработаны методики определения инсулина и ангиотензина II в нативной сыворотке крови. Методики анализа инсулина валидирова-ны по радиоиммунному методу с одновременным построением сахарной кривой, различие в числовых показателях составило не более 15 %. С целью рекомендации использования предлагаемых вольтам-перометрических методик определения инсулина и ангиотензина II в клинических лабораториях рассчитаны коэффициенты вариации (15,47 % и 6,86 %, соответственно) и составлены контрольные карты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Терентьева C.B., Матолыгина Е.М., Кулешов В.И., Ивановская Е.А., Гу-сакова A.M. Вольтамперометрический способ определения инсулина // Патент РФ на изобретение № 2234093, опубликован 10.08.2004., Бюллетень № 22.

2. Терентьева C.B., Матолыгина Е.М., Аптекарь В.Д., Гусакова A.M., Ивановская Е.А., Тепляков А.Т. Разработка вольтамперометрической методики определения инсулина в крови // Химико-фармацевтический журнал. - 2004. -Т. 38, № 7. - С. 54 - 56.

3. Терентьева C.B., Комарова E.H., Андреева Т.И. Инверсионная вольтам-перометрия ангиотенизина II // Рациональное использование лекарств: Материалы российской научно-практической конференции (10-12 марта 2004 года, Пермь). - С. 54 - 55.

4. Терентьева C.B., Матолыгина Е.М., Чернышева C.B., Поздняков Е.Г. Использование катодной вольтамперометрии для определения концентрации инсулина в крови // Рациональное использование лекарств: Материалы российской научно-практической конференции (10 -12 марта 2004 года, Пермь). - С. 95-96.

5. Терентьева C.B., Комарова E.H. Вольтамперометрическое определение ангиотензина II // Пятый международный конгресс молодых ученых «Науки о человеке»: Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск, СибГМУ, 2004 - С. 55 - 56.

6. Терентьева C.B., Матолыгина Е.М., Чернышева C.B. Вольтамперомет-рический анализ инсулина в крови // Пятый международный конгресс молодых ученых «Науки о человеке»: Сборник статей молодых ученых и специалистов / Под ред. Л.М. Огородовой, Л.В. Капилевича. - Томск, СибГМУ, 2004 - С. 69.

7. Терентьева C.B., Автунич Е.В., Ивановская Е.А. Вольтамперометриче-ский способ количественного определения нибентана // Патент РФ на изобретение № 2247368, опубликован 27.02.2005., Бюллетень №6.

8. Терентьева C.B., Автунич Е.В., Ивановская Е.А. Способ определения амиодарона (кордарона) методом инверсионной вольтамперометрии // Патент РФ на изобретение № 2246722, опубликован 20.02.2005., Бюллетень №5.

9. Терентьева C.B., Комарова E.H., Андреева Т.И., Ивановская Е.А., Гуса-кова A.M., Карпов P.C. Способ определения ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии // Патент РФ на изобретение № 2260797, опубликован 20.09.2005., Бюллетень № 26.

10. Кузнецова A.B., Терентьева C.B., Степачева Т.А., Дербенева Н.В. Отдаленные результаты коронарного шунтирования больных инсулиннезависимым сахарным диабетом: данные 3-летнего проспективного наблюдения // Сибирский медицинский журнал. Приложение к журналу. - 2005. - Т. 20, № 2. - С. 121.

11. Левшин A.B., Тепляков А.Т., Нилогов В.Л., Лукинов A.B., Терентьева C.B., Дербенева Н.В. Влияние комбинированной терапии ингибитором АПФ квинаприлом и ß-адреноблокатором карведилолом на постинфарктное ремоде-лирование и регресс хронической сердечной недостаточности // Сибирский медицинский журнал. Приложение к журналу. - 2005. - Т. 20, №2. - С. 131132.

12. Нилогов В.Л., Тепляков А.Т., Терентьева C.B., Левшин A.B. Влияние 8-недельной терапии карведилолом и спираприлом на регресс сердечной недостаточности у больных с постинфарктной дисфункцией миокарда // Сибирский медицинский журнал. Приложение к журналу. - 2005. - Т. 20, №2. - С. 151.

13. Тепляков А.Т., Кузнецова A.B., Терентьева C.B., Степачева Т.А., Са-пожникова Т.Н. Антиишемические и метаболические эффекты кардиоселектив-ных ßi-адреноблокаторов небиволола и беталок зок у больных с постинфарктной дисфункцией сердца, ассоциированной с сахарным диабетом 2-го типа // Сибирский медицинский журнал. Приложение к журналу. - 2005. - Т. 20, № 2. - С. 214-215.

14. Комарова E.H., Терентьева C.B., Тепляков А.Т., Гарганеева A.A., Нилогов В.Л. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики моноприла у пациентов с хронической сердечной недостаточностью // Сердечная недостаточность 2005: Тезисы VI ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности (7-9 декабря 2005 года, Москва). - С. 111.

15. Терентьева C.B., Комарова A.C., Комарова E.H., Тепляков А.Т., Гарга-неева A.A., Нилогов B.JI. Изучение фармакокинетики и фармакодинамики квад-роприла у пациентов с хронической сердечной недостаточностью / // Сердечная недостаточность 2005: Тезисы VI ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности (7-9 декабря 2005 года, Москва). - С. 111.

16. Комарова E.H., Чернышева C.B., Терентьева C.B., Комарова A.C., Нилогов В.Л., Аптекарь В.Д., Гаргенеева A.A., Тепляков А.Т. Изучение фармакокинетики беназеприла гидрохлорида и спираприла гидрохлорида // Тезисы докладов XII Российского Национального конгресса «Человек и Лекарство», г. Москва 18-22 апреля 2005 г. - С. 415.

17. Терентьева C.B., Автунич Е.В., Ивановская Е.А. Изучение фармакокинетики нибентана // Тезисы докладов XII Российского Национального конгресса «Человек и Лекарство», г.Москва 18-22 апреля 2005 г. - С. 563.

18. Комарова E.H., Терентьева C.B., Нилогов В.Л., Гарганеева А.А Изучение фармакокинетики фозиноприлата натрия и спираприла гидрохлорида И Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации», г. Новосибирск, 18-19 мая, 2005 г. -С. 135- 137.

19. Чернышева C.B., Левшин A.B., Терентьева C.B., Аптекарь В.Д., Тепляков А.Т. Изучение фармакокинетики лотензина и его влияния на динамику инсулина и ангиотензина II в процессе терапии // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации», г. Новосибирск, 18-19 мая, 2005 г. - С. 142 - 144.

20. Терентьева C.B., Комарова A.C., Комарова E.H., Поздняков Е.Г., Ивановская Е.А. Способ определения спираприла гидрохлорида методом инверсионной вольтамперометрии // Патент РФ на изобретение № 2280860, опубликован 27.07.2006., Бюллетень №21.

21. Терентьева C.B., Чернышева C.B., Ивановская Е.А., Карпов P.C., Гуса-кова А.М. Способ определения беназеприла гидрохлорида (лотензина) методом инверсионной вольтамперометрии // Патент РФ на изобретение № 2280861, опубликован 27.07.2006., Бюллетень № 21.

22. Терентьева C.B., Комарова E.H., Ивановская Е.А., Карпов P.C. Способ определения фозиноприла натрия методом инверсионной вольтамперометрии // Патент РФ на изобретение Ks 2288469, опубликован 27.11.2006., Бюллетень № 33.

23. Комарова E.H., Терентьева C.B., Комарова A.C., Ивановская Е.А. Инверсионная вольтамперометрия спираприла гидрохлорида // Журнал клинической и экспериментальной медицины. - 2006. - Т. 11, №1-2. - С. 51-53.

24. Чернышева C.B., Левшин A.B., Терентьева C.B., Тепляков А.Т., Аптекарь В.Д., Ивановская Е.А. Изучение фармакокинетики лотензина у пациентов с ишемической болезнью сердца в сочетании с артериальной гипертонией // Журнал клинической и экспериментальной медицины. - 2006. - Т. 11, №1-2. -С. 57-59.

25. Комарова E.H. Терентьева C.B., Гарганеева A.A. Изучение фармакоки-нетики моноприла и квадроприла // Сибирский медицинский журнал. - 2006. -Т. 21, № 3. - С. 100.

26. Комарова E.H., Терентьева C.B., Гарганеева A.A. Изучение фармакоки-нетики квадроприла (спираприла гидрохлорида) методом вольтамперометрии // Сибирский медицинский журнал.-2006.-Т. 21, №4.-С. 43-45.

27. Терентьева C.B., Комарова E.H., Сапожникова Т.Н., Тепляков А.Т., Ивановская Е.А., Андреева Т.И. Вольтамперометрическая методика определение ангиотензина II в крови // Химико-фармацевтический журнал. - 2006. - Т. 40, № 12. - С. 54-56.

28. Чернышева C.B., Левшин A.B., Терентьева C.B., Тепляков А.Т., Аптекарь В.Д., Ивановская Е.А. Изучение фармакокинетики лотензина и исследование его влияния на динамику инсулина и ангиотензина II // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - Т. 22, №3. - С. 39-41.

29. Чернышева C.B., Левшин A.B., Терентьева C.B., Тепляков А.Т., Аптекарь В.Д., Ивановская Е.А. Изучение фармакокинетики акридилола у пациентов с ишемической болезнью сердца в сочетании с II ФК ХСН (по NYHA) // Сибирский медицинский журнал. - 2007. - Т. 22, №4. - С. 17-19.

30. Чернышева C.B., Терентьева C.B. Количественное определение беназе-прила гидрохлорида вольтамперометрическим методом [Электронный ресурс] // Медицина и образование в Сибири: электронный научный журнал. - 2007. - № 3. - Режим доступа: http://ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=152.

31. Терентьева C.B., Чернышева C.B., Тепляков А.Т., Левшин A.B., Аптекарь В.Д. Способ определения карведилола методом инверсионной вольтамперометрии // Патент РФ на изобретение № 2334510, опубликован 27.09.2008., Бюллетень № 27.

32. Чернышева C.B., Терентьева C.B., Ивановская Е.А. Количественное определение карведилола вольтамперометрическим методом [Электронный ресурс] // Медицина и образование в Сибири: электронный научный журнал.-2011.-№ 2. - Режим доступа: http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/abauthors.php7idM81.

33. Терентьева C.B., Ивановская Е.А., Чернышева C.B. Количественное определение амиодарона в лекарственных формах вольтамперометрическим методом [Электронный ресурс] // Медицина и образование в Сибири: электронный научный журнал. - 2011. - № 4. - Режим доступа: http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=520.

34. Терентьева C.B., Ивановская Е.А., Попов C.B., Чернышева C.B. Изучение возможности использования вольтамперометрии в исследовании фармакокинетики амиодарона и нибентана [Электронный ресурс] // Медицина и образование в Сибири: электронный научный журнал. - 2011. - № 5. - Режим доступа: http://www.ngmu.ru/cozo/mos/article/text_full.php?id=522.

Отпечатано в типографии Новосибирского Государственного технического университета 630092, г.Новосибирск, пр. К. Маркса, 20, Тел./факс (383) 346-08-57 Формат 60 х 84/16. Объем 3.25 пл. Тираж 100 экз. Заказ 285. Подписано в печать 17.02.2012 г.

Актуальность проблемы

В настоящее время в распоряжении врачей имеются десятки и даже сотни тысяч лекарственных средств, которых только в России зарегистрировано и внесено в Государственный реестр около 3000, при этом общее количество имеющихся в разных странах препаратов и различных их комбинаций превышает 200000. Еще 20-30 лет тому назад 60 - 80 % применяющихся в настоящее время препаратов не были известны или не использовались. Ежегодно список лекарственных средств пополняется на 200 - 300 наименований; вместе с тем, каждый год из списка разрешенных для клинического применения исключаются около 100-200 препаратов, чаще всего по причине высокой токсичности и широте побочных эффектов. Необходимо учитывать также и то, что лекарственные средства в качестве монотерапии используют редко, чаще в виде сочетаний, иногда в одной лекарственной форме, что усиливает терапевтический эффект и увеличивает число побочных реакций [6; 7; 9; 81].

В связи с этим, актуальными становится поиск и выбор современных высокочувствительных методов для контроля качества лекарственных средств, при этом оптимальным является метод, осуществляющий детекцию по фармакологически активной группе в присутствии сопутствующих веществ, и пригодный для анализа лекарственного средства в биологических жидкостях. К таким методам относятся электрохимические, используемые для контроля состояния окружающей среды, лекарственных средств и исследования физиологических процессов в организме, способные обеспечить определение огромного числа неорганических и органических веществ. Для них характерны высокая чувствительность и селективность, быстрота отклика на изменение состава анализируемого объекта, легкость автоматизации и возможность дистанционного управления, они не требуют дорогостоящего аналитического оборудования и могут применяться в лабораторных, производственных и полевых условиях. Непосредственное отношение к рассматриваемой проблеме имеют три электроаналитических метода: вольтамперомет-рия, кулонометрия и потенциометрия. Нижняя граница определяемых концентраций в методе вольтамперометрии с линейным изменением потенциала индикаторного электрода (классической вольтамперометрии) составляет Ю-6 - 10~5 моль/л. Для ее снижения до 10~8 - 10~7 моль/л используют усовершенствованные инструментальные варианты вольтамперометрии: пере-меннотоковую (с наложением переменного напряжения) и дифференциальную импульсную (с наложением импульсов напряжения).

Особый интерес представляет изучение возможности использования вольтамперометрии для анализа сердечно-сосудистых лекарственных средств (кардиопрепаратов), как наиболее обширной части рынка всех лекарственных средств, тем более следует учесть, что в оказании фармакологического эффекта непосредственно задействованы эндогенные электрохимические процессы.

Цель диссертационной работы. Обоснование целесообразности использования вольтамперометрии для контроля качества и изучения фармако-кинетики сердечно-сосудистых лекарственных средств на примере амиода-рона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназепри-ла гидрохлорида и карведилола. Исследование возможности использования вольтамперометрии в анализе эндогенных полипептидов на примере инсулина и ангиотензина II.

Задачи исследования

1. Выполнить квантово-химические расчеты структуры амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола.

2. Разработать вольтамперометрические методики количественного определения лекарственных средств в модельных растворах стандартного образца.

3. Предложить валидированные условия количественного определения лекарственных средств в лекарственных формах

4. Изучить возможность использования методик количественного анализа лекарственных средств в сыворотке крови и предложить схему пробопод-готовки анализируемых образцов крови.

5. Провести сравнительные фармакокинетические исследования сердечно-сосудистых лекарственных средств вольтамперометрическим методом в сравнении с высокоэффективной жидкостной хроматографией.

6. Исследовать возможность использования вольтмаперометрии в анализе эндогенных полипептидов (инсулина и ангиотензина II).

Научная значимость и новизна результатов

С помощью квантово-химических расчетов структур амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, выполненных методом РМ-3, впервые получены соответствующие значения энергий ионизации атомов, на основании чего дано заключение о вероятном механизме электродного процесса.

Впервые в мировой практике: • обнаружена способность и показана возможность амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола и ангиотензина II участвовать в процессах, протекающих на поверхности стационарных электродов с образованием мало-диссоциированных соединений, электрорастворение которых приводит к появлению сигнала на вольтамперной кривой с параметрами, являющимися качественной и количественной характеристикой определяемого вещества. Получены патенты:

• «Вольтамперометрический способ количественного определения ни-бентана»;

• «Способ определения амиодарона (кордарона) методом инверсионной вольтамперометрии»;

• «Способ определения спираприла гидрохлорида методом инверсионной вольтамперометрии»;

• «Способ определения беназеприла гидрохлорида (лотензина) методом инверсионной вольтамперометрии»;

• «Способ определения фозиноприла натрия методом инверсионной вольтамперометрии»;

• «Способ определения карведилола методом инверсионной вольтамперометрии» (Приложение);

• показана возможность и разработаны эффективные, экономичные и экологически безопасные технологии количественного определения сердечно-сосудистых средств в лекарственных формах вольтамперометриче-ским методом;

• предложены методики пробоподготовки образцов сыворотки крови, содержащих амиодарон, нибентан, спираприла гидрохлорид, фозиноприл натрий, беназеприла гидрохлорид и карведилол для целей вольтамперо-метрического исследования;

• вольтамперометрическим методом проведены сравнительные фармакоки-нетические исследования амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола на базе отделения хирургического лечения сложных нарушения ритма сердца и электрокардиостимуляции (научный руководитель отделения д.м.н., профессор Попов C.B.) и отделения сердечной недостаточности (научный руководитель отделения д.м.н., профессор Тепляков А.Т.) ФГБУ НИИ кардиологии СО РАМН и установлены основные фармакокинети-ческие параметры;

• предложены методические подходы к определению соединений полипептидной структуры в биологических образцах вольтамперометрическим методом;

• предложены вольтамперометрические экспресс-методики определения гормонов: инсулина и ангиотензина II в сыворотке крови для целей изучения влияния лекарственных средств на организм человека: «Вольтамперометрический способ определения инсулина»; «Способ определения ангиотензина II методом инверсионной вольтамперометрии».

Практическая значимость:

Разработаны методики количественного определения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола, инсулина и ангиотензина II в модельных растворах, лекарственных формах и сыворотке крови вольтамперометрическим методом, защищенные патентами Российской Федерации и внедренные в практическую деятельность;

Рассчитаны основные фармакокинетические показатели нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, полученные с использованием вольтамперометрии, и установлена степень влияния сопутствующих заболеваний на фармакокинетику указанных препаратов;

Разработанные методики вольтамперометрического определения лекарственных средств и полипептидов используются в работе ФГБУ НИИ кардиологии СО РАМН, ЗАО «Вектор-Медика», ГУ Новосибирского института органической химии им. H.H. Ворожцова (НИОХ СО РАН), ФГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени E.H. Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», Государственного научного учреждения «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» СО Российской академии сельскохозяйственных наук, что подтверждено актами внедрения (Приложение).

Связь темы диссертации с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы ГБОУ ВПО «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Новосибирск: «Системные механизмы действия ксенобиотиков на организм и разработка новых фармакологических препаратов» № гос. регистрации 01.2.00709495, код ВНТИЦ 0203042450323 и ФГБУ НИИ кардиологии СО РАМН, г. Томск.

На защиту выносятся:

- исследование электрохимического поведения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола и соответствующие квантово-химические расчеты;

- разработка методик вольтамперометрического количественного определения амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, в растворе стандартного образца, модельных смесях, лекарственных формах и сыворотке крови;

- оценка валидности предлагаемых вольтамперометрических методик;

- методические подходы к количественному определению эндогенных полипептидов инсулина и ангиотензина II в сыворотке крови вольтамперо-метрическим методом;

- получение фармакокинетических характеристик амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола вольтамперометрическим методом у пациентов с сердечно-сосудистой патологией.

Апробация работы

Основные материалы диссертации доложены и обсуждены на конференции «Коммуникативная технология наркологии и психиатрии» (Новосибирск, 2002); научно-практической конференции «Рациональное использование лекарств» (Пермь, 2004); международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); XII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005), VI Ежегодной конференции общества специалистов по сердечной недостаточности «Сердечная недостаточность 2005» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции «Современные проблемы фармакологии и фармации» (Новосибирск, 2005). Первом съезде кардиологов Сибирского Федерального Округа (Томск, 2005), региональной конференция «Актуальные проблемы фармакотерапии с позиций доказательной медицины» (Томск, 2006).

Личный вклад автора: для получения результатов, изложенных в диссертации, автор лично изучил электрохимические свойства амиодарона, нибентана, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола, инсулина, ангиотензина II вольтамперометриче-ским методом и разработал методики количественного определения перечисленных веществ в растворах стандартных образцов, модельных смесях и биологических средах, выполнил валидацию предложенных методик с использованием спектрофотометрии и ВЭЖХ, провел фармакокинетические исследования и рассчитал фармакокинетические параметры сердечнососудистых лекарственных средств с участием 59 пациентов.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 34 работы, в том числе 8 патентов и 10 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 335 страницах машинописного текста, включая 107 таблиц и 81 рисунок, состоит из введения, обзора литературы, семи глав, посвященных экспериментальным исследованиям, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. Библиографический указатель включает 297 источников, из которых 147 на иностранных языках.

выводы

1. Выполнены квантово-химические расчеты структуры нибентана, амио-дарона, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида, карведилола и выявлены наиболее электрохимически активные группы: нибентан (нитрогруппа, карбонильный фрагмент амидной группы); амиодарон (карбонильная группа, бензофурановый цикл, ковалент-но-связанный йод); спираприла гидрохлорид (карбоксильная группа, карбонильная группа и карбонильный фрагмент сложно-эфирной группы); фозиноприл натрия (фосфинильная, карбоксильная, карбамидная и сложно-эфирная группы); беназеприла гидрохлорид (карбамидная, карбоксильная и сложно-эфирная группы); карведилол (гидроксильная, метокси- и фенокси-группы).

2. Впервые изучено электрохимическое поведение лекарственных средств в модельных растворах на электродах: нибентан и амиодарон - на стекло-углеродном; фозиноприл натрия - на графитовом; спираприла гидрохлорид и беназеприла гидрохлорид - на золотом; карведилол — на графитовом с золотым напылением, и установлена минимально-определяемая концентрация. Специфичность, точность, воспроизводимость и линейность разработанных методик подтверждена на основе статистической обработки с использованием коэффициента Стьюдента и оценки параметров линейной зависимости.

3. Впервые предложены электрохимические условия количественного определения лекарственных средств в лекарственных формах, которые валиди-рованы на основе фармакопейных методик спектрофотометрического определения в УФ-области и высокоэффективной жидкостной хроматографии. Экспериментально доказано, что предлагаемые нами методики характеризуются специфичностью и простотой пробоподготовки, которая исключает стадию фильтрования и отделения лекарственного средства от вспомогательных веществ.

4. Изучено электрохимическое поведение гормонов полипептидной структуры: инсулина на ртутно-пленочном электроде и ангиотензина II - на графитовом электроде. Получены поляризационные кривые инсулина и ангиотензина II, пригодные для аналитических целей и установлена минимально-определяемая концентрация в 1 пг/л. Установлено, что количество аминокислот в полипептидной цепи влияет на выбор варианта анализа электрохимическим методом, так, инсулин целесообразно определять катодной вольтамперометрией без накопления, а ангиотензин II, представляющий октапептид, — инверсионной вольтамперометрией.

5. Предложены оптимальные условия определения лекарственных веществ в сыворотке крови с использованием пробоподготовки. Для амиодарона предложен новый способ осаждения белков — 10 % раствором цинка сульфата. Методики определения лекарственных средств в сыворотке крови валидированы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии.

6. Выбранные условия вольтамперометрического определения позволили провести фармакокинетические исследования нибентана и амиодарона, спираприла гидрохлорида, фозиноприла натрия, беназеприла гидрохлорида и карведилола, результаты которых используются в работе ГУ НИИ кардиологии СО РАМН, ЗАО «Вектор-Медика», ГУ Новосибирский институт органической химии им. H.H. Ворожцова (НИОХ СО РАН), ФГУ «Новосибирский научно-исследовательский институт патологии кровообращения имени E.H. Мешалкина Федерального агентства по высокотехнологичной медицинской помощи», ГНУ «Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего Востока» СО Российской академии сельскохозяйственных наук, что подтверждено актами внедрения.

7. Разработаны методики определения инсулина и ангиотензина II в натив-ной сыворотке крови. Методики анализа инсулина валидированы по радиоиммунному методу с одновременным построением сахарной кривой, различие в числовых показателях составило не более 15 %. С целью рекомендации использования предлагаемых вольтамперометрических методик определения инсулина и ангиотензина II в клинических лабораториях рассчитаны коэффициенты вариации (15,47% и 6,86%, соответственно) и составлены контрольные карты.