Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Клевера Европейской части России и их лекарственное применение

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ЯВДШЩТИ

РГ6 од-:-_

МОСКОВСКАЯ .МЩЩЦИНСШ АКАДЕМИЯ им.И.и.СЕЧЕНОВА

На правах рукописи

УДК 582.739(470.1/.б):616.322

БАЕЛСКШ ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ .

КЛЕВЕРА ЕВРОПЕЙСКОЙ ЧАСТИ РОССИИ И НХ ЖКАРСТВЕННОБ ПРИМЕНЕНИЕ

15.00.02 - фзрглацовигабокая шащ п фармакогнозия

Автореферат днссертащш на сопокаиие ученой степени доктора фармацевтических науп

Москва - 1993

Работа выполнена в Московской медицинской академии ЕЫвИоЫоСеченова.

Научные консультанты: доктор химических наук, профессор Г.П.Гладшпев, . кандидат биологических наук, профессор Б.И.Барабанов,

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор Д.Л.Муравьева, доктор фармацевтических наук, профессор Э.М.Казьмина, доктор химичеаких наук, профессор ¿.И.Ыврошншова

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт фармации ИЗ РФ,

Защита диссертации ооотоится "_" ________ 1993 га

в_часов на заседании специализированного совета

До074^,05006 при Московской медицинской академии им. И.М.Сеченов (Мооква, Суворовский бульвар, 13),

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Московской медицинской академии им.И.М.Сеченова,

Автореферат разослан " " _______ 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета Д.074.05.06

кандидат фармацевтических наук

Н.П.Садчикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми

Для удовлетворения потребностей клиентурных рынков в лскарот венном растительном сырье ведется систематический поиск перспективных лекарственная раотепий. Опит народной медицины слухит пд-юш пз источников данного попока.

Клевер пэдавна известен кал ценное кормовое растение с широким ареалом. На территории России произрастает свыше 60 видов клевера, пз них около 20 - введено в культуру. Богатый флавонопщшИ соотаэ, содераание конялекоа незаменимых аминокислот л витаминов обусловила широкую фармакологическую эффективность и использование в народной моднцияо в качестве отхаркивающего и мягчительного, потогонного и мочегонного, противовоспалительного п антисептического средства при самых разнообразных заболеваниях.

В научной медицине клевер до настоящего времени не применялся. Отсюда очевидно, что я-зучяое обоснование возможности рационального использования р-аднчных видов клевера в качестве лекарственного растительного сырья, решение вопросов/стандартизации является актуальным.

Неле л..запачп поолеяованпя

Целью настоящей работы является ботаялко-фармакогностическое обоснование возможности эффективного использования клеверов европейской части России в качестве лекарственного растительного омрьп.

В соответствии с целью исследования были поставлелм следутано задачи:

1. на основании ресурсоводчбского и химического анализов выделит*, пэрспектлвные виды клевера для заготовки на сырье;

2. исследовать особенности'онтогенеза перспективных видов клевера о установлены морфйяоГо-ш1атЬмй$ёской'. характеристики каждого этапа развития;

3. проанализировать возмогшую сырьевую продуктивность эксплуатации ценопопуляций клеверов яа основании изучения основных признаков ценопопуляций, их сезонной динамики, факторов, влияющих на киэненность .и устойчивость ценопопуляций;

4. изучить изменения флавоноидного, аминокислотного и минерального составов в ходе онтогенеза для рациональной заготовки перспективных видов клевера на сырье в определенных возрастных состояниях;

5. исследовать специфическую фармакологическую активность и токсичность флавоноидов из сырья клеверов;

6. разработать систему стандартных тестов, характеризующих подлинность и качество сырья клеверов и лекарственных форы на их основе. •

Научная новизна

Впервые изучена поливариантнооть онтогенеза и морфогенеза клеверов, относящихся к различным типам бвоморф, о учетом их морфологической дезинтеграции и показано влияние некоторых факторов на этот*процесс. Разработан комплекс ыорфолого-анатомических и биохимических показателей для оценки возрастных состояний в онтогенезе двенадцати видов клевера.

Проведен анализ ценопопуляций клеверов по основным признакам: численности, возрастной структуре, жизненности. Установлены базовые спектры нормальных ценопопуляций, характерные для каждого вида. Показаны сезонные изменения в ценонопуляцнях клеверов.

Исследованы изменения флавоноидного, аминокислотного и минерального соотавов по отапаы онтогенеза.

Выявлена антиаритмическая, антигипартензивная, противовоспалительная, ранозаживляющая активность, низкая токсичность флавоноидов из инры! клеверов.

Ьнерьиь создана имохеыа станиаргних Ч'ыльь цчн шишки качиотъа

сырья клеверов п лекарственных форм на их основе. Установлены диагностические признаки сырья клеверов, разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин, предложен новый споооб получения сухого; экстракта, разработаны тех нологпчеокпе регламенты на производство; сырья клевера и настойки па травы клевера»

Практическая значимость работы ■ Разработаны п утверждены:

1, Технические условия "Настойка травы клевера лугового" (ТУ 64-4100-92);

2, лабораторно-технологический регламент на производство настойки нэ трави клевера лугового;

3» опытно-промышленный регламент на 1|ропзводство сырья (травы) клевера лугового;

4. инструкции по сбору и сушке трав^ клеверов гибридного, лугового, ползучего, соцветий клевера лугового.

Разработан и принят к рассмотрению Комиссией по стандартизации НПО "ВИЛАР" проект BSG "Трава Севера лугового".

По результатам исследования долучено 2 приоритетных справки на авторские свидетельства.

Приняты к производству лечебно-профилактические косметические препараты на основа сырья клевера: зубной элексир, зубная паста, крем "Каро", гель "Оазис", лосьон "Мираж". Крем "Мадонна" находится в серийном производстве.

Положения» вынос вше на. защиту:- онтогенетическийподход к рациональному а эффективному дспольяо-гояпю'дик'орарфущйх культурный■ лекаротвеашх растений да примере клеверов;

- результаты-комплепйкого ;б0^шпНомТаШако.пюсФпческого п доклипи-

ческого изучения сырья клеверов и лекарственных форм на их ооно-

ве;

- данные по стандартизации оырья клеверов и лекарственных форы на их основе.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы доложены'на У Воероосийокоы съезде фармацевтов (Ярославль, 1987); меадународном ошшоаиуме "Экологические аспекты в фармации" (Москва, 1990); Республиканской научной конференции "Реализация научных достижений в практической фармации" (Харьков, 1991); научно-драктичеокой конференции "Состояние и перспективы развитая фармации в Сибири и на Дальнем Востоке" (Томок, 1991); научных конференциях Фашацевтического факультета ША им.И. 11,Сеченова.

Публикации

Материалы диссертации отранены в 33 работах, из них - 2 авторских свидетельства, технические условия, временная фармакопейная отать&, 2 технологических регламента» 4 инструкции по сбору н сушке сырья.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на страницах машинописного текста, содержит таблиц, рисунков. Библиографический указатель включает источников литературы, из них на иностранных языках.

Работа состоит из введения, обзора литературы, 7 глав экспериментальных исследований, ч^щих выводов, списка литературы и приложения.

В обзоре литературы приведены биоморфологические аспекты хода онтогенеза растений, критический анализ химического состава и фар-иаколш'ического действия расгений ро.ца клевер.

Первая глава в экспериментальной чаоти диосертации поовящена )бъектем а методам исследования, испольёуемыы в работе. Дана мор-^олого-бпологическая характеристика различных видов клевера, прод-этавлеш химические, флзико-химическпе,' фармакологические методы исследования.

1 I

Во второй глав о лрнвэдеяы результаты ресурсоведчеегсого анализа клеверов европейской части Росош.

В третьей глава рассмотрены вопросы развития некоторых видов :слевора в онтогенезе о установлением комплекса морфолого-апатоми-зескпх и биохимических показателей этапов жизненного цикла. Исследована поливариантность онтогенеза и факторы, влияющие па этот процесс.

Четвертая глава посвящена изучению динамики ценопопуляцнй клеверов по основным признакам: численности, возрастной структуре п апзненноотп. Представлены данные о сезонных изменениях в ценопопу-ляцпях клеверов.

Б пятой главе приводятся результаты химического анализа фла-воноидного, аминокислотного и минерального составов различных видов клевера. Показано изменение нх в ходе онтогенеза.

Шестая глава посвящена исследованиям фармакологической активности и токсичности флавоноидов из сырья клеверов» ' ■

В седьмой главе рассмотрены вопросы стандартизации лекарственного растительного сырья клеберов и лекарственных фора на их основе.

\ С0ДЕР1АНИЕ РАБОТЫ I. Объекты и методы исследования

В работе прздетавле'гст результаты изучения II многолетних впдпч рода кловер ( Tzifo&'u/n 1.)\, к.альпийского - TlaSpettie L , К.гибридного ИЛИ шведского -7" tySticium /. , It.горного -T.rmnt< к.земляничного -TSia^f/sru^ . , к. красноватого - Т f £ к. лугового ели красного - ТргаЫп^е I . к< лтииопога -Г^с:

к.ишшонокого -Трйлпапиит уяср. , к. ползучего или белого -Т, герещ , к.среднего - Т. теЖит , к,сходного -

Т. атб^иит в'её « ,

Стационарные наблюдения за ходом онтогенеза дикорастущих клеверов проводились в Московской, Ростовской, Челябинской облаотях, Краснодарском крае на участках о тншг'гой для данной местности растительностью; особи.в культуре изучались в Ыосковокой (ВНИИ кормов им.В.Р.Вильямса) и Хмельницкой областях (совхоз ш„Орджоникидзе JCaмeнeц-I[oдoльcкoгo района). Площадь каддого участке составляла примерно 2 га. В пределах выбранных участков были намечены контродь-1ше площадки в 100 ы , на которых цроводилиоь геоботакические описания растительного покрова и собирался гербарий, спиртовой материал, сырье разновозрастных особой для дальнейшей камеральной обработки. Изучение онтогенеза и выделение возрастных состояний проводилось по методике, разработанной Т.А.Работновыы (1946, 19Р0, 1954). Растения трех видов клевера выращивались из семян на делянках в Подмосковье. При етом соблюдались условия агротехники, рекомендованные дЛя данной культуры.

При изучении динамики ценопопудяций иодользовалвсь методы; наблюдения за маркированными оообями; учета семенного возобновления, плотности и возрастных спектров ценопопудяций.

Определите биохимических показателей возраотных состояний цро-иоцилось по ГБ-И и методикам ВНИИ кормов им,В,Р»Вильяыса. Так, со-дер^ние белка ("сырого протеина") рассчитывали по количеству азота, определяемого на автоанализаторе "Техникоц" (Ирландия) о использованием метода Кьельдаля. Определение содержания клетчатки проводили гравиметрическим методом. Общую золу и влажность определяли пи 15-XI.

При ироаицшши ресурсоведчеокого анализы иссдициицло^ъ географическое уаощюотрлнение дикорастущих клеверов, проносилось карти-

рование зарослей II видов клевера в 26 районах Московской, Ростовской, Челябинской обласкай, Краснодарском крае, устанавливались: плотность запасов, средний выход биомассы с модельного экземпляра» биологический и эксплуатационный запасц сырья, возможный ежегодный объем заготовок» при этом использовался метод "модельного экземпляра" .

При изучении химического состава различных видов клевера марный состав флавояоцдов выделяли по общепринятой методике: экстракция этанолом» очистка хлороформом, извлечение этилацетатом. Разделение суммы флавоноидов осуществляли методами избирательной экстракции, дробной кристаллизации, бумажной, тонкослойной и колоночной хроматография. Идентификацию выделенных флавоноидов проводили по результатам кислотного и ферментативного гидролиза, проб смешения с некоторыми достоверными образцами, температуре плавления, на оснований данных УФ-спектроскопии с понизяруищлми в ком-плексообразугаци. и добавками, ПМР-спектроскепии.

Аминокислотный состав определяли на аминокислотном анализаторе "Ликвимат" (Германия). Исследование минерального состава проводили методом атомно-абсорбционной спектрометрии на ААЗ-З (Германия).

Антигипертензивную активность изучали на спонтанно гилертен-зивных крысах в условиях внутривенного введения. Измерение артериального давления осуществлялось электроманометрическим методом на полиграфе Ем-Об (Япония). Антпаритмическув активность исследовали на белых крысах о использованием модели хлорид кальциевой и аконити новой аритмий (А.С.Саратиков, С.Н.Фатеева, В.К.Горшков, 1987). Изучение влияния на моторику кишечника проводили в опытам на кроликах в условиях гексьаадовой анестезии. Измерение давления в кишечнике осуществлялось методом о^крыто^о;,катетера (Н.Я.Доценко, 1990). Противовоспалйтельцуа активность'-ирследогалл на моделях

первичной гнойной раны в опытах на кроликах (В.И.Стручков, А.В.Григорян, В.КчГостищев, 1975); острой и хронической внутрибршной инфекции в опытах на мышах (ОЛ.Кауфман. С,Н.Бцковская, О.В.Шад-, рян и др.» 1991).

При разработке стандартных тестов на сырье клеверов и лекарственные формы на их основе использовали фармакопейные методы анализа. ;

2. Онтогенез» Динамика ценопопуляций Проведенный ресурсоведческий анализ различных видов клевера европейской части России показал перспективность использования в качеотве лекарственного растительного сырья II видов клевера: альпийского,- гибридного, горного, земляничного, красноватого» лугового, люпинового, паннонского,. ползучего, среднего и сходного.

Клевера формируются по розеточно-моноподиальной модели побегообразования о главным вегетативным полицикдическиы моноиоопально нарастающим побегом, от которого отходят пазушные генеративные моноциклические побеги. У клеверов земляничного, ползучего развитие . происходит по несколько иному варианту этой модели, Наземно-ползу-чие побеги укореняется, но в первые годы сохраняют связь о главным побегом, затем теряют ее и продолжают самостоятельное существование, имитируя цлиннопобеговую моноподиадьцую модель. У клеверов альпийского, хчзрного, красноватого, паннонского, среднего, сходного возможно в ходе онтогенеза образование гипогеогенных побегов и переход к модели развития длинокорневищных многолетников.

В онтогенезе клеверов выделены четыре возрастных периода: латентный, прегенеративный (виргинильный), генеративный, постгенера-твшшй (сенилышй) и девять возрастных состояний: семена ), проростки (р), юьеиилыше ( у' ), имматурные (<"> ), виргинильные ( г ), молодце (ранние) генеративные ^ ^ , средневозрастные Сзре-

лые) генеративные 3). стаРые (поздние) генеративные д), сенильные ( / )х.

Основными критериями выделения возрастных этапов онтогенеза выступайт качественные н количеотвенные морфолого-анатомические признаки. Нами были использованы оледугаше качественные морфологические признаки: степень сформированное^ у особей основных признаков биоморф; способность растений к семенному п вегетативному размножению, наличие у некоторых видов каудекса, корневищ и др„; количественные морфологические признаки (биометрзческие показатели): абсолютные, например, длина оси первого порядка, число узлов на ней, диаметр основания розетки, диаметр главного корня, темпы морфообразователъной деятельности конуса нарастания и относительные. например, соотношение процессов новообразования и отмирания; анатомические признаки, которые носят преимущественно количественный характер: абсолютные. например, высота палисадной хлоренхемц, число устьиц на единицу поверхности эпидермы листочков, диаметр сосудов ксилемы стебля и относительные, например, коэффициент пали-садности листочков, доля механических тканей.

Средневозрастные генеративные растения всех исследованных II видов.клевера характеризуются максимальными размерами и наибольшей биомассой, что следует учитывать при заготовке особей на сырье ■ (табл.1).

Для оценки возрастных этапов .онтогейеза- кЛёверов наряду с, комплексом морфолого-анатомическйх.. йрйзнакол йсЦйЛьбованы биохимические показатели: содержание белка,-ллетчатки, золы, вода. Установлено, что с возрастом' увеличивается количёстйённое.содержание белка, клетчатки,золы',В"рйстёниях II видов клевера и уменьшается содержание воды,-

х Индексы' для- обозначения возрастных состояний предложены 'А:.А.Урановым 4973).

Некоторые.данные биометрических измерений органов и тканей разнововрастннх растений на прямере клевера среднего

Таблица I

Орган растения Биометрический показатель Возрастное состояние

У 1/П ■г 9л ** &3

Ось.1 порядка . длина, ш 4-5 6-7 9-10 11-14 12-15 12-14 ; . 10-12

число узлов 11+2 15+2 . 20+3 25+2 30+3 27+2 18£4

Основание . розетки диаметр, - им 2+1 4+1 6+1 Ы+1 12+1 11+2

Корни отношение числа хивых соковых корней в общему их количеству, % / 100 : 85,2 77,5 68,3 55,4 . 46,8 36,7

■Стебель диаметр сосудов ксилемы, мкм 39+3 46+2 51+3 1 58+3 41+3 33+3.

толщина пластинки, ШО! 154+3 165+5 177±6 181+3 185+4 171+3 162+6.

коэффициент палисадносг-;, % 33 37 40 42 43 38 33

число, ус-тьиц^на I мм эпидермы верхней 356+14 471+18 550+23 587+18 594+20 468+19 399+16

нижней 390+15 496+21 574+20 595426 619+29 485+25 389+19

7 растений различных видов клевера выявлена поливарианТность онтогенеза в зависимости от типа бяок-орф, морфологической дезинтеграции я лшзненностп особей. Tait, для растений видов клевзра моноцентрического типа биоморф характера следующие фазы морфогенеза в ходе онтогенеза о учетом проявления морфологической дезинтеграции!

I. без дезинтеграции;

первичный побег

"главная ось"

первичный ' куо?

2. дезинтеграция полгал поздняя песпоцпализпроваяяая I вариант

'главная первичный рыхлый кустящаяся ось" J куст """ ¡сует ^партикула

¿"À'W in, CrJ г,Мг Ср], р

первичный побег"

P,J

■ 2 вариант

первачнцй_ побег

Р-2*

некуотл--*~тааяся партпгсула

Л

"г.-пвная ось"

Crgtl

1 ервичный кустящаяся некустящаяся куст партикула партикула

$>,[$1] $з £

В начале и середине онтогенеза распределение бпомассн по площади у моноцентрпчеекпх видов клевера характеризуется одним максимумом в центре разрастания особи. В конце онтогенеза новообразование корней, побегов и почек возобновления происходит эсе блике к периферии, появляется отмериий центр.

Для особей видов клевера явнопояацентрического типа биоморф характерен слег да: путь мор огенеза при полной ранней специализированной дезинтеграции:

первичный побег

P'J

'главная ось"

Ctm ]

первичный

«m- * »

куст

куртина

система '"Парциальных кустов

im /'г, р ]

парциальным куст

парниалышй побег

S

Явнополнцентрическне взрооше растеши клеверов имеют несколько явно выраженных центров разрастания особи. Каждый из центров характеризуется корневой системой, побегами и почками возобновления, представляет собой относительно автономную часть особа. Центры соединены между собой специализированными побегами разрастания, например, гипогеогеннымв корневищами или назешюползучсыи побегами а Биомасоа на площади явнополлцент^ическшс клеверов распределена неравномерно» имеются участки с повышенной концентрацией биомассы (например, парциальные кусты или(парциадыше побеги) в с пониженной (например, побеги разрастания). Таким образом, в онтогенезе особей клевера явнополадентричесного типа бвоморф можно выделать следующие фазы: первую моноцентраческую (/3-¿я); явнополвдентра-ческую и вторую ионоцентрнческую (^3

Подивариантность онтогенеза в ваввсшоств от уровня жизненности особей показана на рисунке I на примера клеверов явнополжцентрн-ческого типа биоморф«

Перспектива использования растений некоторых видов клевера в качебтве лекарственного раотнтельного сырья предопределяет более интенсивное использование природных ресурсов в семенного материала этих растений» Для сохранения живой природы в долгосрочного прогнозирования запасов сырья исследованы основные признаке ценопопуляций клеверов: численность, возрастная структура в жизненность. Установлено» что в онтогенезе моноцентрических партикулирупцих -'идов клевера в начале и конце цикла счетными единицами являются особи семенного и вегетативного происхождения, В середине цикла, на стадии компактного клона, счетной единицей выступает клон. У явнополилент-, рических видов клевера в начале онтогенеза в качестве счетных единиц выступают особи семенного происхождения (моноцентрическир лсо-би);в середине цикла - отдельные центри (парциальные кусты) явнопо-лицептрических особей; н конце цикла - вновь монопинтричеекие о^оои

(одиночные парциальные кусты илл побеги). При изучении возрастной структуры ценопопуляций клеверов было замечено, что нормальные це-нопопуляции каэдого вида имеют сходные возрастные спектры прй определенных условиях. Это позволило выделить базовый спектр, свойственный виду в этих условиях (рас.2). Базовые возрастные спектры большинства видов клевера характеризуются преобладанием во взрослой части спектра средневозрастных генеративных особей. Показана возг косность построения теоретических возрастных спектров, имеющих достаточное сходство о базовыми спектрами ценопопуляций на высоком уровне достоверности (рис.2)»

При изучении сезонной динамики ценопопуляций некоторых дикорастущих видов клевера установлено, что возрастные спектры популяций притерлевают сезонные изменения, но при этом общая картина во взрослой части базовых спектров не нарушается. Показано, что популяции клевера находятся в состоянии динамического равновесия и ежегодная гибель растений компенсируется семенным и вегетативным пополнением. При погодичлом изучении возрастной структуры ценопопуляций некоторых дикорастущих видов клевера на постоянных транстем^тах установлено, что развитие имело циклический, волнообразный характер, что проявлялось в постепенном смешении максимума в спектре с ювениль-пых растений (инвазионные ценопопуляции) на особи генеративные (нормальные ценопопуллции) и сенилыше (регрессивные ценопопуляции). Для некоторых популяций удалось наблюдать практически полностью' "малую волну" р^вития ценопопуляций в достаточно короткий отрезок времени (рис.3).

Применены и испытаны показатели яизненности особей клевера для характеристики ценопопуляций. Показано влияние экологических и антропогенных ¿акторов »изяеншеть растений;и популяций в целом, .например, использование л;тои пОц сенокос, пастбище, близость'автомобильных гагистралсН. ¡¡нтенсизное_-'использование участков (два и

Рвс.1. Схемы путоЗ онтогенеза кловеров на примере явнополнцентри-чеокого типа бзоыорф (о - с н^дземяоползучими побегами^ б - о гнпогеогенными побегами) с учетом различной казнен^ ностя оообей (1-Ш):

1-е«. - полный путь онтогенеза без резкого снижения жизненности особей;

- полный путь онтогенеза с резким снижением жизненности;

- сокращенный путь онтогенеза без повреждения особи;

——- сокращенный путь онтогенеза с внезапным повреждением особи»

СГЗ - группы, плохо отличимые морфологически; й - главная вегетативная ось первого порядка; га' - прекращение роста главной оси; 1? - постепенное отмирание главной оси а главного корня; уа - семядоля;

¿8 - слоеный трехлисточковый лист; уР - первый простой лист; Ф - укороченный вегетативный побег; О - вегетативный надземноползучпй побег; f - генеративный побег; ф - гипогеогенный побег; т - мертвые особи.

1С

Примеры некоторых базовых возрастит спектрор нормальнее ценопопуляций различных видов клевера; земляничного /а/, ползучего /б/, среднего /в/, альпийского /г/, паннснско-го /д/, горного/е/.

Пб оси абсцисс - возрастное состояние онтогенезч; по оси ординат - количество особей, %. —#— - базовой спектр, • . —о- - теоретический спектр, - зона базового спектра.

ó

более ухооов за сезон) снижает ашэвеяность деноподуляцвй я как следствие; нарушение устойчивости естественных луговых фнтоценозов как систеиы взаимодействующих ценопопуляцвй, преждевременное старение дикорастущих в культурных популяций,

3. Химический состав, в: знеш . его в ходе онтогенеза

Биологическая активность клеверов обусловлена в основном фла-' воноидамх. Их содержание в сырье травы ген^ратавных растений равно 2-5%. Показано влияние эколого-фнтоценотвческжх факторов на содержание флавоноидов. Например, в генеративном периоде яанбольяее количество флавоноидов выделено на сырья особей луговых в горно-дуговых ценопопуляций, в 1,5-2 раза меоьве флавояовдов содержится в сырье растений степных популяций. Установлена обеда закономерность*, что суммарное количественное содержание флавоноидов в сырь" травы дикорастущих растений выше, чем особей в культуре того же ввда.

Достоверных различий в содержании флавоноидов в сырье растений раз*

личных сортов одного ввда, находящихся в блнаквх аколого-фитоцено-тичеоких условиях, не обнаружено. Исследованжя содержанвя флавоноидов по этапам онтогенеза показали, что навбольаее количественное содержание флавоноидов у всех язученных II видов клевера имели в прегенеративиом периоде нмматурные иди ввргинидыше растения, в генеративном периоде - средневозрастные особи (ржс.'1).

При изучении содержания флавоноидов по фазам вегетации уста. новлено, что в сырье средневозрастных генеративных растений накапливается максимальное содержание флавоноидов в Фазе цветения (табл„2).

} т * ь Я* ь 4

Возрастное состояние

Рпс.4. Суммарное содержание Тлавоноилоя в сырье травы некоторых рилов клевера по этапам онтогенеза, и - клипер гк^рклный; ф - клевер люшшовый; л - клевер средний.

Таблица 2

Суммарное содержание флавоноидов в различных видах сырья средневозрастных генеративных растений по фазам вегетации на примере клевера альпийского

Фаза вегетации Содержание флавоноидоЕ. % в абс.сух.сырье

соцветия листья стебли

Отрастание - 3,41+0,05 - ■

бутонизация 4,64+0,08 4,23+0,10 I,80^0,05

Начало цветения 5,12+0,07 4,87+0,08 2,12+0,06

Полное цветение 5,26+0,12 4,63+0,08 1,93+0,13

Плодоношение - 2,68+0,06 1,09+0,09

Таким образом, для рационального и эффективного использования ценопопуляций клеверов следует заготавливать на сырье срецнеаоз- • растные генеративные растения, характеризующиеся максимальной биомассой, в фазе цветения.

' Сумма флавоноидов из сырья травы средневозрастных генеративных растений II видов клевера представлена флавонолами, флавонами, изофлавонами и их гликозидами (табл.3). В некоторых видах клевера обнаружены производные куместана: куместрол и тркфолиол.

При ср знительном хроматографвческом изучении сырья различных видов клевера установлено, что качественный состав и ко. лчествен-ное содержшше флавоноидов подвержеш значительным колебаниям в зависимости от вида клевера, вида сы^ья (соцветия, листья, трава, корни), места произрастания особей, возраста растений.(рис.5). Изменения количественного содержания преобладающих флавоноидов, их гликозидов и куместрола в ходе онтогенеза показаны в таблице "'на примере шести видов клевера. Увеличение содержания флавоноидов и их гликозидов, нроизюдних <1лавона и флавонола, на этапах геиер,.!-

-ОСН-з

Биоханш А

Биохашш А 7- гшозид

Генистеин

НОч^А

6

m

Ван

Генистйн

TiÖ-o-oh ö

Даидзин

Гилерозид Даддзеиа

VC5S

И

н

-Ita)

Изокверцитрин

Изораннейш

« н

Кверцетин

Кверджтрпн

но А Кемферол

Куместрол

но Ö

Лютеотшн

¿i

-OCHg

Ононин

он

ОСНз Há21

Пратенсеин Прунетин

ПрунитрИй

fWO-fo

-Гсй-О-йз

Псевдобаптизш

Н íiCOf ЦЛХЗ-осНз

ч>-осНз ö

Трифолин 'Грифолйол

Цинарозид

некоторые физико-химические константы флавоноидов и кукестанов, Таблица 3'

выделению: из сырья травы средневозрастных генеративных- -растении различных видов клевера

Ж п/п Название зклерическое Название рациональное Химическая формула Тпл> , ва . Вид _ клевера

I 2 3 . 4 . - 5 ' 6 7

I. Биоханин А 5,7-даояси-4^-иетокси-изофлавон схек12°5 212-214 263, 326 1-И

2. Биоханин А -7-глшозид 5-окси~4*-метоксиизо-<*лавон-7-о^-»-глшозид 2Сь-210 262, 323 1-Н

3. Ге;шстеин 5,7,41-триоксиизо£лавоц . 290-293 263, 325 1-3. 5-7, 9-11

Генистин . 5,41-диоксиизофлавон-7-о-уЗ -2> -глюкозид с21%0°10 251-256 202, 330 2, 6

Гиперозид 5,7,3*,4^-тетраоксичла-вон-3-о-/-2> -гала::тозид ^АоРгс 238-239 257, 26£, 364 2-4, 8, II

Даидзеин 7,41-диоксиизофлавон С15Н10°4 318-320 250, 260, 302 I, 2, 5. 6, 9, 10

7. Даидзин 4^-оксиизофлавон-7-о-А-2> -глшозид ЧдЧгсРэ 215-217 258, 310 6

- î z 3 4 .. 5 6 7

с. Изокверця-триЕ 5,7,3^,4" -гетраокснфла-BOH-3-O-^-D -глшозид ^АсРгг... 238-240 255, 265, 362 I. 2,-4-7, 9-Н

с Изораынетин 3,5,7,41-тетраоксЕ-31-ыетоксифлавон 9I6HI2°7' 305-307 254, 265, 371 I, 2, 4. 5, 6, IÔ

IG. Еверцетвя 3,5,7,3^,4^-пентаокси-флавон °I5HI007 3II-3I3 256, 264, 372 ' I-II

T ' Кверцитрия . 5,7,З1,41-тетраоксифла-вон-3-o-yi -Ф-рамнозвд %1%'оРп - 238-240 256, 267, 363 8, 9

-г Кекпферол 3,5,7,4*-? етраокссфла-вон с15Н1сЯб - . 274-275 267, 368 I-H

13. Куыестрол 7,32-дирксикуиесяан ■®15%05 384-386 244, 304, 344 2-4, 5, 9

14. Лигеолин 5,7,3*,етраоксв- флавоя с15Н10Рб 328-330 256, 350 8, II

. ^ Лютеолин-7-ГЛЕЕОЗИД 5.З1, 4х-триоксвфлавон-7-0-р - »-глвко зид . 256-258 256, 350 . 8, II

le. Ояонин 4^-41 етоксиизофлавон- 7-0-fi -7>-ГЛПК03ЕЦ С22%2°9 210-212 . 230, 250 261, 300 I-II

I . 2 3 4 5 6 7

I?. Пспулнзн 3,5,4^-триоксЕфлавоя-7-0-/-» -глюк032д 270-272 265, 364 1-3, 5-6, 10

18. Пратеясеин. . 5 ,7,3^-трпокси-4^-иет-'оксиизофлавоя °I6HI206 272-273 263, 325 6, 9, II

19. Пруяетин 5,4^-диокса-7-ыетокси-азофлавоа С16Н12°5 234-236 263, 325 6, 9, II

20. i арунитрин i 5-окса-7-метонсиизофла-«рирозид; j воя-4"-о-_р -Tí-глекозид 183-184 264, 325 5-7, 10

21.. ПсевдоОадти-знк 3х ^-метилеядиоксиизо-флавоа-7-о-¡3-2-рути-козид • / . С28Н30°14 248-250 220, 248 6

22. Рутин. • Г Г 5,7,3 ,4^-теФраоксифла-зоя-3-a-^- »-рутинозид С27Н30°16 187-189 254, 354

23. Трифояин ■ 5Г7,41-трзокскфлавоя- ■ Зч>-р - и -гадактозид ^Ао0!! 228-230 267, 354 I, 2, 4, 5-II

24. Трзфалиол 7,Ю-диоЕси-12-аетоася- ауместан С16НЮ°6 331-333 268, 309, 348 9

I 2 3 4 5 6 7

25. Сорыононетия 7-окси-4"С-метоксиизо-флавон CieHI2°4 255-257 250, 300 I-II

.26. Динарозид V 5,3*, 4^-трионсщлавон- -7-0-р-Ъ -ГЛЕЖОЗИД ^I^O0!! 258-260 ; 257, 26t, 351 8

х Виды клевера:; к.альпийский (I),

: к*гибридный" (2), . к.горный (3), . к.земляничный (4),

к.красноватый (5), м

к.луговой (6), а'

к.лшиновый (7),

к.паннонсхвй (8),

к.ползучий (9),

к.средний (10),

к.сходный (II).

А г

О.РО -9 6 О о О о о О о Оо о 8 8 о о О 8 § 8 8 3 о

<ш -о 8 О О О О о о о 8 & б б б © 6 б 8?

О.» -о 6 0 о 6 О & 0 О © 0 О о о с> о*

0,60 - ь 6 0 О о © 6 О 6 & 8 о 9 В 6 Се е 6 8 6 61

0,50 -I § 1 1 1 8 & 8 § 1 8 8 8 8 1 В В 9

0 О о 6 8 6 0 б 6 'С

1\Ч0 ■8, и о о а © 6 0 О о П о о 8 8 8 8 8 Ос

0.10 "о" 0 0 о • л о 0. 6 о О 8 ч* 8 8 8 с щ/ 0

ООО о о 8 8 о 8 о о 8 >I о 8 8 8 О 0

0,10 0.09 "0 О 8 б о б 8 8 о 6 8 6 е 8 б 6

кг а/и 1 2 3 4 5 6 7 8 9 1С 11 } 1«. т ь а « С

Воэоасткое состояние

м о

Рис.5. Разделение суммы флавоноилов из сырья тоавч клеверов пси по:.:озш метода блажной хромагогпа^ки в системе н-£утанол-уксусная ккслота-вола' 6:1:2; пгоявитель'- 1 %-ккР. раствор А1С1о в этаноле. ,•>,

А - тэазличкые виды клевера: 1-к.алыпг5скиЯ; 2-к.гл;ридный; З-к/готдай; 4-к.земляничный; 5-к.коричневый; с—к.юасковапй; 7-к.лгпиновый; &-к. паннсксктй; Э-к.ползучгй; 1С-к.с?еяний; 11-к.схолный. Б - разновозрастные растения клевера лугового.

С - стандартные образны некоторых ^лавокскдов: а-сгнагюзила; б-нзо-кверпЕТокна; в-квернеттеа; г-гг»-гина; л-биохакгаа А-7-глгиозгла: е-?зо-рамнеткна; а-кеидферола; э-лвтголина; и-фармснонетгка; к-52^хак2на А.

Содержание преобладающих флавоноидов и кумесграха в сырье травы некоторых видов клевера по этапам онтогенеза (в %, ь абс»сух.сырье)

Таблица 4

Вид клевера Название флавоноида Возрастные состояния

4 ¡т г ^ $2 9* «Г

К.альпийский 'ТИН ^зокверцитрия трафолан биоханин А—7—глшо зид 0,33 0,13 0,23 0,30 0,65 0,42 0,32 0,36 0,82 0,71 0,46 0,38 0,74 0,67 0,52 0,47 0,95 0,87 0,64 0,37 0,47 0,69 .0,25 0,39 0,10 0,22 0?!Г

Е.гибргдяый биоханин А—7—глшозид изокверпитрин кверцетиз 0.40 0,19 0,11 0,53 0,40 0,27 0,67 0,77 0,42 0,97 0,53 0,24 0,76 0,82 0,55 0,48 ■ 0,20 0,08 0,29 0,05 следи

"к .луговой • изокверцитрин биоханин А-7-глшозид . трифолин - ононин 0,17 0,12 0,23 0,20 0,49 0,25 0,30 «,24 0,89 0,53 0,43 0,28 '0,57 0,66 0,41 0,37 0,99 0,60 0,57 0,30 0,52 0,64 0,07 0,34 0,15 0,12 следы следы

».ползучий' . трйфолия -•.изоквещитрин 'биоханин А-7-глтозид : куместрол 0,22 0,06 0Д6 - следа 0,35 0,19 0,25 0,08 0,57 0,49 0,36. 0,19 0,52 0,36 0,44 0,28 0,71 0,63 0,36 0,20 0,35 0,34 0,39 0,07 следы 0,13 0,19 следы

-X, средний-'. биоханин А-7-глтозид рутин изокверцит^ ля трифолин 0,37 0,19 0,12 0,08 0,60 0,51 0,28 0,11 0(87 0;74 0,64 0,17 0,96 0,48 0,42 0,20 0,79 0,93 0,85 0,58 0,35 0,23 0,29 О.Н 0,16 0,08 0,11 следы

^»сходный гиперозид изокверлзггрин 0,29 0,24 0,21 0,51 0,38 0,30 0,72 0,60 0,46 0,60 0,53 0,44 0,83 0,77 0,59 0,52 0,40 0,25 0,26 0,20 следы

тивного периода жизненного цикла, как правило, коррелятивно связано о уменьшением содержания флавоноидов и их гликозидов, ироиа-водных изофлавона, и наоборот. В зависимости от необходимого фармакологического эффекта тех или иных флавоноидов, их гликозидоь шш кумеотрода следует заготавливать на сырь^ молодые или оредно-возрастные генеративные растения.

Исследование аминокислотного состава сырья травы средневозрастных генеративных растений II видов клевера показало наличие 17 аминокислот, в том чиоле 8 незаменимых. Количественное содержание отдельных аминокислот, выделенных из различных видов, сортов и биотипов клевера, изменяется в зависимости от возраота растений, пра.этом преобладающие аминокислоты сохраняют свой приоритет на протяжении воего жизненного цикла (табл.5). Качественный ашшокии лотный состав остается постоянным в ходе онтогенеза, характерным для навдого вида клевера.

Проведено сравнительное изучение содержания белка в различии л видах сырья (трава, соцветия) средневозрастных генеративных раот» ний некоторых видов клевера, полученное двумя способами: по содержанию общего азота ("сырой-протеин") и по сумме аминокислот цооли гидролиза белка в оптимальных условиях ("истинный белок") (табл.с). Показано, что "сырой протеин" является общепринятым показателем содержания белка в растительном сырье и представляет собой завы :.еняое количество белка, так кап значительную часть общего азота составляет азот небелкового происхождения. Содержание "сырого при теина" монет служить критерием для различного рода сравнительных исследований, но наиболее правильное представление о биологически ценности сырья монет дать аминокислотный состав исследуемого <;ы| и рассчитанное на его основе содержание "истинного белка".

Суммарное содержание незаменимых аминокислот у генеративны* растений исследуемых видов и сортов клевера составляет 1,0-Э,01

Аминокислотный сослав сырья травы разновозрастных растений на примере клевера лугового сорта Московский I озимого биотипа (.сумма свободных в связанных аминокислот после гидролиза, в % в абс.сух.сырье)

Таблица 5

Наименование аминокислоты Возрастное состояние

</ ¿т 1" $1- 9а 9з 4

■Лизин Кетионин Цистин Триптофан Аргинин Йстидин Лейцин ИзолеЕцин "еяплалания Треонлн Валяя Глицин ■ Аспарагиновая кислота Серин Глгаакияовая кислота Алании Тирозин 0,50 . следы 0,05 0,2$ 0,54 0,08 0,66 0,3.0,27 0,35 . 0,16 о!и 1,30 о.зг 0 у 52с 0,30 0,29 0,57 0,03 0,10 0,30 0,50 0,12 0,71 0,13 0,36 С, 2 0,55 0,21 б', 19 С,73 с,-:; 0,33 0,61 0.06 0,18 0,36 0,50 ОДо 0,о1 0,50 0.15 0, ;9 0,С2 0, 1,57 о, . 0.90 С.55 0.30 О.Со 0,08 0,13 0,3о 0.5С 0,20 : -■О.с'7-0,55 0,51 0,52 0,ъ7 0,51 1.12 0.50 0,95 0,55 0,34 0,74 . 0,0с 0,11 0,31 0,60 0,23 0,с9 0,59 ■ 0,5с 0,61 0,71 0.11 • 1,66 0.5-1 .-0,9Ь о,сс :.с,Зо . 0,76 0,05 О.Ю 0,31 О.СС 0,15 0,85 0.58 0,56 0,55 0,72 0, 10 . 1,7о 0,11 0,6! 0,66 ; 0.36 ' 0,75 следы 0,05 0,30 0.50 0,13 О.оО 0,58 0,15 0,50 ■ С.70 0.32 1,72 0,50 С.сС 0.5с 0,30

Сукжа всех аминокислот Г .39 7,79 З.С5 ■.. 9.65 10. 9.71 9,11,

Сукг/.а незаменимых аминокислот 2,68 3,10 3,93 1,29 1,57 ■ 1,03.

Содержание незаменимых амино-

кислот от общей сумггы акияо- 15,3

кислот, % 15,1 53.6 13,1 14,5 -!5,3 . ■44,8

или -10-60* от общего количества аминокислот, что свидетельствует о их высокой ценности и возможности перспективного использования в качестве источника аминокислот.

Таблица 6

Содержание "сырого протеина" и "истинного бе::а" в сырье травы средневозрастных генеративных растений Иаза полного цветения) некоторых видов и сортов клевера

Вид и сорт клевера Содержание "сырого протеина", а в абс.сух, сырье Содержание "истинного белка"

% в абс.сух, сырье % от сырого протеина

к.альпийский 1-1,6 11,0 75,3

к.гибридный ВПК I 15,5 12,6 81,3

к.красноватый 13,1 10,0 74,6

к.луговой ВПК 7 1С,С 13,2 78,6

к.луговой МОСКОВСКИХ! I 15,7 12,1 77,1

к.луговой Тетра-илоицный ВПК 15,9 12,7 79,9

к.люпиновый 10,2 7,5 73,5

к.ползучий 11,9 11,1 7-1,5

к.нолзучиП Юбилейный 23,-1 113,0 76,9

Анализ минерального состава сырья (травы, соцветий) средневоз-

растных генеративных растений II видов клевера показал, что все вицы клеьера богаты биологически активными макро- и микроэлементами. ..х количественное содержание зависит от почвенно-климатических условий произрастания особей, фазы вегетации растений при сборе на ирье и а меньшей степени вида и сорта клевера.

Ери исследовании содержания отдельных компонентов минерального состава клеверов по этапам онтогенеза установлено, что с возрастал постепенно увеличивается содержание кальция, калия, кремния и фосфора (рис.К). Четких закономерностей в изменении остальных алсмен-тпв на обн.'ф/ .■(.'Н!),

состояние

Рис. б.Содеркалие некоторых минеральных компонентов в сырье травы разновозрастных растений на примере клевера ползучего, собранного в Московской области /ВНИИ кормов им.В.Р.Вильямса/, о -калий, © -кальций, д -кремний, к -фосфор.

. При заготовке клевера на сырье следует учитывать его способность аккумулировать некоторые элементы,и в местах сильного экологического загрязнения возможно накопление минеральных компонентов, оказывающих токсическое действие на организм человека (табл,7). Это свойство клевера позволяет использовать evo в качеотве биоиндикатора вредных веществ в загрязненных биологических системах.

Таблица 7

Содержание некоторых минеральных компонентов в сырье средневозрастных генеративных растений клевера лугового, собранного с различных мест произрастания особей (в мг/кг абс.сух.сырья)

Наименование элемента Участок Л I Участок К 2 Участок И 3

трава соцвеТИЯ трава соцветия трава соцветия

Железо 363,0+ 10,СГ 2СО.О+ 5,0 " 2G2.0+ С,0 " 129.0+ 1.0 " 101.0+ 2,0 - 9U,0+ 2,СГ

Марганец 14,7+ з,сг 28,5+ i!tr 30,0+ Т О— 1 23,2+ 26,5+ 0,5" 22,7+ i¡cr

Цинк 33,7+ 0,5" 30,0+ . 2,5" 20,2+ 0,5" 29,5+ Т 20,0+ 0,5" 27,5+ i;or

Шисель 5,0+ 0,2" 3,0+ 0,1" 1,0+ о.г- 3,7+ 0,1" 2,5+ 0,2" 2,0+ 0,2"

Кобальт 0,7+ 0,1- 0,5+ o.i- 0,5+ о,1- 0,5+ 0,1" 0,2+ о,1- 0,2+ o,i-

.Медь 21,0+ 0,7- 19,5+ 0,5" IL.2+ 0,5" 15,0+ 0,2- 10,0+ ; 0,2- 10,0+ 0,2-

х Участок О- I - обочина Каширского шоссе (Москва).

Участок №2-5 км от Каширского шоссе.

Участок № 3 - поля ВНИИ кормов им. ¡3. Р. Вильяме а (фоновая область).

4. Фармакологическая активность и токсичность флавоноидов из сырья клеверов

Известно, что флавоноиды яв^^ются перспективной группой для поиска лекарственных средств, обладающих антигиаертензввной и антиаритмической активностью.

Антигипертензивное действие флавоноидов (экстракт) из сырья травы клеверов изучалось на спонтанно гипертензивных крысах. Установлено, что пороговым действием обладает доза 5 мг/кг, в дозе 10 мг/кг отмечается снижение давления более чем на 5С£ при длительности максимального эффекта 1-2 минуты, дозы 25-100 мг/кг приводят к более выраженному действию при достоверной длительности эффекта от 20 минут до 2 часов (рис.7). Среднео^Фективная доза флавоноидов (ЕДзд) по антигилертензивному действию составила 9+2 мг/кг»

Антиаритмичеокая активность флавоноидов (экстракт) исследова-лаоь на белых крысах. Введение флавоноидов в дозе 100 мг/кг приводило к выживанию 30$ особей при хлорид кальциевой аритмии, в дозе 200 мг/кг в 75$ случаев гибели белых крыс не отмечалось (рис.8). Средне эффективная доза (ЕД^) по данному тесту составила I '.0+3 мг/кг. При аконитиновой аритмии введение флавоноидов в дозе 100 мг/кг предупреждало развитие летальных эффектов у гглвотных (рис.8). ЕДдф по тесту аконитиновой аритмии составила.69+0 мг/кг.

Изучение влияния флавоноидов на моторику кишечника проводилось в опытах на кроликах..Показано, что флавоноиды (экстракт) .оказывай' сходное действие на моторику кишечника с известным стимулятором кишечной перистальтики - ацетилхолпнок. При этом TOiryc тси-■ • шечника повышается в меньшей степени, сталируется перестальтичес-кал волнообразная активность тонкого кийечшша, в окыкч'. окт;;в.шх дозах побочное действие на гемодинамику '.¡нвотных меньае./

Противовоспалительная и раяазагпвляпаая активность Флавоноидов (экстракт, настойка) исследовалась на ::ролг :ах на модели пер-

Рнс.7. Автнпгаертензивнов действие флавоноидов из

сырья трапы клевера лугового при внутривенном введении спонтанно ггпертензивным крысам. Доза судаы флавоноидов: о,- 5 мг/кг; о - .10 мг/кг; д - 25 иг/га-; о - 50 иг/кг; п - 100 ыг/кг.

25 ц

Доза флавоноидов, мг/кг Pac.iL Антиаритмическая активность флавоноидов из -

сырья травы клевера лугового на фоне кальций хло-ридной и ахонитиновой моделей аритмии у крио. Е5 - кальипя хлорид; - аконитин.

вичной гнойной раны. Показано Солее быстрое очищение и заживление раны (A.c.приор.справка й 50C5I7I от 29.01.92). Нанесение 'флавоно-идов (экстракт, настойка) на поверхностные кожные повреждения, вызванные скарификацией эпидермиса у морских свинок, такие способствовало более быстрому развитию репаративных процессов по сравнению с контрольным опытом.

, Исследование лечебной и профилактической эффективности фдаво-ноидов (экстракт) на моделях острого в хронического перитонита проводилось в опытах на белых мышах. Б дозе 50 мг/кг (внутрибрю-шинно) флавоноиды достоверно снижали гибель животных от абсолютно смертельной дозы SiaptyUcoccuf auzeus1 (рис.9). Это свидетельствует о перспективности использования флавоноидов, выделенных из клевера, при острых и хронических инфекциях.

При изучении влияния флавоноидов (экстракт) на пролифератив-цую активнооть лимфоцитов периферической крови человека и клеток селезенки мышей установлено, что флавоноиды оказывают активизирующее влияние на кнллерные системы, участвуйте в иммунных процессах при воспалении и шешше ватное значение для оккогенеза.

Показана низкая острая токсичность флавоноидов, выделенных из клеверов, в опытах на белых мышах и кроликах. В дозе от 5 мг/кг до: 500 мг/кг (JffigQ> 500 мг/кг) флавоноиды не вызывают летальных эффектов.

5. Стандартизация сырья и лекарственных форм на его основе

Установлены диагностические морфологические и анатомические признаки сырья травы в соцветий изучаемых видов-клевера. Диагностическое значение имеют форма и размеры сложного тройчатого листа, длина черешков, наличие и форма прилистников,, форма л пвет стебля, форма соцветий, цветков, наличие и фор^а прицветников. Характерны>'" отличительными особенностями анаточического строения являются:

Рис.' 9. Лечебное и профилактическое действие флавоноидов при стафилококковом перитоните у мышей, А - хронический опыт; Е - профилактический опыт.

ЕЭ- контроль; (Щ- Главоноиды,

тип устьичного комплекса верхней и нижней »пидермы листа, наличие простых одноклеточных я многоклеточных волосков, число впидериаль-ных клеток у их основания, осооенности строения поперечных срезов листочка тройчатого листа, рахиса, чересочка, стебля, венчика, опушенность листочков чашечки.

Предложена качественная реакция с хлоридом алюминия для обнаружения флавоноидов в сырье клеверов. Методика изложена в ЮС на траву клевера, Разработаны показатели качества сырья клевера с учетом результатов сравнительного хроматографического исследования содержания экстрактивных веществ в различных лекарственных формах, полученных из сырья клевера и анализа средних проб сырья из пар-тийв заготовленных в совхозе АПК "Эфирлекраспрома" (деревня Старая Ушица Каменец-Подольского района Хмельницкой области), институте кормов Московской области (культивируемые растения),"Ростовской, Челябинской облаотях, Краснодарском крае (дикорастущие растения) в 1989-92 годах. Для цельного в измельченного сырья установлена влажность не более 14$. В анализируемых образцах влажность, определяемая фармакопейным и деряватографическик методами, находилась в пределах 10,8-13,6$. Установлена норма на содержание общей золы -и- более 13$ для травы и не более 12$ для соцветий; золы, нерастворимой в.хлористоводородной кислоте - не более 6$ идя травы и не более 4$ для соцветий. Определение золы в анализируемых образцах осуществлялось.фармакопейным и дериватографическим методами, Определение нормы допустимых примесей в сырье клеверов: органической примеси - не более 1$; минеральной примеси - не более 1$ для травы и не более 0,5$ для соцветий; побуревших и почерневших частей - не более 10$ для травы, не более 8$ для соць-тий; соцветий с остатками стеблей длиной свыше I см - не более 5$.

Для умельчённого сырья установлены дополнительные показатели '•ячества: частиц,, не'ароходаорх-,.сквозь сито с отверстиями диамет-

ром 7 ым - но солее 15*, исотрактпшшх веществ, извлекаемых 70%-ным атнлови); спиртом - по ü сне о 2Ъ%, массовая доля флавоноидов в пересчете на рутин - не менее 0,5%,

Разработ ш методика количественного определения содержания флавоноидов в пересчете на рутин в сырьо клевера, изложенная в ВХ'С на траву клевера. В основе методики ле л? спектрофотометрическнД метод определения рутина после экстракции флавоноидов 60^-ншд этанолом из сырья кливера и получения окраиенного продукта при добавления спиртового раствора влшиния хлорида» Выбор рутина на роль стандартного обусловлен тем, что основные флавоноидц» входящие в состав сырья клевера, имеют длинноволновый максимум поглощения в области 380-130 км. Максимум поглощения стандартного образца рутина находится при 110—115 км. Сравнительный анализ УФ-спектров фла-воиоидов из сырья различных проб и ГСО рутила показал, что они близки по положению а относитзльной интенсивности полоо поглощения» Кроме того, рутин входит в состав флавоноидов из сырья клевера.

Определена упаковка, маркировка а транспортирование сырья клевера. Установлено, что пра правильном хранении сырья показатели качества достоверно соо.оетствуют требованиям BJC в течение 2,5 лет, В ВТ С предлагается ограничить срок годности оырья - 2 года.

Разработаны инструкции по сбору и сушке травы и соцветий трех видов клевера, в которых предлояена система рационального испол-ь-ования дикорастущих п культивируемых популяций клевера.

Разработан опытно-промышленный регламент на производство сырья (травы) клевера лугового. Технологическая схема производства шлдчает пять стадий. Рассчитаны норды расхода сырья по каядой стадии технологического процесса. Оценено допустимое количество т-ходоц производства и оптимальный выход конечного продукта. Установлены важнейшие точки производства, обеспечивающие соблюдение установленного технологического режима, в том числе do ведены исследо-

ваняя по определении оптимального режима сушха сырья. Определены средства контроля, контролируемые параметры ж регламентируемый норматив в этих точках производства. Маркировка, упаковка, транспортирование и условия хранения сырья согласуются с данными ЮС на траву клевера.

На настойку травы клевера разработано ТУ 61-1-100-92. Основными показателями качества определены: массовая доля сухого остатка »• не менее 1,2$, содержание этилового спирта - не менее 2Ь%, показатель активности водородных ионов (рН) - 7,4+0,5. Предложены упаковка» маркировка, транспортирование и условия хранения настойки, требования безопасности, правила приемки и методы испытания. Наотойка клевера была подвергнута всестороннему токсикологическому исследованию в НИИ гигиены труда и профзаболеваний и была отне-оена к 4 клаосу малоопасных соединений (по ГОСТ 1^,1007-76).

Разработан лабораторно-технологический регламент на производство настойки травы клевера. Технологическая схема производства включает 6 технологических стадий и заключается в экстрагировании биологически активных веществ 30^-ным этанолом способами мацерации или перколяций Я последующим отстаиванием извлечения, фильтрованием упаковкой и маркировкой товара. Рассчитаны нормы расхода сырья и материалов по стадиям технологического процесса, оценено допустимое количество отходов производства и оптимальны!; выход конечного продукта. Определены методы анализа и контроля препарата,

Для определения количественного содержания флаьоноидов попользовали методику; разработанную нами для определения .¡лавоноидов в пересчете на рутин в сырье. Установлено содержание р. тина в анализируемых образцах настойки клевера от 0,03^ до С,С5^. Предложена норМа' содер.-кания :суьг.ы ¡Тлавонойдов в пересчете на рутин не менее О * 035? в лаоораторно-техяологпческом регламенте на производство, нас-тЛки'из травы клевора.

Разработаны основные показатели качества сухого экстракта травы клевера: содержание влага а тяжелых металлов, как указано в статье ГО-П "антракты", количественное содержание флавоноидов в пересчете на г тин, определяемое по модифицированной методике определения флавоноидов в сырье травы клевера, не менее 0,65?.

Предложен новый способ получения сухого экстракта из сырья травы клевера (A.C.првор.справка 5025175-й). Сущность его заключается в экстрагировании лекарственного растительного сырья 30-80?-ным этанолом методом мацерации с последующим концентрированием на роторном испарителе или лиофильной сушкой» Преимуществами данного способа является существенное упрощение процесса экстракции, повышение в 5 раз шхода сухого остатка, оптимальное сочетание биологически активных веиеств. Существенным отличием данного способа является использование роторного испарителя пли лиофильной сушки вместо упаривания при температуре Ю0°С. При данном способе получения улучшаются цветовые а органолептические показатели качества экстракта,

В качестве показателей качества настоев и отваров из сырья травы клевера нами пред; '.ейы: содержание сухого остатка не менее 1,5?; содержание флавоноидов в пересчете на рутин не менее 0,01?.

Настойка н настой клевера прошли испытания в лаборатории хи-...ии и технологии косметических продуктов Всесоюзного неучно-иссле-гпвательского института синтетических и натуральных душистых веществ (ВНИИСЩОВ) и рекомендованы к использованию в средствах для ухода за полостью рта, в частности в зубном элексире и зубной пас-i для придания им противовоспалительного, антисептического и анти-аллергениого действий при гингивитах и парадонтоза*. Клинические испытания зубного илексира и зубной пасти, проведенные в ШОП ' им.H.A.Семашко, подтвердили наличие положительного терапевтического »¡»{екта. Средства для ухода за полостьи рта, сидерите иастийк*

и настой травы клевера, приняты к производству на предприятиях Концерна Союзпарфшерпрома (письмо из БШМСНДВ й I0G3/5 от 07.10.92).

Настойка клевера дугового прошла испытания в Научно-исследовательском институте медицины труда и рекомендована к использованию в кремах "Каро", "Мадонна", геле Д2Я ко*Л! лица и рук "Оазис", лосьоне "Ыирая" для придания им противовоспалительного, антисептического и антиаллергенного действий (письмо й 06-01-I1-117 от 10.08.92 в № 0S-0I-I-1-124 от 23.08.92). Клинические испытания, проведенные в Институте красоты и в ММСИ им.Н.А.Семашко на кафедре кожных и венерических болезней, не выявили неблагоприятного действия при длительном применении (письмо й 216 от 23.05.91 и заклше- . нке $ 156/92 от 25.09.92). Рецептуры крема "Каро", геля "Оазис", лосьона "Мираж", содержащих настойку клевера лугового, приняты к производству. Крем "Мадонна" находится в серийном производстве.

ОБЩИЕ ШВОДЫ

1." Впервые осуществлено комплексное Оотшшко-^армакогностическое и доклиническое изучение II видов клевера.

2. В результате исследования онтогенеза II видов :;левера установлены морЯолого-анатомическве признаки и биохимические показатели возрастных состояний; показана полквариантиость морфогенеза

в зависимости от типа биоморф и ыорфологическо.': дезинтеграции; выделено три уровня яизненностп особей в зависимости от ил мощности *и возможных перспектив развития в ходе онтогенеза. Установлено, что для рационального использования клеверов следует заготавливать на сырье средггевозрастные генеративные растения, характеризующиеся максимальными размерами и наибольшей биомассой.

3. Изучены различные варианты жизненного цикла клеверов моноцентрического в явнополицентрического типов биог/орХ-; определены основные факторы, влияющие на ход онтогенеза и возрастные показа-

тели, Установлено, что действие антропогенных факторов вызывает постепенное снижение уровня жизненности особей, сокращение жизненного цикла, преждевременную гибель растений»

4» На основании исследований основных признаков ценопопуляций II видов клевера установлены базовые возрастные спектры нормальных ценопопуляций, свойственные виду в определенных условиях; показана возможность построения теоретических возрастных спектров для долгосрочного прогнозирования запасов сырья клевера.

5. В результате изучения химического состава сырья II видов клевера установлено, что наибольшее суммарное количество фшавоно-здов содержат в прегенеративном периоде имматурные или виргиниль-ные растения, в генеративном периоде - средневозрастные особи; показано влияние эколого-фитоценотических факторов на содержание флавоноидов, Исследована динамика флавоноидов в различных видах сырья по фазам вегетации, установлено, что для рационального и эффективного использования ценопопуляций клеверов следует заготавливать на сырье средневозрастные генеративные растения в фазе цветения.

6. Выделены и идентт1и1щрованы из сырья травы II видов клевера 21 вещества из группы флавоноидов; биоханин А, биохатш А-7-глю-козид, генистеин, генистин, гиперозид, даидзеин, даидзин, изоквер-цитрин, изорамнетин, кверцетин, кверцитрид.кемферол, лютеолин, лю-теолин-7-глюкозид, ононин, популнин, пратенсеин, прунетин, прунит-рин, псевдобаптизин,- рутин, трифолин, формононетин, цинарозид и 2 соединения из группы куместанов: куместрол и трифолиол. Исследована их динамика в ходе онтогенеза.

На основании изучения аминокислотного состава сырья травы II видов клевера установлено наличие 17 аналитически определяемых аминокислот, в том числе 8 незаменимых; исследовано изменение их концентраций в ходе онтогенеза; показана перспективность испильчи-

вания клеверов в качестве источника аминокислот и необходимость оценки онрья по содержанию "истинного белка"*

8« Исследован минеральный состав сырья (травы, соцветий) II видов клевера. Установлено, что количественное содержание компонентов зависит от почвенно-климатических условий, возраста растений, фазы вегетации, вида сырья и, в меньшей степени, вида и сорта клевера* Показана способность клеверов аккумулировать некоторые элементы (например, никель, медь, кобальт, цинк) и возможность использования растений в качестве биоиндикаторов загрязненных биологических систем.

9. Изучена впервые антигипертензивная, антиаритмическая, противовоспалительная и ранозаживляющая активность флавоноидов из сырья клеверов; показана их низкая токсичность,

10. Впервые разработана система стандартных тестов, характеризующих подлинность и качеотво сырья (травы, соцветий) II видов клевера, нашедшая отражение в фармакопейной статье, инструкциях по сбору и сушке сырья, опытно-промышленном регламенте на производство оырья клевера. Предложена методика количественного определения флавоноидов в пересчете на рутин в сырье клеверов.

11. Установлены показатели качества настойки, сухого экстракта, наотоя и отвара клеверов, которые использовались при разработке технического условия на настойку травы клевера, лабораторно-технологического регламента на производство настойки травы клевера, нового способа получения сухого экстракта из сырья травы клевера.

12. Прошли клинические испытания и приняты к производству: зубной элекоир и зубная паста о настойкой иди настоем клевера, обладающие противовоспалительной, антисептической в антиаллергенной ак-тивноотьй .и рекомендовайные- для профилактики и лечения гингивитов

и парацонюзо'в./крец пКаро"Ггель .."Оазис", лосьон "Мираж" о настойкой'клевера, -придающей, ^«Гп^ФивозсспаМФегГьное, антисептическое и.

антиаллергенное действия» Крем "Мадонна", содержащий настойку клевера и обладаицнй аналогичными действиями, находится в серийном

производстве.

Основное содержание диссертации изложено в следующих работах:

1. Бабаския B.C. Ботанико-фармакогностическое исследование клевера лу го во го , //!,1ат ер, У Всерос. съезда фармацевтов, Ярославль, 1987, о.419-421,

2. Бабаскин В.С;, Барабанов Е.И,, Воробьева Т.И. и др. Биоморфологический анализ некоторых видов лекарственных растений. // Сб. науч.тр. I ММИ "Актуальные проблемы современной фармации", 1.1., 1986, c.II6-II7,

3. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И., Шустова А.Л. Анатомическая характеристика травы клевера красного. // Деп. в ВИНИТИ, й 2411-В87, с,5.

4» Бабаскин B.C., Барабанов Е.И» Биометрическая характеристика воз. растных состояний некоторых представителей семейства амариллисовых. // Сб.науч.тр.ВНИИФ "Ресурсоведческое и фармахогиостичес-кое изучение лек.флоры СССР", М., 1937, т.XX/.

5. Бабаскин B.C., Барабг"тов. Е,И., Бабаскина Л,, И. Химический состав в биологическая активность растений видов рода клевер ( Ttífo-¿•отцщ // s."Фармация", 1989, & 3,. с.78-82.

6, Бабаскин В,С,, Барабанов Е.И,, Бабаскина Л.И. Частота встречаемости цианогенеза в популяциях Tzifoiium рга tense / // Деп. в ВИНИТИ, Jí I6I9-B88, с.8.

7, Бабаскин B.C., Петров Н.П., Бабаскина Л,И. Использование клевера лугового как биоиндикатора антропогенных воздействий. // Сб. науч.тр. "Актуальные проблемы фармации Западной Сибири и Урала", Свердловск, 1989, с.130-134,

8. Бабаскин B.C., Барабанов E.H., Васнецова O.A. и др. Опытно промышленный регламент (ОПР) на производство обьиытиниго ощл.н

(травы) клевера лугового ( Ht-гйа fcifoftt pinfe/ist's ). М., 1989.

9. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И. Цианогенез в клевере луговом -liifott'ufh p7»ten$e А // к."Фармация", 1989, * 6, O.I4-I6.

10. Бабаскин В.С», Барабанов Е.Й. Изучение онтогенеза клевера лугового в экологическом аспекте. // Тез.докл.меадунар.оимпоз."Экологические аспекты г фармации",. М., 1990, с.47.

11. Бабаскин B.C., Барабанов В.И. Анатомическая диагностика сырья клевера лугового - Tiifo(tum рт tense /// е."Фармация", 1991, Л 4, 0.22-25.

12. Бабаскин B.C., Барабанов Ё;И. Перспективы использования клевера в научной медицине, // Сб.науч.тр.БНИИШС "Состояние и перспективы создания лек,средств и фитохимических препаратов", Харьков, 1990.

13. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И, Новый подход в изучении онтогенеза лекарственных растений (на примере клевера лугового). // Тез.

. докд.Республ.науч.конф."Реализация науч.достижений в практич. фармации", Харьков, 1991.

14. Бабаскин B.C., Бабаскина Л.И. Влияние различных факторов на комплекс возрастных показателей в онтогенезе клевера лугового. //• Тез.докл.науч»-практ»конф."Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке", Томск, 1991, с.12.

15. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И., Муравлева М.Ю. и др. Рпохимичес-кие показатели возрастная этапов онтогенеза клевера лугового. // Деп. в ВИНИТИ, Jft 988-B9I, с.7.

16. Бабаскин B.C., Киселевский М.В., Добрянский B.C. Антиаритмичес-кпе свойства суммы флавоноидов клевера лугового ( Tiifadium ptniense ). // я."Фармация", 1992, Я 3, с.65-66.

17. Бабаски.. B.C., Киселевский М.В., Маринова.Н.Д. Настойка травы клевера лугового. // ТУ 64-1-1CO-S2. .

10. Бабаскин B.C., Киселевский M.В..Новожилова Т.И.- и др. Способ получения экстракта биологически активных веществ из клевера лугового. // А.С.приор.справка № 5025175 от 29.01.92.

19. Бабаскин b.c., Киселевский М.В., Новожилова Т;И. и др. Применение экстракта клевера лугового в качестве ранозаживляющего и противовоспалительного средства. // А.с.приор.справка J& 5025I7I от 29.01.92.

20. Бабаскин B.C., Киселевский М.В. Лабораторно-технологический регламент на производство настойки травы клевера лугового. М., 1992.

21. Бабаокин B.C., Киселевский М.В. Антигипертензивное действие фла-воноидов клевера лугового. // ж."Фармация", I9a3, №2 , с. ,

22. Бабаскин B.C., Киселевский М,В. Влияние суммы флавоноидов, выделенной из клевера лугового, на моторику тонной кишки. // »."Фармация", 1992, й 6, с.78-79.

23. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И. Динамика морфолого-анатомических признаков надземных частей растений некоторых видов рода клевер в ходе онтогенеза, // ж."Фармация", 1992, К 6, с.*50-36.

21. Бабаскин B.C., Киселевский М.В., Абронина И.Ф. и др. Влиянии экстракта клевера на пролиферацию лимфоцитов человека и мышей. // л."Бпл.экопер.биологии и медицины", 1992, И II, с,520-521.

25. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И., Бабаскина Л.И. Основные морфологические признаки возрастных соотояний онтогенеза надземних частей растений рода клевер. // Дел. в ВИНИТИ, В 2784-В92, с.lu.

26. Бабаркин В»С,, Барабанов Е.И,, Бабаскина Л.И. Анатомические признаки возрастных состояний в онтогенезе надземных частей растений рода клевер. // Деп. в ВИНИТИ, № 2782-Б92, ц.13.

27. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И., Бабаскина Л.И. Некоторые мозоли-го-анитомические признаки корневой системы разновозрастных тений клонера в онтогенезе. // Ден. ь ШШШ'И, й l!Vt<3-lУХ', с.ч

28. Бабаокин B.C., Барабанов Е.И., Арзамасцев А.П. Трава клевера лугового. J J Временная фармакопейная статья. М., 1992.

29. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И..Киоелевсквй М.В. и др. Инструкция по сбору и сушке травы клевера лугового, М., 1993, о.4.

30. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И., Киселевский М.В. il др. Инструкция по сбору и сушке травы клевера гибридного, M., 1993, о.4.

31. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И., Киселевский М.В. и др. Инструкция по сбору и сушке травы клевера ползучего,'М.,' 1993, о.4.

32. Бабаскин B.C., Барабанов Е.И., Киселевский Ы.В. и др. Инструкция по сбору и сушке соцветий клевера лугового, Ы., 1993, с.4.

33. Бабаскин B.C., Шадрин О.В., Досовская С.Н. Лечение экспериментального перитонита, вызванного 'tflapAyiococcuf лиге и ^ f экстрактом фдавоноидов клевера лугового, // s."Б&д.вкопор.биологии и медицины", 1993, В 4.