Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение влияния фармацевтических факторов на высвобождение дибунола и оксиметилурацила из биообъектов и лекарственных форм

На правах рукописи

ШИКОВ АРТЕМ НИКОЛАЕВИЧ

□03054Э00

ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ФАКТОРОВ НА ВЫСВОБОЖДЕНИЕ ДИБУНОЛА И ОКСИМЕТИЛУРАЦИЛА ИЗ БИООБЪЕКТОВ И ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Самара - 2007

¿7*

003054900

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Лиходед Виталий Алексеевич

Научный консультант: кандидат медицинских наук,

Чернов Николай Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Шаталаев Иван Федорович

доктор фармацевтических наук, профессор Халиуллип Феркат Адельзянович

Ведущая организация:

Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования "Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию"

Защита состоится « /У» ал/,. .¿с¿Х- 2007 г. в Ю_ часов на заседании диссертационного совета К 208.085.03 при ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (443079, г. Самара, пр. К.Маркса, 165Б).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (443079, г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «_»_2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Кандидат фармацевтических наук, доцент Е.В.Авдеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Особый интерес представляют исследования по разработке способов изолирования лекарственных веществ из биообъектов и их качественное и количественное определение в лекарственных формах, что позволяет не только усовершенствовать и модифицировать известные методы анализа, но и предлагать новые подходы в решении обсуждаемых проблем. Эти исследования можно охарактеризовать как комплексное направление в практическом использовании в химических лабораториях, в технологических процессах и судебно-медицинской экспертизе.

В последнее время большое внимание уделяется лекарственным формам, обладающим, антиоксидантной активностью. К ним относятся современные новые лекарственные препараты дибунол и оксиметилурацил.

Высокая фармакологическая активность антиоксиданта дибунола (2, 6-дитретбутил-4-метилфенол) делает актуальными исследования, направленные на разработку новых лекарственных форм (таблетки, суппозитории, карандаши, овули), а также создает предпосылки для разработки современных методов анализа и изучения фармакологической активности, фарма-кокинетики, что позволит расширить область клинического применения данного антиоксиданта.

В лаборатории укрупненного синтеза и УНЦ РАН синтезирован стимулятор иммунитета - оксиметилурацил (5-гидрокси-6-метилурацил). Впервые его иммуномодулирующие свойства обнаружены Д.Н.Лазаревой, Е.К.Алехиным в начале 60-х годов.

Препарат успешно прошел две стадии клинической апробации в ведущих клиниках страны. На основании комплексных исследований Фармакологическим комитетом МЗ РФ утверждена ФСП 42-0415-2776-02 на субстанцию оксиметилурацила. В связи с этим представляются актуальными исследования по разработке новых методов изолирования оксиметилурацила из биообъектов, по разработке методов качественного и количественного определения оксиметилурацила из различных лекарственных форм (суппозиториев и мазей), по изучению фармако-кинегических параметров.

Расширение ассортимента методов анализа действующих веществ - дибунола и оксиметилурацила, изучение их фармакокинетики позволяют оценивать влияние фармацевтических факторов, и решать вопросы усовершенствования технологии различных лекарственных форм.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы явились комплексные исследования по разработке методов анализа дибунола и оксиметилурацила в биологических объектах, изучение влияния фармацевтических факторов на высвобождение исследуемых соединений из лекарственных форм, а также изучение их фармакокинетических параметров.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Обосновать с помощью метода математического планирования эксперимента оптимальные условия экстракции дибунола из плазмы крови и разработать способ его количественного определения в биообъектах.

2. Определить время экстракции дибунола из биологических объектов в экспериментах на опытных животных.

3. Определить время достижения максимальной концентрации дибунола в плазме крови после введения перорально и ректально опытным животным. Установить наличие корреляционной связи в опытах in vitro и in vivo при различных способах введения.

4. Разработать методики качественного анализа дибунола в лекарственных формах.

5. Разработать способ определения концентрации оксиметилурацила в крови.

6. Изучить связывание оксиметилурацила с белками и эритроцитами крови.

7. Определить фармакокинетические параметры и предложить оптимальную схему приема оксиметилурацила.

8. Разработать методику изолирования оксиметилурацила из биообъектов и его количественного определения в опытах in vitro и in vivo при различных способах введения. Установить наличие корреляционной связи.

Научная новизна. Установлены оптимальные условия экстракции дибунола из плазмы опытных животных, выявлены оптимальные условия очистки экстракта методом ТСХ, с последующим спектрофотометрическим определением. Разработан способ количественного определения дибунола в биообъектах, и установлено время экстракции для каждого биообъекта. При пероральном и ректальном введении дибунола установлена его максимальная концентрация в плазме крови. Методами in vitro и in vivo установлена биодоступность таблеток и суппозиториев, расчитаны площади под фармакокинетическими кривыми.

С использованием ГХ/МС разработана методика обнаружения дибунола в лекарственных формах (суппозитории, овули, карандаши и таблетки).

Разработан способ изолирования оксиметилурацила из биологических объектов (кровь, сердце, почки, печень, кишечник, надпочечники, мышцы, мозговая ткань и раневой струп), с последующим качественным и количественным определением методом спектрофотометрии. Изучено связывание оксиметилурацила с белками и эритроцитами крови.

С помощью разработанного способа изолирования оксиметилурацила в крови и органах животных установлены основные фармакокинетические параметры: время и периоды полувсасывания, полураспределения и полувыведения, кажущийся и кинетические объемы распределения, общий клиренс, площадь под фармакокинетической кривой, а также время достижения максимальной концентрации. Рассчитана площадь под фармакокинетической кривой AUC, которая составляет 341,00± 8,05 мкг/мл. Предложена схема приема пероральных лекарственных

форм, содержащих оксиметилурацил. Препарат следует назначать 4 раза в день с временным интервалом 5 часов.

Практическая значимость. На основании проведенных комплексных исследований разработаны и внедрены:

1. Методические рекомендации «Изолирование, обнаружение и определение оксиметилура-цила в биологических объектах». Бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ РБ.

2. Акт о внедрении результатов научно-исследовательской работы «Изолирование, обнаружение и определение оксиметилурацила в биологических объектах». Бюро судебно-медицинской экспертизы МЗ РБ.

3. Акт о внедрении «Средство для лечения заболеваний глаз с метронидазолом и оксиметилу-рацилом» №44-1/01 от 27.05.03. ГУ Всероссийский центр глазной и пластической хирургии.

4. Акт о внедрении «Средство для лечения заболеваний глаз с метронидазолом и оксиметилу-рацилом» от 23.05.2003. УФНИИ глазных болезней МЗ РФ.

5. Акт о внедрении «Стоматологический карандаш с дибунолом и экстрактом прополиса» от 19.12.2002. ООО «Космедент».

6. Акт о внедрении «Стоматологический карандаш с дибунолом и экстрактом прополиса» от . 15.01.2003. Клиническая стоматологическая поликлиника БГМУ.

Положения, выносимые на защиту:

1. Принципы разработки методов анализа дибунола и оксиметилурацила.

2. Методы изолирования дибунола и оксиметилурацила из биообъектов, время и условия экстракции.

3. Методы качественного и количественного определения дибунола и оксиметилурацила в лекарственных формах (таблетки, суппозитории, овули, карандаши).

4. Результаты биофармацевтических исследований, фармакокинетические показатели как неотъемлемая часть фармацевтических факторов, влияющих на высвобождение дибунола и оксиметилурацила. .

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы обсуждались на научных конференциях студентов и молодых ученых БГМУ (Уфа, 1997, 2000, 2001, 2002), научной конференции (Пятигорск, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 печатных работ, из гегх 8 патентов и 1 рационализаторское предложение.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР БГМУ по проблеме «Изыскание и изучение новых лекарственных средств» (№ гос. регистрации 01200507996).

Объем и структура диссертации.

Диссертация изложена на 170 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 3 глав экспериментальных исследований, общих выводов, библиографии и приложений. Работа иллюстрирована 23 табл. и 23 рис. Библиографический указатель включает 290 источников, из них 54 иностранных авторов.

Во введении обоснована актуальность проблемы, сформулированы цели и задачи исследования, охарактеризована научная новизна и практическая значимость полученных результатов.

В главе I представлен обзор литературы, приведены данные по современному состоянию исследований высвобождения лекарственных веществ in vitro и биологической доступности их in vivo - как современных показателей качества лекарственных препаратов. Приведены данные по использованию в медицине дибунола и пиримидиновых оснований.

В главе II экспериментальной части изложены методики проведения исследований, даны характеристики использованным материалам.

В главе III экспериментальной части представлены собственные исследования по разработке методов экстракции дибунола из биообъектов, по определению фармакокинетических параметров, по изучению его высвобождения из лекарственных форм.

В главе IV собственных исследований представлены данные фармакокинетических исследований, количественного определения оксиметилурацила в биообъектах и его высвобождения из лекарственных форм.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментальных исследованиях использованы лекарственные вещества и полимерные соединения, зарегистрированные в РФ. Стандартные физико-химические, биохимические, технологические исследования, методы статистической обработки экспериментальных результатов.

1. Фармакокинетические исследования дибунола

Разработка методики изолирования и обнаружения дибунола из биожидкостей осуществлялась с учетом оптимальных условий экстракции. Для определения оптимальных условий экстракции применяли один из методов математического планирования эксперимента - латинский квадрат. Нами изучено одновременное влияние на процесс экстракции четырех факторов: природы органического растворителя, рН буферного раствора, введения электролитов и времени экстракции в минутах. Каждый из факторов варьировал в 7 повторениях. В качестве органических растворителей применяли: бутанол-4, диэтиловый эфир, хлороформ, изопропиловый

спирт, дихлорэтан, метиловый спирт и гексан. В процессе выбора экстрагента оптимальное значение pH создавали с использованием универсальной буферной смеси. Измерение pH проводили с помощью прибора иономер рН-150. Электролитами служили растворы натрия хлорида и сульфат аммония в концентрации 5%, 20%, и добавленные до насыщения. Для определения количественного содержания экстрагированного дибунола использовали метод УФ-спектрофотометрии. Предварительно был снят УФ-спектр поглощения дибунола в 95% этаноле, отмечено полное совпадение с литературными данными (Clarke's Isolation and Identification of Drugs. - London, 1986).

В ходе разработки методики изолирования из биологических объектов (плазма крови крыс) дибунол вводился крысам (самцам) массой 180±10 г в дозе 50 мг/кг per os, заборы крови осуществляли через 3 и 4 часа. Для проведения экстракции была использована колба с обратным холодильником при нагревании на водяной бане. Проводился регулярный забор экстракта с целью обнаружения максимального количественного содержания дибунола.

При экстрагировании в течение 15, 30, 45 минут дибунол в биожидкости (крови) не наблюдается. Концентрация извлекаемого препарата находится на низком уровне. Оптическая плотность исследуемого раствора составляла от 0,080 до 0,200. В дальнейших исследованиях процесс экстракции проводили в течение 60 минут. Оптическая плотность образцов составляла от 0,200 и выше, что позволяет проводить математический расчет концентрации дибунола в биологических объектах и биожидкостях. Установлено, что максимальный выход дибунола из биообъекта наблюдается при использовании в качестве экстрагента изопропилового спирта, при pH 6,0, в присутствии электролита раствора хлорида натрия 5% и времени экстракции 60 минут.

Наибольший выход дибунола в биообъектах (в %) получен при использовании изопропилового спирта (77,32%). При добавлении электролитов эффективность экстракции дибунола из биообъекта увеличилась в диапазоне от 10 до 20 %. Так же оказывало влияние время экстракции, и поэтому выбор времени целесообразно оценивать для каждого биологического объекта индивидуально. Из полученных данных по эксперименту экстракцию следует проводить изопропиловым спиртом не менее 60 минут при наличии электролита 5% раствора хлорида натрия, при pH раствора = 6,0.

Установлено, что при анализе экстракта спектрофотометрическим методом полученные спектры поглощения имеют пики присущие примесям, находящимся в плазме крови и извлекаемым экстрагентам. Следовательно, для получения достоверных и четких спектральных графиков препарата из биообъекта необходима дополнительная очистка полученных извлечений. С этой целью нами использовался метод тонкослойной хроматографии (ТСХ), который позволил осуществить выбор оптимальной системы растворителей (табл. 1).

Таблица 1 - Изучение влияния системы растворителей на степень высвобождения дибунола методом ТСХ

№ системы Состав системы и соотношение компонентов Интенсивность пятен метчиков

1 Этанол-уксусная кислота-вода (4:1:4) +

2 Гексан-этилацетат (3:1) ++

3 Хлороформ-ацетон (9:1) +++

4 Бутанол-вода-уксусная кислота (12:5:3) -

5 Этилацетат-метанол-аммиак (17:2:1) ++

б Гексан-диэтиловый эфир (5:3) ++

7 Спирт-аммиак (4:1) ++

8 Бензол-петролейный эфир (3:1) +

9 Бензол-петролейный эфир (1:1) +

10 Бензол-этилацетат (95:5) ++

11 Хлороформ-ксилол (1:1) -

12 Бензол-этанол-уксусная кислота (45:8:4) ++

Примечание: - не наблюдается; + слабо выражено; ++ удовлетворительно выражено; +++ четко выражено.

Каждая система растворителей влияла на степень высвобождения дибунола из извлечений и по интенсивности проявленных пятен можно сделать вывод о лучшем высвобождении. В процессе эксперимента все системы растворителей (табл.1), за исключением систем растворителей № 4, 11 показали удовлетворительный результат. Пластины были просмотрены в УФ-свете, и проявлены в парах йода. Наиболее четкие пятна наблюдались в системе растворителей №3, поэтому в дальнейших исследованиях методом ТСХ, в качестве системы растворителя использовали бинарную смесь хлороформ-ацетон (9:1).

Для изучения присутствия и количественного содержания дибунола в биообъектах исследования проводились на 387 белых беспородных половозрелых крысах самцах массой 160220 г, содержавшихся в стандартных условиях вивария. Дибунол вводили животным в виде водной суспензии с помощью зонда в дозе 50 мг/кг. Животных декапитировали под легким эфирным наркозом. Концентрация дибунола определялась в биообъектах - плазме крови, сердце, печени, почках, мозговой ткани, подкожной жировой клетчатке (табл. 2). Все исследования проводились в сравнении с контрольной группой животных. Экстракцию дибунола из биообъектов проводили изопропиловым спиртом. Способ определения дибунола из тканей осуществляют следующим образом. В эксперименте использовались биообъекты животных в качестве гомогената приготовленного из расчета 1 г биообъекта с добавлением 5 мл физиологического раствора.

Таблица 2 - Перечень биообъектов используемых для экстракции

№ n/n Масса животного Время, часы Вес органов, г

сердце Печень Почки (правая) Мозговая ткань Подкожная жировая клетчатка ! Кровь, (плазма)

1 210 1 1,0 8,7 0,7* 1,0 0,5* 5,0

2 240 2 1,0 5,5 1,0 1,0 0,5* 6,0

3 250 3 1,0 6,5 0,8* 0,8* 0,5* 3,5

4 250 4 0,7* 5,5 0,7* 1,0 0,5* 4,0

5 150 5 0,8* 8,2 1.0 1,0 0,5 4,0

6 250 6 1,0 9,3 0,8* 1,0 0,5* 3,5

7 170 7 0,7* ■ 6,5 0,8* 1,0 0,5 2,5

8 180 8 0,7* 5,2 0,6* 1,0 0,5 3,0

9 170 10 0,7* 5,5 0,7* 1,0 0,5 3,5

10 190 12 0.6* 4,8 0,6* 1,0 0,5 3,5

1 11 190 24 0,7* 5,7 0,6* 1,0 0,5 4,5

*- орган с целым весом

Массу гомогенизировали в гомогенизаторе и помещали в сухую химическою колбу емкостью 100 см3 в количестве 1,0 г, и прибавляли 50 мл изопропилового спирта, 10 мл 5% раствора хлорида натрия, перемешивали стеклянной палочкой и ставили на водяную баню. Колбу закрывали обратным холодильником и проводили экстракцию при 80° С, в течение 1, 2, 3, 4, 5, б, 7 и 8 часов. Экстракт охлаждали при комнатной температуре и обезвоживали 5 г меди сульфата (предварительно прокаленным). Фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в сухой химический стакан емкостью 50 см3, в сухую выпарительную чашку емкостью 25 см3 помещали 5 мл фильтрата и выпаривали на водяной бане до сухого остатка, который растворяли в 0,1 мл этилового спирта 96%. Проводили хроматографическое определение в тонком слое сорбента, которое осуществляется следующим образом. Стеклянным капилляром наносили исследуемый раствор на линию старта хроматографической пластинки марки "Сорбфил" и параллельно наносили PCO - 0,5% раствор дибунола в этиловом спирте. Пластинку хроматографиро-вали в системе растворителей: хлороформ - ацетон (9:1), пробег фронта растворителей 10 см и проявляли в парах йода, на участке с исследуемым раствором наблюдали окрашенные пятна желтого цвета с Rf = 0,9, Наблюдаемые пятна в ультрафиолетовом свете элюировали и помещали в сухой химический стакан емкостью 25 см,3 растворяли в 5мл этилового спирта 96%, фильтровали через бумажный фильтр и измеряли оптическую плотность на спектрофотометре марки HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 276 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. Раствором сравнения служил раствор исследуемого объекта - опыт интактных животных, который подготовлен к анализу аналогичным образом. Приведены результаты изучения оптимального времени экстракции (табл. 3).

Таблица 3 - Изучение времени экстракции в биологических объектах

№ п/п Название биологического объекта Время экстракции, часы Максимальное значение оптической плотности при Х-276 нм

1 Плазма 5 2,49842 + 0,059

2 Печень 4 1,39725 ±0,027

3 Почки 3 0,81132 + 0,082

4 Сердце 2 0,81231 ±0,055

5 Мозговая ткань 4 0,74989 ± 0,049

6 Подкожная жировая клетчатка 3 0,72438 ±0,018

Опытным животным (крысам) дибунол вводился перорально в виде таблеток из расчета 50 мг/кг и ректально в виде суппозиториев из расчета 50 мг/кг, результаты исследований приведены в таблицах 4 и 5.

Таблица 4 - Концентрация дибунола в плазме крови в зависимости от времени при введении животным ректально в виде суппозиториев, хЮ^мкг*

№ Время после введепия животным, часы

п/п 0,5 1 2 3 6 12 24

1 1,59350 4,23890 3,52945 3,16800 2,63900 2,19015 1.16260

2 1,52595 4,21710 3.50995 3,18145 2,71280 2,00970 1,16880

3 1,57455 4,22335 3,83280 3,49115 3,08510 1,92515 1,16720

4 1,67215 4,38270 4,22745 3,85330 3,44710 1,91235 0,79880

5 1,54405 4,32650 4,12970 3,88675 2,52380 1,90755 0,81330

Среднее значение . 1,58204 4,27771 3,84587 3,51613 2,88156 1,98898 1,02214

Концентрация дибунола с учетом интактного опыта 1,44754 4,14321 3,71137 3,38163 2,74706 1,85448 0,88764

Таблица 5 - Концентрация дибунола в плазме крови зависимости от времени при введении животным перорально в виде таблеток, хЮ^мкг*

Л4 Время после введения животным, часы

п/п 0,5 1 2 3 6 12 24

1 1,07100 ' 2,50405 3,58220 2,54985 1,94310 1Д0325 1,17765

2 1,06400 2,45960 3,56750 2,44505 1,92755 1,19295 1,17135

3 1,06260 2,36065 3,43065 2,38625 1,91835 1,19925 1,17445

4 1,05795 2,16175 3,76440 2,79310 1,92505 1,19605 1,04470

5 1,05080 2,13445 3,72635 2,75675 1,91600 1,19845 1,05255

Среднее значение 1.06127 2,32410 3,61422 2,58620 1,92601 1,19799 1,12414

Концентрация дибунола с учетом интактного опыта 0,92677 2,18960 3,47972 2,4517 1,79151 1,06349 0,98964

* - содержание дибунола в 1,0 г плазмы крови с учетом интактного опыта равно 0,1345х10~6мкг

Установлено, что (табл. 4 и 5) при введении опытным животным дибунола перорально в виде таблеток из расчета 50 мг/кг, дибунол был обнаружен в максимальном количестве в плазме через 2 часа после введения 3,48-10"6 мкг, и при ректальном введении - в виде суппозиториев из расчета 50 мг/кг, дибунол был обнаружен в максимальном количестве в плазме через 1 час после введения 4,! 4-10"6 мкг.

Таким образом, дибунол был обнаружен для последующего определения распределения его в органах при различных путях введения, что имеет исключительно важное значение при судебно-медицинской экспертизе и изучения методов лечения различных заболеваний, их коррекции, титрования дозы - гастродуоденальных язв, гепатитов, колитов, профилактики сердечно-сосудистых заболеваний и применения в дерматологической практике.

В процессе исследований возник интерес по изучению влияния высвобождения дибунола из лекарственных форм. Нами были проведены исследования по разработке методики качественного определения дибунола в различных лекарственных формах - суппозиториях, овулях, карандашах и таблетках.

Качественное определение дибунола в лекарственных формах (суппозитории, овули, карандаши, таблетки), проводили путем экстракции дибунола из лекарственных форм (получали рабочий раствор), с последующим определением на газожидкостном хроматографе, снабженным масс-селективным детектором. 1 мкл рабочего раствора вводили в инжектор газожидкостного хроматографа AGILENT-6890, снабженного кварцевой капиллярной колонкой HP-5-MS (30м • 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм). Масс селективный детектор «AGILENT 5973 N». Газ носитель - гелий. Скорость расхода газа - носителя через колонку 1 мл в минуту. Температура инжектора и интерфейса 250-280° С соответственно. Температура колонки програми-рованная, начальная температура 70 °С в течение 2 минут, повышение температуры со скоростью 15 °С в минуту до 290 "С и удерживание температуры в течение 5 минут. Способ введения без деления потока газа носителя. Условия детектирования: энергия ионизации 70 ЭВ. Режим сканирования ионов от 50 до 550 абсолютных единиц массы. Параллельно готовили PCO дибунола. 1 мкл PCO вводили в инжектор газожидкостного хроматографа. При этом на хромато-грамме фиксировался пик с временем удерживания 9,29 минут, масс-спектры снятые с вершины данного пика по библиотеке NIST-98 следующие: 205; 220; 57; 145; 177; 189 m/z. При хромато-графировании растворов дибунола, приготовленных из лекарственных форм наблюдались пики с временем удерживания и масс-спектрами соответствующие стандартному раствору дибунола (PCO).

Для определения эффективности лекарственных форм (таблеток и суппозиториев) проводили исследования биологической доступности дибунола in vivo, на кафедре фармакологии № 2, под руководством профессора Х.М.Насырова Башкирского государственного медицинско-

го университета. Результаты определения количественного содержания дибунола в крови опытных животных после введения таблеток с дибунолом 0,5 г представлены на рисунке б.

Время, часы.

Рисунок 6 - Динамика изменения концентрации дибунола в опытах "in vivo".

Наиболее высокая концентрация дибунола (рис.б) в крови животных наблюдается через 2 часа после введения таблеток, затем концентрация постепенно снижается и через 24 часа обнаружены только следы препарата. Степень биодоступности лекарственного вещества в крови может быть установлена по величине отношения площадей под фармакокинетическими кривыми, полученными при введении лекарственного вещества в исследуемых формах. AUC — (auea under curve) площадь под кривой для таблеток составляет 33,8279 мкг/мл.час. В таблице 7 приведены данные по биодоступности таблеток с дибунолом методами in vitro и in vivo.

Таблица 7 - Содержание дибунола (мкг/мл) в диализате и плазме крови

Метод испытания Время испытания (мин)

30 45 60 90 120

In vitro 2800 3950 4100 4300 4530

In vivo 0,93 . 2,10 2,19 3,42 3,48

Как видно из таблицы, скорость растворения таблеток дибунола коррелирует с биодоступностью.

Таким образом, доказана эффективность и целесообразность применения дибунола на примере лекарственной формы - таблеток. Результаты определения количественного содержания дибунола в крови опытных животных после введения суппозиториев с дибунолом 0,5 г из расчета 50 мг/кг (рис. 8).

2 3 6 Время, часы

Рисунок 8 - Динамика изменения концентрации дибунола в плазме крови in vivo

Наиболее высокая концентрация (рис. 8) дибунола в крови животных наблюдается через 1 час после введения суппозиториев, затем концентрация постепенно снижается, через 24 часа обнаружены следы препарата. Установлено, что А11С для суппозиториев составляет 48,3205 мкг/мл-ч.

2. Фармакокинетические исследования оксиметилурацила

Нёооходимоеть изучения фармакокинетики оксиметилурацила при различных путях введения обусловило разработку количественного определения его в крови. При этом важно предварительно установить, связывается ли оксиметилурацил с белками и эритроцитами крови. Исследование связывания оксиметилурацила с белками и эритроцитами крови проводили с применением метода равновесного диализа, при этом учитывали, что объем эритроцитов составляет около 40% объема крови (исследования проводились совместно с Ж.М.Головастиковой, Д.В.Плечевой).

2.1 Определение связывания оксиметилурацила с белками крови.

В эксперименте, использовали кровь кролика объемом 2 мл, в которую вводили различные количества оксиметилурацила (250, 500 и 750 мкг) в виде 1 % водного раствора. После инкубирования полученных проб при температуре 37° С в течение 30 минут проводили диализ через целлофановую мембрану в 50 мл буферного раствора с рИ 7,4 (50 мл 0,2 М КН2РО4; 39,5 мл 0,2 М №ОН; вода очищенная до 200 мл). Через каждые 60 минут в течение 5 часов после начала эксперимента производили забор проб в объеме 10 мл с последующим восстановлением диализата. Количественное определение оксиметилурацила в диализате проводили спектрофотометрически при длине волны 278±2 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм. В качестве контроля использовали диализат крови кролика без оксиметилурацила (табл. 9).

Таблица 9 - Связывание оксиметилурацила с белками крови кролика

в опытах in vitro (п=5, Р=95,0)

Содержание Исходное Метрологиче-

оксимети- количество Найдено оксиметилурацила в диализате, через ские характе-

лурацила оксиметилурацила, время, час ристики

мкг % 1 2 3 4 5

Мкг 500 60,00 61,49 64,18 68,00 80,00 Sx=2,476

% 100 21,00 24,60 25,67 27,00 32,00 Е=4,12%

Мкг 250 62,50 67,50 72,50 82,50 85,00 S«=1,996

% 100 25,00 27,00 29,00 33,00 34,00 Е=3,92%

Мкг 150 46,56 50,75 57,31 61,31 64,50 Sx=2,023

% 100 31,00 33,00 38,00 41,00 43,00 Е=4,31%

Через 1 час в диализате обнаружено 21-31% лекарственного вещества, а через 5 часов концентрация изменилась до 32-43%. Полученные данные указывают на связывание оксиметилурацила с белками крови на 60 - 70%.

2.2 Определение связывания оксиметилурацила с эритроцитами

Учитывая тот факт, что концентрация оксиметилурацила почти не влияет на скорость диализа, изучение связывания оксиметилурацила с эритроцитами проводили следующим образом: 1% водный раствор 0,04 мл (400 мкг) вводили в кровь кролика и инкубировали при 37° С в течение 30 минут. Эритроциты отделяли центрифугированием при 7000 об/мин в течение 10 минут. 2 мл полученной плазмы помещали в целлофановый мешок и проводили диализ в 50 мл указанного выше буферного раствора с рН 7,4. Через каждые 60 минут в течение 5 часов после начала эксперимента делали забор проб в объеме 10 мл с последующим восстановлением диализата. Количество оксиметилурацила в диализате определяли спекгрофотометрически при длине волны 278±2 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 10 мм (табл. 10).

Результаты исследования представлены в таблице 10, где показано, что в диализате плазмы крови обнаружено только 10-18% введенного оксиметилурацила, что указывает на его связывание с эритроцитами крови на 10-20%. Следует отметить, что скорость перехода оксиметилурацила из плазмы и из крови в диализат в обеих сериях эксперимента примерно одинакова.

Таблица 10 - Связывание оксиметилурацила с эритроцитами крови кролика ____ в опытах in vitro (n-5, Р=95,0)

Содержание оксиметилурацила Исходное количество оксиметилурацила, мкг% Найдено оксиметилурацила в диализате, через время, час Метрологические характеристики

1 2 3 4 5

Мкг % 400 100 40,00 10,00 60,30 15,00 72,10 18,00 84,00 18,00 84,20 1800 S„= 1,466 Е=3,72%

Вследствие того, что оксиметилурацил практически не растворим' в воде очищенной и органических растворителях, трудно растворим в ДМСО, в качестве экстрагента была использована смесь ДМСО и воды очищенной в соотношении 3:1.

Оксиметилурацил является производным пиримидинового основания (урацила), поэтому возникла необходимость разделения его от присутствующих в крови пиримидинов. С этой целью была использована хроматографическая колонка с окисью алюминия. Высота колонки 5 см, диаметром 0,7 мм установлена экспериментально. Экстракцию оксиметилурацила из крови животных проводили по следующей методике. Кровь в количестве 1 мл из ушной вены кролика, которому был введен оксиметилурацил в виде суспензии в дозе 250 мг/кг, помещали в сухую химическую круглодонвую колбу объемом 50 мл и прибавляли 4 мл смеси ДМСО и воды очищенной в соотношении 3:1 по объему, перемешивали стеклянной палочкой, закрывали обратным холодильником и проводили экстракцию на водяной бане при температуре 80° С в течение 30, 60 и 90 минут. Экстракт охлаждали до комнатной температуры, фильтровали через бумажный фильтр «синяя лента» в сухую мерную пробирку, устанавливали объем, который должен быть не менее 4,5 мл. Фильтрат пропускали через подготовленные хроматографиче-ские колонки, заполненные окисью алюминия, и элюировали водой очищенной для получения прозрачного элюата в сравнении с эталоном (ГФ XI издания, с.867).

В олтоате присутствие оксиметилурацила определяли методом ТСХ (ГФ X издания, с.807) и спектрофотометрически. Ультрафиолетовый спектр полученного элюата в области от 200 до 350 нм имел максимум поглощения при длине волны 278±2 нм, что соответствовало PCO оксиметилурацила. Количественное содержание оксиметилурацила в элюате определяли спектрофотометрическим методом на спектрофотометре HEWLETT PACKARD 8452А. Контролем служил элюат плацебо. Время экстракции оксиметилурацила из крови определялось по максимальному значению оптической плотности. На основании полученных данных установлено, что оптимальное время экстрагирования оксиметилурацила из крови составляет 1 час.

С целью определения концентрации оксиметилурацила в крови опытным животным, кроликам породы «шиншилла» массой 2,5±0,2 кг, оксиметилурацил вводили перорально в виде суспензии в дозе 250 мг/кг однократно. Содержание оксиметилурацила в крови определяли каждый час в течение 10 часов. Статистическая обработка результатов показала наличие незначительного разброса, обусловленного очевидно, как различием пола, так и отличием их возраста. Для частичной нивелировки этого влияния в каждой серии опытов использовали в основном одних и тех же животных. Перед опытом животных не кормили в течение суток, повторно их использовали не ранее, чем через 7 дней. Все опыты проведены в пятикратной по-вторности. Фармакокинетическую кривую получали вычислением М ± m значений концентраций для каждого интервала времени (табл. 11).

Таблица 1 I - Количественное содержание оксиметилурацила в крови кролика гфИ однократном введении per us (n=5, Р=95%).

1 2 j 3 ■ 4 5 6

— 0,600± : !,900± 0.014 ; 0,048 1 ¡03,8± 2,4 159,2± 3,76 51,2± 1,2

Как видно из таблицы 11 через 2 часа после приема концентрация ЬкСЙметилурацила в крови составила 0,600±0,С$4

Найдено оксиметилурацила в крови, м кг/мл, через время , ч

Рисунок 12 - Динамика концентрации оксиметилурацила в крови при повторном введении peros каждые 5 часов в дозе 250 мкг/кг Максимальная концентрация в среднем составляет 159.2±3,7б мкг/мл и наблюдается к 5 часу после введения препарата, после чего содержание оксиметилурацила резко понижается до 51,2±1,2 мкг/мл (6 часов). При повторном введении содержание оксиметилурацила удерживается на одном уровне (рис. 12),

Площадь иод фармакокинетической криной AUC составляет 341,00= 8,05 мкг/мл. Кроме того, характер фармако кинетической кривой свидетельствует о медленном всасывании препарата из желудочно-кишечного тракта. Для обеспечения терапевтического эффекта необходимо создать в крови концентрацию, сохраняющуюся в течение определенного периода времени. Всасывание оксиметилурацила происходит медленно, максимальная концентрация оксиметилурацила в крови наблюдается через 5 часов, после чего резко снижается, Следовательно, для поддержания кокценграции на определенном уровне необходимо повторно вводить прела-

рат через каждые 5 часов. На основании полученных результатов нами разработана и экспериментально доказана схема приема пероралышх лекарственных форм - 4 раза в день с временным интервалом 5 часов.

С помощью разработанной нами методики изолирования оксиметилурацила из биологических объектов можно обнаружить и качественно подтвердить присутствие оксиметилура-цила в органах (табл. 13). Исследования проводили на белых крысах массой 170±10 г, оксиме-тилурацил вводили per os из расчета 250 мкг/кг массы тела животного. Забор проб биологических объектов (органов) проводили через определенные промежутки времени, после введения препарата, обнаружение оксиметилурацила проводили двумя способами: методом тонкослойной хроматографии в среде растворителей аммиак концентрированный - спирт этиловый 96% в отношении 4:1 по объему и спектрофотометрическим методом при длине волны 278±2нмв кювете с толйшной рабочего слоя 10 мм.

Таблица 13 - Обнаружение оксиметилурацила в биологических объектах

№ Биологический объект (орган) Обнаружен методом

тех УФ-спектрофотометрии

1. Сердце - -

2. Почки + +

3. Печень + +

4. Селезенка - -

5. Легкие - -

6. Кишечник + +

7. Мышцы + +

8. Мозговая ткань + +

9. Сальник - -

10. Надпочечники + +

11. Кожа - •

12. Струп раневой + +

Полученные результаты, приведенные в таблице 13, подтверждают литературные данные о присутствии оксиметилурацила в таких органах как надпочечники, печень, а также способность препарата проникать через гематоэнцефалический барьер. Кроме того, препарат обнаружен в кишечнике, мышцах, почках и раневом струпе.

Проникновение препарата в ту или иную ткань зависит от ее кровоснабжения. Относительно доступными для препаратов считают кровь, ткани сердца, легких, печени, почек, менее доступными - все остальные. Классификация тканей по принципу доступности условна, поскольку характер распределения препарата в организме зависит от ряда факторов (растворимость в липидах, связывание в крови и тканях и пр.). В случае если лекарственное вещество оказывает физиологическое воздействие в центральной камере, периферическая камера является «резервуаром» («депо») для лекарственного вещества.

Put. 14. Определение параметров "медленной" экспоненты для двухкамерной

фармако кинет и ческой модели со всасыванием

Рис. 15. Определение параметров "быстрой" экспоненты для двухкамерной фармакокинетиче-ской модели со всасыванием

Печень и альбумины крови могут выступить в роли «депо». Снижение концентрации ок-симетилурацила в крови нелинейно. Отчетливое выделение (3 и а фаз, а также способность ок-симетилурацила связываться с белками крови позволяет интерпретировать полученные данные в рамках двухкамерной модели со всасыванием (рис. 14 и 15).

Таблица 16 - Фармакокинетические параметры оксиметилурацила после его

однократного введения в виде суспензии в дозе 250 мг/кг

№ Фармакокинетические параметры Сокращенное название параметра Размерность М±т

1. Константа скорости абсорбции кабс Час"' 0,635 ±0,015

2. Период полуэлиминации Т]/2 вбс Час 1,69 ±0,04

3. Максимальная концентрация Стах мкг/мл 159,21 ±3,75

4. Время достижения максимальной концентрации Час 5

5. Период распределения в ¡} -фазе ип р Час 1,26 ±0,03

6. Период распределения в а-фазе ^/2 а Час 0,700 ±0,016

7. Период полуэлиминации Тш е1 Час 1,06 ±0,03

8. Кажущийся объем распределения V, л/кг 0,0505 ±0,0012

9. Константа скорости распределения в центральной камере к2| Час' 1,26 ±0,03

10. Константа скорости распределения в периферической камере к п Час'1 0,049 ±0,001

11. Константа скорости элиминации кс! Час' 0,89 ± 0,02

12. Клиренс при внесосудистом введении С1 л/юг. час 0,049 ± 0,001

13. Площадь под фармакокинетической кривой ЛИС мкг/час.мл 341,00 ±8,04

Дальнейшие исследования были направлены на изучение скорости высвобождения оксиметилурацила из суппозиториев в опытах на изолированном кишечнике. Нами предложена методика определения скорости высвобождения оксиметилурацила из суппозиториев на модели изолированного кишечника крысы. Суппозитории, содержащие оксиметилурацил 0,5 г готовили методом выпивания на суппозиторной основе - твердый жир.

У Крысы после лекапитации отпрепарировали нижний отдел кишсчиика длиной 3 см, В про cae т кишки вводили суппозиторий с оке и метил ура и илом из расчета на массу крысы, приготовленную на основе твердого жира и далее перевязывали кишку с обеих сторон. Отрезок кишки с суппозиторием опускали в стакан с 50 мл буферного растворе с рН 7, 4 или раствора Тироде Стакан помещали в термостат при температуре 37,0±0,5'J С и опускали в него канюлю с регулируемой подачей воздуха. Забор проб проводили через определенные промежутки времени (через каждые 15 минут в течение 3 часов после начало эксперимента) с последующим восстановлением диализата.

Количественное определение оксиметилурацила в диализате определяли спектрофото-мегрически на спектрофотометре HEWLETT PACKARD 8452А при длине волны 278±2 нм в кювете с толщиной рабочего слои 10 мм Динамика высвобождения оксиметилурацила ИЗ кишечника крысы отображена графически (рис. 17).

Рисунок 17 - Динамика высвобождения оксиметилурацила в опытак in vivo

Скорость, высвобождения окешетияурацкль суягшжториеъ, приготовленных на основе твердого жира характеризуется медленной скоростью (рис. 17), длительным период высвобождения (3 часа) и указывает на прохождение оксиметилурацила через стенки кишечника, что позволяет предположить не только местное, но и резорбтивное действие препарата. Площадь под фармнкокинетической кривой составляет 293,80±6,93 мкг/час. мл. Из этого следует,

что суппозитории с оксиметилурацилом можно рекомендовать для лечения и профилактики не только воспалительных заболеваний кишечника (проктиты, язвенные колиты), но и как средство, оказывающее общее действие на организм, что позволит в дальнейшем расширить область применения данной лекарственной формы.

ВЫВОДЫ

1. Методом математического планирования эксперимента (латинский квадрат) выявлены оптимальные условия экстракции дибунола из плазмы крови. Обоснована очистка экстракта методом ТСХ с последующим спекгрофотометрическим определением.

2. Установлено оптимальное время экстракции дибунола индивидуально для каждого биообъекта: плазма крови, печень, почки, сердце, мозговая ткань и подкожная жировая клетчатка.

3. При введении опытным животным дибунола перорально в виде таблеток и ректально в виде суппозиториев из расчета 50 мг/кг установлены его максимальные количества в плазме - ко 2 часу после введения (перорально), и к 1 часу после введения (ректально). Методами in vitro и in vivo определено наличие корреляционных связей и рассчитаны площади под фармакокинети-ческими кривыми для таблеток (33,83 мкг-мл/ч) и суппозиториев (48,32 мкг-мл/ч).

4. Разработана методика изолирования дибунола из лекарственных форм (суппозитории, ову-ли, карандаши и таблетки) с последующим качественным определением методом ГЖХ с масс-селектнвным детектором.

5. Разработан способ определения оксимегилурацила в плазме крови опытных животных, основанный на его экстракции с последующей очисткой с использованием колоночной хроматографии на окиси алюминия. Для качественной оценки предложен ТСХ анализ, для количественного анализа УФ - спектрофотометрия.

6. Проведены исследования по изучению связывания оксиметилурацила с белками на 60 -70% и эритроцитами крови на 10 - 20%.

7. Определены основные фармакокинетические параметры оксиметилурацила: время и периоды полувсасывания, полураспределения и полувыведения, кажущийся и кинетический объемы распределения, общий клиренс, а также время достижения максимальной концентрации - к 5 часу после введения препарата. Предложена схема приема пероральных лекарственных форм, содержащих оксиметилурацил, который следует назначать 4 раза в день.

8. Разработана методика определения оксиметилурацила в биообъектах, основанная на экстрагировании с последующим спекгрофотометрическим определением. Оксиметилурацил обнаружен в плазме крови, почках, печени, кишечнике, надпочечниках, мышцах, мозговой ткани, раневом струпе и отсутствует в сердце, селезенке, сальнике, легких и коже. Методами in vitro и in vivo определено наличие корреляционной связи и рассчитана площадь под фармакокинети-ческой кривой для суппозиториев (341,00 мкг-мл/ч).

9. Впервые изучены фармакокинетические параметры дибунола и оксиметилурацила, теоретически и экспериментально обосновано влияние различных факторов на их высвобождение из лекарственных форм, внедрены методические рекомендации в СМЭ РБ, получен ряд патентов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шикова, Ю.В. Изучение влияния мазевой основы на биодоступность дибунола методом in vitro / Ю.В. Шикова, С.К. Зырянов, А.Н. Шиков // Тезисы докл. 62-й науч. конф. студентов и молодых ученых, поев. 50-летию СНО БГМУ. - 4.1. - Уфа, 1997. - С. 63 - 64.

2. Лиходед, В. А. «Способ определения дибунола из биообъектов» / В.А. Лиходед, Х.М. На-сыров, С.К. Зырянов, Н.В. Чернов, А.Н. Шиков // Патент РФ №2157992, от 22.02.1999 - 8 с.

3. Насыров, Х.М. «Определение времени экстракции дибунола из биообъектов» / Х.М. На-сыров, В.А. Лиходед, С.К. Зырянов, Н.В. Чернов, А.Н. Шиков //Патент РФ №2152667, от 22.02.1999-6с.

4. Насыров, Х.М. «Способ экстракции ионола из тканей и биожидкостей» / Х.М. Насыров, С.К. Зырянов, Ю.В. Шикова, А.Н. Шиков //Рационализаторское предложение, свидетельство №1786 от 12.05.1997.

5. Шикова, Ю.В. Разработка состава и технологии гинекологических овулей для лечения воспалительных заболеваний / Ю.В. Шикова, Т.А. Лиходед, Е.А. Лазарева, Ю.Л. Баймурзина, А.Н. Шиков, Е.А. Зайнуллина //Фармацевтическому факультету Башкирского государственного медицинского университета 20 лет. Здравоохранение Башкортостана. - Уфа. - 2002. - № 2. - С. 70 -71.

6. Шикова, Ю.В. Изучение влияния вида мазевой основы на фармацевтическую доступность оксиметилурацила методами «in vitro» / Ю.В. Шикова, Т.А. Лиходед, И.В. Микрюкова, Д.В. Плечева, А.Н. Шиков, A.M. Алтьшбаев // Фармацевтическому факультету Башкирского государственного медицинского университета 20 лет. Здравоохранение Башкортостана. - Уфа. -2002. - № 2. - С. 71 - 73.

7. Шикова, Ю.В. Разработка основообразующей композиции стоматологического карандаша, содержащего дибунол и экстракт прополиса / Ю.В. Шикова, Е.А. Лазарева, Т.А. Лиходед, З.Р. Кадырова, Э.А. Газизова, Ю.Л. Баймурзина, А.Н. Шиков // Сборник научных трудов конференции ученых Республики Башкортостан «Научный прорыв - 2002», посвященный Году Здоровья, 70-летию БГМУ и Дню Республики. - Уфа, 2002. - С. 128 - 129.

8. Шикова, Ю.В. «Гинекологические овули с дибунолом для лечения воспалительных заболеваний» / Ю.В. Шикова, В.А. Лиходед, С.Б. Бахтаярова, А.Н. Шиков, Т.А. Лиходед, Ю.Л. Баймурзина, Е.Д. Зайнуллина, Р.Т. Низаев, P.A. Зарипов // Патент РФ №2249449 от 15.05.2003. -Юс.

9. Шикова, Ю.В. «Суппозитории с дибунолом и экстрактом прополиса для лечения гинекологических воспалительных заболеваний» / Ю.В. Шикова, В.А. Лиходед, С.Б. Бахтиярова, А.Н. Шиков, Е.В. Прусаков, Е.Д. Зайнуллина, Р.Т. Низаев, Ю.Л. Баймурзина // Патент РФ №2249448 от 15.05.2003.-Юс.

10. Шикова, Ю.В. «Стоматологический гель для лечения воспалительных заболеваний полости рта» / Ю.В. Шикова, В.А. Лиходед, В.В. Плечев, Д.В. Плечева, A.A. Голубь, С.А. Лазарев, Т.С. Чемикосова, Е.А. Лазарева, А.Н. Шиков, Т.А. Лиходед // Патент РФ №2226383, от 10.04.2004-8 с.

11. Шикова, Ю.В. «Средство для лечения заболеваний глаз с метронидазолом и оксиметилу-рацилом» / Ю.В. Шикова, Д.В. Плечева, В.А. Лиходед, В.В. Плечев, Е.К. Алехин, Р.Т. Нигма-туллин, З.Р. Кадырова, Р.З. Кадыров, А.Н. Шиков //Патент РФ №2241455, от 10.12.2004 -10 с.

12. Шикова, Ю.В. «Стоматологический карандаш с дибунолом для лечения пародонтита» / Ю.В. Шикова, В.А. Лиходед, С.Б. Бахтиярова, Е.А. Лазарева, А.Н. Шиков, Т.А. Лиходед, Т.С. Чемикосова, С.А. Лазарев, A.A. Голубь, Ю.Л. Баймурзина, Р.Т. Низаев // Патент РФ №2240103, от 20.11.2004-10 с.

13. Шикова, Ю.В. Выбор основообразующей композиции для суппозиториев с дибунолом, ви-нилином и экстрактом прополиса / Ю.В. Шикова, В.А. Лиходед, Е.В. Прусаков, Э.Р. Хусаинова, А.Н. Шиков, Ю.Л. Баймурзина, С.Б. Бахтиярова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов. Выпуск 59. - Пятигорск, 2004. - С.137 -139.

14. Быков, В.А. Разработка методики определения подлинности дибунола в лекарственных формах / В.А. Быков, Ю.В. Шикова, А.Н. Шиков, Е.В. Прусаков, Т.В. Кайдашев // Башкирский химический журнал. - Уфа. - 2004. - Т.Н. - № 3. - С. 63 - 65.

15. Плечев, В.В. «Способ определения оксиметилурацила в крови» / В.В. Плечев, В.А. Лиходед, В.М. Тимербулатов, Ж.М. Головастикова, Ю.В. Шикова, Д.В. Плечева, А.Н. Шиков, М.А. Браженко, Е.В. Елова, Н.В. Чернов // Патент РФ №2276360, от 10.05.2006 - 6 с.

Подписано в печать 15.02.2007. Формат 60x84/16. Бумага офсетная. Печать оперативная. Усл. печ. л. 1,39. Тираж 100 экз. Заказ 925.

Отпечатано с готового оригинал-макета В типографии ООО «ОФОРТ». 443068, г.Самара, ул. Межевая, 7. Тел.: 335-37-01, 335-37-45, 279-08-22.