Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Изучение физико-химических свойств и стандартизация магнитоуправляемых липосом

На правах рукописи

Исмаилова Галима Капаровна

Изучение физико-химических свойств и стандартизация магнитоуправляемых липосом

15.00.02- фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Ватигарси 2085

Работа выполнена в ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и ФГУЗ Ставропольском научно-исследовательском противочумном институте Роспотребнадзора

Научный руководитель

Официальные оппоненты

Ведущая организация

Заслуженный деятель науки РФ, доктор фармацевтических наук, профессор Беликов Владимир Георгиевич

Доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Эдуард Тоникович

Доктор фармацевтических наук, профессор Кузякова Людмила Михайловна

Санкт-Петербургская химико-фармацевтическая академия

Защита состоится «_£_» ЫЮИ^ 2005 г. в 5_часов

на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Автореферат разослан «2£_» ОмрлЯ 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор фармацевтических наук, профессор

Е.В. Компанцева

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Создание новых лекарственных средств, сочетающих в себе все достоинства магнитоуправляемых и липосомальных форм лекарственных веществ, позволит повысить эффективность лечения многих патологических состояний организма.

Продолжительный прием глюкокортикостероидных лекарственных препаратов часто осложняется целым рядом побочных эффектов, связанных с их системным действием. В связи с этим актуальным является поиск новых лекарственных форм глюкокортикостероидов, обладающих высокой терапевтической эффективностью при использовании минимальных доз. Наиболее полно этим требованиям отвечает магнитоуправляемая липосомальная форма.

Преимущества липосомальных форм лекарственных веществ общеизвестны, но их применение сопряжено с рядом трудностей, связанных с отсутствием методологических подходов к получению и стандартизации липосомальных лекарственных форм.

Решение проблемы создания магнитных лекарственных средств непосредственно связано с производством и стандартизацией исходных магнитных компонентов.

Из всего арсенала веществ, обладающих магнитными свойствами, исследователи наибольшее предпочтение отдают магнетиту, полномасштабное использование которого в практической медицине и фармации на данном этапе невозможно, так как отсутствует нормативная документация (НД), позволяющая оценить его качество.

В настоящий момент изучены некоторые физико-химические, фармакологические характеристики магнетита, полученного в лабораторных условиях. Для его практического применения в фармации как вспомогательного вещества необходимым условием является стандартизация магнитных свойств этого носителя.

Все вышеперечисленное подтверждает тот факт, что стандартизация магнитных носителей, разработка оптимальной технологии получения, стандартизации фосфолипидов (ФЛ) и магниточувствительной липосомальной формы полусинтетического глюкокортикостероида является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования является разработка норм качества магнетита по показателю "магнитные свойства", обоснование состава, получение и стандартизация магнитоуправляемых липосом, изучение возможности включения глюкокортикостероидных препаратов в магнитолипосомы на примере преднизолона и изучение их противовоспалительного действия.

Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:

- предложить методики измерения магнитных свойств магнетита и содержащих его лекарственных форм;

- установить нормы качества магнетита по показателю "магнитные свойства";

- предложить сырьевой источник, способ получения и стандартизацию ФЛ; -разработать проекты НД на магнитный носитель-магнетит и на ФЛ из головного мозга свиней;

- обосновать состав, получить липосомы с магнитным носителем и провести их стандартизацию;

-обосновать состав, предложить способы получения и стандартизацию липосом и магнитолипосом с глюкокортикостероидным препаратом на примере преднизолона; -изучить противовоспалительное действие полученных образцов липосомальных препаратов.

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена необходимость стандартизации магнитных носителей, ФЛ и липосом, приготовленных на их основе. Изучены магнитные свойства магнетита с помощью вибрационного магнетометра. Исследован процесс получения ФЛ из головного мозга свиней, показана идентичность полученных ФЛ и ФЛ из головного мозга крупного рогатого скота. Разработаны научно-методические подходы к

обоснованию состава и конструированию новых липосомальных препаратов. Впервые в РФ проведены исследования по включению магнетита в липосомы. Выяснено, что магнетит включается во внутреннюю полость липосом. Обоснован состав и способ получения магнитоуправляемых липосом. Показана возможность совместного включения магнетита во внутреннюю полость липосом и глюкокортикостероидного препарата, на примере преднизолона, в бислойную фосфолипидную мембрану. С учетом этой новации выбран и обоснован состав, способ получения и методы стандартизации липосом и магнитолипосом, содержащих преднизолон. Установлен выраженный противовоспалительный эффект магнитоуправляемых липосом преднизолона, который обусловлен суммарным действием внутриклеточно доставляемого преднизолона, липосомальных ФЛ и воздействием магнитного поля, способных восстанавливать поврежденные мембраны клеток.

Практическая значимость работы. Усовершенствована аппаратурная схема вибрационного магнетометра. Предложена методика, позволяющая определять магнитные свойства ферримагнетиков. Установлены нормы качества магнетита по показателю "магнитные свойства". Усовершенствован способ получения ФЛ из животного сырья. Предложены методы контроля и показатели качества ФЛ из тканей головного мозга свиней. Разработаны ТУ на магнетит и ФЛ, используемые для получения липосом. Предложены способы получения и методы стандартизации магнитоуправляемых липосом, липосом и магнитолипосом с преднизолоном. Результаты исследований противовоспалительной активности образцов магнитоуправляемых липосом с преднизолоном позволяют рекомендовать их для дальнейшего изучения с целью создания эффективного противовоспалительного лекарственного средства.

Внедрение результатов исследований в практику. Разработаны

-ТУ 9154-001-01897080-2004 "Фосфолипиды для получения липосом", утвержденные Зам. Главного санитарного врача Российской Федерации (Письмо ФЦ№ 12ФЦ/2514А от 19.08.2004г.),

-ТУ 9154-01962942-2004 "Магнетит - магнитный носитель", утвержденные Зам. Главного санитарного врача Российской Федерации от 3.08.2004г.,

- промышленный регламент производства "Липосомальная основа для получения диагностических, липосомальных и косметических препаратов", утвержденный Ученым советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (протокол № 4 от 20 апреля 2004г.).

- результаты исследований по получению магнитоуправляемых липосом с преднизолоном, представленные в информационном письме "Разработка технологии, стандартизация и фармакологическое исследование магнитоуправляемых липосом с преднизолоном", используются в научно-исследовательской работе 1-го Военно-Морского Клинического Госпиталя (акт внедрения от 17 августа 2004г.).

Положения, выносимые на защиту:

- результаты исследований по стандартизации магнитных свойств магнетита;

- обоснование состава и стандартизация ФЛ;

- результаты исследований по способу включения магнитного носителя в липосомы;

- данные по стандартизации магнитоуправляемых липосом;

-итоги исследований по иммобилизации и стандартизации глюкокортикостероидных препаратов на примере преднизолона в липосомы и магнитолипосомы;

результаты изучения противовоспалительной активности полученных липосомальных препаратов.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена согласно плану научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора и соответствует проблеме "Фармация" Ученого совета Минздравсоцразвития РФ, секция № 38 "Фармация".

Апробация работы. Основные фрагменты диссертационной работы доложены на 60-й региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста в компьютерной верстке и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (5 глав), общих выводов и списка литературы, включающего 210 источников, в том числе 54 иностранных, содержит 24 таблицы, 13 рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Изучение магнитных свойств магнетита

Для нормирования качества магнетита были подобраны аппаратурная схема и методики измерения, позволяющие достоверно оценить магнитные свойства ферримагнетиков, но в то же время простые и доступные для целей фармацевтического анализа. В качестве основных магнитных характеристик магнетита, позволяющих контролировать процесс егс получения, были выбраны намагниченность насыщения, остаточная намагниченность и коэрцитивная сила.

Для измерения намагниченности магнетита магнитометрическим методом был использован модифицированный нами вибрационный магнетометр, предложенный доктором физико-математических наук Ю.И. Диканским.

С помощью вышеуказанного устройства при помещении магнетита в изменяющееся магнитное поле были получены первоначальные кривые намагничивания магнетита. Измерения проводили на 6 сериях магнетита, определяли его кривую намагничивания (зависимость намагниченности (I) от напряженности магнитного поля (Н)). На рисунке 1 приведена кривая первоначального намагничивания магнетита для серии № 1, для серий № 2-6 были получены аналогичные кривые.

J_I___„{...........I

J, кА/м

Рисунок 1 - Кривая первоначального намагничивания магнетита

По кривым первоначального намагничивания для 6 серий магнетита рассчитывали его магнитные характеристики, необходимые для стандартизации ферримагнетика. На основании полученных данных установлены нормы качества магнетита по показателю "магнитные свойства", представленные в таблице 1.

Таблица 1 - Нормы качества магнетита по показателю магнитные свойства

Показатель качества Пределы значений

Намагниченность насыщения, I, кА/м 58,7- 60,3

Осчагочная нама;ниченность, 1г, кА/м 10,3 -10,6

Коэрцитивная сила, Ш, Э 146,7 -147,3

Все серии полученного в дальнейшем магнетита соответствовали разработанным нормам. Намагниченность насыщения и остаточная намагниченность магнетита составили 59,6 и 10,5 кА/м, соответственно. Значение коэрцитивной силы в среднем составило 147 Э, что является характерным для магнетита.

Таким образом, по значениям намагниченности насыщения, остаточной намагниченности и коэрцитивной силы все полученные серии магнетита соответствовали предложенным нормам качества, что свидетельствует об идентичности процесса получения, его обработки и кристаллической структуры образцов магнитного носителя.

Получение и стандартизация фосфолипидов из головного мозга свиней

Исследования по получению и стандартизации ФЛ из головного мозга свиней и липосом, полученных на их основе, выполнялись нами на базе Ставропольского научно-исследовательского противочумного института, директор, профессор Ефременко В.И.

Ранее ФЛ получали по способу, предложенному Кузяковой Л.М. и Ефременко В.И., из головного мозга крупного рогатого скота. Однако ученые установили возможность заражения человека губкообразной энцефалопатией при потреблении лекарственных и косметических препаратов, приготовленных из этого вида сырья. В связи с этим был предпринят поиск других видов сырьевых источников. Для получения ФЛ нами использовался свежий или замороженный головной мозг свиней. Схема выделения ФЛ из животного сырья заключалась в многократной хлороформно-этанольной экстракции липидов с последующим их осаждением ацетоном. Выход готового продукта ФЛ из 1 кг головного мозга свиней составил 16,8%, при этом отходы органических растворителей после восстановления возвращались в технологический процесс.

Возможность использования ФЛ из головного мозга свиней в качестве вспомогательного вещества для создания липосом является перспективной. Это объясняется тем, что в доступной литературе не встречаются данные о случаях заражения свиней губкообразной энцефалопатией. Согласно литературным данным, ФЛ из головного мозга свиней обладают сродством к веществам, содержащимся в мембране кожи человека. К тому же предлагаемые ФЛ - относительно недорогое и доступное сырье в отличие от, например, чистого лецитина.

Для качественной и количественной оценки полученной фосфолипидной фракции использована методика ТСХ анализа и метод Васьковского и Светашева.

Результаты проведенных исследований позволили предложить для нормирования качественного состава полученной фосфолипидной фракции следующие данные хроматографического анализа в системе растворителей хлороформ-метанол-вода (65:24:4). На хроматограмме должны проявляться 7 пятен

со следующими значениями : 0,15±0,01 (фосфатидилсерин); 0,18±0,01 (сфингомиелин); 0,24±0,01 (фосфатидилинозит); 0,33±0,01 (фосфатидилхолин); 0,60±0,01 (фосфатидилэтаноламин); 0,74±0,01 (цереброзиды); 0,90±0,02 (холестерин) и не более 3 неидентифицированных пятен с И/ 0,29±0,01; 0,49±0,02; 0,52±0,01. Видовое содержание ФЛ в полученном продукте должно находится в следующих пределах: фосфатидилхолина 73,2±0,19 %; фосфатидилэтаноламина 12,6±0,13 %; фосфатидилсерина 4,3±0,01 %; фосфатидилинозита 2,6±0,01 %; сфингомиелина 2,8±0,01 %.

Окисленность жирнокислотных остатков определяли по содержанию продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) - малонового диальдегида (МДА). Метод основан на измерении оптической плотности окрашенного комплекса, формирующегося в результате связывания двух молекул 2-тиобарбитуровой кислоты с молекулой МДА, образующейся при нагревании в кислой среде из продуктов ПОЛ. На основании проведенного анализа содержание МДА в готовом продукте ФЛ должно находится в интервале 5,89-6,25 нмоль/л.

Для предотвращения ПОЛ готовили хлороформный раствор с концентрацией ФЛ 50 мг/мл. Хроматографическими исследованиями показано, что в течение 1 года хранения в посуде из темного стекла с притертой пробкой под подушкой инертного газа (азота) в холодильнике, качественный состав полученных ФЛ не изменялся.

Таким образом, полученные ФЛ могут быть использованы в качестве исходного сырья для получения липосомальных форм лекарственных препаратов.

Обоснование состава липосомальных препаратов

Для придания липосомам способности перемещаться под действием внешнего источника магнитного поля необходимо введение ультрадисперсных частиц магнитного носителя, размеры которых должны чуть превышать размер однодоменных частиц. Магнитолипосомы получали "методом выпаривания и обращения фаз" озвученной ультразвуком смеси хлороформного раствора ФЛ и суспензии магнетита. В результате проведения исследований по изучению

возможности одновременного включения в липосомы ферримагнетика и глюкокортикостероидного препарата, на примере преднизолона, были получены образцы липосом и магнитоуправляемых липосом, содержащие преднизолон.

Для контроля образования, размеров и структуры липосом использовали электронно-микроскопический метод. Результаты исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Результаты электронно-микроскопического исследования

полученных липосом

№ Наименование продукции Размер магнетита, нм Размер липосом,нм

1 Магнитоуправляемые липосомы 5-8 145-850

2 Липосомы с преднизолоном - 120-850

3 Магнитоуправляемые липосомы с преднизолоном 5-8 120-900

Все полученные липосомы были представлены моноламеллярными везикулами, гетерогенными по размеру от 120 до 900 нм. На ультратонких срезах выявлены включения магнетита во внутреннюю полость липосом. С помощью качественного и количественного анализа магнетита подтверждено включение магнитного носителя в магнитоуправляемые липосомы.

Для отделения липосом от невключившегося материала были выбраны методы гель-хроматографии и ультрацентрифугирование, позволяющие наиболее полно отделить неиммобилизованный материал от полученных липосом.

Для сохранения исходных свойств липосом и снижения воздействия на них неблагоприятных факторов внешней среды проводилось предварительное низкотемпературное замораживание липидных везикул в присутствии криопротекторов. В качестве криопротектора использовали сахарозу (до 5%). Для снижения протекания "процесса ПОЛ добавляли антиоксиданты: ретинол и а-токоферол. Все это способствовало повышению качества и стабильности приготовленных липосомальных препаратов.

Выход магнитоуправляемых липосом, липосом с преднизолоном и магнитолипосом преднизолона составил 55,38%, 55,29% и 55,28%, соответственно.

И

Таким образом, на основании проведенных исследований впервые показана принципиальная возможность включения магнетита в липосомы, сочетание глюкокортикостероидного лекарственного вещества, на примере преднизолона, и магнитного носителя в липосомах.

Стандартизация полученных липосомальных препаратов

В соответствии с литературными данными, для стандартизации липосом нами предложены критерии качества, предъявляемые к липосомальным формам: описание, рН, содержание МДА, микробиологическая чистота, подлинность и количественное содержание лекарственного вещества. Кроме того, включены показатели качества, присущие магнитоуправляемым липосомам: подлинность по магнитному наполнителю, намагниченность насыщения и количественное определение магнетита.

С целью разработки норм качества полученных липосом анализировали по б серий каждого липосомального препарата в трех повторностях. Результаты определений представлены в таблице 3.

Таблица 3 - Нормы качества липосомальных препаратов

Показатели качества Нормы качества

магнитоуправляемых липосом липосом с преднизалоном магнитолипосом с предиизолоном

1 2 3 4

Описание эмульсия сероватого цвета без запаха эмульсия молочного цвета без запаха эмульсия сероватого цвета без запаха

РН 5,7-7,5 5,7-7,5 5,7-7,5

Содержание МДА, нмоль/л 22,30-24,00 10,37-11,23 10,55-11,45

Намагниченность насыщения, кА/м 0,67-0,73 - 0,64-0,70

Подлинность - реакция с гексацианоферратом (III) калия - реакция с тиоционатом аммония - реакция с реактивом Фелинга - реакция с кислотой серной концентрированной - реакция с гексацианоферратом (Ш) калия -реакция с тиоционатом аммония - реакция с реактивом Фелинга - реакция с кислотой серной концентрированной

Продолжение таблицы 3

1 2 3 4

Микробиологическая чистота в 1 г может содержаться не более 102 аэробных бактерий и грибов (суммарно) при отсутствии Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus и бактерий семейства Enterobacteriaceae

Количественное определение 0,00129-0,00151 г/мл магнетита 0,00475-0,00525 г/мл преднизолона 0,00115-0,00135 г/мл магнетита 0,00475-0,00525 г/мл преднизолона

Все серии полученных липосом по предложенным показателям качества соответствовали разработанным нормам.

При определении индекса окисленности полученных липосомальных препаратов установлено, что более низким содержанием МДА характеризовались липосомы преднизолона (10,8610,29 нмоль/л) и магнитолипосомы с преднизолоном (11,05±0,28 нмоль/л) по сравнению с магнитоуправляемыми липосомами (23,26±0,53 нмоль/л). Очевидно, это связано с исключением процесса УЗ-озвучивания фосфолипидной дисперсии в процессе их приготовления.

Намагниченность насыщения магнитоуправляемых липосом и магнитолипосом преднизолона в среднем составила 0,7 и 0,67 кА/м, соответственно. С помощью мостового метода была дополнительно определена магнитная восприимчивость полученных магнитных липосом. Это позволило получить дополнительную информацию о кинетике намагничивания исследуемых образцов. Магнитная восприимчивость магнитоуправляемых липосом составила 7,3210-5 при относительной погрешности определения метода, равной 4,39%. Следует отметить, что полученные магнитоуправляемые липосомы перемещались под действием внешнего магнитного поля при просмотре в световом микроскопе и удерживались постоянным магнитом при промывке в стеклянном сосуде. На данном свойстве могут быть основаны способы очистки липосомальных препаратов от невключившихся маркеров при их производстве.

Подлинность магнетита устанавливали на основе качественных реакций на железо (II) и (III) с гексацианоферратом (III) калия и тиоцианатом аммония соответственно. Качественные реакции с реактивом Фелинга и концентрированной серной кислотой позволили провести идентификацию преднизолона в липосомах.

Установлено, что изучаемые липосомальные препараты по показателю "микробиологическая чистота" соответствовали требованиям Государственной Фармакопеи XI издания (вып.2, стр.187-190) и Изменениям №3 от 19.03.03., категория 2.

Количественное содержание магнетита в магнитоуправляемых липосомах проводили гравиметрическим методом, который позволил определить магнитный носитель без проведения дополнительных операций.

Степень включения магнитного носителя в липосомы рассчитывали по разнице между исходным количеством магнетита, используемым в процессе получения липосомальных препаратов, и количеством магнетита, включившегося в липосомы.

Результаты определения представлены в таблице 4 .

Таблица 4 - Количественное определение магнетита в липосомах

Наименование препарата №. Содержание мш негита, % Метрологические характеристики Степень включения магнетита, % Метрологические характеристики

1 _, 0,1382 Т =0,1398 5 = 0,00126 69,1 з =69,60

г 2 0,1420 70,47 5 = 0,53

I 3 3 0,1396 69,87

И Г! 4 0,1398 -0,00051 69,20 Б* =0,219

5 0,1403 69,8

1 6 0,1392 Л» =0,0013 69,46 Ддг = 0,56

1 с -0,95% Е "0,8%

О * 1 и О 1 0,1257 х -0,1246 62,48 х -62,12

2 0,1239 62,29

е; 3 о 3 0,1241 5 = 0,000953 61,37 5-0,395

& о I 1 М! 4 0,1237 62,03

5 0,1243 в х =0,000389 62,21 Эх =0,161

н в и 6 0,1259 Лл = 0,001 62,33 Л* = 0,41

2 с-0,8% в =0,67%

Количество включившегося магнетита во внутренний объем магнитоуправляемых липосом и магнитолипосом с преднизолоном составило 0,14% и 0,12%, соответственно. Относительная погрешность определения магнетита гравиметрическим методом в магнитолипосомах составила 0,95%, а в магнитолипосомах с преднизолоном - 0,8%. Степень включения магнитного

носителя в магнитолипосомы и магнитоуправляемые липосомы с преднизолоном составила 69,60±0,56% и 62,12±0,41%, соответственно.

Количественное определение преднизолона в структуре мембран липосом при их разрушении раствором детергента не представлялось возможным, так как ФЛ мешали определению преднизолона в полученном растворе.

Содержание преднизолона, иммобилизованного в мембрану липосом, находили по разнице между исходным количеством преднизолона, используемым в процессе получения липосомальных препаратов, и количеством преднизолона, невключившегося в липосомы. По количеству исходного и невключившегося в липосомы лекарственного вещества рассчитывали процент фиксации преднизолона в бислойные липидные везикулы.

Для количественного определения невключившегося преднизолона, отделенного от липосом, использовали метод УФ-спектрофотометрии. Оптическую плотность раствора преднизолона измеряли при длине волны 242 нм. В качестве раствора сравнения использовали экстрагент метиловый спирт.

Результаты определения преднизолона представлены в таблице 5.

Таблица 5 - Результаты количественного определения преднизолона в

липосомах

Наименование препарата № Содержание преднизолона, % Метрологические характеристики Степень включения преднизолона, % Метрологические характеристики

1 0,5138 х =0,4949 69,54 X -68,29

2 0,4964 68,58

1 1 3 0,4897 5=0,0127 67,76 5=1,0678

1 § 4 0,5021 69,36

о к С £ 5 0,4759 Бх =0,0052 66,78 Б х =0,4359

£ Ч ч а с 6 0,4912 Дг = 0,0134 67,7 Дг= 1,12

с =2,7% £=1,64%

и 1 0,4963 68,08 х -68,25

1 5 8 о 2 0,4796 х =0,4964 67,27

8 о 3 0,5121 5 = 0,0123 69,43 в -1,0935

1 § 4 0,5065 66,87

Ч X 2 * 5 0,4856 в х =0,0050 69,55 5 X = 0,4464

II ¡3 с 6 0,4984 Дг = 0,0129 68,31 Дж- 1.15

2 6 = 2,59% Е =1,68%

Оценивая результаты эксперимента, представленные в таблице 5, можно сделать вывод, что содержание преднизолона, фиксированного в мембрану липосом и магнитолипосом, составило 0,49% и 0,50 % соответственно. Степень включения преднизолона в липосомы составила 68,29±1,12%, а в магнитоуправляемые липосомы - 68,25±1,15%.

В результате проведенной валидационной оценки методик определения магнетита и преднизолона установлено отсутствие систематической ошибки в обоих случаях.

На основании результатов исследования по изучению стабильности полученных липосомальных препаратов при хранении в естественных условиях предложен предварительный срок годности - 8 месяцев хранения.

Изучение эффективности применения полученных липосомальных

препаратов при экспериментальном аллергическом дерматите Проведено сравнительное изучение противовоспалительного действия магнитоуправляемых липосом преднизолона, липосом с преднизолоном, магнитолипосом и 0,5% преднизолоновой мази при экспериментальном аллергическом дерматите.

Эксперимент проводили на морских свинках-самцах светлой масти массой 350-400 г. Контактный аллергический дерматит вызывали нанесением в течение 3 дней 5% раствора 2,4-динитрохлорбензола на эпилированный участок (20 х 20 мм) правого бока животных.

Все животные были разделены на 5 групп. На участок поражения 1-ой группе экспериментальных животных наносили магнитоуправляемые липосомы с преднизолоном, 2-ой группе - липосомы преднизолона, 3-ей группе -магнитоуправляемые липосомы, 4-ой - 0,5% преднизолоновую мазь, 5-ая группа лечению не подвергалась, очаг поражения обрабатывали физиологическим раствором (контрольная группа).

Каждое животное обрабатывали исследуемым липосомальным препаратом 1 раз в сутки до полного исчезновения признаков аллергического дерматита 1-ой и 3-ей группам морских свинок участки поражения дополнительно подвергали воздействию магнитного поля с помощью устройства «ЭДМА», предназначенного для магнитотерапии

Результаты проведенных исследований оценивали на 1-3 сутки развития аллергического дерматита и после проведенного лечения. О состоянии процесса регенерации судили по изменению площади кожной раны. Особого внимания заслуживало гистологическое изучение состояния кожи в процессе лечения. Результаты проведенного эксперимента представлены на рисунке 2.

1 2 3 4 5 Группа животных

1-группа животных, леченная магнитолипосомами преднизолона

2-группа животных, леченная липосомами преднизолона

3-группа животных, леченная магнитолипосомами

4-группа животных, леченная 0,5% преднизолоновой мазью

5-группа животных - контрольная

Рисунок 2 - Сроки заживления по экспериментальным группам

В результате проведенного эксперимента впервые показано, что наилучший эффект восстановления структуры поврежденного эпидермиса наблюдался на 8 сутки при сочетании магнитолипосом преднизолона с внешним источником магнитного поля по сравнению с контрольной группой (18 сутки) При данном способе лечения площадь воспаления вокруг зоны поражения была значительно

Р

меньше (5,1 х 4,6 мм по сравнению с контролем 31,6 х 26,2 мм), при этом отмечалась умеренная гиперплазия зернистого слоя, в остальных слоях изменения эпидермиса не выявлялись. Очевидно, это связано с тем, что при применении магнитоуправляемых липосом преднизолона происходил направленный транспорт преднизолона в очаг поражения, увеличивалась глубина проникновения лекарственного вещества за счет сочетанного действия магнитного поля с магнитной формой преднизолона.

У животных 2-ой и 4-ой групп при использовании липосом преднизолона и 0,5% преднизолоновой мази признаки аллергического дерматита исчезали в среднем на 10-й день. После лечения липосомами преднизолона у животных 2-ой группы в эпидермисе макроскопически наблюдались отек (8,3 х 10,1 мм), образование незрелой грануляционной ткани. Микроскопически выявлялось большое количество макрофагов, плазмоцитов, что подтверждало формирование незрелой грануляционной ткани, происходило усиленное формирование примитивных сосудов. При использовании 0,5% преднизолоновой мази в процесс заживления были вовлечены почти все слои дермы, т.е. процесс формирования молодого эпидермального слоя в данном случае происходил на 3-4 суток медленнее, чем при использовании магнитоупраЕЛяемых липосом преднизолона, и в результате заживления формировался коллоидный рубец.

После лечения магнитоуправляемыми липосомами в биоптате 3-ей экспериментальной группы морских свинок макроскопически была видна гиперемия кожного покрова, умеренный отек (14,8 х 15,7 мм), десквамация эпидермиса. Микроскопически в эпидермисе отмечались гиперкератоз, функциональная активность клеток базального слоя, гиперхромия.

В контрольной группе процесс заживления протекал значительно медленнее (18 суток), по сравнению с другими экспериментальными группами животных, в итоге образовывался келоидный рубец. К тому же в дерме обнаруживалось скопление микробных клеток, что свидетельствовало о присоединении инфекционного процесса к воспалительному. При лечении животных 1-4 групп

магнитолипосомами с преднизолоном, липосомами преднизолона, магнитолипосомами, 0,5% преднизолоновой мазью инфекционный процесс отсутствовал, что подтверждает литературные данные о способности подавлять рост условно-патогенной микрофлоры липосомами и магнитным полем.

Таким образом, проведенные экспериментальные исследования позволили установить более выраженное противовоспалительное действие магнитоуправляемых липосом преднизолона по сравнению с 0,5% преднизолоновой мазью.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована аппаратурная схема и разработана методика, позволяющая проводить измерения магнитных свойств таблетированных образцов магнетита.

2. Для стандартизации магнитных параметров магнетита предложены следующие критерии: намагниченность насыщения, остаточная намагниченность и коэрцитивная сила.

3. Разработаны нормы качества, которые составили для намагниченности насыщения магнетита 58,7- 60,3 кА/м, остаточной намагниченности 10,3 - 10,6 кА/м. Коэрцитивная сила магнетита должна находиться в интервале 146,7 -147,3 Э.

4. Предложен новый источник получения ФЛ - головной мозг свиней, позволяющий получать ФЛ, отвечающие современным требованиям фармацевтической технологии.

5. Установлены критерии норм качества для стандартизации ФЛ: содержание МДА, качественный состав, видовое содержание ФЛ.

6. Обоснован состав магнитоуправляемых липосом, липосом преднизолона и магнитолипосом преднизолона, для их получения выбран метод "выпаривания и обращения фаз".

7. Методом электронно-микроскопического исследования ультратонких срезов липосом доказано включение частиц магнетита размером 5-8 нм во внутреннюю полость липосом. С помощью качественного и количественного анализа преднизолона и магнетита показана возможность одновременного их включения в липосомы.

8. Разработаны методики качественного и количественного анализа полученных липосом по магнитному наполнителю и преднизолону.

9. Проведена валидационная оценка методик гравиметрического определения магнетита и спектрофотометрического анализа преднизолона. Показано, что предлагаемые методы анализа соответствуют требованиям валидации.

10. Проведена стандартизация полученных липосомальных препаратов по показателям: описание, определение рН, содержание МДА, подлинность по магнитному наполнителю и преднизолону, намагниченность насыщения, микробиологическая чистота, количественное содержание магнетита и преднизолона.

11. Установлено, что все полученные липосомы в течение 8 месяцев хранения в естественных условиях по всем показателям соответствовали нормам качества.

12. В экспериментах на животных установлено выраженное противовоспалительное действие магнитоуправляемых липосом с преднизолоном по сравнению с 0,5% преднизолоновой мазью.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Стандартизация магнетита // Хим.-фармац. журн. -2002.- Т.36., №6.-С.48-51. (соавт. Беликов В.Г., Курегян А.Г.).

2. Оценка раздражающего действия мазей с магаитоакгивным компонентом // Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (58; 2003; Пятигорск): Материалы ...-Пятигорск,2003.-С.375. (соавт. Сергиенко А.В., Курегян А.Г, Яськов А.С.).

3. Изучение магнитных свойств магнетита // Межрегион. конф. «Медицинская наука и здравоохранение» (2004; Краснодар): Сб. науч. тр. - Краснодар, 2004.-С.143-144. (соавт. Курегян А.Г.).

4. Количественное определение преднизолона и магнетита в магнитоуправляемой липосомальной форме // Современные наукоемкие технологии.-2004.-№3.-С70-71. (соавт. Курегян А.Г.).

5. Перспективы применения магнитоупраляемых липосом с преднизолоном при экспериментальном аллергическом дерматите // Междунар. научно-практ. конф. «Здоровье и образование в XXI веке» (5; 2004; Москва): Сб. тез.- Москва, 2004.-С.154.

6. Использование сахарозо-желатиновой среды для лиофилизации липосом // Науч.-практич. конф. «Противочумные учреждения России и их роль в обеспечении эпидемического благополучия населения страны» (2004; Москва): Сб. тез. ... - Москва, 2004.-С.286-287. (соавт. Дикова С.П., Головченко Т.В., Таран Т.В.).

7. Изучение намагниченности насыщения магнетита // Регион. конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (60; 2005; Пятигорск): : Материалы ... -Пятигорск, 2005.- С.223-224. (соавт. Курегян А.Г.).

8. Применение липосомальных форм лекарственных веществ // Пятигорск, 2005.-15с. Деп. в ВИНИТИ РАН 22.05.2005, №254-В 2005.// Анн.: Биб. ук. Депонир. науч. работы (естеств. и точн. науки, техника) -М., 2005.-№4.-С.13

9. Технологические аспекты получения липосомальных препаратов // Пятигорск, 2005.-14с. Деп. в ВИНИТИ РАН 22.05.2005, №253-В 20057/ Анн.: Биб. ук. Депонир. науч. работы (естеств. и точн. науки, техника) -М., 2005.-№4.-С.13

10. Методы измерения магнитных свойств ферримагнетиков и использование магнетита в фармации // Пятигорск, 2ОО5.-15с. Деп. в ВИНИТИ РАН 22.05.2005, №252-В 2005.// Анн.: Биб. ук. Депонир. науч. работы (естеств. и точн. науки, техника) -М., 2005.-№4.-С.13

11. Биотехнология получения магнитоуправляемых липосом // Хим.-фармац. журн. -2005.- Т.39., №4.- С.95-97. (соавт. Ефременко В.И.., Курегян А.Г.).

ИСМАИЛОВА ГАЛИМА КАПАРОВНА

Изучение физико-химических свойств и стандартизация магнитоуправляемых липосом

АВТОРЕФЕРАТ

Подписано в печать <55 ОЧ .$С05 Г-. Формат 60x84/16. Бумага книжно-журнальная. Печать - ротопринтная. Усл. печ. л. 1,0. Тираж 100 экз. Заказ ъчо

ГОУ ВПО Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

357532, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11. Ротап^интГ ГО^ ВПО ПятГФА

Г » * I

Федерального агентства по здравоохранению и

V. ■

П 7 ч ■! «лог 668

21 и' 1>1 1 /Лэ . .

Актуальность темы. Создание новых лекарственных средств, сочетающих в себе все достоинства магнитоуправляемых и липосомальных форм лекарственных веществ, позволит повысить эффективность лечения многих патологических состояний организма.

Продолжительный прием глюкокортико стероидных лекарственных препаратов часто осложняется целым рядом побочных эффектов, связанных с их системным действием. В связи с этим актуальным является поиск новых лекарственных форм глюкокортикостероидов, обладающих высокой терапевтической эффективностью при использовании минимальных доз. Наиболее полно этим требованиям отвечает магнитоуправляемая липосомальная форма.

Преимущества липосомальных форм лекарственных веществ общеизвестны, но их применение сопряжено с рядом трудностей, связанных с отсутствием методологических подходов к получению и стандартизации липосомальных лекарственных форм.

Решение проблемы создания магнитных лекарственных средств непосредственно связано с производством и стандартизацией исходных магнитных компонентов.

Из всего арсенала веществ, обладающих магнитными свойствами, исследователи наибольшее предпочтение отдают магнетиту, полномасштабное использование которого в практической медицине и фармации на данном этапе невозможно, так как отсутствует нормативная документация (НД), позволяющая оценить его качество.

В настоящий момент изучены некоторые физико-химические, фармакологические характеристики магнетита, полученного в лабораторных условиях. Для его практического применения в фармации как вспомогательного вещества необходимым условием является стандартизация магнитных свойств этого носителя.

Все вышеперечисленное подтверждает тот факт, что стандартизация магнитных носителей, разработка оптимальной технологии получения, стандартизация фосфолипидов (ФЛ) и магниточувствительной липосомальной формы полу синтетического глюкокортикостероида является актуальной проблемой.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования является разработка норм качества магнетита по показателю "магнитные свойства", обоснование состава, получение и стандартизация магнитоуправляемых липосом, изучение возможности включения глюкокортикостероидных препаратов в магнитолипосомы на примере преднизолона и изучение их противовоспалительного действия.

Для реализации поставленной цели необходимо решение следующих задач:

- предложить методики измерения магнитных свойств магнетита и содержащих его лекарственных форм;

- установить нормы качества магнетита по показателю "магнитные свойства";

- предложить сырьевой источник, способ получения и стандартизацию ФЛ; -разработать проекты НД на магнитный носитель-магнетит и на ФЛ из головного мозга свиней;

- обосновать состав, получить липосомы с магнитным носителем и провести их стандартизацию;

-обосновать состав, предложить способы получения и стандартизацию липосом и магнитолипосом с глюкокортикостероидным препаратом на примере преднизолона;

-изучить противовоспалительное действие полученных образцов липосомальных препаратов.

Научная новизна. Теоретически обоснована и экспериментально подтверждена необходимость стандартизации магнитных носителей, ФЛ и липосом, приготовленных на их основе. Изучены магнитные свойства магнетита с помощью вибрационного магнетометра. Исследован процесс получения ФЛ из головного мозга свиней, показана идентичность полученных ФЛ и ФЛ из головного мозга крупного рогатого скота. Разработаны научно-методические подходы к обоснованию состава и конструированию новых липосомальных препаратов. Впервые в РФ проведены исследования по включению магнетита в липосомы. Выяснено, что магнетит включается во внутреннюю полость липосом. Обоснован состав и способ получения магнитоуправляемых липосом. Показана возможность совместного включения магнетита во внутреннюю полость липосом и глюкокортикостероидного препарата, на примере преднизолона, в бислойную фосфолипидную мембрану. С учетом этой новации выбран и обоснован состав, способ получения и методы стандартизации липосом и магнитолипосом, содержащих преднизолон. Установлен выраженный противовоспалительный эффект магнитоуправляемых липосом преднизолона, который обусловлен суммарным действием внутриклеточно доставляемого преднизолона, липосомальных ФЛ и воздействием магнитного поля, способных восстанавливать поврежденные мембраны клеток.

Практическая значимость работы. Усовершенствована аппаратурная схема вибрационного магнетометра. Предложена методика, позволяющая определять магнитные свойства ферримагнетиков. Установлены нормы качества магнетита по показателю "магнитные свойства". Усовершенствован способ получения ФЛ из животного сырья. Предложены методы контроля и показатели качества ФЛ из тканей головного мозга свиней. Разработаны ТУ на магнетит и ФЛ, используемые для получения липосом. Предложены способы получения и методы стандартизации магнитоуправляемых липосом, липосом и магнитолипосом с преднизолоном. Результаты исследований противовоспалительной активности образцов магнитоуправляемых липосом с преднизолоном позволяют рекомендовать их для дальнейшего изучения с целью создания эффективного противовоспалительного лекарственного средства.

Внедрение результатов исследований в практику. Разработаны -ТУ 9154-001-01897080-2004 "Фосфолипиды для получения липосом", утвержденные Зам. Главного санитарного врача Российской Федерации (Письмо ФЦ № 12ФЦ/2514А от 19.08.2004г.)3

-ТУ 9154-01962942-2004 "Магнетит - магнитный носитель", утвержденные Зам. Главного санитарного врача Российской Федерации от 3.08.2004г.,

- промышленный регламент производства "Липосомальная основа для получения диагностических, липосомальных и косметических препаратов", утвержденный Ученым советом Ставропольского научно-исследовательского противочумного института (протокол № 4 от 20 апреля 2004г.).

- результаты исследований по получению магнитоуправляемых липосом с преднизолоном, представленные в информационном письме "Разработка технологии, стандартизация и фармакологическое исследование магнитоуправляемых липосом с преднизолоном", используются в научно-исследовательской работе 1-го Военно-Морского Клинического Госпиталя (акт внедрения от 17 августа 2004г.).

Положения, выносимые на защиту:

- результаты исследований по стандартизации магнитных свойств магнетита;

- обоснование состава и стандартизация ФЛ;

- результаты исследований по способу включения магнитного носителя в липосомы;

- данные по стандартизации магнитоуправляемых липосом;

-итоги исследований по иммобилизации и стандартизации глюкокортикостероидных препаратов на примере преднизолона в липосомы и магнитолипосомы;

- результаты изучения противовоспалительной активности полученных липосомальных препаратов.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук.

Диссертационная работа выполнена согласно плану научно-исследовательских работ ГОУ ВПО Пятигорской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и ФГУЗ Ставропольского научно-исследовательского противочумного института Роспотребнадзора и соответствует проблеме "Фармация" Ученого совета Минздравсоцразвития РФ, секция № 38 "Фармация".

Апробация работы. Основные фрагменты диссертационной работы изложены на 60-й региональной конференции по фармации, фармакологии и подготовке кадров (Пятигорск, 2005).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста в компьютерной верстке и состоит из введения, обзора литературы (глава 1), экспериментальной части (5 глав), общих выводов и списка литературы, включающего 210 источников, в том числе 54 иностранных, содержит 24 таблицы, 13 рисунков.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Усовершенствована аппаратурная схема и разработана методика, позволяющая проводить измерения магнитных свойств таблетированных образцов магнетита.

2. Для стандартизации магнитных параметров магнетита предложены следующие критерии: намагниченность насыщения, остаточная намагниченность и коэрцитивная сила.

3. Разработаны нормы качества, которые составили для намагниченности насыщения магнетита 58,7- 60,3 кА/м, остаточной намагниченности 10,3 -10,6 кА/м. Коэрцитивная сила магнетита должна находиться в интервале 146,7- 147,3 Э.

4. Предложен новый источник получения ФЛ - головной мозг свиней, позволяющий получать ФЛ, отвечающие современным требованиям фармацевтической технологии.

5. Установлены критерии норм качества для стандартизации ФЛ: содержание МДА, качественный состав, видовое содержание ФЛ.

6. Обоснован состав магнитоуправляемых липосом, липосом преднизолона и магнитолипосом преднизолона, для их получения выбран метод "выпаривания и обращения фаз".

7. Методом электронно-микроскопического исследования ультратонких срезов липосом доказано включение частиц магнетита размером 5-8 нм во внутреннюю полость липосом. С помощью качественного и количественного анализа преднизолона и магнетита показана возможность одновременного их включения в липосомы.

8. Разработаны методики качественного и количественного анализа полученных липосом по магнитному наполнителю и преднизолону.

9. Проведена валидационная оценка методик гравиметрического определения магнетита и спектрофотометрического анализа преднизолона. Показано, что предлагаемые методы анализа соответствуют требованиям валидации.

10. Проведена стандартизация полученных липосомальных препаратов по показателям: описание, определение рН, содержание МДА, подлинность по магнитному наполнителю и преднизолону, намагниченность насыщения, микробиологическая чистота, количественное содержание магнетита и преднизолона.

11. Установлено, что все полученные липосомы в течение 8 месяцев хранения в естественных условиях по всем показателям соответствовали нормам качества.

12. В экспериментах на животных установлено выраженное противовоспалительное действие магнитоуправляемых липосом с преднизолоном по сравнению с 0,5% преднизолоновой мазью.