Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследования в области совершенствования контроля качества и клатратообразования некоторых стероидных гормонов, производных кортикостерона

л -

м!

I

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РСФСР ПЯТИГОРСКИЙ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

Гаврилин Михаил Витальевич УДК 615.357:541.4э] 07

ИССЛЕДОВАНИЯ В ОБЛАСТИ СОВЕШЕНСТВОВАНИЯ КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА И КЛАТРАТООБРАЗОВАНИЯ НЕКОТОРЫХ СТЕРОИДНЫХ ГОРМОНОВ, ПРОИЗВОДНЫХ КОРТИКОСТЕРОНА

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Пятигорск - 1992

Работа выполнена в Пятигорском фармацевтическом институте Научный руководитель:

заслуженный деятель науки РСФСР, доктор фармацевтических наук, профессор В.Г. Беликов

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор H.A. Казаринов доктор химических наук, профессор М.Ф. Маршалкин

Ведущая организация - Харьковский фармацевтический инсли

Защита состоится & 1992 г. в " " часов

на заседании специализированного совета Д 084.45.01 по защитам диссертаций при Пятигорском фармацевтическом институте /357533, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11/

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пятигорского фармацевтического института /пр. Калинина,11

Автореферат разослан Ученый секретарь специализированного совета, доцент

1992 г.

Е.В. Компанцева

Актуальность теш. Стероидные гормоны и их полусинтетические аналоги, производные кортикостерока, находят широкое применение в медицинской практике при лечении различных заболеваний. Для получения лекарственных препаратов этой группы в промышленности используется микробиологическая трансформация исходных стероидов. Этот способ значительно эффективнее химических методов. Он позволяет проводить селективное дегидрирование и гидрок-силирование стероидных соединений в определенном положении. В тоже время метод микробиологической трансформации не лишен недостатков. Одним из них является низкая загрузка производственных мощностей (0,5-1 г стероида на литр культуральной жидкости), обусловленная тем, что производные кортикостерона практически нерастворимы в воде. Поэтому поиск путей повышения растворимости исходных продуктов, биотрансформапди имеет существенное значение для решения проблемы увеличения выпуска препаратов этой группы, а так же создания лекарственных форм производных кортикостерона с повышенной биологической доступностью.

Изучение отечественной и зарубежной литературы по анализу стероидных соединений свидетельствует о несовершенстве многих применяемых способов контроля качества лекарственных препаратов из числа стероидных гормонов и их лекарственных форм.

Поэтому актуальным является совершенствование процесса производства этих препаратов с целью увеличения объёма их выпуска и создание новых лекарственных форм кортякостероидов с улучшенными биофармацевтическими характеристиками, что в свою очередь требует разработки экспрессных и селективных методик анализа.

Решить проблему улучшения растворимости производных кортикостерона можно при помощи $ -циклодекстрина (ОД), который обладает свойством образовывать с различными веществами соединения включения (СВ) или югатраты. Это приводит к изменению физи-

ко-химаческих и биофармацевтичеоких свойств включаемых соединений, в том числе и к улучшению растворимости. Поэтому получэни« СВ производных кортикостерона с ОД, обладающих повышенной растворимостью в воде является актуальной задачей. Исследование СЗ позволит создать лекарственные формы с повышенной биологическое доступностью и повысить интенсивность процесса производства ere ровдов.

Б качестве объектов исследования наш выбраны препараты -гидрокортизона ацетат, цреднизолон, триамцинолона ацетонид и се нафяан, а такае некоторые полупродукты их производства - корте* солон, гидрокортизон, фгороксикортексолона ацетонид и фторокси-преднизолона ацетонид.

Цели и задачи исследования. Целью исследования является сс вершенствование способов анализа производных кортикостерона и изучение возможности использования ЦД для совершенствования про цесса производства гидрокортизона» преднизолона и синафлаиа и повышения биологической доступности гидрокортизона ацетата, три амцинолона ацетонада и синафяана.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решать следующие задачи:

1. Изучить хроматографическое поведение производных кортикостерона на нескольких сорбентах с использованием различных элю-ентов.

2. Разработать методики анализа этих соединений в культуральных жидкостях и технических щюдуктах, мазях и водных растворах.

3. Установить наличие взаимодействия мевду производными кортика стерона и ОД в водных растворах, а также влияние ЦД на их ра створимость в воде.

4.Получить различными способами. СВ производных кортикостерона

и разработать методики их анализа.

5. Комплексом физико-химических методов подтвердить наличие взаимодействия медцу изучаемыми соединениями и ОД в твердом состоянии.

6, Провести биологические испытания линимента синафлана, содержащего ЦЦ.

Научная новизну. Найдены оптимальные условия ВЭЯХ и ГЖХ анализа производных кортикостерона в культуральных жидкостях, технических продуктах и мазях. Для выбора условий спектрофото-метрического определения изучены УФ спектры а определены основные спектрофотомегрические характеристики водных растворов кор-тексолона, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, фтороксияор-тексолона адетонида, триащинолона ацетонида и синафлана.

Спектрофотометрическим методом исследовано взаимодействие мэаду производными кортикостерона и ЦД, рассчитаны константы образования соединений включения. Высказано предполояение о механизме их образования, показано влияние химической структуры стероидов и гидрофобности на процесс клатратообразования.

Впервые получены СВ кортексолона, гидрокортизона ацетата, фтороксикортексолона ацетонида, триамцанолона ацетонида и синафлана. Для этого использованы методы соосаядения, растирания и удаления растворителя при пониженных температуре и давлении, а также после предварительного автонлавирования. Автоклашрование для получения СВ лекарственных веществ стероидной природы было использовано впервые. Для получения СВ методами растирания и соосаядения проведен выбор оптимальных условий. Методами ТСХ и ВЭ1Х установлена стабильность производных кортикостерона в процессе синтеза СВ.

Впервые методами ИК спектроскопии, дифференциального тер-

маческого анализа и рентгеиодафрактографми исследованы полученные СВ. Установлена зависимость между константами, образования СВ и их спектральными характеристиками.

Найдены условия и оптимальные количества ОД, позволяющие более чем в три раза повысить растворимость в воде кортексолона гидрокортизона и фтороксикортексолона ацетонвда, что явилось основой дая разработки новых условий микробиологического производства гидрокортизона, лреднлзодона и санафлана.

Практическая ценность работу. Разработаны методики ГЖХ и ВЭЖХ определения производных коргакостарона в культуралышх жидкостях, технических продуктах и мазях, которые отличаются высокой селективностью и экспрессностью и позволяют одновременно проводить качественную идентификацию и количественное определение данных соединений, а такта примесей присутствующих в них."

Изучение растворимости СВ гидрокортизона ацетата, триамца-нолона ацетонида и синафлана показало значительное влияние ОД на этот процесс, что позволило создать лекарственную форму - линимент синафлана, содержащий ОД, с повышенной фармакологической активностью. Предварительные доклинические испытания линимента в опытах на хивотных показали увеличение противовоспалительной и противоаллергической активности в два раза по сравнению с ли-юшентом)выпускаемым промышленностью.

Степень внедрения. Методики качественного и количественного определения кортексолона, гидрокортизона, преднизояона и фтор оксилреднизолона ацетонида внедрены в практику работы ХФК "Акрихин". Там же апробированы способа улучшения растворимости кортексолона, гидрокортизона и фтороксикортексолона ацетонида с помощью ЦД. Полученные результаты используются комбинатом для со-

вершенствования процесса получения стероидов на стадиях гидрок-силирования.

Работы по доклиническому изучению линимента синафпана, содержащего БД, включены в план работы Пятигорского фармацевтического института на 1992-1993 гг.

По теме диссертации опубликовано II печатных работ.

Структура и объём работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на страницах машинописного текста. Она состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы, включающего 131 источник, из которых 54 на иностранных языках. В диссертации приводятся 29 рисунков и 33 таблицы.

Апробация работц. Основные результаты исследований доложены на научных конференциях Пятигорского фармацевтического института в 1989,1990 и 1991 гг.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Разработка методик определения производных кортикостерона в различных объектах

Для определения производных кортикостерона в культуральных жидкостях, технических продуктах и мазях используются хромато-спектрофотометрические и фотоколоримегрическае методики. При этом на проведение анализа затрачивается 3-4 часа и относительная ошибка определения часто превышает 5-6%. С целью совершенствования способов определения кортексолона, гидрокортизона, пред-низолона, фтороксикортексолона ацетонида и фтороксипреднизолона ацегонида нами был проведен поиск оптимальных условий определения этих соединений методом ВЭЖХ. Для этого изучено их хроматографа-

ческое поведение в цряыофазном и обращеннофазном вариантах с использованием различных злюентов. В обращеннофазном варианте д качестве неподвижной фазы использовала Зератоп С^ и З^аво) -С^д» а в качестве подвижной фазы - смеси метанол-вода и ацето-нитрил-вода, В прямофазном варианте соответственно - ЗЛазогЪ -600 и смеси хлороформа и метанола. При выборе растворителей исходили из данных литературы, учитывали гидрофобность анализируемых веществ и полярность растворителей. Хроматографическуи подвижность анализируемых соединений оценивали по продолжительное ти времени удерживания, В качестве критериев для выбора оптимальных условий были выбраны продолжительность и селективность анализа, что обусловлено необходимостью оперативно определять стероиды в присутствии различных примесей стероидного (кортизо* эпикортизол, 20<? -оксипреднизолон и др.) и нестероидного проис-

и

хождения.

Проведённые исследования позволили установить, что анализировать методом ВЭ12 кортексолон в выбранных условиях не представляется возможным, т.к. исходный цродукт для получения кор-тексолона, являющийся основной примесью, не имеет максимума по1 лощения в УФ области, что делает затруднительным его опродвлеша на жидкостном хроматографа с спектрофотометрическим детектором.

Изучение хроматографического поведения различных стероидо! на прямой фазе показало, что в этих условиях можно провести раз деление всех изучаемых стероидов с достаточной селективностью. При хроматографировании экстрактов из культуральных жидкостей установлено, что в прямофазном варианте можно успешно анализировать культуральные нидкости производства преднизолона (Рис. 3 и фтороксипреднизолона ацетонида.

Рис. I Хроматограша хлороформного экстракта из культуральной жидкости производства преднизолона. I - кортексолон, 2 - гидрокортизон, 3 - преднизолон, 4 - 20$ -оксипред-низолон

Однако в этих условиях не удалось получать достаточно чёткого пика гидрокортизона т.к. он сливается о многочисленными пиками примесей. Поэтому для определения гидрокортизона в экстракте из культуральной жидкости, при его производстве, был выбран обра-щеннофазный вариант ВЭЖХ. Для разработки методик количественного определения исходили из принятой на ХФК "Акрихин* загрузки стероидов в культуральную жидкость и используемой методики экстракции. Учитывая эти количества, на анализ культуральной жидкости, содержащей гидрокортизон и преднизолонубрали по 10 мл, а содержащей фтороксипреднизолона ацетонид - 20 мл. По разработанной методике аликвоту культуральной жидкости экстрагировали хлороформом, который затем отгоняли и остаток растворяли в метаноле, причем объем растворителя был равен объему взятой на анализ аликвоты. Полученный раствор использовали для хроматографирования. Расчет количест-

венного содержания проводили по методу калибровки, для чего параллельно хроматографировали такие же количества 0,01$ растворо; определяемых веществ, соответствующих НТД. Относительная ошибка определения по данной методике не превышает Ъ%, продолжительное анализа 40-50 мин.

Условия определения производных кортикостерона методом ВЭЖ в культуральных жидкостях и технических продуктах представлены в таблице I.

Таблица I

Условия определения производных кортикостерона методом ВЭЖ

! Скорость ! подачи ! элюента

Стероид

у\,НМ

Вариант хроматографии_

Злюент

4-

Гидрокортизон Преднизолон

248 248

Фтороксипреднизо-| лона

ацетонвд ! 248

Обр. фаз. Прям. фаз.

Прям. фаз.

метанол-вода(6:4)

хлороформ-метанол (98:3)

хлороформ-метанол (97:3)

50 мкл/ми!

100 - " -

| 100

Для количественного определения кортексолона в присутствии примесей был выбран метод ГЖХ. Предварительно изучено хроматогра фическое поведение этих соединений на неподвижных жидких фазах различной полярности. Оптимальной фазой оказался нигрилсиликон ХВ-60, т.к. на этой фазе элшрование стероидов занимает не более 15 мик времени. Количественное определение проводили методом вну реннего стандарта, в качестве которого был выбран холестерин. Разработанные методики были использованы и для определения г^ас-

совой доли производных кортикостерока в технических продуктах. Методика позволяет определять как основное вещество так и примеси - эпикортизол, кортизон, 20^-оксипреднизолон и др.

Метод ВЭЖХ, как наиболее экспрессный из хроматографаческих методов, был использован для количественного определения гидрокортизона ацетата, преднизолона и синафлана в мазях - гидрокорти-зоновой-1^, преднизолоновой-0,5^, "Гиоксизон" и мази синафлана-0,025%. Согласно НТД эти препараты в мазях определяются фотоколориметрически после цветной реакции о изониазидом. Данная методика отличается высокой точностью и воспроизводимостью, однако очень трудоёглка и занимает много времени - до 4 часов.

Для определения стероидов в мазях изучалась возможность анализа как в прямофазном, так и в обращеннофазном вариантах. В качестве элюентов оказалось возмоггным использовать те же системы растворителей, что и при определении производных кортикостерона в культуральных жидкостях. В дальнейшем для анализа на прямой фазе нами была использована смесь хлороформ-метанол 97:3, а на обращенной фазе - метанол, как растворитель с максимальной элшру-пдей силой на привитых сорбентах.

Извлечение стероидов из мазевых основ проводили хлороформом, содержание препарата рассчитывали методом калибровки. При этом установлено, что оба варианта ВЗНХ позволяют проводить количественное определение стероидов в мазях. Относительная ошибка определения не превышает продолжительность анализа 25-30 мин.

С целью изучения влияния Щ на растворимость в воде кортек-солона, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, фтороксинортексо-лона ацетоиида, триамцинолона ацетонида и синафлана предварительно были выбраны оптимальные условия для их спектрофотометрическо-

го определения в водных растворах. Полученные результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Условия спектрофотометрического определения производных кортикостерона в водных растворах

Стероид

Область подчинения з-ну Вера, мшу мл

Кортексолон

Гидрокортизон

Гидрокортизона ацетат

¿гороксякортек солона ацетонид

Триамцинолона ацетонид

Сина^лан

3-20 3-20

3-25

3-25

3-25 3-25

Л'

нм

248,6 247,8

248,0

241.5

241,8

240.6

й1см

457,6±5,0 435,6^4,8

393,2±4,3

344,2±4,1

343,7±4,2 331,2^4,1

Как следует из представленных данных, в выбранных условиях мояно проводить спектрототоштрическое определение производных кортикостерона в водных растворах с достаточной точностью.

2. Исследование взаимодействия стероидов с ЦД и получение СБ Наш было изучено взаимодействие кортексолона, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, фггороксипреднизолона ацетонида, триамцинолона ацетонида и синафяана с ЦЦ в водных растворах. Исследования проводились спектрофотометрцчесним методом. Используемая методика основана на способности ЦП, уменьшать абсорбцию 3-кето-стероидама УФ излучения в растворах, что позволило рассчитать

константы образования комплексов стероид-ЦД, приведенные в таблице 3. При этом установлено, что максимальную константу образования имеет комплекс ЦД с кортексолоном - 1,98x10^ М"^ и гидро-

п ■]

кортизоном - 7,06x10" М . Введение двойной связи в цикл А, 21-ацетилирование и 1-2 дегидрирование стероидов последовательно приводит к снижению константы образования. Значительно снижает клатратообразование введение атома фтора в молекулу стероидов. Необходимо отметить, что клатратообразование производных корти-костерона в большей степени зависит от особенностей химической структуры, чем от гидрофэбности. Представленные в таблице 3 коэффициенты экстракции стероидов в системе октанол-вода подтверждают сделанное предположение.

Наличие взаимодействия стероидов с ДЦ в водных растворах позволяет использовать его для улучшения растворимости и создания лекарственных форм производных кортикостерона с повышенной биологической доступностью. Для решения этой задачи различными способами были получены СВ кортексолона, гидрокортизона, гидрокортизона ацетата, фтороксикортексолона ацетонида, триамшнолона ацетонида и синафлана. Получение СВ проводили тремя основными способами - соосаждения, растирания и удаления растворителя, причем как при повышенных так и при пониженных температуре и давлении. Одновременно был проведен поиск оптимальных условий получения СВ методами соосаждения и растирания, изучены факторы влияющие на процесс образования СВ. Проведенный эксперимент позволил выявить зависимость между величиной константы образования комплекса стероид-ДЦ, выходом СБ при получении методом соосаждения и временем, в течении которого происходит осаждение продукта. Полученные результаты представлены в таблице 3. Синтез СВ других

стероидов вели в тех лее условиях, которые были выбраны на примере кортексолона при помощи симплексного планирования. Критерием окончания процесса образования СБ было полное осветление надоса-дочной жидкости.

Таблица 3

Характеристики взаимодействия стероидов с ЦЦ в растворах

-1

Стероид

Кортексолон

Гидрокортизон

Гидрокортизона ацетат

Фтороксикортек-солона ацетонид

Триамцинолона ацетонид

Синафлан

Кобр.*""

1,98x10 7,06х103

4,21х103

5,30х103

4,04х103 1,16х103

Т" 3---Т"

Кэ Время соосавдения ---- Выход,:

0,92 33 мин 9З7О2

0,85 45 мин 79,21

0,92 9 час 62,48

0,79 6 час 88,54

0,89 11 час 60,08

0,89

Представленные в таблице результаты — выход СБ и время соосавдения продукта, хорошо согласуются с константами образования комплексов. Уменьшения Койр последовательно приводит к сокращению выхода СБ и увеличению времени соосавдения. Очевидно, что при величине константы менее ЗхЮ3 получать СВ производных коюткостерона методом соосавдения нецелесообразно из-за низкого выхода продукта и большого времени, затрачиваешго на соосаж-денае.

Для количественного определения стероидов в СВ была разработана экстракционно-спектрофотометрическая методика: точную массу СВ диспергируют с водой, полученную суспензию экстрагируют хлороформом. Хлороформное извлечение фильтруют через бумажный фильтр с безводным сульфатом натрия, хлороформ отгоняют, остаток растворяют в этаноле и в полученном растворе спектрофотометричес-

ки определяют массовую долю стероида. Проведенные исследования показали, что кортексолон, гидрокортизон, гидрокортизона ацетат и синафлан образуют СВ с содержанием стероида 13-15%, что соответствует молярному соотношению "гость-хозяин" 1:2. В СВ три-амцинолона ацетонида и фтороксикортексолона ацетонида, полученных методами соосаждения и растирания>содержание Гостевых" компонентов соответствует молярному соотношению 1:1,5. Такой состав СВ может быть объяснен тем, что полученные продукты представляют собой смеси комплексов.состава 1:1 и 1:2.

Для контроля стабильности стероидов в процессе получения СВ использовали метода ТСХ и ВЭ2Х. ВЭ1Х исследования проводили по методике разработанной для количественного определения гидрокортизона в культуральной жидкости. Исследования методом ТСХ выполняли с помощью описанных в литературе методик. В качестве подвижной фазы использовали систему растворителей хлороформ-метанол 9:1, пластинки проявляли -5% раствором, фосфорношлибденовой кислоты в этаноле, а так же просматривали в УФ свете. Хроматдгра-фирование вели на силикагеле восходящим способом. В результате проведенного эксперимента установлено, что разложения производных кортикостерона в процессе получения СВ не происходит.

3. Изучение СВ при помощи физико-химических методов

С целью подтверждения включения стероидов в юлость молекулы ЦЦ в твердом состоянии были использованы методы ИК спектроскопии, дифференциального термического анализа и рентгенодафрак-тографии. Для исследований брали образцу полученные методом со-осаждения (синафлана - методом растирания,), т.к. при этом способе получения вероятность включения наибольшая. Параллельно с об-

разцами СВ анализу подвергались исходные стероиды и их физические смеси с ЦД, приготовленные в молярном соотношении 1:2.

В полученных ИК спектрах было проведено отнесение полос поглощения отдельных функциональных групп каждого исследуемого образца. Анализ полученных результатов показывает, что в спектрах физических смесей сохраняются все полосы, соответствующие как ЦД, так и стероидам. В Ж спектрах СВ, по сравнению с спектрами исходных компонентов, имеются определеннне отличия. Взаимодействие кортексолона, гидрокортизона ацетата и еинафлана приводит к сдвигу максимума, соответствующего поглощению 3-кетогруппы, на 12-20 см в более длинноволновую область. Для всех стероидов характерно расширение полос поглощения и увеличение интенсивности в области 3400-3100 сгвдроксильные группы ЦД^. Имеются также отличия в области "отпечатков пальцев".

Проведенные исследования позволяют сделать вывод об участии в образовании СВ сопряженного карбонила стероидов и гидроксиль-ннх групп ЦП,. Исходя из этого можно предположить, что в твердом состоянии сохраняются водородные связи между карбонилом стероидов и вторичными гидроксилами ЦЦ. Изменения в спектрах, при переходе от препарата к СВ, в области "отпечатков пальцев" могут свидетельствовать об участии углеродных атомов стероидного ядра в образовании гидрофобных связей с молекулой ЦЦ.

Изучение термограмм производных кортикостерона, их СВ и физических смесей с ЦЦ показало, что для всех СВ характерны термические эффекты испарения влаги и плавления с разложением в области 280-315 °С, что на 50-70 °С превышает область температур, соответствующих плавлению препаратов. Причем указанный сдвиг температур наиболее выражен для стероидов с максимальной гидрофоб-ностью - кортексолона, гидрокортизона ацетата и синафлана и в

меньшей степени для гидрокортизона и гТтороксикортексолонеацето-нида.

С наибольшей достоверностью образование СВ производных кортикостерона доказывается методом рентгенодифрактографии. Сравнительный анализ кристаллографических данных интактных стероидов, их СВ и физических смесей с ЦД показал, что при взаимодействии стероидов с ЦД образуются соединения с индивидуальной кристаллической структурой. Дифракционные спектры полученных СВ характеризуются исчезновением рефлексов, присущих ЦД и индивидуальным стероидам, и появлением новых, что еще раз доказывает взаимодействие стероидов и ЦД.

Таким образом, проведенные исследования полученных продуктов при помощи физико-химических методов, подтверждают, что при взаимодействии с ЦЦ производные кортикостерона образуют СВ.

4. Изучение влияния ЦЦ на растворимость производных кортикостерона

С целью изучения возмо юности использования ЦД для улучшения растворимости в воде кортексолона, гидрокортизона и фтороксикор-тексолона ацетонида наш была исследована растворимость этих соединений в растворах различной концентрации. Исследования проводили при температуре процессов гидроксилирования и дегидрирования стероидов 27-29 °С. Предварительно было установлено, что максимальное количество стероида растворяется как в воде, так и в растворах ЦД за 50-55 мин. Проведенные исследования позволили установить, что максимальной растворимости кортексолона - 0,34 г/л можно достичь в С,растворе ЦД, увеличение растворимости составляет 5,2 раз; гидрокортизона в 0,9-1,2?! - 1,15 г/л, увели-

чение в 3,3 раза и фтороксикортексолона ацетонида в 2,0$ растьо ре ЦД-- 0,38 г/л, увеличение раствориюсти в 5,2 раз. Получении результаты в виде кривых растворимости представлены на рисунке

Рис. 2 Влияние ЦД на растворимость производных кортикост! рона в воде. 1 - кортексолон, 2 - гидрокортизон, 3 - фтороксикортексолона ацетонид

Представленные результаты свидетельствуют о том, что макси-эдум растворимости кортексолона и гидрокортизона наблюдается при определенных концентрациях ВД. Увеличение количества ЦЦ приводи1: к выпадению осадков СВ,и к уменьшению концентрации стероида в растворе.

По литературным данным известно, что ЦЦ не подвергается бис конверсии в условиях гидроксилирования и дегидрирования стерои-

доб. Учитывая это обстоятельство мы провели изучение экстракции конечных продуктов биотрансформаций - гидрокортизона, преднизо-лона и фтороксилреднизолона ацетонида из растворов, содержащих ЦК. При этом установлено, что ЦЦ лишь несколько замедляет экстракцию стероидов, в целом не нарушая этого процесса.

Биофармацевтическую оценку СБ гидрокортизона ацетата, три-амцинолона ацетонида и синафлана осуществляли в соответствии с указаниями ГФ XI - методом "вращающейся корзинки", в течении 1 часа. Количество растворенных стероидов определяли спектрофото-метрически. Из результатов проведенного эксперимента следует, что присутствие ЦЦ во всех случаях приводит к улучшению растворимости производных кортикостерона в воде. Для гидрокортизона ацетата максимальная растворимость обеспечивается СВ, полученным методом соосаждения, и составляет 0,07 г/л, растворимость улучшается в 2,85 раза. СВ, полученные другими способами, не обеспечивают такой растворимости гидрокортизона ацетата /рисунок 3/.

Наибольшей растворит стью триамцинолона ацетонида также обладает СВ, полученное методом соосаждения и физическая смесь, но у последней скорость растворения в 2 раза меньше, а растворимость улучшается в 3 раза, до 0,П5 г/л. СВ, полученные другими способам^ дают значительное меньшее возрастание растворимости триамцинолона ацетонида.

Максимальное улучшение растворимости стероидов было достигнуто у СВ синафлана - в 7,8 раза. Такое улучшение обеспечивается СВ полученным методом удаления растворителя после предварительного автоклавирования и физической смесью, растворимость синафлана при этом составляет 0,1 г/л.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что при помощи" ЦЦ можно значительно повысить растворимость производных кор~

Рис. 3 Кривые растворимости гидрокортизона ацетата, его Физической смеси с ЦЕ и СВ, полученных разными способами :

1 - гидрокортизона ацетат, 2 - физическая смесь, 3 - СВ, полученное удалением растворителя после автоклавирования, 4 - СВ, полученное лиофилизаци 5 - СВ, полученное растиранием, 6 - СВ, полученн соосавдением

тикостерона. При этом отличия в растворимости СБ, полученных разными способами, может быть объяснена разной степенью дисперсности продуктов и образованием полиморфных форм.

Исходя из того, что набольшее увеличение растворимости при помощи ЦЦ было достигнуто для синафлана, проведено изучение противовоспалительной и противоаллергической активности линимента синафлана 0,025^, содержащего ЦД. Противовоспалительную активность изучали на белых крысах, по изменению отека конечности после введения флогогена, в качестве которого использовали гистамин. Противоаллергическую активность оценивали визуально, по состоянию конъюнктивы мэрской свинки после введения гистамина. Контролем во всех случаях служил линимент синафлана 0,025%, выпускаемый промышленностью. Количество ВД в линименте изменяли от 0,5 до 51!. Проведенный эксперимент показал, что ЦЦ,внесенный в линимент в количестве 2-2,5%}более чем в два раза в опытах на животных увеличивает активность синафлана.

ОБШИЕ ВЫВОДЫ

1. Проведено изучение хроматографического поведения кортек-солона, гидрокортизона, преднизолона, фтороксикортексолона ацетонида, фтороксигидрокортизона ацетонида, фтор-оксзпреднизолона ацетонида, а так же кортизона, эшкор-тизола и 20 $-оксипреднизолона на прямой и обращенной Фазах с использованием различных элюентов. Осуществлен выбор оптимальных условий определения этих соединений методом ВЭдХ.

2. Разработаны методики определения гидрокортизона, предни-золона и фтороксипреднизолона ацетонида методом ВЭЖХ и кортексолона методом ПХ в культурапьнкх жидкостях и

технических продуктах в присутствии'различных примесей. Относительная ошибка определения не превышает 3%, время затрачиваемое на анализ, в 3-4 раза меньше, чем по методикам НТД,

3. Разработаны экспрессные и селективные методики качественной и количественного определения гидрокортизона ацетата, предш золона и синафлана в мазях методом ВЭ^Х. Относительная ошибь определения не превышает 4%, время затрачиваемое на анализ и более 1 часа.

4. Выбраны оптимальные условия УФ спектрофотометрического о пред ления производных кортикостерона в водных растворах, устано! лены основные спектрофотометрические характеристики.

5. Спектрофотометрнческим методом исследовано взаимодействие щ изводных кортикостерона с ЦД в водных растворах, рассчитаны константы образования комплексов включения. Установлено, что И/гидроксилирование, 1-2 дегидрирование, 21 ацетилирование молекулы, а так же введение фтора в бесили ЭйС-положение у пр изводных кортикостерона г<риводит к снижению констант образования комплексов включения.

6. Показано, что величина константы образования комплексов с ЦЦ обусловлена, главным образом, химической структурой произвол ных кортикостерона, а не их гидро(Тобностью.

7. Предложены способы получения СВ производных кортикостерона м тодамя соосавдения, растирания и удаления растворителя. .

8. Разработана методика количественного определения производных кортикостерона в их СВ методом экстракционной спектрофотомет рии. Установлено, что кортексолон, гидрокортизон, гидрокорти зона ацетат и синафлан образуют СВ в соотношении стероид-Ц 1:2, а фтороксикортексолона ацетонид и триамцинолона ацетони, в соотношении 1:1,5.

9. Методами Ж спектроскопии, дифферевнциального термического анализа и рентгенодифрактогра^ли подтверждено наличие взаимодействия между ЦЦ и производными кортккостерона в твердом состоянии. Образование ОБ идет за счет взаимодействия между сопряженным карбонилом стероидов и вторичными гидроксилами ЦД, а так же за счет гидрофобных взаимодействий.

10. Изучено влияние ЦЦ на растворимость производных кортикостеро-на. Найдены оптимальные способы получения СБ и количества ЦЦ, необходимые для достижения максимальной растворимости в воде кортексолона, гидрокортизона, фтороксикортексолона ацетонида, гидрокортизона ацетата, триамцинолона ацетонида и синафлана.

11. Проведено фармакологическое исследование противовоспалительной и противоаллергической активности линимента син&флана, содержащего ЦД, В опытах на животных установлено, что добавление к основе 2% ЦЦ в два раза увеличивает биологическую активность линимента.

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Количественное определение гидрокортизона в культуральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии ( Ь.В, Компанцева, Э.Ф. Умнова, С.А. Кудрин) .-//НЖТЭХИМ. Науч.-тех. и реф. сб.: Рац. предл. л перед, произв. опыт.-1990.-Вып. 5,-С. 24-26.

2. Изучение влияния^ -циклоденстрина на растворимость некоторых препаратов стероидных гормонов (В.Г. Беликов, Е'.В. Компанцева] „//Тез. докл. Всесоюз. науч.-тех. конф.,3-5 окт. 1990, г.Харьков "Состояние и перспективы созданяя новых лекарственных препаратов ".-Харьков.-1990.-С.249-250.

3. Исследование взаимодействия кортексолона с -даклодекстрином

(Е.В. Компанцева, К .К. Ботезат-Белый, Э.Ф. Умнова и др.^ //Хим. фармац. журнал.-1990.10.-С. 81-82.

4. Изучение возможности использования ^-циклодекстрина для совг шенствования процесса получения предайзолона (В.Г. Беликов, Е.В. Компанцева, Э.Ф. Умнова) .-Хим. фармац. журнал.-1991.-№ 2.-С. 48-49.

5. Количественное определение кортексолона в культуральной жидкости мвтодом ГЕК (Умнова Э.Ф., С.А. Кудрин) .- Фармация.-1991.-* 1.-С. 33-35.

6. Получение и исследование соединения включения гидрокортизона с 8-циклодекстрином ( В.Г. Беликов, Е.В. Компанпева, Ю.К. Ботезат-Белый)/.-Тез. докл. нучн.-практ. конф. ^Резервы сове шенствования лекарственного обеспечения населения РСФОР" и пленума ВНОФ, 12-13 марта 1991, Владишр.-1991.-С. 10-11.

7. Влияние й-циклодекстрина на растворимость некоторых стероид ных гормонов в воде (В.Г. Беликов, Е.В. Компанцева, Л.И. Дра ник]т// Фармация.-1991.-Я 2,- С. 35-378, Количественное определение преднизолона в культуральной жидкости методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

( Э.Ф. Умнова, С.А. Кудрин) .-// Фармация.-1991.2.-С. 679. Влияние -циклодекстрина на улучшение растворимости препаратов, производных прегнана и пиридина (В.Г. Беликов, Е.В. Компанцева, Л.П. Овчаренко ) .-// Материалы 46-й региональной конференции по фармации и фармакогологии, Пятигорск,-1991.-С. 76-77.

10. Изучение возможности использования^ -циклодекстрина в произ водстве синафлана ( В.Г. Беликов, Е.В. Компанцева, Э.Ф. Умнов -// Биотехнология.-1991.-$ 5.-С. 63-64,

1. Изучение комплексообразования некоторых стероидных гормонов с ß-циклодекстрином (В.Г. Беликов, E.H. Вергейчик, Е.В. Ком-панцева, И.В. Саенко) .-// Известия CK НЦВШ. Естественные науки. -1991. З.-С. 36-39.