Исследование цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) с целью получения биологически активных веществ

Подгорная, Жанная Валериевна

Диссертации по фармакологии → Фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Исследование цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) с целью получения биологически активных веществ

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Подгорная, Жанная Валериевна Пятигорск 2008 г.

Ученая степень: кандидата фармацевтических наук

ВАК РФ: 15.00.02

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Исследование цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) с целью получения биологически активных веществ

003454G03

На правах рукописи

ПОДГОРНАЯ ЖАННА ВАЛЕРИЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦВЕТКОВ БАРХАТЦЕВ РАСПРОСТЕРТЫХ (TAGETES PATULA L.) С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Г*. Г , „ „ л- ------

ПЯТИГОРСК 2008 ' ' ........J

003454003

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Пятигорская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор

Оганесян Эдуард Тоникович

Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор

Компанцев Владислав Алексеевич

доктор химических наук, профессор Маршалкгш Михаил Федорович

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 16 декабря 2008 года в 900 часов

на заседании диссертационного совета Д.208.069.01. при ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (357532, Ставропольский край, Пятигорск, пр. Калинина, 11).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава.

Автореферат разослан 10 ноября 2008 г

Ученый секретарь диссертационного совета

Е.В. Компанцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы.

Из всех групп природных соединений, применяемых в медицинской практике, особое место занимают флавоноиды, которые опосредовано через ферментные системы регулируют процессы, определяющие, в первую очередь, состояние клеточной мембраны. Широкий спектр действия флавоноидов объясняется их избирательностью по отношению к активным формам кислорода (АФК): при гиперпродукции АФК они проявляют антиоксидантные свойства, а при низком уровне генерации АФК - прооксидантные. В нормализации окислигельно-восстановительных процессов важное значение имеет функциональное состояние печени. Наилучшими генатопротекторными свойствами характеризуются такие лекарственные препараты флавоноидов, как Кареил (Болгария!. Легален (Франция), Силибор (Украина), Фламин (Украина), Конвафлавин (Украина). К сожалению, в настоящее время из лекарственных препаратов, разработанных в бывшем СССР, в Украине, производяюя только Фламин и Ликвиритон. Лекарственных препаратов на основе флавоноидов в Российской Федерации производится недостаточно по разным причинам, одной из которых является отсутствие соответствующей сырьевой базы.

Поэтому поиск новых сырьевых источников и разработка отечественных желчегонных и гепатопротекгорных средств растительного происхождения является актуальной задачей.

С этой точки зрения большой интерес представляют бархатцы распростертые (Tagetes patula L.), которые характеризуются высоким содержанием каротиноидов, флавоноидов и других биологически активных веществ, но до настоящего времени не нашли применения в официнальной медицине. Известно, что флавоноид из цветков Tagetes patula - патулетин, снижает проницаемость капилляров, обладает гипотензивным и диуретическим действием, проявляет Р-витаминную активность.

На кафедре биологической химии и микробиологии, кандидатом фармацевтических наук Тереховым АЛО. и доцентом Доркиной Е.Г. была изучена гепатопротекторная, антиоксидантная, противовоспалительная и ранозаживляющая активности отдельных флавоноидных фракций, выделенных нами из цветков бархатцев распростертых. Однако для их внедрения в медицинскую практику необходимы более углубленные исследования химического состава цветков

бархатцев, а также изучение влияния основных биологически активных веществ на биохимические процессы.

Поэтому актуальным является химическое и биохимическое обоснование использования цветков бархатцев распростертых в качестве источника для получения суммарных флавоноидных комплексов, оказывающих благоприятное влияние на гепатобилиарную систему.

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы является исследование химического состава цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) и разработка рациональных путей получения из них индивидуальных соединений, а также суммарных фракций, обладающих желчегонной и гепатопротекторной активностью.

Для реализации поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач:

изучить качественный и количественный состав основных групп биологически активных соединений цветков Tagetes patula L.;

использовать методы избирательной экстракции для получения отдельных фракций и изучить их химический состав;

разработать препаративные способы выделения индивидуальных флавоноидов из цветков бархатцев распростертых с целью последующего их использования в качестве стандартных образцов для аналитических целей; обосновать целесообразность использования патулетина как стандартного образца для количественного определения флавоноидов в цветках бархатцев распростертых:

определить основные диагностические признаки цветков Tagetes patula L. Научная новизна

Изучен химический состав основных биологически активных веществ цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.).

Впервые доказано, что основными флавоноидами в них являются патулетин и патулитрин, а также рутин, робинии, дигидрокверцетин, кверцетин, гиперозид, виценин, лютеолин-7-гликозид, агшгенин, внтексин.

В цветках бархатцев распростертых впервые установлено наличие двух веществ кумариновой природы - дигидрокумарина и умбеллиферона.

Изучен витаминный и аминокислотный состав цветков бархатцев и показано наличие лейцина, глутаминовой и аспарагиновой кислот, каротиноидов, токоферолов и кислоты аскорбиновой.

Установлено содержание в цветках Tagetes patula L. водорастворимых полисахаридов, пектиновых веществ, гемицеллюлозы А и гемицеллюлозы Б. Впервые изучена сорбционная способность пектинового комплекса бархатцев распростертых.

Элементный состав цветков бархатцев, в основном, представлен макроэлементами.

Изучена заьпСилилль систова извлечений, полученных из uncíкои бархащев распростертых, от свойств растворителя и показано, что:

- С02-экстракт представлен токоферолом, аминокислотами (лизин до 0,3%) и незначительной частью полифенольных соединений;

- в липофильной фракции присутствуют флавонол патулетин, фитостерины и карогиноиды;

- сухой экстракт, полученный экстракцией спиртом этиловым 70%, характеризуется высоким содержанием полифенольных соединений, а также макро- и микроэлементами;

- очищенный полифенольный комплекс представлен патулетином и его гликозидом - патулитрином.

Учитывая высокое содержание патулетина в сырье и отдельных фракциях нами разработан способ его получения, заключающийся в экстракции цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) безводным хлороформом с последующим концентрированием полученного извлечения и отделением самопроизвольно кристаллизующегося целевого продукта в виде светло-желто-зеленых кристаллов фильтрацией и дальнейшей трехкратной кристаллизацией из спирта этилового 70%.

Экспериментально доказано, что для количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев и различных фракциях целесообразно применение метода спектрофотометрии, а в качестве стандарта патулетина.

Определены основные диагностические признаки бархащеи рас проел ер t ы\ (Tagetes patula L.).

Практическая значимость работы

Разработаны способы получения фармакологически активных фракций: С02- и сухого экстракта, липофильной фракции, очищенного полифенольного комплекса.

Предложен препаративный способ получения стандартного образца патулетина - доминирующего флавоноида цветков бархатцев распростертых, обладающего выраженной желчегонной и гепатопротекторной активностью.

Разработана методика спектрофотометрического анализа для количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на натулетин.

На основании исследований подготовлено информационное письмо для кафедр биологического профиля «Обоснование применения различных фракций из цветков бархатцев распростертых для коррекции экспериментальных гастропатий и гепатозов».

Впедреннс результатов в практику

Технические условия «Цветки бархатцев распростертых (Tagetes patula L.)» и проект ФСП «Бархатен цветки «аигро», пачки, фильтр-пакеты», регламентирующие показатели качес1ва сырья внедрены в практику ОАО «Флора Кавказа» КЧР. что подтверждается соответствующими актами внедрения (от 14.03.2007г).

В настоящее время на кафедре биохимии и микробиологии ПятГФА проводятся углубленные доклинические исследования желчегонной и гепатопротекторной активности патулетина, а также полученных нами суммарных фракций с целью установления механизма действия, что подтверждается соответствующим актом внедрения.

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование использования цветков бархатцев распростертых в качестве источника для получения биологически активных веществ;

- результаты химического исследования качественного и количественного состава цветков бархатцев распростертых;

- препаративные методы выделения отдельных фракций и результаты изучения их химического состава;

- предлагаемый способ получения патулетина и патулитрина;

результаты количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев распростертых в пересчете на патулетин;

диагностические признаки растения бархатцы распростертые (Tagetes patula L.)

Связь задач исследования с проблемами бармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательской работы (НИР) ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава, а также в соответствии с соглашением о выполнении НИР между Федеральным агенством по здравоохранению и социальному развитию и ГОУ ВПО Пятигорской ГФА Росздрава (№06/1049).

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы изложены на 58-й, 59-й, 60-й, 61-й, 62-й и 63-й научных конференциях «Разрабснка, исследование и маркетиш новой фсфм<щещ и ческой продукции« (Пятигорск 2005-2008 гг.). По теме диссертация оиубликоилни о работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 145 страницах текста компьютерного набора и состоит из обзора литературы и 5 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 167 источников, в том числе 70 иностранных; содержит 28 таблиц, 25 рисунков и приложение.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

С целью выбора конкретного сорта бархатцев нами проведено предварительное изучение отдельных сортов на содержание флавоноидных соединений. Образцы сортов Tagetes patula: Tagetes patula cv.Cordoba, Tagetes patula cv.WaildfilI, Tagetes patula cv.Orange, Tagetes patula cv.Pascal, Tagetes patula cv.Ehrenkreuz были любезно предоставлены Ботаническим садом г. Ставрополя. Установлено, что наибольшее содержание флавоноидов характерно для сорта cv.Orange, который использовался нами для последующих исследований.

Определение основных групп биологически активных веществ

Для изучения химического состава цветков бархатцев распростертых сырье последовательно "экстрагировали различными расширителями, что представлено ка схеме 1.

Схема 1 - Фракционирование биологически активных соединений Качественными реакциями установлено, что в хлороформной фракции присутствуют флавоноиды, кумарины, стерины, витамины А и Е, а также производные коричной кислоты; в этанолъном извлечении - флавоноиды, кумарины, кислота аскорбиновая, производные коричной кислоты. В водной фракции обнаружены флавоноиды, сапонины, аминокислоты и углеводы.

Поскольку флавоноиды присутствуют во всех трех извлечениях, то представлялось целесообразным проведение сравнительного хроматографического анализа.

Методами бумажной и тонкослойной хроматографии установлено, что в хлороформной, водной и спиртовой фракциях присутствует одно и то же вещество флавоноидной природы. Помимо этого соединения, в водной фракции присутствует одно, а в спиртовой два вещества флавоноидной природы. Хроматограммы обрабатывали хромогенными реактивами и по совокупности качественных реакций можно сделать вывод, что в анализируемых фракциях присутствуют производные флавонола, а вещество со значением = 0,62 проявляется во всех фракциях.

Количественное содержание суммы флавоноидов в сырье составляет (4,60±0,14)% п пересчете на кверцетин.

Известно, что цветки бархатцев распростертых содержат и другие биологически активные соединения, в связи с чем нами установлен: пминокипотный, витаминный, полисахаридный и макроэлементный состав (таблица 1). Таблица 1 - Содержание биологически активных веществ в цсетках бархатцев распростертых

Витаминный Аминокислотный Полисахар идиый Элементный состав

состав состак COCldB

Токоферолы В наибольшем Водорастворимые Макроэлементы

0,6% количестве: полисахариды 47,0 %

(метод ВЭЖХ) глутаминовая 16,26%, в пересчете на золу;

каротиноиды кислота 1,1% пектиновые вещества

0,005% аспарагиновая 11,87%. Микроэлементы

(метод ВЭЖХ) кислота 0,83% гемицеллголоза А 7,28%

кислоты лейцин 0,95% 0,91% в пересчете на золу.

аскорбиновой гемицеллголоза Б

1,78% 0,55%

(титриметри-

ческий метод)

Получение фракций биологически активных соединений из цветков бархатцев распростертых

В настоящее время одним из способов выделения биологически активных веществ из растительного сырья является экстракция жидким оксидом углерода (IV). В связи с этим нами на базе фирмы ООО «Явента» (г. Краснодар) был получен С02-экстракт цветков бархатцев распростертых с использованием жидкого С02 в докритической области (1 = 26°С и давление — 68У0,' к!!а).

Качественный анализ полученного С02-экстракта свидетельствует о наличии каротиноидов и токоферолов. Хроматографически в этом же экстракте идентифицированы умбеллиферон, а также феруловая и кофейная кислоты.

Последующий качественный анализ шрота бархатцев распростертых после С02-экстракции на основные группы биологически активных веществ показал наличие флавоноидов, каротиноидов, стеринов, кумаринов, аминокислот, производных коричной кислоты, сапонинов и углеводов. Из этого следует, что при зкетракции жидкой углекислотой в докритических условиях, полного истощения сырья от липофилытых компонентов не происходит. Поэтому, с целью извлечения оставшихся в шр01е липофильных веществ для последующей экстракции нами был выбран хлороформ. Экстракцию хлороформом проводили в аппарате Сокслета. При охлаждении хлороформного извлечения в виде кристаллического осадка выделяется вещество I, желто-зеленого цнем, легко растворимое в нлиоле. Данные хроматографического анализа свидетельствуют о том, что обнаруженное вещество является флавонолом, имеющим орто-дигидроксигруппировку в боковом фенильном радикале.

Методом УФ-спектроскопии в присутствии комплексообразующих и ионизирующих добавок было установлено положение заместителей в ядре хромона, что представлено на рис.1 и 2.

УФ-спектр вещества I в метаноле характеризуется двумя основными полосами поглощения с примерно равной интенсивностью и максимумами при длинах волн 260 и 375 нм, что является характерным признаком для агликонов флавонолов.

Рисунок 1 - Спектры поглощения вещества 1 в присутствии комплексообразующих добавок 1) метанольный раствор, 2) с добавкой А1С13; 3) с добавкой А1С1/ВС1

1 п

НМ

Рисунок 2 - Спектры поглощения вещества I в присутствии ионизирующих добавок 1) метанольный раствор; 2) с добавкой СН3СООЫа; 3) с добавкой СН3С00Иа/Н3В03; 4)С.НШ'а

Батохромный сдвиг длинноволновой полосы поглощения на 15 им ара добавлении ацетата натрия к метанольному раствору вещества I указывает на наличие ОН - группы у С7 (рис.1 и 2), а батохромный сдвиг той же полосы на 75 нм в присутствии метилата натрия (рис.2) свидетельствует о наличии ОН - группы у С'4. Батохромный сдвиг длинноволновой полосы на 25 нм под влиянием ацетата натрия и борной кислоты свидетельствует о присутствии 3,4-дигидроксигруппировки в боковом фенольном радикале (рис.2). Гидроксилирование по положениям С3 и С5 подтверждается сильным батохромпым сдвигом этой асе полосы на 60 нм под влиянием безводного хлорида алюминия (рис.2). Величина этого батохромного сдвига практически сохраняется после добавления раствора хлороводородной кислоты.

Таким образом, на основании данных УФ-спектроскопии можно утверждать, что вещество I является флавонолом и имеет свободные гидроксильные группы у С5, С г, С'з и С'4.

Для подтверждения строения вещества I использовали ЯМР-Н'-спектроскопию (рисунок 3).

OCHs В2Д*Е SeCíeo¡aíTW*

дмсо

он«

ОН-Г

OH-»-

Рисунок 3 - ЯМР-Нспектр флавоноида из липофильной фракции цветков Tagetes patilla

В ЯМР Н1 — спектре вещества отчетливо наблюдаются сигпад?-л пяти протонов фенельных гидроксигрупп. четырех протоков ядра флавона и трех протонов метоксигругшы.

На основе анализа полученных данных можно сделать вывод, что из хлороформного извлечения кристаллизуется патулетин. представляющий собой 3.5.7,3',4' - пентагидрокси -6 - метоксифлавон.

Фильтрат, полученный после отделения из хлороформной фракции подвергли дальнейшему исследованию на содержание других биологически активных веществ. Хромате графическими методами здесь установлено наличие каротиноида — виолоксантипа, а также фитостерина.

Шрот, оставшийся после обработки сырья хлороформом, далее сушили и трижды экстрагировали спиртом этиловым 70%, после чего извлечения объединяли, а растворитель удаляли в роторном испарителе до получения густого экстракта. Последний далее сушили под вакуумом до получения сухого остатка.

Для получения очищенной суммы флавоноидов сухой экстракт растворяли в воде при кипячении и, после охлаждения, в делительной воронке обрабатывали этилацетатом. Полученные этилацетатные извлечения объединяли, сгущали и смешивали с трехкратным объемом сухого хлороформа. Выделившийся осадок

полифенолов отделяли и сушили в эксикаторе. Анализ суммы полифенолов осуществляли предварительно методом бумажной хроматографии, который показал, что она содержит шесть веществ: значения И! и хроматографическое поведение 3-х веществ указывают на их идентичность с соединениями, обнаруженными ири изучении спиртового извлечения из сырья. Хроматографически, с использованием стандартных образцов свидетелей фенолкарбоновых кислот, идентифицированы галловая, хлорог еновая и коричная кислоты.

С учетом полученных данных нами разработана технологическая схема получения различных фракций, содержащих преимущественно отдельные группы биологически активных соединений (схема 2).

рш

*"ЖИЛКМЙ СО?

* 4 уплпа

+ этанол

Хл оро фор м ное извлечение

липофнльная

фр ИКНИЯ

ипирто но е извлечение

1 Отгонка

Выпаривание на I этанола

водяной бане 1

сгущеное

Сухой экстракт

извлечение

1+ этил ацетат

Этил ацетатное извне- : чеиие

|ОТГОН1С<1

¡растворителя

Сгущенное» 3 тип ацетатное извлечение

Обработка сухим СНС1е

Схема 2 - Получение различных фракций биологически активных веществ

Все полученные фракции, а также патулетин были подвергнуты биохимическому скринингу. Наиболее активные в отношении гепатобшшарной системы фракции далее были подвергнуты более детальным исследованиям на кафедре биологической химии и микробиологии Пятигорской ГФА. Результаты подробного изучения гепатопротекторной активности и желчегонного действия липофилыюй фракции, сухого экстракта и очищенной суммы полифенолов представлены в диссертационной работе Терехова А.Ю. В дополнение к этому нами установлено, что липофильная фракция стимулирует процессы репаративной регенерации поврежденных под влиянием температуры различных участков кожи. Выявлено также противовоспалительное действие С02-экстракта на модели каолинового отека.

Исследование химического состава различных фракций, полученных из цветков бархатцев распростертых

СОгжетракт. Качественный и количественный состав полифенолов С02-экстракта изучен методом ВЭЖХ. Среди полифенольных соединений преобладаю! флавонопды (лютеолин-7-гликозид, кверцетин, ишексин, дигидрокверцетин, робинин и виценин) и фенолкарбоновые кислоты (галловая, хлорогеновая, коричная, феруловая и цикориевая). Впервые в цветках бархатцах распростертых доказано наличие двух веществ кумариновой природы - дигидрокумарина и умбеллиферона.

Аминокислотный состав представлен в наибольшем количестве лизином (0,3%) и глютаминовой кислотой (0.11%). Витаминный состав СОгэкстракта определяли методом ВЭЖХ. Установлено, что в С02-экстракте содержание витамина Е составляет 0,06%.

Хлороформная фракция. В хлороформном извлечении обнаружены -патулетин (12,5%), каротиноид - виолоксантин и фитостерины. Установлено наличие жирорастворимых витаминов А и Е методом ВЭЖХ., содержание которых составляет 0,01 и 0,29% соответственно.

Очищенный комплекс полифенолов. Изучение химического состава очищенной суммы полифенолов проводили методом препаративной колоночной хроматографии. Элюирование веществ проводили последовательно следующими системами растворителей: гексан. гексан : хлороформ; хлороформ; хлороформ : этиловый спирт. Контроль процесса элюирования осуществляли методом восходящей

БХ в системе БУВ 4:1:5. При использовании системы растворителей гексан : хлороформ в соотношении 3:7, 2:8 и 1:9 установлено, что во всех элюатах присутствует патулетин.

Смесью растворителей хлороформ : этанол в соотношении 9:1 удается элюировать два соединения. По значению Я!", одно из них совпадает с патулетином, а значение Я!'второго вещества значительно меньше.

Изменение соотношения растворителей в системе хлороформ : этанол - 7:3 позволило элюировать преимущественно второй флавоноид (вещество II).

Для установления строения вещества II был проведен количественный кислотный гидролиз. В качестве свидетеля - агликона использовали патулетин. Установлено, что время полного гидролиза составляет 3 часа, а выход агликона составляет около 65%, что свидетельствует о моногликозидном характере вещества. Таким образом, исходное вещество II является мологликозидом патулетина.

Идентификацию углеводного компонента после кислотного гидролиза осуществляли хроматографически с использованием анилинфталатного реактива. Установлено, что в веществе П сахарный остаток представлен глюкозой.

Для уточнения положения гликозидной связи в веществе II использовали УФ-спектроскопию в присутствии ионизирующих и комплексообразующих добавок. Полученные данные подтверждают наличие у гликозида свободных ОН-групп в положениях 3 и 5, а также 3 и 4. Незначительный батохромный сдвиг па 10 им длинноволновой полосы под влиянием ацетата натрия в сравнении с патулетином указывает на гликозидирование по положению С-7. Анализ спектральных характеристик и результаты количественного кислотного гидролиза позволяют сделать вывод, что выделенное вещество II является 7-О-гликозидом патулетина, известным под названием - патулитрин (6-метокси-3',4',3,5,7 -пентагидроксифлавон).

Сухой экстракт. Для изучения полифенолыюго состава сухого экстракта из цветков бархатцев распростертых использовали метод ВЭЖХ. Установлено, что из полифенольных соединений в наибольшем количестве содержатся фенолкарбоновые кислоты - галловая, хлорогеновая и феруловая; из флавоноидных соединений -рутин, робинии, дигидрокверцетин, и гиперозид. Установлено также наличие одного вещества кумариновой природы - дигидрокумарина.

Изучен элементный состав сухого экстракта. Отмечено, высокое содержание макроэлементов: калия (40%), натрия (3%), кальция (2%), магния (3%) и фосфора (3%) в пересчете на золу, а также микроэлементов: железа (0,1%), алюминия (0,1%) и кремния (0,1 %) в пересчете на золу.

Получение стандартных образцов патулетина и патулитрина и их применение для количественной характеристики фракций из цветков Tagetes patilla L.

Обращает на себя внимание тот факт, что на ВЭЖХ - хроматограммах неидснтифицированными 0стаю1ся 2 вещества, характеризующиеся высокой интенсивностью и значительными площадями пиков. С другой стороны в тех же фракциях нами достоверно доказано наличие патулетина и патулитина, содержание которых, судя по хроматограммам, достаточно высокое.

Учитывая вышеизложенное, мы сочли целесообразным разработать технологически доступные способь! препаративного получения этих соединений в индивидуальном состоянии с целью дальнейшего использования их в качестве стандартных образцов.

Патулетин легко выделяется из хлороформного извлечения, а для получения патулитрина целесообразно использовать метод препаративной колоночной хромашграфии. Чистоту патулетина и патулитрина доказывали с помощью двумерной хроматографии.

Полученные образцы патулетина и патулитрина предварительно анализировали методом ВЭЖХ, используя при этом 0,02%-ные растворы каждого соединения. Исследование проволили на кафедре фармацевтической химии ПятГФА. В качестве неподвижной фазы использовали металлическую колонку Luna С-18 размером 4,6*250мм. Подвижная фаза: элюепт А - 2%-ный раствор муравьиной кислоты, элюент Б - ацетонитрил. Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 1 мл/мин. Продолжительность анализа 40 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детектора при длине волны 254 нм. Результаты представлены на рисунке 4.

45б7 81

....... л и -л ,зв)'<«1>м ;] ггу*

) I 1 I I 1 ....................................I-1->-1-1-1-1-1—I—I—г—I—I—*—--1-1-1—1--1—1

О 5 (3 ;5 20 25 30 ш» С "О 23 Ч 4С"«»

А Б

Рисунок 4 - ВЭЖХ - хроматограммы 0,02%-ных растворов патулитрина (А) и патулетина (Б) в этаноле

Как следует из представленных хроматограмм, полученные нами образцы веществ являются хроматографически чистыми и по значениям времени удерживания очень существенно разнятся между собой: для патулетина 26,32 мин, для патулитрина 18,59 мин.

Для большей достоверности полученных нами данных был проведен ВЭЖХ анализ в других условиях на кафедре токсикологической химий ПятГФА. Хроматографическая колонка размером 2*75мм, заполненная обрашенно-фазовым сорбентом РгопюЗП 120-5С Ар. Подвижная фаза: элюент А - 2%-ный раствор муравьиной кислоты, элюент Б - ацетонитрил. Скорость потока - 100мкл/мин, аналитическая длина волны - 254 нм, температура термостата 35°С, градиент от 15% до 60% элюента Б за 20 мин, объем пробы 10 мкл. Результаты представлены на рисунке 5.

4^7

30 мин с

Рисунок 5 - ВЭЖХ - хроматограшлы 0,02%-ных растворов патулитрина (А) и патулетина (Б) в этаноле

Изменение условий ВЭЖХ анализа подтвердили индивидуальность образцов, и различие значений времени удерживания.

На основании полученных данных, можно сделать вывод, что выделенные I нами образцы патулетина и патулитрина являются хроматографически чистыми и могут быть использованы в качестве стандартных образцов для изучения флавоноидного состава растительных объектов методом ВЭЖХ.

Следующим этапом наших исследований явился ВЭЖХ- анализ сухого и С02-экстрактов, а также липофильной фракции и очищенной суммы фенольных ■ соединений с целью определения содержания патулетина и патулитрина. В качестве стандартных образцов использовали 0,02%-ные растворы патулетина и патулитрина. | Анализ проводился на кафедре токсикологической химии ПятГФА.

Наличие патулетина и патулитрина в исследуемых фракциях определяли путем I

СраБНСгШЯ прСМСпИ удерл\НБаНг1л о^лДСО^В СООТьСТСТВу^и^гХ (рршСДИИ СО |

стандартными образцами. !

Анализ позволил подтвердить, что во всех фракциях содержится вещество, | значение времени удерживания которого совпадает с таковым для патулетина. Патулитрин отсутствует в липофильной фракции, но в сухом экстракте содержится в 1 значительном количестве.

Так как патулетин является мажорным флавопоидом цветков бархатцев распростертых, то нами был разработан метод количественного определения флавопоидов данного растения с использованием стандартного образца патулетина. [ С целью разработки оптимальной методики количественного анализа нами предварительно изучены УФ- спектры поглощения этанольных растворов сухого и С02- экстрактов в сравнении с патулетином. Данные УФ - спектров представлены на рис 6.

Рисунок 6 - УФ-спектр растворов патулетина, сухого и СОг - - экстрактов

в этаноле

Сопоставляя спектры поглощения анализируемых растворов, можно сделать вывод, что для них характерны три полосы поглощения: длинноволновая полоса средней интенсивности и высокоинтенсивная коротковолновая полоса. Для всех спектральных кривых характерна и третья, средняя полоса, которая по интенсивности несколько выше длинноволновой полосы. Максимумы полос поглощения растворов сухого и С02-экстрактов практически совпадают с таковыми для патулетина - 370, 260 и 205 нм.

При количественном анализе флавоноидов в аналитических целях обычно используются две полосы - длинноволновая (в интервале 310-470 им) и коротковолновая (в интервале 225-280 нм). Что же касается полосы поглощения в области 200-205 нм, то она относится к бензольному поглощению и не считается характерной для флавоноидов.

Для количественного анализа флавоноидов в бархатцах распростертых и 01 дельных фракциях в качестве аналитической нами выбрана длинноволновая полоса с максимумом 370 нм, поскольку именно она в наибольшей степени чувствительна к большинству комплексообразующих и ионизирующих добавок. Как правило, у всех флавоноидов, образующих комплекс с А1С13, в УФ-спектре наблюдается батохромный сдвиг максимума 1-й полосы поглощения на 60-75 нм. С учетом этих особенностей в предлагаемой нами методике определения также использована реакция комплексообразования с алюминия хлоридом, но в качестве стандарта использован патулетин.

Предлагаемая нами методика количественного анализа флавоноидов в цветках бархатцев распростертых включает следующие последовательные операции:

- 10,0 г цветков бархатцев распростертых (точно измеренная масса) в аппарате Сокслета исчерпывающе экстрагируют бензолом;

- высушенное после бензола сырье далее следует экстрагировать спиртом этиловым 96% в соотношении сырье : экстрагент - 1:5; кратность экстракции -3 в режиме кипения растворителя в течение 60 минут;

- объединенные этанольные извлечения фильтруют через беззольный бумажный фильтр, после чего этанол частично отгоняют и получаю г 100 мл (точно

измеренный объем) анализируемого раствора, с которым и проводятся все последующие операции.

Результаты количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на патулетин представлены в таблице 2.

Таблица 2- Содержание флавоноидов в цветках бархатцев и отдельных фракциях

(п-5)

Цветки бархатцев распростертых СОг-экстракт Сухой экстракт Липофидьная фракция

Сумма флавоноидов, % 9,51 2,51 15,69 12,48

9,47 2,48 15,76 12,50 12,36

9,40 2,50 15,80

9,37 2,49 15,89 12,40

9.42 2,53 15,85 12,53

Метрологические характеристики Хср= 9,43, S=0,0559, SXcp=0,0250, АХ=0,07. е=0,74% Хер= 2,511, S=0,0!92, SxcP=0.0086 , ДХ=0,02, Е=0.96% ХСр= 15,8, 5=0,0779, SXcp=0,0348 ,ДХ=0,10, £=0,61% Хср= 12,45, S=0.0712, SXcp=0.0319. ЛХ=0,09, £=0,71%

Микро-диагностические признаки цветков бархатцев распростертых

С учетом возможной перспективы использования цветков бархатцев распростертых в качестве источника получения гепаюзащитного и желчегонного средств, а также стандартных образцов патулетина и патулитрина нами, совместно с преподавателем кафедры ботаники ПятГФА Жемчуговой И.В., проведены исследования с целью установления микро-диагностических признаков сырья, на основании которых оформлены ТУ «Цветки барахатцев распростёртых Tagetes patula» и проект ФСП «Бархатцев цветки «ангро», пачки, фильтр-пакеты». Оформление проекта ФСП и ТУ проведено в соответствии с требованиями ОСТ 91500.05.001-00 от 01.11.01 «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения». Результаты основных показателей норм качества цветков бархатцев распростертых представлены в таблице 3.

Таблица 3 — Показатели норм качества цветков бархатцев распростертых

Tagetes patula

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки ГФ XI, вып 1 Соответствует ФСГ1

Микроскопия ГФ XI, вып 1 Соответствует ФСП

Качественные реакции

- флавоноиды хроматография Соответствует ФСП

цианидиновая проба Соответствует ФСП

-каротиноиды взаимодействие со SbCb Соответствует ФСП

Числовые показатели

Цельное сырье

- флавоноидов в пересчете на иагулетин, %, спектро фотометрия Не менее 9,4

- каротиноиды в пересчете на Р-каротин, мг/% спектрофотометрия Не менее 80,8

- влажность, % ГФ XI, вып 1 Не более 5.0

- золы общей, % ГФ XI. вып I Не более 9,0

-золы, нерастворимой в 10% рае-шоре

хлористоводородной кислоты, % ГФХ1, вып 1 Не более 1,8

- остатков цветоносов, в том числе отделенных

от корзинок при анализе % ГФ XI, вып 1 Не более 6

- корзинок с полностью осыпавшимися

язычковыми и трубчатыми цветами

(цветоложе с корзинкам"), % - побуревших корзинок, % - других частей растения (кусочков стеблей, ГФХ!, вып 1 ГФ XI, вып I Не более 20 Не более 3

цветоносов, листьев и плодов семянок), % - органической примеси, % - минеральной примеси, % ГФХ1, вып 1 ГФ XI, вып 1 ГФ XI, вып 1 Не более 10 Не более 0,5 Не более 0,5

Общие выводы

1. Впервые доказано, что в цветках бархатцев распростертых наряду с известными флавоноидами патулетином и патулитрином содержатся рутин, робинии, дигидрокверцетин, кверцетин, гиперозид, виценин, лютеолин-7-глюкозид, апигенин, витексин.

2. Разработан способ получения патулетина - стандарта, заключающийся в экстракции сырья хлороформом и последующей очистки путем перекристаллизации из спирта этилового 70%.

3. Предложена методика выделения индивидуального флавонол-гликозида -патулитрина из извлечения, полученного экстракцией цветков бархатцев спиртом лиловым 70%.

4. Изучено содержание флавоноидов в цветках бархатцев 'распростертых, липофилыюй фракции, С02 -, сухом экстракте и установлено, что сумма флавоноидов в пересчете па патулетин составляет 9,43, 12,45, 2,5 и 15,8% соответственно.

5. Изучен аминокислотный состав цветков бархатцев распростертых: общее содержание свободных и связанных аминокислот составляет 8,95%, из которых в наибольшем количестве содержатся глютаминовая кислота (1,1%), лейцин (0,95%) и аспарагиновая кислота (0,83%).

6. Содержание макро- и микроэлементов в сырье составляет 47,0 и 7,28% (в пересчете на золу) соответственно.

7. Витаминный состав представлен каротиноидами 0,005%, токоферолами 0,6% и кислотой аскорбиновой 1,78%.

8. В полисахаридном комплексе на долю водорастворимых полисахаридов приходится 16.26%, пектиновых веществ 11.87%, i емицеллюлозы А 0,91% и гемицеллюлозь: Б 0,55%.

9 R сухом экстракте методом ВЭЖХ обнаружены фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикорисвая, феруловая, коричная кислоты; ку марины - дигидрокумарин.

10. Состав С02-экстракта представлен фенолкарбоновыми кислотами (галловой, хлорогеновой, кофейной, пикориевой, феруловой, коричной), кумаринами (дигидрокумарин и умбеллиферон), аминокислотами (лизин - 0,3% и глутаминовая кислота - 0,11%), витаминами (токоферолы - 0,06 %).

11. Установлено, что помимо патулетина в липофильной фракции содержатся жирорастворимые витамины: токоферолы - 0,29%, а каротиноиды - 0,01%.

12. Определены основные микро-диагностические признаки цветков Tagetes patula L. cv Orange, на основе которых разработана нормативная документация (ТУ и проект ФСГ1 на цветки бархатцев распростертых).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Аминокислотный и витаминный состав цветков бархатцев Tagetes patula L.

/Научное обозрение. - 2008. - № 2. - С. 7-8. (Соавт. И.В. Гранкина)

2. Выделение различных субстанций из бархатцев отклоненных (Tagetes patula) и изучение их биологической активности/ Человек и лекарство: тез. докл. 12 Рос. нац. конгр. 18-22 апр. 2005 г. -М., 2005. - С. 564. (Соавт. АЛО. Терехов).

3. Изучение химического состава С02-экстракта Tagetes patula L., и его фармакологической активности/ Известия высш. учеб. заведений. Сев.-Кавк. регион. Естественные науки. Спецвыпуск. Фармакология. - 2006. - С.23-24. (Соавт. И.В. Гранкина, Ю.А. Огурцов).

4. Изучение химического состава цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.)/ Известия Самарского научного центра РАН. Спец. вып. «XII конгр. Экология и здоровье человека». - 2007. - Т.2. - С. 188-190. (Соавт. Э.Т. Оганесян, О А, Андреева).

5. Полисахариды цветов бархатцев о i клоненных (Tagetes patula Т..)/ Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики: материалы регион, науч.-практ. конф. с междунар. участием. 15 декабря 2006, Курск: КГМУ, 2006. - С. 304-306. (Соаш. Э.Т. Оганесян, O.A. Андреева, З.М.

I 1..^.А 1/Л ТI !----------\

Iiv^/uw/in, fblV. [1 lo 1 J J Ulli

6. Получение липофильной фракции из цветков Tagetes patula, ее качественный состав и изучение антиаритмической активности/ Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2005. - 18 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 31.01.06. № ПО-в-Об. (Соавт. Э.Т. Оганесян, А.О. Андреева, A.B. Крикова, М.А. Оганова, Г.С. Гаранян)

7. Современное состояние исследований биологически активных соединений бархатцев распростертых (Tagetes patula Ь.)/Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2008. - 20 с. - Деп. в ВИНИТИ РАН 21.04.08., № ЗЗб-в-08.

8. Пат. № 2085217 Российская Федерация, МКИ А61 L15/00 К31/74. Способ получения гепатозащитного средства из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.). -№2007110014/15; заявл. 19.03.07; опубл. 30.09.2008, Бюл. № 10. -6с. (Соавт. Э.Т. Оганесян, Е.Г. Доркина, А.Ю.Терехов).

9. Физико-химическое исследование водорастворимого комплекса, выделенного из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.)/ Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / Пятигорская ГФА, 2007. — Вып.62. - С.346-348. (Соавт. Л.П. Мыкоц, Т.А. Савельева, А.Ю. Щетина).

Ол

ПОДГОРНАЯ ЖАННА ВАЛЕРИЕВНА

ИССЛЕДОВАНИЕ ЦВЕТКОВ БАРХАТЦЕВ РАСПРОСТЕРТЫХ (TAGETES PATULA L.) С ЦЕЛЬЮ ПОЛУЧЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

15.00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Подписано к печати г., формат 60 х 84 1/16

Бумага книжно-журнальная. Печать - ротапринтная. Усл. печат. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ОБРАЗОВАТЕЛЬНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ ВЫСШЕГО ПРОФЕССИОНАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ «ПЯТИГОРСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ ФЕДЕРАЛЬНОГО АГЕНТСТВА ПО ЗДРАВООХРАНЕНИЮ И СОЦИАЛЬНОМУ РАЗВИТИЮ» (357532, г Пятигорск, пр. Калинина, 11)

Оглавление диссертации Подгорная, Жанная Валериевна :: 2008 :: Пятигорск

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. Сведения о химическом составе и фармакологически активных компонентах цветков бархатцев распростертых — Tagetes patula L. (Обзор литературы)

Выводы по главе 1.

ГЛАВА 2. Изучение химического состава цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.)

2.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

2.1.1. Обоснование выбора исходного сырья

2.1.2. Определение основных групп биологически активных веществ в цветках Tagetes patula.

2.1.2.1. Флавоноиды.

2.1.2.2. Витамины А и Е.

2.1.2.3. Кумарины.

2.1.2.4. Стерины.

2.1.2.5. Аскорбиновая кислота.

2.1.2.6. Аминокислоты.

2.1.2.7. Сапонины.

2.1.2.8. Производные коричной кислоты.

2.1.2.9. Углеводы.

2.1.3. Витаминный состав цветков Tagetes patula L.

2.1.4. Аминокислотный состав Tagetes patula L.

2.1.5. Элементный состав цветков Tagetes patula L.

2.1.6. Количественное определение флавоноидов в сырье.

2.1.7. Количественное определение каротиноидов в сырье.

2.1.8. Количественное определение полисахаридов в сырье.

2.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

2.2.1. Хроматографическое исследование флавоноидов.

2.2.2. Определение жирорастворимых витаминов.

2.2.3 Определение аминокислот.

2.2.4. Количественное определение флавоноидов в сырье.

2.2.5. Количественное определение каротиноидов.

2.2.6. Количественное определение полисахаридов.

Выводы по главе 2.

ГЛАВА 3. Получение фракций биологически активных соединений из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.).

3.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

3.1.1. Экстракция жидким СОг.

3.1.2. Экстракция хлороформом.

3.1.3. Экстракция водным этанолом.

3.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.2.1. Получение СОг-экстракта.

3.2.2. Получение хлороформного извлечения.

3.2.3. Получение сухого экстракта.

3.2.4. Выделение очищенной суммы флавоноидов.

Выводы по главе 3.

ГЛАВА 4. Исследование химического состава различных фракций, полученных из цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.).

4.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

4.1.1. Изучение С02-экстракта.

4.1.1.1. Полифенольный состав.

4.1.1.2. Аминокислотный состав.

4.1.1.3. Витаминный состав.

4.1.2. Изучение хлороформной фракции.

4.1.2.1. Витаминный состав.

4.1.3. Изучение химического состава очищенной суммы флавоноидов.

4.1.4. Изучение химического состава сухого экстракта.

4.1.4.1. Полифенольный состав.

4.1.4.2. Элементный состав.

4.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

4.2.1. Условия проведения ВЭЖХ анализа.

4.2.2. Кислотный гидролиз.

Выводы по главе 4.

ГЛАВА 5. Получение стандартных образцов патулетина и патулитрина и их применение для количественной характеристики фракций из цветков Tagetes pa tula L.

5.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

5.1.1. Приготовление РСО патулетина и патулитрина для ВЭЖХ анализа.

5.1.2. ВЭЖХ анализ.

5.1.3. ВЭЖХ анализ фармакологически активных фракций, полученных из цветков Tagets patula L.

5.1.4. Разработка метода количественного определения флавоноидов в полученных фракциях и в сырье.

5.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

5.2.1. Методика выделения патулетина из цветков бархатцев распростертых.

5.2.2. Методика выделения патулитрина из цветков бархатцев распростертых.

5.2.3. Условия проведения ВЭЖХ - скрининга.

5.2.4. Методика приготовления РСО патулетина.

5.2.5. Методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев распростертых в пересчете на патулетин.

Выводы по главе 5.

ГЛАВА 6. Стандартизация цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.).

6.1. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

6.1.1. Макроскопический анализ цветков Tagetes patula L.

6.1.2. Морфолого-анатомический анализ цветков Tagetes patula L.

6.1.3. Товароведческие показатели цветков Tagetes patula L.

6.2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

6.2.1. Техника проведения микроскопического анализа.

Выводы по главе 6.

Введение диссертации по теме "Фармацевтическая химия и фармакогнозия", Подгорная, Жанная Валериевна, автореферат

Актуальность проблемы.

Из всех групп природных соединений, применяемых в медицинской практике, особое место занимают флавоноиды, которые опосредовано через ферментные системы регулируют процессы, определяющие, в первую очередь, состояние клеточной мембраны. Широкий спектр действия флавоноидов объясняется их избирательностью по отношению к активным формам кислорода (АФК): при гиперпродукции АФК они проявляют антиоксидантные свойства, а при низком уровне генерации АФК — прооксидантные. В нормализации окислительно-восстановительных процессов важное значение имеет функциональное состояние печени. Наилучшими гепатопротекторными свойствами характеризуются такие лекарственные препараты флавоноидов, как Карсил (Болгария), Легалон (Франция), Силибор (Украина), Фламин (Украина), Конвафлавин (Украина). К сожалению, в настоящее время из лекарственных препаратов, разработанных в бывшем СССР, в Украине, производятся только Фламин и Ликвиритон. Лекарственных препаратов на основе флавоноидов в Российской Федерации производится недостаточно по разным причинам, одной из которых является отсутствие соответствующей сырьевой базы.

Поэтому поиск новых сырьевых источников и разработка отечественных желчегонных и гепатопротекторных средств растительного происхождения является актуальной задачей.

На кафедре биологической химии и микробиологии, кандидатом фармацевтических наук Тереховым А.Ю. и доцентом Доркиной Е.Г. была изучена гепатопротекторная, антиоксидантная, противовоспалительная и ранозаживляющая активности отдельных флавоноидных фракций, выделенных нами из цветков бархатцев распростертых. Однако для их внедрения в медицинскую практику необходимы более углубленные исследования химического состава цветков бархатцев, а также изучение влияния основных биологически активных веществ на биохимические процессы.

Для реализации поставленной цели мы сочли целесообразным решение следующих задач: изучить качественный и количественный состав основных групп биологически активных соединений цветков Tagetes patula L.; использовать методы избирательной экстракции для получения отдельных фракций и изучить их химический состав; разработать препаративные способы выделения индивидуальных флавоноидов из цветков бархатцев распростертых с целью последующего их использования в качестве стандартных образцов для аналитических целей; обосновать целесообразность использования патулетина как стандартного образца для количественного определения флавоноидов в цветках бархатцев распростертых; определить основные микро-диагностические признаки цветков Tagetes patula L.

Научная новизна

Впервые доказано, что основными флавоноидами в них являются патулетин и патулитрин, а также рутин, робинин, дигидрокверцетин, кверцетин, гиперозид, виценин, лютеолин-7-гликозид, апигенин, витексин.

Элементный состав цветков бархатцев, в основном, представлен макроэлементами.

Изучена зависимость состава извлечений, полученных из цветков бархатцев распростертых, от свойств растворителя и показано, что:

- СОг-экстракт представлен токоферолом, аминокислотами (лизин до 0,3%) и незначительной частью полифенольных соединений;

- в липофильной фракции присутствуют флавонол - патулетин, фитостерины и каротиноиды;

- очищенный полифенольный комплекс представлен патулетином и его гликозидом — патулитрином.

Определены основные микро-диагностические признаки цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.).

Практическая значимость работы

Разработаны способы получения фармакологически активных фракций: СОг- и сухого экстракта, липофильной фракции, очищенного полифенольного комплекса.

Предложен препаративный способ получения стандартного образца патулетина — доминирующего флавоноида цветков бархатцев распростертых, обладающего выраженной желчегонной и гепатопротекторной активностью.

Разработана методика спектрофотометрического анализа для количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на патулетин.

Технические условия «Цветки бархатцев распростертых (Tagetes patula L.)» и проект ФСП «Бархатцев цветки «ангро», пачки, фильтр-пакеты», регламентирующие показатели качества сырья внедрены в практику ОАО «Флора Кавказа» КЧР, что подтверждается соответствующими актами внедрения (от 14.03.2007г, от 17.04.2008г).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- препаративные методы выделения отдельных фракций и результаты изучения их химического состава;

- предлагаемый способ получения патулетина и патулитрина;

- результаты количественного определения суммы флавоноидов в цветках бархатцев распростертых в пересчете на патулетин;

- диагностические признаки растения бархатцы распростертые (Tagetes patula L.)

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук

Апробация работы и публикации

Основные положения диссертационной работы изложены на 58-й, 59-й, 60-й, 61-й, 62-й и 63-й научных конференциях «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск 2005-2008 гг.). По теме диссертации опубликовано 8 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК. Получен 1 патент.

Объем и структура диссертации

Заключение диссертационного исследования на тему "Исследование цветков бархатцев распростертых (Tagetes patula L.) с целью получения биологически активных веществ"

Общие выводы

1. Впервые доказано, что в цветках бархатцев распростертых наряду с известными флавоноидами патулетином и патулитрином содержатся рутин, робинин, дигидрокверцетин, кверцетин, гиперозид, виценин, лютеолин-7-глюкозид, апигенин, витексин.

2. Разработан способ получения патулетина — стандарта, заключающийся в экстракции сырья хлороформом и последующей очистки путем перекристаллизации из спирта этилового 70%.

3. Предложена методика выделения индивидуального флавонол-гликозида -патулитрина из извлечения, полученного экстракцией цветков бархатцев спиртом этиловым 70%.

4. Изучено содержание флавоноидов в цветках бархатцев распростертых, липофильной фракции, С02 -, сухом экстракте и установлено, что сумма флавоноидов в пересчете на патулетин составляет 9,43, 12,45, 2,5 и 15,8% соответственно.

6. Содержание макро- и микроэлементов в сырье составляет 47,0 и 7,28% (в пересчете на золу) соответственно.

7. Витаминный состав представлен каротиноидами 0,005%, токоферолами 0,6% и кислотой аскорбиновой 1,78%.

8. В полисахаридном комплексе на долю водорастворимых полисахаридов приходится 16,26%, пектиновых веществ 11,87%, гемицеллюлозы А 0,91% и гемицеллюлозы Б 0,55%.

9. В сухом экстракте методом ВЭЖХ обнаружены фенолкарбоновые кислоты: галловая, хлорогеновая, кофейная, цикориевая, феруловая, коричная кислоты; кумарины — дигидрокумарин.

Ю.Состав С02-экстракта представлен фенолкарбоновыми кислотами (галловой, хлорогеновой, кофейной, цикориевой, феруловой, коричной), кумаринами (дигидрокумарин и умбеллиферон), аминокислотами (лизин - 0,3% и глутаминовая кислота - 0,11%), витаминами (токоферолы - 0,06 %).

11 .Установлено, что помимо патулетина в липофильной фракции содержатся жирорастворимые витамины: токоферолы - 0,29%, а каротиноиды - 0,01%.

12.Определены основные микро-диагностические признаки цветков Tagetes patula L. cv. Orange, на основе которых разработана нормативная документация (ТУ и проект ФСП на цветки бархатцев распростертых).

Список использованной литературы по фармакологии, диссертация 2008 года, Подгорная, Жанная Валериевна

1. Аминокислоты фиалки полевой и донника рослого// И.JI. Дроздова и др.// Фармация. 2003. - № 5. - С. 14-15.

2. Антимикробные свойства С02-экстрактов/ А.И. Таран и др.// Пищ. пром-сть. 2002. - № 12. - С.69.

3. Балицкий, К.П. Лекарственные растения и рак/К.П. Балицкий, А.Л. Воронцова. — Киев: Наук, думка, 1982. 373с.

4. Бандюкова, В.А. Применение цветных реакций для обнаружения флавоноидов путем хроматографии на бумаге/В.А. Бандюкова // Растит, ресурсы. 1965. Т.1, вып. 4. - С. 591-596.

5. Бандюкова, В.А. Распространение флавоноидов в некоторых семействах высших растений. Сообщ. 2: сем. Asteraceae. // Раст. ресурсы. 1968. - Т.4, № 1. - С. 138-193.

6. Бандюкова, В.А. Фенолокислоты растений, их эфиры и гликозиды/ В.А. Бандюкова// Химия природ, соединений 1983. - № 3. - С. 263271.

7. Бархатцы эфирномасличные растения// Раст. ресурсы. - 1971. - Т.7, № 4. - С.571-574.

8. Безбородое, A.M. Антибактериальное действие некоторых каротиноидов природного происхождения/ A.M. Безбородов, В.В. Добромыслов// Микробиология. 1965. - Т.24, вып. 6. - С. 697-699.

9. Беликов, В.Г Фармацевтическая химия: в 2 ч/ Беликов В.Г. — изд. 3-е, перераб. и доп. -Пятигорск: ПятГФА, 2003. 713с.

10. Ю.Боголицин, К.Г. Современные тенденции в химии и химической технологии растительного сырья/К.Г. Боголицин// Рос. Хим. журн. (Журн. Рос. Хим. об-ва им. Д.И. Менделеева). 2004. - Т. 28, № 6. - С. 105-123.

11. Бодруг, М.В. Биологические особенности, урожайность и химический состав эфирного масла Tagetes signata parti, при выращивании в

12. Молдавии/ М.В. Бодруг, И.П. Драгалин, П.Ф. Влад// Раст. ресурсы. -1983. Т. 19, вып. 3. - С. 323-327.

13. Бубеичиков, Р.А. Изучение полисахаридов травы фиалки донской/ Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2004. — Вып.59. С. 8.

14. Бубенчиков, Р.А. Изучение состава фенольных соединений фиалки полевой методом ВЭЖХ/ Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров// Хим.-фармац. журн. 2005. - Т. 39, № 3. - С. 31-32.

15. Бубенчикова, В.Н. Изучение флавоноидов травы иссопа лекарственного методом ВЭЖХ/ В.Н. Бубенчикова, Т.В. Сень, Н.Ф. Гончарова// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. — Пятигорск, 2006. -Вып. 61.-С. 7-8.

16. Бунин, В.Н. Биохимия витаминов/ В.Н. Бунин. — М.: Наука, 1982. — С. 119-121.

17. Василенко Ю.К. Биологическая химия: учеб. пособие/ Ю.К.Василенко Пятигорск, 2005. - 418 с.

18. Ветров, П.П. Определение содержания липофильных веществ и суммы каротиноидов в растительном сырье /П.П. Ветров, С.В. Гарная, Л.Г. Долганенко// Хим. фармац.журн. 1989. - Т.23, № 3. - С.23-25.

19. Ветров, П.П. Экстрагирование природных веществ из растительного сярья сжиженными газами/ П.П. Ветров//Технология и стандартизация лекарств: сб. науч. тр. ГНЦЛС. Харьков, 1996. - С. 220-232.

20. Влияние экстрактов девясила (Inula sp.) на показатели фармакодинамики и фармакокинетики этанола у экспериментальных животных/ В.Г. Нарушный и др.// Наркология. 2004. - № 8. - С. 2127.

21. Войткевич, С.А. Эфирные масла для парфюмерии и ароматерапии/С.А. Войткевич. М.: Пищевая химия, 1999. - 282 с.

22. Воробьев, В.Н. Взаимосвязь физических параметров молекул флавоноидов с противоопухолевой активностью/В.Н. Воробьев, Г.К. Никонов, А.В. Юдаев// Вестн. новых мед. технологий 1997. - № 4. -С.73.

23. Выделение и анализ природных биологически активных веществ/ Е.А.Краснов и др.. Томск: Изд-во Том. ун-та, 1987. - 184с.

24. ВЭЖХ в исследовании флавоноидов. Определение рутина./ В.И. Дейнека и др.// Хим.-фармац. журн. 2004. - Т.38, № 4. - С. 23-25.

25. Георгиевский, В.П. Биологически активные вещества лекарственных растений/ В.П. Георгиевский, Н.Ф. Комисаренко, С.Е. Дмитрух -Новосибирск: Наука Сиб. отд, 1980. 156с.

26. Георгиевский, В.П. Физико-химические методы анализа биологически активных веществ растительного происхождения/ В.П. Георгиевский, Н.А. Казаринов, М.О. Каррыев. Ашхабад, 1976. - 156с.

27. Гепатозащитное действие цветков бархатцев / Е.Г. Доркина и др. // Фармация. 2004. - №2. - С. 33-35.

28. Гепатозащитные свойства препаратов из бархатцев распростертых/ Ю.К. Василенко и др.// Хим.-фарм. журн. 1990. - Т.24, № 1. - С. 5356.

29. Дороднева, В.И. Идентификация каротиноидов грецкого ореха методами спектрофотометрии и тонкослойной хроматографии/ В.И. Дороднева//Раст. ресурсы. 1967. - Т.З, вып. 2. - С.266-268.

30. Дроздова, И.Л. Аминокислотный и микроэлементный состав листьев лопуха/И.Л. Дроздова// Фармация. 2004.-№ 3 - С.18-19.

31. ЗАО «Натуральные ингредиенты» Электронный ресурс. — М., 2006. — Режим доступа:http://www.Naturalingredients.ru/products/substance/substance95.html. Загл. с экрана.

32. ЗБ.Изучение гепатозащитного действия различных субстанций из растений рода бархатцы/ Е.Г. Доркина и др.// Человек и лекарство: тез. докл. 9 Рос. нац. конгр. 8-12 апр. 2001 г. М., 2002. - С. 609.

33. Изучение гепатозащитного действия различных субстанций из цветков бархатцев распростертых / Е.Г. Доркина и др. Пятигорск, 2003. - 8с. Деп. в ВИНИТИ РАН 24.06.03.№ 1209-В2003.

34. Изучение гепатозащитного действия суммарного флавоноидного комплекса из цветков Tagetes patula / Е.Г. Доркина, Ю.К. и др.// Регион, конф. по фармации, фармакологии и подготовке кадров (57; 2002; Пятигорск): материалы . Пятигорск, 2002. - С. 159-161.

35. Изучение механизма гепатозащитного действия флавоноидных соединений из растений рода бархатцы / Е.Г. Доркина и др.// Человек и лекарство: тез. докл. 11 Рос. нац. конгресс. 19-23 апр. 2004 г.— М., 2004.-С.783.

36. Изучение состава фенольных соединений донника лекарственного методом ВЭЖХ/ В.Н. Бубенчикова и др.// Хим.-фармац. журн. — 2004. Т.38, № 4. - С. 24-25.

37. Ингибирование обратной транскриптазы ВИЧ-1 фенольными соединениями солодки уральской (Glycyrrhiza uralensis Fish.)/ Т.В. Ильина и др..//Химия в интересах устойчивого развития. 2001. - № 9. - С. 643-644.

38. Исследование микроэлементного состава объектов растительного происхождения/ Д.А. Муравьева и др.// Достижения современной фармацевтической науки и образования практическому здравоохранению: материалы юбил. научн.-практич. конф. Пермь, 1997.-С.224.

39. Касьянов, Г.И. До- и сверхкритическая экстракция: достоинства и недостатки/ Г.И. Касьянов// Пищ. пром-сть. 2005. - № 1. - С. 36-39.

40. Касьянов, Г.И. Технологические основы СОг-обработки растительного сырья/Г.И. Касьянов// М.: Россельхозакадемия, 1994. 132с.

41. Кемпфероловые и кверцетиновые флавоноиды Rosa rugoza/ Z.P. Xiao et al.// Химия природ, соединений 2006. - № 6. - С. 600-601.

42. Кирхнер, Ю.А. Тонкослойная хроматография: в 2 ч./ Кирхнер Ю.А. -М.: Мир, 1981.-Т.2-523 с.

43. Клышев, JI.A. Флавоноиды растений/ JI.A. Клышев, В.А. Бандюкова; JI.C. Анюкина. Алма-Ата: Наука, 1978. - 220 с.

44. Кочетков, Н.К. Химия биологически активных соединений/ Н.К. Кочетков. М., 1970. - 486 с.

45. Кузнецова, Г.А. Кумарины и фурокумарины в растительном мире/Г.А. Кузнецова// Терпеноиды и кумарины/под ред. Г.В. Пугулевского МЛ.: Наука, 1965.-С.З-4.

46. Кушинская, И.Н. Идентификация каротиноидов, содержащихся в сухих плодах шиповника вида R. cinnamomea/ И.Н. Кушинская// Мед. пром-сть. СССР. 1964. - № 4. - С. 38-40.

47. Лигай, Л.В. Изучение полифенолов и полисахаридов некоторых растений сем. мальвовых: дис. .канд. фармац. наук: 15.00.02./ Лигай Лилия Вениаминовна — Спб., 1977. 71с.

48. Логазидзе, Д.С. Жирнокислотный состав цветков Tagetes patula L., культивируемых в Грузии/Д.С. Логазидзе// Приоритеты фармац. науки и практики: материалы заочн. Междунар. конф. М., 2006. — С. 312313.

49. Лукин, Ю.П. Хроматографическое разделение каротиноидов растительного происхождения/Ю.П. Лукин// Хим.-фармац. журн. — 1991. Т.25, № 9. - С. 75-77.

50. Машанов, В.И. Пряно-ароматические растения/В.И. Машанов, А.А. Покровский. — М.: Агропромиздат, 1991. 223с.

51. Мединфа. Медицинская энциклопедия Электронный ресурс. -М., 2008. — Режим доступа: http://medinlkm/dmg/3/455// Загл. с экрана.

52. Методики идентификации различных пигментов и количественного определения суммарного содержания каротиноидов белка ив фитомассе Spirulina platensis (Nords) Geilt/ C.B. Первушкин и др.// Раст. ресурсы. 2002. - Т.38, вып. 1.- С. 112-119.

53. Методы анализа флавоноидных соединений/ В.Г. Беликов и др.// Фармация. 1970. - № 1. - С.66-78.

54. Молчанов, Г.И. Съедобные целебные растения Кавказа/ Г.И. Молчанов. Ростов-н/Д: Изд-во. Рост, ун-та, 1989. — С. 464.

55. Москалева, В.Е. Методы микроскопического исследования лекарственных растений/ Е.В. Москалева//Изучение и использование лекарственных растительных ресурсов СССР: т. Всесоюз.науч.фармац.конф. Баку, 1964. - С.131-134.

56. Муравьева, Д.А. Фармакогнозия: учебник/ Д.А. Муравьева, И.А. Самыкина, Г.П. Яковлев 4-е изд., перераб. и доп. - М.: Медицина, 2002. -656с.: ил.

57. Нащенкова, О.В. Применение биологически активных веществ в лечении возрастной макулодистрофии/ О.В. Нащенкова// Русский мед. журн. 2004. - Т.5, № 2. - С. 253.

58. Никонов, Г.К. Растения и рак/ Г.К. Никонов// Вестн. новых мед. технологий 2003. - № 1, 2 . - С. 109-111.

59. Новые каротиноидсодержащие фитопрепараты/ П.П. Ветров и др.// Провизор. 2000. - № 16. - С. 19-20.

60. Определение полифенольного состава сухого экстракта гребней винограда методом ВЭЖХ/ А.В. Еремина и др.// Хим.-фармац. журн. 2004. - Т.38, № 3. - С. 26-28.

61. OPTO здоровье как награда Электронный ресурс. -М., 2007. — Режим доступа: http://www.ortho.rn/a2:ents/vision/visiomax Han.htm. Загл. с экрана.

62. Петрова, О.А. О фитонцидных свойствах некоторых декоративных растений/ О.А. Петрова// Бюл. главн.бот. сада. 1955. - Вып.21. - С.69-71.

63. Пехов, А.В. Исследование экстракции растительного сырья сжиженными газами и использование полученных продуктов в промышленности: автореф. дис. .канд.технол.наук:15.00.01/Пехов Алексей Владимирович — Харьков. 1968. — 22с.

64. Пехов, А.В. СОг-экстракция/ А.В. Пехов, Г.И. Касьянов, А.Н. Катюжанская// Обзорная информация — М.: АгроНИИТЭИПП, 1992. -35с.

65. Пигулевский, Т.В. Химия терпенов/ Пигулевский Т.В.- JL: Изд-во ЛГУ, 1949-288с.

66. Племенко, В.В. Молекулярная спектроскопия органических соединений для химиков-фармацевтов/ В.В. Племенко, Г.Ш. Бикбулатова Казань, 1988. - 130с.

67. Полисахариды цветков бархатцев отклоненных (Tagetes patula L.)/ Э.Т. Оганесян и др.//Достижения, проблемы и перспективы фармацевтической науки и практики: материалы регион, науч.-практич. конф. Курск, 2007. - С.304-306.

68. Пономарев, В. Д. Экстрагирование лекарственного сырья/ В.Д Пономарев М.: Медицина, 1976. - 204с.

69. Растения целебный источник производства отечественных функциональных продуктов питания XXI века/ A.JI. Казаков и др. — М.: Демиург-Арт, 2005. - 304с.

70. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав и использование/под ред. А.Д. Соколова. — JL: Нева, 1980. — С.16-20.

71. Русский медицинский журнал Электронный ресурс.— М., 2006-2008. — 158с. — Режим доступа: http://www.rmj.ru/articles5178.htm. Загл. с экрана.

72. Самылина, И.А. Фармакогнозия: атлас: учеб. пособие: в 2 т./ И.А. Самылина, О.Г. Аносова. М.: ГЭОТАР - Медиа, 2007. - Т. 1. - 192 с.

73. Сергеева, Н.В. Качественное и количественное изучение каротиноидов в некоторых галеновых препаратах/ Н.В. Сергеева, Н.Д. Захарова// Фармация. 1977. - Т.26, № 1 - С. 34-38.

74. Скурихин, В.Н. Методы анализа витаминов А, Д, Е и каротина в кормах, биологических объектах и продуктах животноводства/ В.Н. Скурихин, С.В. Шабаев. М.: Химия, 1996. - 96с.

75. СС>2-экстракция: материалы научных конф. — Краснодар, 1982. -365 с.

76. Справочник биохимика: пер. с англ. -М.: Мир, 1999. 638с.

77. Справочник по витаминам и минеральным веществам: пер. с англ. — М.: Медицина и питание, 1997. — 320с.

78. Сравнительное изучение антиоксидантной активности витаминов А,Е и Р-каротина/И.В. Кутузова и др.//Фармация. -2004. № 4. - С. 15-18.

79. Стренковская, А.Г. Участие витаминов в регуляции окислительных процессов кожи/ А.Г. Стренковская, Н.П. Рзаева// Актуальные проблемы витаминологии. М., 1978. - Т. 2. - С.38-39.

80. Строев, Е.А. Практикум по биологической химии: учеб. пособие / Е.А. Строев, В.Г. Макаров М.: Высш. шк., 1986. - 231 с.

81. Сур, С.В. Методы выделения, идентификации и определения терпеновых соединений/ С.В. Сур//Хим.-фармац. журн. 1990. - № 5. — С.42-48.

82. Терпило, Н.И. Анатомический атлас лекарственных растений. Киев: Гос. мед. Изд-во УССР. 1961. - 363с.

83. Тонкослойная хроматография флавоноидов/ В.А. Бандюкова и др.// Химия природ, соединений 1973. - № 1. - С.20-25.

84. Трофимова, Н.Н. Функциональная роль каротиноидов желтого пятна сетчатки глаза// Н.Н. Трофимова, П.П. Зак, М.А. Островский// Сенсорные системы. М., 2003. - Т. 17, № 3. - С. 198-208.

85. Установление структуры органических соединений физическими и химическими методами/ под общ. ред. А.Вайсберга: в 2-х т. — М.: Химия, 1967.-Т.2.-531с.

86. Федоров, А.А. Атлас по описательной морфологии высших растений. Цветок./ А.А. Федоров, З.Т. Артюшенко JL: Наука, 1975. — 362с.

87. Флавоноиды фиалки трехцветной/ Р.А. Бубенчиков и др.// Фармация.-2004. -№2.-С.11-12.

88. Флора СССР: в 30-ти томах /под общ. ред. B.JI. Комарова. М.-Л.: Изд-во АН СССЗ.

89. Химический анализ лекарственных растений/ под ред. Н.И. Гринкевича, Л.Н Сафроновича. М.: Высш шк., 1983. - С.8-10.

90. Центр гармоничного общения «Зеленая линия» Электронный ресурс. — М., 2008. — Режим доступа: http://www.slovorit.ш/zdorovie/viziomax.htm. Загл. с экрана.

91. Экстрагирование лекарственного растительного сырья/ А.В. Пехов и др.// Тр. Краснов НИИ Пищ. пром-ти. 1996. - Т.5. С.244-247.

92. A quantum chemical explanation of the antioxidant activity of flavonoids/ Ven Acker S.A. et al. // Chem. Res. Toxicol. 1996. - Vol. 9. -P. 1305-1312.

93. Acylated quercetagetin glycosides with antioxidant activity from Tagetes maxima/ Parejo I. et al.// Phytochemistry. — 2005. Vol. 66, № 19. - P. 2356-2362.

94. An extract of Tagetes lucida and its phenolic constituents an antioxidants / Aquino R et al.//J. Nat. Prod. 2002. - Vol. 65, № 12. - P. 1773-1776.

95. Antimicrobial activity of flavonoids from leaves of Tagetes minima/ Tereschuk M. L. et al.// J. Ethnopharmacol. 1997. - Vol. 56, № 3. - P. 227-232.

96. Antioxidant activity of natural flavonoids is governed by number and location of aromatic hydroxyl groups/ Chem Z.Y. et al.//Chemistry and physics of lipids 1996.-Vol.79.-P. 157-163.

97. Antioxidant capscity and phenolic content of spinach as affected by genetics and maturation/ Pandjaitan N. et al.// J Argic Food Chem. 2005. - Vol. 53, № 22. - P. 8618-8623.

98. Antioxydant and pro-oxidant actions of flavonoids: effects on DMA damage induced by nitric oxide, peroxynitrite and nitroxyl anion/ Ohshima H. et al.// Free Radic Biol Med. 1998. - Vol. 25, № 9. - P. 1057-1065.

99. Arora, A. Structure activity relationships for antioxidant activities of a series of flavonoids in a liposomal system /Arora A., Nair M. G., Strasburg G. M. //Free Radic. Biol. Med. - 1998. - Vol. 24. - P. 1355-1363.

100. Bannerjee, N.R. Isolation and constitution of patuletin/ Bannerjee N.R., Sechardi I.R.// Proc. Indian Acad. Sci. 1957. - Vol. 44, 5, № 15. - P. 1443.

101. Beyer, G. Effects of selected flavonoids and caffeic acid derivatives on hypoxanthine-xanthine oxidase-induced toxicity in cultivated human cells / Beyer, G., Melzig M.F. // Planta Med. 2003. - Vol. 69. - P. 11251129.

102. Biosynthesis of thiophenes in Tagetes patula/ Morgl L. et al.// Phytochemistry. 2001 - Vol. 58, № 6. - P. 875-887.

103. Caffeic acid phenethyl ester (CAPE) analogues: Potent nitric oxide inhibitors from the Netherlands propolis/ Nagaoka T. et al.// Biol. Pharm. Bull. 2003. - Vol. 26. - P. 487-491.

104. Carotinoid composition of marigold (Tagetes erecta) flower extract used as nutritional supplement /Hadden W.L. et al.// J. Argic Food Chem. -1999.-Vol. 47, № 10. P. 4189-4194.

105. Chelating and free rsdical scavenging mechanisms of inhibitoryaction of rutin and quercetin in lipid peroxidation / I. B. Afanas ev et al.// Biochem. Pharmacob. 1989. - Vol. 38. - P. 1763-1769.

106. Cheng, I.F. On the ability of four flavonoids, baicelein, luteolin, neringenin, and quercetin, to suppress the Fenton reaction of the iron ATP complex / Cheng I.F., Breen K. // BioMetals. - 2000. - Vol. 13. - P. 77-83.

107. Chi-Manzanero, B. Extraction of total RNA from a high pigment contect plant Marigold (Tagetes erecta)/ Chi-Manzanero В., Robert ML, Rivera-Madrid R// MolBiotechnol. 2000. - Vol.13. - P. 17-21.

108. Constantinescu, D. Gr. Localisation und Entstehung von Flavonoiden in Tagetes patula L. und Tagetes erectus L. / Constantinescu D. Gr., E. Tarpo, Dihn Due Tien //Studii Cercetari Biol.(Bucuresti). Ser. Biol, veget. -1962.-Vol. 14.-S. 299.

109. Cotelle N. Antioxidant properties of hidroxy-flavones / Cotelle N. et al.// Free Radic. Biol. 1996. - Vol.20. - P. 35-43.

110. Cytotoxicity and lipid peroxidation inhibiting activity of flavonoids / Cos P. et al.// Planta Med. - 2001. - Vol. 67. - P. 515-519.

111. Dean, F.M. Natural occurring oxygen ring compounds/ Dean F.M. -London, 1963.-329 p.

112. Deng, W. Flavonoids function as antioxidants: by scavenging oxygen species or by chelating iron/ Deng W., Fang X., Wu J.// Radiat. Phys. Chem. 1997. - Vol.50. - P. 271-276.

113. Enzymas of the mavalonate pathway in rat liver nodules induced by 2-acetylaminofluorene treatment/ Olsson J.M. et al.// Carcinogenesis. -1995.-Vol. 16.-P. 599-605.

114. Flavonoids as acavengers of nitric oxide raical/ Van Acker S. A. et al.// Biochem. Biophys. Res. Commun. 1995. - Vol. 214. - P. 755-759.

115. Flavonoids as antioxidants: determination of radical-scavenging efficiencies/ Bors W. et al. // Methods Enzymol. 1990. - Vol. 186. - P. 343-355.

116. Flavonoids as peroxinitrte scavengers: the role of the hydroxyl groups / Heijen C.G. et al.// Toxicol, in vitro. 1991.- Vol.15 - P. 3-6.

117. Flavonoids from pegeaphyton scapiflorum/ Zi-yan Li et al.// Химия природ. Соединений 2006. - № 6. - C.597-599.

118. Flavonoids: a review of probable mechanisms of action and potential applications/ Nijveldt R.J. et al.// Am. J. Clin. Nutr. 2001. - Vol. 74. - P. 418-425.

119. Follow-up studies on glycosylated flavonoids and their complexes with vanadium: their anti-hyperglycemic potential role in diabetes /Cazarolii L.H. et al. // Chem. Biol. Interact. 2006. - Vol. 7, № 163(3). - P. 177-191.

120. G1C and GLC-mS analysis of thiophene derivatives in plants and in in-vitro cultures of Tagetes patula L. (Asteraceae)/ Margl L. et al.// Naturforsch 2002. - Vol. 57, № 1,2. - P. 63-71.

121. Gomez, R. Carotenoids from marigold (Tagetes erecta) petals and their esterified fatty acids/ Gomez R., Goni F.M., Macarulla J.M.// Rev. Esp Fisiol. 1978. - Vol. 34, № 3 - P. 253-256.

122. Gonzalez de Mejia E. Antimutagenicity of xanthophylls present in Aztec Marigold (Tagetes erecta) against 1-nitropyrene/ Gonzalez de Mejia E., Loarca Pina G., Ramos - Gomez M. // Mutat Res. - 1997. - Vol. 17, № 389(2-3).- P.219-226.

123. Guan, Ye. Flavonoids of limonium aureum/ Ye Guan, Chenggang Huang// Химия природ.соединений 2006. - № 2. - С. 192-193.

124. Hamzah, A.S. Kaempferitrin from the leaves of Hediotis veryicillata and its biological activity/ Hamzah A.S., Lajis N.H., Sargent M.V. // Planta Med.- 1994. -Vol. 60, № 4. P. 388-389.

125. Hattory, Sh. Glycosides of flavones and flavonols: Geissman Т.А/ Hattory Sh. //The Chemistry of flavonid compounds. 1962. - Vol. 11. - P. 317.

126. Hausen, B.M. Butenylbithiothene, alpha-terthienyl and hydroxytremetone as contact allergens in cultivars of marigold (Tagetes sp.)/

127. Hausen B.M., Helmke В. // Contact dermatitis. 1995. - Vol. 33, № 1. - P. 33-37.

128. Hepatoprotective effect of Epaltes divaricata extract on carbon tetrachloride induced hepatotoxici in mice/ R.P. Hewawaasam et al.//Indian J Med Res 2004. - Vol.120 - P. 30-34.

129. Horhammer, L. Neue Flavonglykozide aus der Kamille (Matricaria chamomilla L.). 3. Mitt. Uber Kompositen-und Papilionateenflavone/ Horhammer L., Wagner H., SalfnerB. // Arzn.-Forsch. 1965. -Bol. 13. - S. 33.

130. Hypotensive and toxicological study of citric acid and other constituents from Tasetes patula roots/ Saleem R. et al.// Arch. Pharm. Res. 2004. - Vol. 27, № 10. - P. 1037-1042.

131. Influence of iron chelation on the antioxidant activity of flavonoids/ Van Acker S.A. et al. // Biochem. Pharmacol. 1998. - Vol. 56. - P. 935943.

132. Inhibition of rat lens aldose reductase by quercetagetin and patuletin/ Li S. et al.// Yan Ke Xue Bao. 1991. - Vol. 7, № 1 - P. 29-33.

133. Inhibitory activity of flavonoids from Prunus davidiana and other flavonoids on total ROS and hydroxyl radical generation/ Jung H.A. et al. // Arch. Pharm. Res. 2003. - Vol. 26. - P. 809-815.

134. Isolation and Characterization of Mutant of Thiophene Synthesis in Tagetes erecta/ Jacobs J.J. et al.// Plant Physiol. 1995. - Vol. 107, № 3. -P. 807-814.

135. Khachik, F. An efficient conversion of (3R, 3 R, 6'R) lutein to (3R, 3'R, 6^)-Ыет (3 '-epilutein) and (3R. 3*R) - zeaxanthin/ Khachik F.// J. Nat. Prod. - 2003 - Vol. 66, № 1. - P. 67-72.

136. Kim, D.O. Comprehensive study on vitamin С eqvivalent antioxidant capacity (VCEAC) of various polyphenolics in scavenging a free radical and its structural relationship/ Kim D.O., Lee C.Y.// Crit. Rev. Food Sci. Nutr. -2004. Vol. 44. - P. 253-273.

137. Kim, S.R. Flavonoids of Inula Britannica prodect cultured cortical cells death induced by glutamate/ Kim S.R. et al.// Free Radic Biol. Med. -2002. Vol. 32, № 7. - P. 356-604.

138. Magnani, L. Spectrophotometric measurement of antioxidant properties of flavones and flavonols against superoxide anion/ Magnani L., Gaudou E M., Hubaud J.C. // Anal. Chim. Acta. 2000. - Vol. 411. - P. 209-216.

139. Mckay, D.L. A revier of the bioactivity and potential health benefits of Chamomile tea (Matricaria recutita L.)/ Mckay D.L., Blumberg J.B.// Phytother Res. 2006. - Vol. 20, № 7. - P. 519-530.

140. Pankajamani, K.S. Survey of anthoxanthins/ Pankajamani K.S., Seshdri T.R. // J. Scient. and Industr. Res. 1957. - Vol. 14. - P. 93.

141. Park, E.J. Acylated flavonol glycosides from the flower of Inula Britannica/ Park E.J., Kim Y., Kim J. // J. Nat. Prod. 2000. - Vol. 63, № 1. -P. 34-36.

142. Potapovich, A.I. Comparative study of antioxidants properties and cytoprotective activity of flavonoids/ A.I. Potapovich, V.A. Kostyuk// Biochemistry.-2003. Vol.68, № 5.- P. 514-519.

143. Protective effect of natural flavonoids on rat peritoneal macrophages injury caused by asbestos fibers/ V.A. Kostyuk et al.// Free Radic. Biol. Med. 1996. - Vol.21. - P. 487-493.

144. Quantitative structure activity relationship analysis of phenolic antioxidants/ Lien E.J. et al.// Free Radic. - Biol. Med. - 1999. - Vol.26. -P. 285-294.

145. Rajasekaran, T. Production of thiophenes from callus cultures of Tagetes Patula L. and its mosquito larvicidal activity/ Rajasekaran Т.,

146. Ravishanakan G.A., Reddy B.O. // Indian J. Exp Biol. 2003. - Vol. 41, №1.- P. 63-68.

147. Rice-Evans, C.A. Antioxidant properties of phenolic compounds/ Rice-Evans C.A., Miller N.J., Paganga G. // Trends Hant Sci. 1997. - Vol.2.-P. 152-159.

148. Sankara Subramanian, S. Flavonoide der Bliiten von Gauzuma tomentosa und Delonix elata/ Sankara Subramanian S., M. Narayana Swamy// Curr. Sci. 1964. - Vol. 32. - P. 308.

149. Screening of the influence of flavonoids on lipoxygenaae and cyclooxygenase activity, as well as on nonenzymic lipid oxidation/ Robak J. et al.// Pol. J. Pharmacol Pharm. 1988. - Vol. 40, №5. - P. 451-458.

150. Sichel, G. In vitro scavenger activity of some flavonoids and melanins against 02"/Sichel G.H Free Radic. Biol. 1991. - Vol.l 1.-P. 1-8.

151. Sinner, M. The chromatographic behavior of polysaccharides/ Sinner M, Puis J.J.// J. Chromatogr. 1978. - Vol. 156, № 1. - P. 194-204.

152. Structural dependence of flavonoid interactions with Cu ions; implications for their antioxidant properties / Brown J.E. et al. // Biochem. J.- 1998.-Vol. 330.-P. 1173-1178.

153. The structure activity relationship of flavonoids as scavengers of peroxynitrite/ Choi J.S. et al.// Phytother. Res. - 2002. - Vol. 16. - P. 232235.

154. Tordera, M. Influence of anti-inflammatory flavonoids on degranulation and arachidonic acid release in rat neutrophils/ Tordera M., Ferrandiz M.L., Alkaraz M.J. // Z NaturforschC. 1994. - Vol. 49, № 3. -P. 235-240.

155. Webner, J. Die Rohstoffe des Pflanzenreichs/ Webner J. // Leipzig. — 1927.-Bol. l.-S. 164.

156. Yochino, M. Interaction of iron with poliphenolic compounds: application to antioxidant characterization/ Yochino M., Murakami K. // Anal. Biochem. 1998. - Vol. 257. - P. 40-44.