Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсилогическое исследование циклометиазида

РГЗ од

О 2 ИЮН 1997 на правах рукописи

КИБЕЦ ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЦИКЛОМЕТИАЗИДА

15.00.02. - фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата фармацевтических наук

Москва-199 7

Работа выполнена в Курском государственном медицинском университете.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук,

профессор Квач A.C. Официальные оппоненты: доктор фармацевтических

наук, профессор Карташов B.C. доктор фармацевтических наук, Саломатин Е.М. Ведущая организация: Пятигорская государственная

фармацевтическая академия

, Защита состоится 1997 г. в

" 14 " час. на заседании диссертационного Совета Д-074.05.06 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова (г.Москва, Никитский бульвар,13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московской медицинской академии (Зубовский бульвар, 1).

Автореферат разослан "_£&_" схmali^S 1997 г.

Ученый- Секретарь Специализированного Совета, кандидат фармацевтических наук,, доцент

Н.П. Садчикова

ОБ1ЦАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность темы . Циклометиазид - лекарственное средство нашедшее широкое применение в медицинской практике для лечения нарушений сердечно-сосудистой системы, отеков различной птншюпш , заболеваний почек и печени.

Анализ литературных данных показал , что несмотря на широкое применение циклометиазида в медицинской практике не исключены случаи проявления его токсического действия ( при передозировке и индивидуальной непереносимости ) , о чем свидетельствуют описанные в литературе случаи острых и хронических отравлений данным препаратом. Несмотря на это в химико-токсикологическом отношении циклометиазид изучен недостаточно. В литературе нет данных о проведении комплексного исследования по изысканию оптимального варианта выделения циклометиазида из объектов биологического происхождения , методы его обнаружения и количественного определения , пригодные для целей химико-токсшсологического анализа разработаны недостаточно также нет сведений о сохраняемости циклометиазида в биологическом материале в процессе его гнилостного разложения .

В связи с указанным выше , разработка метода выделения циклометиазида из объектов биологического происхождения , способов его идентификации и количественного определения з извлечениях из био.чп! пческот материала , химико-токсикшюгичеекое исследование циклометиазида является одной из актуальных проблем токсикологической химии.

Цель и основные задачи исследования. .Целью наших исследований является разработка эффективных методов выделения циклометиазида из объектов биологического происхождения , методов обнаружения и количественного определения препарата , выделенного из биологического материала, пригодных для целей . химико-токсикологического анализа.

Для достижения данной цели мы поставили следующие задачи

разработать чувствительные методы обнаружения циклометиазида , пригодные для целей химико-токсикологического анализа;

установить возможность использования описанных в литературе реакций идентификации циклометиазида для его обнаружения в биоматериале при проведении химико-токсикологических исследований,

разработать методы количественого определения циклометиазида , проигодные для целей химико-токсикологического анализа;

- изучить эффективность общепринятых в практике судебно-химического анализа методов изолирования токсикологически важных веществ .применительно к изолированию из биоматериала циклометиазида (методы Стаса-Отто, Васильевой А.А.,Крамаренко В.Ф.);

•г-разработать метод выделения циклометиазида из объектов биологического происхождения;

, - изучить распределение препарата в органах , тканях , биологических жидкостях лабораторных животных , отравленных этим препаратом;

- изучить сохраняемость циклометиазида в трупном материале в процессе его гнилостного разложения.

Научная новизна исследований. Впервые проведено систематическое исследование , посвященное изучению

циклометиазида в химико-токсикологическом отношении. Разработаны оптимальные условия идентификации циклометиазида с помощью цветных реакций,микрокристаллоскопических реакций .метода хроматографии в тонком слое сорбента и ВЭЖХ, пригодные для обнаружения циклометиазида в субстанции и в объектах биологического происхождения.

Разработаны фотоколориметрический и

спектрофотометрический методы количественного определения циклометиазида в субстанции , в лекарственных формах и в объектах биологического происхождения .

Разработан метод количественного определения циклометиазида с использованием ВЭЖХ.

Разработан метод выделения циклометиазида из объектов биологического происхождения.

Изучено распределение циклометиазида в органах и биологических жидкостях лабораторных животных , отравленных этим препаратом , а также влияние процессов гниения на сохраняемость цикломентиазида в печени трупа.

Практическое значение работы. Разработанные нами методики изолирования циклометиазида из биологического материала и последующего обнаружения и количественного определения могут быть использованы в практике лабораторий судебно-медицинской экспертизы при исследовании экспертного материала при отравлении этим препаратом, а также в практике фармакокинетических и клинических лабораторий при исследовании и отработке оптимального режима дозирования циклометиазида.

Материалы исследований по определению циклометиазида в

объектах биологического происхождения внедрены в практику Курского Бюро СМЭ (акт внедрения N 57 от 30.09.96 г.),"Методические указания к лабораторно-практическим занятиям по ВЭЖХ (элективы) (определение производных бензотиадиазина) внедрены в учебный процесс КГМУ (акт внедрения от 25.11.96)

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета по проблеме "Фармация"(№ гос. регистрации 01.9.30009254)

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на:

- конференциях молодых ученых и студентов Курского государственного медицинского университета ( Курск , 1993 , 1994 ),

- на 3 международной конференции студентов и молодых ученых "Актуальные вопросы современной медицины"(Бишкек.Кыргызстан,1996);

- юбилейной конференции , посвященной 60-летию Курского государственного университета ( Курск ,1995 );

на Всероссийской конференции "Проблемы химии и химической технологии " ( Курск, КГТУ, 1995 );

- на заседании кафедры аналитической и токсикологической химии совместно с проблемной комиссией фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета (Курск, 1996 ).

По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе получено положительное решение ВНИИГПЭ о выдаче патента на изобретение "Способ количественного определения циклометиазида" (Авт. заявка №94045817/ 25 (045442 от 27.12.94 г.)

\

На защиту выносятся следующие результаты исследований и их теоретическое обоснование:

-методы обнаружения и количественного определения циклометиазида в субстанции,лекарственных формах,объектах биологического происхождения;

-методы изолирования циклометиазида из обьектов биологического происхождения;

-метод очистки полученных биоизвлечений;

-результаты изучения распределения циклометиазида в органах подопытных животных;

-результаты изучения сохраняемости циклометиазида в биоматериале в процессе его гнилостного разложения.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 175 страницах машинописного текста, содержит 52 таблицы, 11 рисунков, состоит из введения, 4 глав, общих выводов, списка литературы, включающего 120 источников, из них 62 на иностранном языке.

Содержание работы. Во введении отражается актуальность, научная новизна и практическое значение исследований, определены их цели и задачи.

В обзоре литературы даны физико-химическая характеристика циклометиазида,анализ существующих методов определения циклометиазида в лекарственных формах и объектах биологического происхождения, отражены фармакологические и токсические свойства циклометиазида.

1.0бнаружение цикломстиазида.

Циклометиазид - 3-циклопентил-6-хлор-7-сульфамоил-3,4-дигидро-1,2,4-бензотиадиазин-1,1 -диоксид.

Для идентификации циклометиазида применяются реакции осаждения и цветные реакции . Однако область применения этих реакций, как правило, ограничена обнаружением циклометиазида в чистом виде и в лекарственных формах.

Возможность применения, описанных в литературе реакций для обнаружения циклометиазида в химико-токсикологическом анализе не исследована, поэтому мы задались целью проверить их пригодность для данных целей, а также разработать новые более чувствительные реакции обнаружения циклометиазида, выделенного из объектов биологического происхождения.

Для идентификации циклометиазида нами предложены микрокристаллоскопические реакции с 5% раствором дихромата калия, насыщенным раствором пикриновой кислоты,5% раствором

соли Мора,5% раствором иодида калия,1% раствором нитропруссида натрия, реактивом Вагнера. Предложенные нами реакции можно использовать для обнаружения циклометиазида в вытяжках из биологического материала , после их очистки от белков и эндогенных аминов, предложенным нами способом. Данные по определению чувствительности микрокристаллоскопических реакций обнаружения циклометиазида представлены в таблице N1.

Таблицах? 1

РЕЗУЛЬТАТЫ ИДЕНТИФИКАЦИИ ЦИКЛОМЕТИАЗИДА МИКРОКРИСТАЛЛОСКОПИЧЕСКИМИ РЕАКЦИЯМИ.

№ Используемый реактив Чувствительность реакции

открываемый минимум (мкг) предельная концентрация

1. 5% раствор дихромата калия 10 1:100000

2. Насыщенный раствор пикриновой кислоты 10 1:100000

3. 5% раствор соли Мора 10 1:100000

4. 5% раствор йодида калия 10 1:100000

5. 1% раствор нитропруссида натрия 50 1:20000

6. Реактив Вагнера 100 1:10000

Для обнаружения циклометиазида в чистом виде, в лекарственных формах и в вытяжках из биологического материала (после их очистки) нами предложена реакция образования азокрасителя из продукта кислотного гидролиза циклометиазида. В качестве азокомпонентов реакции использовали производные родапина: 3-а,у -дикарбоксипропилроданин, 3-а,Р~

дикарбоксиэтилроданин,3-Р-карбоксиэтилроданин. Гидролиз

циклометиазида проводили путем нагревания его в 4 н. растворе соляной кислоты в течение 20 минут.

Предел обнаружения циклометиазида данной реакцией составляет 4 мкг в 1 мл. Вещества, содержащиеся в вытяжках из

биологического материала и в моче, мешают обнаружению циклометиазида данной реакцией, поэтому предложенная реакция пригодна для обнаружения циклометиазида в данных объектах после очистки их предложенным нами методом микроколоночной сорбционной хроматографии на полиамидном сорбенте.

Нами разработаны методики идентификации циклометиазида с помрщью метода тонкослойной хроматографии на пластинках Силуфол иУ-254. Детекцию пятен циклометиазида проводили в парах йода. Циклометиазид обнаруживается в виде бурых пятен..

Предлагаемые нами системы растворителей и величины Ш:, рассчитанные по результатам проведенных исследований, приведены в таблице №2.

Предложенная ТСХ- методика использована для идентификации циклометиазида в вытяжках из биологического материала, полученных и очищенных, предлагаемым нами методом. Значения 1И циклометиазида, выделенного из биологического материала совпадают со значениями стандарта.

Таблица №2

ЗНАЧЕНИЯ К£ И Не ЦИКЛОМЕТИАЗИДА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПРИМЕНЯЕМЫХ СИСТЕМ РАСТВОРИТЕЛЕЙ

№ Систека растворителей Р^ циклот метиазида Иб по гипотиазиду

1. " Хлороформ-метанол (1:1) 0.42 0.54

2. Этилацетат-метанол-ледя ная уксусная к-та (85:10:1) 0.65 1.02

3. Хлороформ-этанол-ледяная уксусная к-та (2:1:0,5) 0.48 0.62

4. Гексан-ацетон (2:1) 0.20 1.25

В литературе имеются сведения о применении метода ВЭЖХ для идентификации циклометиазида. Однако существующие методики не получили широкого распространения в области химико-

токсикологического анализа в связи с тем, что были разработаны с использованием сложной аппаратуры, не обладали достаточной чувствительностью, экспрессностью.

Мы разработали методику определения циклометиазида с использованием отечественного хроматографа Милихром-4, а также исследовали возможность ее применения для обнаружения циклометиазида в объектах биологического происхождения.

В своей работе мы использовали колонки КАХ-4 длиной 64 мм-и внутренним диаметром 2 мм, заполненные обращенно-фазным сорбентом Сепарон С18 с диаметром зерен 5,0 мкм и эффективностью около 4600 теоретических тарелок. Детекцию пиков проводили с помощью УФ детектора при 272 нм. В качестве элюента использовали смесь ацетонитрил: цитратный буферный раствор (рН 3,5),взятых в объемном соотношении 45:55.Идентификация циклометиазида может быть проведена по объему удерживания, относительному удерживанию и методу "добавок".

Предел обнаружения циклометиазида составляет 0,002 мкг в пробе (10 мкл):

2.Количественное определение циклометиазида.

Для количественного определения циклометиазида применяют титриметрические, фотометрические, хроматографические методы анализа. Часть из них обладает недостаточной селективностью, длительностью, часть -сложностью аппаратурного обеспечения, что затрудняет их широкое применение в химико-токсикологическом анализе.

Поэтому разработка чувствительных методов количественного определения циклометиазида, пригодных для использования в фармацевтическом и химико-токсикологическом анализах, является актуальной проблемой.

Разработанный нами фотометрический метод количественного определения циклометиазида, основан на реакции диазотирования

продукта кислотного гидролиза циклометиазида и последующего взаимодействия образующейся соли диазония с 3-замещенными производными роданина. В качестве азокомпонентов реакции нами были исследованы следующие производные роданина: 3-а,у-дикарбоксипропилроданин, 3-а,Р-дикарбоксиэтилроданин, 3-Р-карбоксиэтшхроданин. Нами изучены оптимальные условия проведения гидролиза циклометиазида, оптимальные условия проведения реакции образования азороданина (концентрация раствора нитрита натрия, концентрация раствора азокомпонента, время диазотирования, рН средьО, стабильность полученных окрашенных растворов азороданинов.

Оптическую плотность полученных окрашенных растворов азороданинов измеряли с помощью фотоэлектроколориметра КФК-2 при Лэфф.=490±10 нм в кювете с толщиной рабочего слоя 50,0 мм и с помощью спектрофотометра СФ-46 при длинах волн, соответствующих максимумам полос поглощения данных азороданинов в видимой области спектра в кюветах с толщиной рабочего слоя 10,0 мм и 50,0 мм.

Построены калибровочные графики для фотометрического определения циклометиазида, рассчитаны параметры уравнений прямых, соответствующих прямолинейным участкам калибровочных графиков, удельные и молярные коэффициенты светопоглощения (таблица N3).

В результате исследований в качестве азокомпонента реакции , лежащей в основе метода количественного определения циклометиазида, нами рекомендован 3-а,у-

дикарбоксипропилроданин.

Таблица №3

УРАВНЕНИЯ КАЛИБРОВОЧНЫХ ГРАФИКОВ, КОЭФФИЦИЕНТЫ СВЕТОПОГЛОЩЕНИЯ ОКРАШЕННЫХ _РАСТВОРОВ АЗОРОДАНИНОВ._

Азокомпонент Уравнение калибровочного графика Удельный коэффициент (Е1% ) 1см Молярный коэффициент (81М) 1см

3-а,у-Дикарбоксипроп-илроданин D =0,0036С -0,0127 900,02 3,41*10* .

3-о.Р- Дикарбоксиэтил-роданин D =0,0029С +0,0683 725,01 2,75*104

з-р- Карбоксиэтилро-данин D =0,0035С -0,0289 874,99 3,32«104

Светопоглощение окрашенных растворов азороданинов, полученных на основе 3-а,у-дикарбоксипропилроданина подчиняются закону Бугера-Ламберта-Бера в пределах концентраций от 10 до 50 мкг (при измерении оптической плотности с помощью КФК-2 и СФ-46 в кювете с толщиной рабочего слоя 50,0 мм) и от 50 до 200 мкг (при измерении оптической плотности с помощью СФ-46 в кювете с толщиной рабочего слоя 10,0 мм)в 25 мл конечного фотометрируемого раствора. Стабильность окрашенных растворов не менее 30 минут.

С помощью разработанного фотометрического метода количественного определения циклометиазида нами были проанализированы субстанция и таблетки циклометиазида (по 0,0005 г).ГГо материалам данного метода получено положительное решение ВНИИГПЭ от 21.06.96 Авторская заявка N94045817/25 (045442) от 27.12.94. "Способ количественного определения циклометиазида".

Разработана методика количественного определения циклометиазида методом В ЭЖХ в субстанции и в таблетках.

Сравнительная оценка методов количественного определения циклометиазида в субстанции и таблетках представлена в таблицах №4, №5.

Таблица №4

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИКЛОМЕТИАЗИДА В СУБСТАНЦИИ.

Метрологичес -кие характеристики метода Спектро-фотометрия (видимая область) Фотоколор-и метрия ВЭЖХ Фармакопейный метод

X 98,70% 98,92% 99,42% 97,54%

Б 0,98 1,08 0,59 4,31

Эх- 0,44 0,48 0,26 1,92

АХ 1,22 1,34 0,73 5,35

ё ±1,23% ±1,35% ±0,74% ±5,48%

Х±ДХ 98,70% 98,92% ,99,42% 97,54%

.. ■ ±1,22 ±1,34 ' ±0,73 ±5,35

Относительная , ошибка определения циклометиазида в субстанции составляет ± 0,74%, в таблетках ±0,77%.

Таблица №5

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА МЕТОДОВ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИКЛОМЕТИАЗИДА В ТАБЛЕТКАХ.

Метрологические характеристи ки метода Спектро-фотометрия (видимая область) Фотоколориметрия ВЭЖХ Фармакопейный метод

X 98,24% 97,67% 99,14% 98,29%

Б 0,88 1,54 0,61 1,68

Яг 0,39 0,69 0,27 0,75

дх 1,09 1,91 0,76 2,08

{Г ±1,10% ±1,95% ±0,77% ±2,12%

х±дх 98,24% 97,67% 99,14% 98,29%

±1,09 ±1,91 ±0,76 ±2,08

-153. Выделение циклометиазида из объектов биологического происхождения.

3.1.Выделение циклометиазида из ткани печени.

В связи с тем,что в доступной литературе отсутствуют сведения о методах выделения циклометиазида из органов и тканей организма, нами проверена пригодность описанных в литературе методов выделения токсикологически важных веществ (Стаса-Отто, А.А.Васильевой, В.Ф.Крамаренко) применительно к выделению циклометиазида.

В результате проведенных исследований установлено, что классическими методами циклометиазид из биологического материала извлечь не удается. В связи с этим возникла необходимость разработки метода изолирования циклометиазида из объектов биологического происхождения.

Нами исследована зависимость степени выделения циклометиазида из биоматериала от природы и концентрации различных изолирующих жидкостей: растворов серной, соляной, хлорной кислот различных концентраций, 95% этилового спирта, ацетона, 1,4-диоксана. Изучено влияние кратности, длительности настаивания и объема изолирующей жидкости на степень выделения циклометиазида из биоматериала. С учетом проведенных исследований нами разработан метод, основанный на 4-х кратном настаивании (в течение 30 минут каждое) 25 г исследуемой ткани печени с 25 мл 1 н. раствора хлорной кислоты. Дополнительным положительным моментом использования в качестве изолирующей жидкости 1 н. раствора хлорной кислоты является исключение этапа очистки биовытяжки от белков, что ведет к сокращению анализа.

В качестве растворов сравнения мы использовали вытяжки из незатравленного биологического материала, получаемые • в одинаковых условиях с основным опытом.

-16В связи с тем, что биовытяжки "холостых" опытов, очищенные от основной массы белков путем осаждения их хлорной кислотой, при выполнении с ними реакции , лежащей в основе разработанного нами фотометрического метода определения циклометиазида, обладали существенной оптической плотностью для получения более объективных результатов опытов возникла необходимость в разработке метода очистки извлечений из биоматериала и от эндогенных примесей, которые действием хлорной кислоты из вытяжки удалить не удается. Для количественного определения циклометиазида в полученных биоизвлечениях методом ВЭЖХ также необходима дополнительная очистка, так как содержащиеся в биоизвлечениях белковые вещества способны связываться с сорбентами для обращенно-фазной ВЭЖХ, что ведет к выходу из строя колонок.

Нами была исследована возможность очистки биоизвлечений, освобожденных от основной массы белков путем осаждения их хлорной кислотой, от эндогенных примесей методом сорбционной микроколоночной хроматографии с использованием полиамидного сорбента .

При изучении хроматографической подвижности циклометиазида и эндогенных ароматических аминов на полиамидном сорбенте при различных значениях рН нами установлено, что эндогенные ароматические амины элюируются первыми тремя фракциями буферных растворов с рН 2,0-11,0.Десорбция циклометиазида с полиамидного сорбента наиболее полно происходит в интервале рН от 10,0 до 11,0. Таким образом, для очистки биоизвлечений от эндогенных ароматических аминов, микроколонки на которые внесено биоизвлечение из ткани печени с рН 2,0 .содержащее циклометиазид, промывали универсальным буферным раствором с рН 2,0.Десорбцию циклометиазида с полиамидного сорбента проводили 95% этиловым спиртом. Спиртовые элюаты использовали для идентификации и

количественного определения в них циклометиазида разработанными нами методами.

Результаты изолирования циклометиазида из ткани печени (искусственная смесь, содержащая 700 мкг в пробе) представлены в таблице №6.

Таблица №6

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИКЛОМЕТИАЗИДА В ТКАНИ

ПЕЧЕНИ.

Метод определения Метрологические характеристики метода

х% Б Эк ДХ Е% Х±ДХ

Фотометрия 64,39 2,46 1,10 3,05 ±4,74 64,39±3,05

ВЭЖХ 65,28 2,25 1,01 2,79 ±4,27 65,28±2,79

Из данных таблицы №6 следует, что разработанным нами методом из ткани печени можно выделить 64,39% циклометиазида с относительной ошибкой ±4,74%.

3.2.Выделение циклометиазида из биожидкостей организма.

В основу метода определения циклометиазида из крови мы положили разработанный нами метод определения его в биоматериале (печени трупа). Метод изолирования циклометиазида из крови заключается в 4-х кратном настаивании исследуемых проб крови, подвергшейся гемолизу в течение 10 минут , с 1 н. раствором хлорной кислоты, взятых в объемном соотношении 1:1. Продолжительность каждого настаивания - 30 минут. Полученные извлечения подвергали очистке от эндогенных ароматических аминов методом микроколоночной сорбционной хроматографии на полиамидном сорбенте. В полученных спиртовых элюатах определяли содержание циклометиазида разработанным нами фотометрическим методом.

Для сведения к минимуму влияния эндогенных аминов и пигментов на результаты анализа при определении циклометиазида

-18в моче анализируемые пробы необходимо предварительно разбавить не мене чем в 20 раз и затем подвергнуть очистке методом микроколоночной сорбционной хроматографии. Промывать микроколонку с анализируемыми пробами мочи необходимо фосфатным буферным раствором с рН 7,4.

Результаты определения циклометиазида в биожидкостях организма представлены в таблице №7.

Таблица №7

РЕЗУЛЬТАТЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЦИКЛОМЕТИАЗИДА В _БИОЖИДКОСТЯХ ОРГАНИЗМА._

Метрологич- Фотометрический метод ВЭЖХ

еские

характерно -

тики

метода

кровь моча кровь моча

х% 64,52 90,59 64,66 91,22

Б 2,35 2,56 2,26 2,22

Б* 1,05 1,15 1,01 0,99

ДХ 2,92 3,17 2,80 2,76

б" ±4,52% ±3,51% ±4,34% ±3,02%

х±дх 64,52±2,92 90,59±3,17 64,66±2,80 91,22±2,76

Из данных таблицы №7 следует, что разработанным нами методом из крови можно выделить 64,52% циклометиазида с относительной ошибкой ±4,52% и из мочи 90,59% циклометиазида с относительной ошибкой ±3,51%.

4. Распределение циклометиазида в органах и биологических жидкостях подопытных животных. Сохраняемость циклометиазида в биологическом материале.

В литературе мы не нашли сведений о распределении циклометиазида в органах и биологических жидкостях животных.

-19В связи с этим мы задались целью изучить распределение циклометиазида в органах и биологических жидкостях кроликов.

В нашем эксперименте были использованы кролики весом от 2.000 до 3.200 кг , которым в желудок после суточной голодовки с помощью зонда вводили циклометиазид в виде водной суспензии из расчета 1.0 г циклометиазида на 1 кг веса кролика. Через 2 часа после введения циклометиазида кроликов забивали , подвергали •вскрытию и приступали к изолированию циклометиазида и его количественному определению в извлечениях из желудка с содержимым , кишечника с содержимым , почек , печени , легких , сердца , мозга , в моче и крови. Изолирование циклометиазида из биологического материала и биологических жидкостей проводили разработанными нами методами.

В результате изучения распределения циклометиазида в тканях и биологических жидкостях кроликов, отравленных этим препаратом, можно сделать вывод, что при подозрении на отравление циклометиазидом, на химико-токсикологическое исследование следует направлять органы и биожидкости, содержащие наибольшее его количество: желудок с содержимым, кишечник с содержимым, печень, кровь, мочу.

Результаты, полученные при определении циклометиазида в биоматериале фотометрическим методом в результате его гнилостного разложения представлены в таблице № 8.

Как следует из данных таблицы №8 в гнилостном биологическом материале через 15 суток с помощью разработанного нами метода можно найти 10,87% циклометиазида.

Таблица №8

СОХРАНЯЕМОСТЬ ЦИКЛОМЕТИАЗИДА В БИОЛОГИЧЕСКОМ

МАТЕРИАЛЕ В ПРОЦЕССЕ ЕГО ГНИЛОСТНОГО РАЗЛОЖЕНИЯ.

Время хранения (сутки) Метрологические характеристики метода

х% Б Эх ДХ 7% Х±ДХ

1 64,39 2,46 1,10 3,05 ±4.74 64,39± 3,05

5 43,44 1,68 0,75 2,08 ±4,80 43,44± 2,08

10 26,69 1,95 0,87 2,42 ±9,06 26,69± 2,42

15 10,87 1,23 0,55 1,53 ±14,04 10,87± 1,53

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ . \

1. Для обнаружения циклометиазида в чистом виде и в объектах биологического происхождения разработаны микрокристаллоскопические реакции с 5% раствором дихромата калия,5% раствором соли Мора, 5% раствором йодида калия, насыщенным раствором пикриновой кислоты(предел обнаружения-10 мкг/мл), с 1,0% раствором нитропруссида натрия (предел обнаружения-50 мкг/мл), с реактивом Вагнера (предел обнаружения-100 мкг/мл). Разработаны условия обнаружения циклометиазида пс реакции образования азороданина, получаемого при взаимодействии соди диазония продукта кислотного гидролиза циклометиазида с 3-замещенными производными роданина (предел обнаружения-4 мкг е 1 мл).

2.Для идентификации циклометиазида предложен метод тонкослойной хроматографии, выполняемый на пластинках Силуфол

иУ-254 в системах растворителей хлороформ-метанол (1:1), этилацетат-метанол-ледяная уксусная кислота (85:10:1), хлороформ-

этанол-ледяная уксусная кислота (2:1:0,5). Предел обнаружения-0,5 мкг в пробе (0,01 мл). Разработаны оптимальные условия обнаружения циклометиазида методом ВЭЖХ по объему удерживания, по относительному удерживанию и с использованием метода "добавок". Предел обнаружения циклометиазида составляет 0,002 мкг в пробе (10 мкл).

3.Разработан фотометрический метод количественного определения циклометиазида в субстанции и в таблетках на основе реакции образования азороданина, получаемого при взаимодействии диазотированного продукта кислотного гидролиза циклометиазида с 3-сс, у-дикарбоксипропил-роданином. Относительная ошибка фотоколориметрического определения циклометиазида - в субстанции ± 1,73%, в таблетках ±1,98%. Относительная ошибка спектрофотометрического определения циклометиазида в субстанции составляет ±1,37%, в таблетках- ±1,49%.

4.Разработана методика количественного определения циклометиазида методом ВЭЖХ в субстанции и в таблетках. Относительная ошибка определения циклометиазида в субстанции доставляет ±0,74%,в таблетках ± 0,77%.

5.Установлены оптимальные условия выделения, диклометиазида из объектов биологического происхождения. Разработан метод его изолирования из ткани печени и крови с ^пользованием 1 н. раствора хлорной кислоты путем 4-х кратного тстаивания биоматериала в течение 30 минут. Разработан способ »чистки биоизвлечений от эндогенных примесей методом гакроколоночной сорбционной хроматографии на полиамидном орбенте. Предложенным нами методом удается выделить 64,39% [иклометиазида из ткани печени и 63,52% циклометиазида из крови, 'азработан метод выделения циклометиазида из мочи, с помощью оторого удается выделить не менее 90,59% циклометиазида.

6.Изучено распределение циклометиазида в органах, тканях и биологических жидкостях кроликов, отравленных циклометиазидом. Установлено, что наибольшее количество циклометиазида можно определить в желудке с содержимым, кишечнике с содержимым, в печени, крови, моче. Для проведения химико-токсикологической экспертизы при подозрении на отравление циклометиазидом рекомендовано направлять указанные органы и биожидкости.

7.Циклометиазид сохраняется в гнилостном биологическом материале в течение 15 суток. С помощью разработанного нами метода через 15 суток в гнилостном материале можно определить 10,87% циклометиазида.

Сведения о полноте опубликованных научных результатов.

1.Авторская заявка N94045817/25(045442) от 27.12.94. Способ количественного определения циклометиазида //Положительное решение ВННИГПЭ от 21.06.96 /Квач A.C., Кибец В.Н.

/2.Квач A.C., Кибец В.Н. Фотоколориметрическое определение циклометиазида//Актуальные вопросы экспериментальной и клинической медицины и фармации. Материалы юбилейной конференции, посвященной 60-летию Курского государственного медицинского университета.-Курск.-1995.-С.95-96.

3.Квач A.C., Кибец В.Н. Исследование хроматографической подвижности циклометиазида на полиамидном сорбенте //Там же,С.97.

4.Квач A.C., Кибец В.Н. Идентификация циклометиазида методом тонкослойной хроматографии //Материалы Всероссийской научно-технической конференции "Проблемы химии и химической технологии".-Курск,КГТУ.-1995.-С.91-92.

5.Квач A.C., Кибец В.Н. Использование реакции образования азороданина для идентификации циклометиазида //Там же,С.75-70.

| б.Квач , A.C., Кибец В.Н. Зависимость степени выделения

циклометиазида из биологического материала от природы изолирующих жидкостей //Актуальные вопросы современной медицины. Материалы 3 международной конференции студентов и молодых ученых.-Бишкек.Кыргызстан.-1996.-c.84.

7.Квач A.C., Кибец В.Н. Спектрофотометрическое определение циклометиазида в таблетках//Достижения современной фармацевтической науки и практики на рубеже 21 века. Сборник научных трудов, посвященных 30-летию фармацевтического факультета Курского государственного медицинского университета. -Курск,1997.-С.106-108.