Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Химико-токсикологическое исследование анаболических стероидов

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ ХИМИКО-ФАРМАЦЕВТИЧЕСКАЯ АКАДЕМИЯ

р г_т;—од-

На правах рукописи

1

ГОРБАЧЕВА ТАТЬЯНА ВАСИЛЬЕВНА

ХИМИКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ АНАБОЛИЧЕСКИХ СТЕРОИДОВ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Научный руководитель: кандидат биологических наук доцент Е.С. Бушуев

Санкт-Петербург 1996

Работа выполнена в Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Бушуев Е.С.

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук Соломатин Е.М. доктор химических наук Зенкевич И.Г.

Ведущая организация: НИИ токсикологии МЗ РФ

Защита диссертации состоится 997г.

в " часов на заседании специализированного совета Д. 084.63.01. при Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии по адресу: 197376 Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 14.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке СПГХФА (197376, Санкт-Петербург, ул. проф. Попова, 4/6.)

Автореферат разослан '¿¿^декабря 1996г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат фармацевтических наук

АВ- рУсак

Общая характеристика работы

Актуальность темы: В настоящее время накоплено достаточное количество фактов, которые свидетельствуют о том, что длительный прием анаболических стероидов (АС) в больших дозах вызывает эффекты, сходные с алкогольной или наркотической зависимостью, а также маниакальные черты, включая раздражительность, агрессивность, эйфорию. Отмена препаратов нередко вызывает депрессию, которая приводит к суицидцным попыткам. Применение АС может чаще, чем других препаратов привести к жестокому поведению и агрессивности с грандиозными жестокими навязчивыми идеями (H.GJr. Pope, 1994 L. River, 1994).

По исследованиям, проведенным в ¡996г. в Москве и Санкт-Петербурге, от 7 до 38% занимающихся в спортивных секциях пользуются различными стимуляторами. Это значит, что допинговая проблема актуальна и для нашей страны (Толпегин, 1996). Исходя из токсичности АС в 1976г. Международный Олимпийский комитет включил АС, также как все фармакологически близкие соединения, в список веществ, подлежащих допинг-контролю (Допинг и .международный спорт, 1989).

В настоящее время имеются неоспоримые данные о том, что длительное применение АС нередко приаодит к смертельному исходу. Морфологическая картина при летальном исходе недостаточна характерна. Ка исследовании трупов отмечают деградацию жизненно важных органов: сердечно-сосудистой системы, органов желудочно -кишечного тракта, цирроз печени с почти полным распадом. Статистика по данным смертельным случаям затруднена, так как причиной смерти зачастую называют не анаболики, а, например, инфаркт (Толпегин, 1996).

В судебно-химическои плане АС практически не изучены. Клинико- и химико-токсикологическое исследование биологических жидкостей и биотканей на присутствие АС при подозрении на употребление препаратов этой группы, как правило, не проводится ввиду отсутствия методики их изолирования, обнаружения и определения.

Учитывая широкое применение в медицине и спорте, наличие случаев отравления, в том числе и со смертельным исходом, а также отсутствие методических рекомендаций по исследованию биоматериала на присутствие анаболических стероидов, следует считать, что разработка методов выделения, очистки, обнаружения и количественного определения этих лекарственных препаратов в

органах трупов и биологических жидкостях является одной из актуальных проблем современной судебной химии.

Цель и задачи исследования. Целью исследований является разработка методов выделения метандростенолона и метиландро-стендиола из объектов биологического происхождения, обнаружения и количественного определения этих препаратов, пригодных для судебно-химических исследований.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- разработать чувствительные методики идентификации метандростенолона и метиландростендиола при совместном присутствии с помощью различных хроматографических, фотометрических методов;

- разработать чувствительные методики количественного определения метандростенолона и метиландростендиола с применением высокоэффективной тонкослойной хроматографии (ВЭТСХ), высокоэффективной жидкостной хроматогра-фии(ВЭЖХ), УФ-спектрофотометрии;

- изучить пригодность разработанных методов обнаружения и количественного определения для анализа метандростенолона и метиландростендиола, выделенного из объектов биологического происхождения;

- определить оптимальные условия жидкость-жидкостной экстракции метандростенолона и метиландростендиола из водных растворов;

- провести сравнительную оценку методов выделения метандростенолона и метиландростендиола из объектов биологического происхождения;

- изучить закономерность распределение метандростенолона и метиландростендиола в органах экспериментальных животных в условиях моделирования отравления этими препаратами;

- изучить длительность сохраняемости метандростенолона и метиландростендиола в трупном материале при его гниении.

Научная новизна работы. Разработаны оригинальные методы изолирования метандростенолона и метиландростендиола из внутренних органов, позволяющие выделить до 70% метандростенолона и 42% метиландростендиола. Изучено влияние различных факторов на изолирование препаратов из крови и мочи и определены оптимальные условия изолирования. Проведено исследование влияния рН среды, природы органических растворителей в водной фазе на степень экстракции метандростенолона и метиландростендиола из водных растворов и вытяжек из объектов биологического происхождения. Разработанные методы разделе-

ния и идентификации метандростенолона и метиландростендиола, выделенных из биоматерила, пригодные для целей химико-токсикологического анализа, включающие в себя хроматографи-ческие и спектральные методы. Впервые применен метод ТСХ в сочетании с денситометрией для идентификации и количественного определения метандростенолона и метиландростендиола, выделенных из биоматериала. Изучено распределение метандростенолона и метиландростендиола в органах крыс. Впервые изучена сохраняемость препаратов в трупном материале. Даны рекомендации судебно-медицинским экспертам по забору органов для исследования на содержание анаболических стероидов.

Практическое значение работы заключается в том, что разработаны методики выделения метандростенолона и метиландростендиола из биологического материала, методы их разделения, идентификации и количественного определения, которые могут использоваться в практике судебно-химических и судебно-токсикологических лабораторий для идентификации данных препаратов.

Данные по распределению и сохраняемости метандростенолона и метиландротендиола могут быть использованы для обоснованного отбора биологического материала с целью проведения судебно-химнческого исследования на анаболические стероиды.

Разработанная методика выделения, обнаружения и определения метандростенолона и метиландростендиола в биологическом материале внедрена в практику Судебно-медицинской экспертной службы Санкт-Петербурга, Ленинградского Областного Бюро судебно-медицинской экспертизы, 78 судебно-медицнснкой лаборатории Ленинградского военного округа, в учебный процесс Санкт-Петербургской Государственной химико-фармацевтической академии на факультете повышения квалификации и на кафедре фармацевтической химии, в учебный процесс Санкт-Петербургского Государственного медицинского университета им. акад. И.И. Павлова на кафедре судебной медицины с основами правоведения.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены:

- на конференции "Использование современных методов при проведении экспертных исследований" (Москва, 1995)

- на Первой всероссийской конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии" (Санкт-Петербург, 1995)

- на межвузовской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов "Актуальные вопросы теории и практики судебной медицины" (Санкт-Петербург, 1996)

на Международном научно-практическом семинаре "Пробоподготовка и исследование токсических веществ в биологических пробах инструментальными методами анализа"(Санкт -Петербург, 1996)

на Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств" (Санкт-Петербург, 1996)

- на расширенном заседании кафедр Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии (1996).

Публикации. По теме диссертационной работы опубликовано 5 научных работ. Подготовлены методические рекомендации, принятые для апробации.

Объем н структура диссертации. Диссертация изложена на /// страницах машинописного текста и состоит из введения ¿(глав, заключения, выводов, списка литературы, включающего 207 источников, из которых 86 иностранных и приложения.

Содержание работы

1. Идентификация метандростенолона и метиланд-ростендиола.

Метандростенолон (17а-метиландростадиен-1,4-ол-17 -он-3) и

метиландростендиол (17-метиландростен-5-диол-3.17)

относятся к группе андрогешшх анаболические стероидов, являются препаратами отечественного производства и достаточно широко распространены в нашей стране.

Разработана методик?, идентификации метандростенолона и метиландростендиола с помощью метода хроматографии в тонком слое сорбента на различных пластинках.

Исследование проводили на стандартных пластинках: "Силуфол УФ-254", "Алуфол", "Сорбфил УФ-254", "КлеБе^е! 60 И 254" (алюминиевая подложка), "Клевере! 60 Б 254" (стеклянная подложка), "Юеве^е! 60" ( с концентрационной зоной) в 14 одно-компонентных системах. Наилучшие результаты по форме пятен и воспроизводимости значений КГ получены на пластинках "Клевере! 60 Р 254". К достоинствам данных пластинок также относятся наличие люминофора и алюминиевая подложка, что позволяет их нагревать без деформации. На пластинках "Сорбфил-УФ-254", "Силуфол иУ-254" также получены относительно неплохие результаты разделения и формы пятен. Единственным условием ограничивающим использование пластинок "Сорбфил-УФ-254" для количественного определения метандростенолона и метиландростендиола является подложка, которая деформируется при на-

гревании, что затрудняет сканирование пластины. Для работы с извлечениями из биоматериала предложено использовать пластины "Клевере! 60 Б 254" с концентрационной зоной. Основным достоинством пластинок с концентрационной зоной (кроме присущих всем пластинкам "К^е^е! 60 Б 254") является наличие полосы сорбента с более крупным зернением, которая при хроматографи-ровании задерживает высокомолекулярные вещества и таким образом происходит дополнительная очистка извлечения. Наличие концентрационной зоны не влияет на значения И! метандростено-лона и метиландростендиола.

Исходя из экспериментальных данных по определению хро-матографической подвижности анализируемых веществ в одно-компонентных системах были построены "хроматографические диаграммы", позволяющие конструировать новые системы растворителей для получения оптимальных значений КГ препаратов.

Значения КГ метандростенолона и метиландростендиола в этих системах на различных пластинках представлены в табл. 1.

Таблица I

Значения КГ метандростенолона (М) к метшгандростсвдкола (Д) на различных пластинах

№ Система растворителей Значения ИГ

Сорбфил Клевг^е! Силуфол

1. Этилацетат -гептан (3:!) 0,54 0,67 0,48 0,60 0,39 0,48

2. Этилацетат -гексан (3:1) 0,61 0,73 0,56 0,69 0,46 0,55

3. Хлороформ -ацетон (9:1) 0,63 0,50 0,41 0,38 0,50 0,37

4. Хлороформ - изобутанол (9:1) 0,84 0,83 0,67 0,60 0,60 0,53

5. Диэтиловый эфир 0,47 0,57 0,51 0,67 0,55 0,72

Для идентификации метандростенолона и метиландростендиола на хроматографических пластинках при совместном присутствии мы использовали следующие методы:

- облучение УФ-светом (метандростенолон);

- опрыскивание 5% раствором фосфорномолибденовой кислоты в 95% этаноле, с последующим нагреванием пластинки при 100° С -

2 мин. Фон с пластины убирали обработкой последних парами 25% гидроксида аммония (синие пятна метандростенолона и ме-тиландростендиола на белом фоне);

- опрыскивание 2% раствором хлорной кислоты с последующим нагреванием в термостате при 150° С - 7 мин (коричневые пятна метандростенолона и метиландростендиола на белом фоне).

Предел обнаружения метандростенолона и метиландростендиола в зависимости от условий хроматографирования составляет 60 нг метандростенолона и 150 нг метиландростендиола в пробе.

Нами изучены УФ-спектры поглощения метандростенолона и метиландростендиола в 0,1 моль/л растворе соляной кислоты, 0,1 моль/л растворе гидроксида натрия и 95% этиловом спирте. При этом установлено, что метиландростендиол не имеет максимума поглощения ни в одном из указанных растворителей. Мегандро-стенолон имеет максимум поглощения Х=244 нм в 95% этиловом спирте и при А.=250 нм в 0,1 моль/л растворах соляной кислоты и гидроксида натрия. Определены удельные показатели поглощения метандростенолона в 95% этиловом спирте 511+ 5; в 0,1 моль/л растворе соляной кислоты 521+6 и в 0,1 моль/л растворе гидроксида натрия 516+6.

Предел обнаружения метандростенолона в этиловом спирте: 1 мкг в 1 мл раствора.

Гак как метиландростендиол не имеет максимума поглощения в УФ-области спектра, то для его идентификации особую ценность представляет метод спектроскопии в ИК-области. Наиболее характерными полосами поглощения для молекулы метандростенолона являются: 1664 (>С=0 при Сз) и 1624 (>С=С< при С4) см1, а для молекулы метиландростендиола являются полосы: 1056 (-ОН при Сз), 1667 (>С=С< при С5) см-'.

Таким образом, по ИК спектрам достаточно легко различить метандростенолон и метиландростендиол . Метод ИК спектроскопии наиболее подходит для исследования вещественных доказательств, изъятых с места происшествия, в том числе таблеток, порошков.

Нами изучены условия обнаружения метандростенолона и метиландростендиола методом газо-жидкостной хроматографии.

Метандростенолон и метиландростендиол хроматографиро-вали в виде силильных производных.

Преимущества этого метода заключаются в следующем:

а) путем дериватизации можно повысить термическую устойчивость стероидов;

б) дериватизация позволяет значительно снизить необратимую адсорбцию. В фармацевтическом анализе дериватизацию не

проводят, однако в биоклиническом анализе перед хроматогра-фированием почти всегда получают производные тех же стероидов. Необходимость дериватизации вызвана тем, что при фармацевтическом анализе в хроматограф вводят "макропробы", составляющие несколько микрограммов, тогда как в биомедицине размер пробы гораздо меньше - в интервале нанограммовых или пикограммовых количеств. В этом интервале концентраций необратимая адсорбция стероидов с полярными группами (окси-кетогруппы) на активных центрах колонки приводит к серьезным относительным потерям (пики могут полностью исчезнуть). Эту проблему можно разрешить, уменьшив полярность стероидов при помощи подходящей реакции дериватизации;

в) дериватизация во многих случаях позволяет увеличить летучесть стероида и, следовательно, уменьшить его время удерживания;

г) в некоторых случаях путем подходящей дериватизации можно улучшить разрешающую способность хромато-графической системы.

Для наиболее оптимального разделения метандростенолона и метиландростендиола проводили реакцию дериватизации с N-метил-К-триметилсилилтрифторацетамидом (MSTFA). Его формула:

?

F3C--C-N—Si-СНз СН3 СН3

Исследование проводили на газовом хроматографе НР-5890 (Хьюлетт-Паккард), оснащенном пламенно-ионизационным детектором и кварцевой капиллярной колонкой размерами 12,5 м х 0,2 мм (внутренний диаметр) с толщиной неподвижной фазы НР-1 (типа SE-30) - 0,33 мкм.

Температуру колонки программировали от 180°С до 280°С (10 мин) со скоростью 10°С/мин, температура испарителя и детектора соответственно 250°С и 300°С. Расход газа-носителя (гелия) составлял 1,5 см3 /мин, водорода и воздуха к детектору- 25 и 250 см3/мин соответственно.

Пробу вводили в хроматограф в режиме деления потока газа-носителя 1:50. Объем вводимой пробы составлял 1,0 мкл.

Регистрацию и обработку результатов исследования проводили с использованием интегратора НР-3396А (Хьюлетт-Паккард). Идентификацию метандростенолона и метиландростендиола проводили по абсолютным временам удерживания.

Пределы обнаружения: 5 нг метандростенолона и 5 нг мети-ландрсотендиола.

Для идентификации анаболических стероидов очень широко применяется высокоэффективная жидкостная хроматография. Это объясняется тем, что для анализа стероидов данным методом отпадает необходимость получения производных стероидов.

Исходя из того, что метод ВЭЖХ достаточно широко распространен в практике судебно-химических лабораторий, перед нами встала задача разработать методику, рассчитанную на отечественное оборудование.

Исследование проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе "Милихром-4-УФ", оснащенном детектором на УФ область спектра. Разделение проводили на колонке КАХ-4, длиной 64 мм, диаметром 3 мм, заполненной обращенно-фазным сорбентом Сепарон С18, диаметром 5,0 мкм. В работе использовали наиболее часто применяемые в высокоэффективной жидкостной хроматографии растворители: ацетонитрил, этанол, метанол, тет-рагидрофуран (ТГФ).

Метандростенолон имеет максимум поглощения 244 нм и при его анализе особых трудностей не возникало. В отличие от него, мэтиландростендиол не имеет характерного максимума поглощения в УФ. Для идентификации метандростенолона и метиландро-стендиола при совместном присутствии нами было предложено проводить детекцию при 2-х длинах волн: 210 и 246 нм.

Оптимальные условия разделения получены при использовании элюента следующего состава: этанол-вода 50:50 (по объему). При идентификации метандростенолона на хроматограмме две кривые поглощения при 210 и 246 нм, при идентификации мети-ландростендиола - только одна кривая поглощения при 210 нм. Идентификацию стероидов проводили по абсолютным временам, которые составили для метандростенолона и метиландростендио-ла 3,5 мин и 5,0 мин соответственно. Чувствительность данного метода при 210 нм для метандростенолона 30 нг, метиландростен-диола- 200 нг; при 246 нм для метандростенолона 10 нг.

2. Количественное определение метандростенолона и метиландростендиола

Для количественного определения метандростенолона и метиландростендиола в таблетках и извлечениях из биоматериала нами разработаны метод денситометрии, УФ-спектрофотометрии, высокоэффективной жидкостной хроматографии.

Денситометрический метод. Основан на предварительном хроматографировании образцов на пластинах для ТСХ и на последующем измерении оптической плотности полученного пятна непосредственно на пластине с помощью денситометра "CAMAG". Запись хроматограмм осуществляли с помощью интегратора "HP 3396". Пластины с метандростенолоном сканировали в УФ области при Х=244 нм, а пластины с метиландростендиолом проявляли 2% раствором хлорной кислоты, нагревали при 150° С 7 мин и затем сканировали при длине волны А=372 нм. Расчет содержания метандростенолона и метиландростендиола проводили по калибровочному графику. Калибровочный график для метандростенолона прямолинеен в диапазоне концентраций 1-5 мкг; для метиландростендиола - 2-8 мкг. Относительная ошибка методики для количественного определения метандростенолона 6,5%, мстиландрстендиола 8,6%.

УФ-спектрофотометричесхий метод. При определении метандростенолона УФ-спектрофотометрическим методом в качестве растворителя мы применяли 95% этиловый спирт, так как в нем растворимость исследуемого препарата выше, чем в растворах кислот и щелочей. Измерение оптической плотности проводили на спектрофотометре "Спекорд М-40" /кювета 1 см/ при длине волны 244 нм. Удельный коэффициент поглощения метандростенолона в 95% этиловом спирте равен 511+5. Расчет содержания метандростенолона проводили по удельному показателю поглощения. Границы концентраций в пределах, которых поглощение раствора метандростенолона подчиняется закону Бугера-Ламберта-Бера, равны 20-40 мкг данного вещества в 1 мл. Относительная ошибка методики 1,6%.

Метод ВЭЖХ. Количественное определение метандростенолона и метиландростендиола методом ВЭЖХ проводили методом абсолютной калибровки при Я=244 нм для метандростенолона и Я=210 для метиландростендиола. Относительная ошибка методики 2,1%.

3. Экстракция метандростенолона и метиландростендиола из водных растворов

Нами изучена зависимость степени экстракции метандростенолона и метиландростендиола из водных растворов от рН среды и природы органического растворителя. В качестве органических растворителей мы применяли хлороформ, диэтиловый эфир, бензол, этилацетат, гексан.

Таблица 2

Влияние экстрагента и значения рН среды на полноту извлечения метандростенолона (М) и метиландростендиола (Д) из водных растворов (%)

Ль Органический растворитель Степень экстракции

Значения рН

2,0 7,0 10,0

М д М д М д

1. Хлороформ 80,3 89,1 82,5 86,2 84,7 83,4

2. Эфир диэтиловый 66,8 81,2 67,9 77,8 70,4 78,1

3. Этилацетат 86,1 89,3 87,7 84,2 89,4 85,6

4. Гексан 47,5 67,1 49,1 62,5 51,3 64,3

5. Бензол 73,4 67,1 76,2 62,2 79,1 79,1

В результате проведенных исследований нами установлено, что характерной особенностью экстракции метандростенолона и метиландростендиола явл яется, то что они практически одинаково экстрагируются из кислой, щелочной и нейтральной среды. Лучшими органическими растворителями для экстракции исследуемых препаратов из водных растворов являются этилацетат, хлороформ.

4.Выделение метандростенолона и метиландростендиола из биологического материала

Для выделения метандростенолона и метиландростендиола из биологического материала мы применили методы, основанные на изолировании этих препаратов водой, подкисленной щавелевой кислотой (метод А.А. Васильевой), водой, подкисленной серной кислотой (метод В.Ф. Крамаренко), и этиловым спиртом, подкисленным винной кислотой (метод Стаса-Отто). При этом было установлено, что с помощью классических методов изолирования токсикологически важных веществ удается выделить около 30%

метандростенолона и 24% метиландростендиола. Поэтому нами были проведены исследования направленные на увеличение степени экстракции веществ из биологического материала.

В качестве извлекателя мы использовали ацетон или ацето-нитрил. Наш выбор объясняется тем, что ацетон и ацетонитрил, как и этанол по своей полярности занимают промежуточные положения между гидрофильными и липофильными растворителями. Амфифильные растворители, имея сродство к гидрофильным и гидрофобным участкам мембраны легко проникают внутрь клеток, извлекая лекарственные вещества. Основным достоинством ацетона и ацетонитрила- являются способность денатурировать белки, разрушать связь анализируемых веществ с белками, извлекать их как из водных растворов, так и из липидов. Кроме того, ацетон и ацетонитрил извлекают минимальное количество экстрактивных веществ и не образуют трудноразделимые эмульсии, что значительно сокращает время проведения анализа.

50 г печени с внесенным стандартным раствором метандростенолона или метиландростендиола заливали 50 мл ацетонитрила (ацетона), подкисленного серной кислотой до рН=2 и настаивали при комнатной температуре 2 часа, после чего ацетонитрил (ацетон) декантировали, а биоматериал еще дважды настаивали с подкисленным ацетонитрилом (ацетоном) по 50 мл по 1 часу. Аце-тонитрильные (ацетоновые) извлечения объединялись, фильтровались и упаривались в выпарительной чашке до нескольких мл. К остатку добавляли 50 мл воды и упаривали под горячим феном до исчезновения запаха растворителя. Раствор фильтровали через бумажный фильтр. К фильтрату добавляли раствор едкого натра до рН= I1, переносили его в делительную воронку и экстрагировали триады хлороформом (20, 20, 10). Хлороформные извлечения объединяли, фильтровали через бумажный фильтр. Так метандро-стенолон и метиландростендиол практически одинаково экстрагируются как из кислой, так и из щелочной и нейтральной среды, то очистка извлечений из биоматериала методом реэкстракции невозможна. Поэтому нами предложено проводить очистку методом замены растворителя, основанном на большей летучести ацетона и ацетонитрила по сравнению с водой.

Таблица 3

Сравнительная оценка методов выделения метандростенолона и метиландростендиола из биологического материала

Выделено в %

Метод изолирования Метандростенолон Метиландростендиол

Стас-Отто 28,4-30,2% 24,3-28,1%

м-д A.A. Васильевой 22,3-24,5% 15,2-16,2%

м-д В.Ф. Крамаренко 15,8-16,7% 7,5-9,5%

Предложенный нами метод а) ацетон б) ацетонитрил 60,6-66,7% 63,5-70.1% 40,8-44,5% 38,5-42,3%

5. Выделение метандростенолона и метиланд ростеIадиол а из крови

В доступной нам литературе мы не нашли специальных методов изолирования анаболических стероидов из крови. Поэтому нами было проведено исследование по изучению влияния различных осадителей и органических растворителей на степень экстракции метандростенолона и метиландростевдиола.

В результате проведенных исследований можно сделать вывод, что максимальное количество метандростенолона и метилан-дростендиола извлекается хлороформом, диэтиловым эфиром, этилацетатом, ацетонитрилом, ацетоном. Добавление различных осадителей приводило к уменьшению степени экстракции. Этот факт может быть объяснен соосаждением анаболических стероидов с белками плазмы, а также тем,что метандростенолон и мети-ландростендиол не образуют ионизированных форм и изменение рН среды существенно не влияет на степень экстракции. Кроме того, при изолировании метандростенолона и метиландростен-диола из крови хлороформом, диэтиловым эфиром, этилацетатом, ацетонитрилом, ацетоном получали чистые извлечения, пригодные для количественного определения. В то же время, при использовании дихлорэтана, изо-пропанола, диоксана получали извлечения с большим количеством соэкстрактивных веществ, которые затрудняли количественное определение.

В результате проведенных исследований мы рекомендуем для изолирования метандростенолона и метиландростендиола использовать прямую экстракцию хлороформом, диэтиловым эфиром, этилацетатом, ацетоном или ацетонитрилом. Предел обнаружения 0,05 мг/мл метиландростендиола и 0,02 мг/мл метандростенолона.

6. Выделение метандростенолона и метиландростендиола из мочи

Исходя из того, что метандростенолон и метиландростендиол выводится из организма, в основном, в виде глюкуронидов для разработки методов изолирования из мочи мы использовали мочу добровольцев, полученную после приема ими терапевтических доз препаратов. При приеме метандростенолона в дозе 0,025 г добровольцами, мочу собирали через 3 часа, а при приеме метиландростендиола в дозе 0,05 г через 12 часов. Мы сравнивали метод прямой экстракции хлороформом, метод твердофазной экстракции на патронах "Диапак С16" с последующим гидролизом с р-глюкуронидазой и без него.

На основе представленных данных можно сделать вывод, что максимальное количество метандростенолона и метиландростендиола изолируется из мочи методом твердофазной экстракции с последующим гидролизом с Р-глюкуронидазой для разрушения глюкуронидов.

10 мл мочи, полученной от добровольцев, пропускали через патрон "Диапак С16", предварительно кондиционированный 3 мл дистиллированной воды. Патрон промывали 3 мл воды. Стероиды элюировали 3 мл метанола. Элюат упаривали под феном, сухой остаток растворяли в 3 мл ацетатного буфера /рН=4,5/ и добавляли р-глюкуронидазу. Инкубировали при 50° С в течение 60 минут. Затем 10% раствором аммиака доводили до рН=9 и экстрагировали хлороформом 2 раза по 10 минут. Объединенные извлечения фильтровали через бумажный фильтр и упаривали под феном. Сухой остаток растворяли в 0,5 мл 96% этилового спирта и исследовали методом денситометрии.

Результаты экспериментов представлены в таблице 4.

Таблица 4

Изолирование метавдростенолона и метиландростендиола из мочи.

Метод изолирования Содержание метандроетенолона в гр. на 10 мл мочи Содержание метиландростендиола в гр на 10 мл мочи

1. Прямая экстракция хлороформом 2,2 х Ю-5 3,6 х 10-5

2. Изолирование патронами "ДиапакС 16" 4,0 х 10 -5 6,8 х 10 5

3. Изолирование патронами "Диапак С 15" с последующим гидролизом 5,1 х 10-5 7,4 х 10-5

7. Распределение метандроетенолона и метиландростендиола в органах и тканях

экспериментальных животных

Фармакокинетика метандроетенолона и метиландростендиола изучена на крысах при однократном пероральнои введении дозы 200 мг/кг. Через 2 часа животных забивали и определяли содержание метандроетенолона и метиландрсстечднола в биотканях и биожндкостях. Показано, что при 2 часозоь экспозиции метандрсотенолон и метиландростеидиол определяется во всех исследуемых органах и тканях (головной мозг, почка, поджелудочная железа, сердце, селезенка, легкие, печени, стенке желудка, кишечнике, крови). Наибольшая концентрация при указанных условиях определялась з поджелудочной железе, стенке желудка, кишечнике, почках, селезенке и легких, наименьшие их обнаруживалось в головном мозге, сердце, печени.

мг/г

0,1 0,08 0,06 0,04 0,02 0

1

10

Рис. 1. Распределение мегпандростенолона в органах крыс при перо-ральном введении препарата: 1 - головной мозг, 2 - почки, 3 - поджелудочная железа, 4 - сердце, 5 - селезенка, 6 - легкие, 7 - печень, 8 - желудок, 9 - кишечник, 10 - кровь.

мг/г

0,1

0,08 0,06 0,04 0,02 О

10

Рис. 2. Распределение метиландростендиола в органах крыс при пероралъном введении препарата: 1 - головной мозг, 2 - почки, 3 -поджелудочная железа, 4 - сердце, 5 - селезенка, 6 - легкие, 7 - печень, 8 - желудок, 9 - кишечник, 10 - кровь.

8. Сохраняемость метаидростенолона и метиландростендиола в биологическом материале после захоронения.

Сохраняемость метаидростенолона и метиландростендиола после захоронения изучалась на экспериментальных животных. Метандростенолон и метиландростендиол вводили белым крысам через зонд и забивали крыс декапитацией через 2 часа. Трупы животных в деревянных контейнерах захоранивали на глубину 1 м в гнилостно-песчаном грунте в весенней период (март-апрель) при среднемесячной температуре - 8°-6°С.

Химико-токсикологическое исследование органов (головной мозг, почки, поджелудочная железа, сердце, селезенка, легкие, печень, желудок, кишечник, кровь) от трупов экспериментальных животных проводили через 1, 2 и 3 месяца после захоронения. Контролем служили трупы животных, смерть которых наступила от механических повреждений, при тех же условиях захоронения.

Исследование показало, что метандростенолон и метиландростендиол через 1 месяц после захоронения выявляется во всех органах т тканях, кроме головного мозга. Через 2 месяца метандростенолон и метиландростендиол ке определялись в головном мозгу, легких, печени, а в других тканях концентрация препаратов резко снизилась. Через 3 месяца метандростенолсп и метиландростендиол в биологическом материале не определялись.

0,04--р-|---------------г-3--------

12 3 4 5 6 7 8

Рис. 1. Сохраняемость метиландростендиола в органах крыс при пероральном введении препарата.

2 3 4 5 6 7 8

Рис. 2. Сохраняемость метандростенолона в органах крыс при пе-роральном введении препарата: 1 - почки, 2 - поджелудочная железа, 3-селезенка, 4-легкие, 5-печень, 6-желудок, 7 -кишечник

Общие выводы

1. Для идентификации метандростенолона и метиландростен-диола предложены методы хроматографии в тонком слое сорбента, тазо-жидкостной и высокоэффективной жидкостной хроматографии, УФ- и ИК- спектроскопии. Эти методы пригодны для обнаружения метандростенолона и метиландростенднола, выделенных из объектов биологического происхождения.

2. Разработана методика количественного денситометриче-ского определения метандростенолона и метиландростенднола, выделенных из объектов биологического происхождения. Предел обнаружения составляет для метандростенолона 60 нг, для метиландростенднола 150 нг.

3. Для количественного определения метандростенолона предложен УФ-спектрофотометрический метод. Определен удельный коэффициент поглощения метандростенолона в 95% этиловом спирте. Установлено, что граница концентраций раствора метандростенолона в пределах, которой соблюдается закон Буге-ра-Ламберта-Бера составляет 20-40 мкг/мл.

4. Разработана методика количественного анализа метандро-стенолона и метиландростендиола методом ВЭЖХ, характеризующаяся воспроизводимостью и высокой чувствительностью.

5. Установлено, что степень экстракции метандростенолона и метиландростендиола не зависит от значения рН среды. Степень экстракции метандростенолона и метиландростендиола зависит от природы органических растворителей. Максимальное количество метандростенолона и метиландростендиола экстрагируется этил-ацетатом и хлороформом.

6. Разработан метод изолирования метандростенолона и метиландростендиола из объектов биологического происхождения с помощью ацетона, ацетонитрила, что позволило выделить до 70%% метандростенолона и до 42% метиландростендиола.

7. Разработан метод изолирования метандростенолона и метиландростендиола из крови, основанный на прямой экстракции органическим растворителем. Разработана методг.ка изолирования мегакдростенолопа и метиландростендиола из мочи на патронах для твердофазной экстракции "Диапак С16" с последующим гидролизом с Р- глкжуронидазой и экстрагировании свободной фракции стероидов хлороформом.

8. Изучено распределение метандростенолона и метиландростендиола в органах крыс. На основании порученных данных для проведения судебно-химнческой экспертизы на присутствие метандростенолона и метиландростендиола рекомендовано направлять стенку желудка, кишечник, поджелудочную железу, почку и мочу. Метандростенолон и метиландростендиол после захоронения животных можно обнаружить только в первые даа месяца после захоронения.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Бушуев Е.С., Горбачева Т.В. Определение метандростено-лона в биологическом материале // Актуальные вопросы теории и практики судебной медицины. - Спб., 1995.

2. Горбачева Т.В. Обнаружение анаболических стероидов в биологических объектах методом денситометрии // Актуальные проблемы теоретической и прикладной токсикологии - 4.2. -Спб., 1995.-С. 50.

3. Горбачева Т.В. Оптимизация условий изолирования анаболических стероидов из биоматериала //Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств - Спб, 1996. - С.40-41.

4. Бушуев Е.С., Горбачева Т.В. Определение метандростено-лона в биологическом материале // Актуальные вопросы теории и практики судебной медицины - Спб., 1996. - С. 26-27.

5. Горбачева Т.В. Обнаружение анаболических стероидов в биологических объектах методом денситометрии // Актуальные вопросы теории и практики судебной медицины. - Спб.,1996. - С. 20-21.