Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Физико-химическое и фармакокинетическое исследование новых антиоксидантов фенозан-кислоты и феноксана

БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКОЕ И ФАРМАКОКИНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ НОВЫХ АНТИОКСИДАНТОВ ФЕНОЗАН-КИСЛОТЫ И ФЕНОКСАНА

15.00.02. — фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автор ефер ат диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

На правах рукописи

ШУКИЛЬ Людмила Владимировна

Уфа — 1993

Работа выполнена в Московском медицинском стоматологическом институте им. Н. А. Семашко.

Научный руководитель — доктор фармацевтических наук, профессор А. С. Берлянд

Научный консультант — доктор фармацевтических наук, профессор А. 3. Книжник

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор А. А. Цуркан

доктор фармацевтических наук, профессор Е. Н. Вергейчик

Ведущая организация — Московская медицинская Академия им. И. М. Сеченова

Защита состоится « » марта 1993 г. в час. на

заседании специализированного совета К 084.35.02 при Башкирском государственном медицинском институте.

450000, Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкирского государственного медицинского института.

Автореферат разослан « » 1993 г.

Ученый секретарь специализированного совета

доктор медицинских наук, профессор Э. Г. Давлетов

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы Современная медицина располагает широким спектром лекарственных средств (ЛС) самого разнообразного химического строения и механизма действия. Вместе с тем, в настоящее время сохраняется потребность в расширении ассортимента применяемых препаратов с целью получения более эффективных ЛС.

Одним из важнейших направлений современной фармацевтической и медицинской науки является изучение сравнительно новой группы лекарственных препаратов и фармакологических средств - синтетических антиоксидантов. Практическая медицина испытывает острую потребность в новых отечественных антлоксидантах.

В "Лаборатории синтеза антиоксидантов" Ю® РАН синтезирован ряд новых биологически активных веществ - производных пространственно-затрудненных фенолов (ПЗФ), проявляющих свойства антиоксидантов. Среди них по специфической фармакологической активности и безопасности применения наибольший интерес представляют фенозан-кислота (Ж) и ее калиевая соль - феноксан.

. Преимуществом феноксана по сравнению с другими фармакологическими* средствами (<ЕС) этого класса является его водораствори-мость, что очень важно в медицинской практике.

До настоящего исследования в аналитическом плане свойства ФК изучены в недостаточной степени, а феноксана не были изучены.

Для внедрения фармакологического средства в медицинскую практику необходимо, наряду с фармакологическими свойствами, изучить его физико-химические свойства, разработать методы контроля и стандартизации, на их основе составить нормативно-техническую документацию на субстанцию и предполагаемые лекарственные формы (ЛФ). Кроме того, в соответствие с приказом МЗ РФ

от 30.12. 83 г. "О дальнейших мерах по совершенствованию порядка оформления разрешения к медицинскому применению и передачи для промышленного производства новых лекарственных препаратов" не-, обходимо исследовать фармакокинетику этого соединения.

Таким образом, комплексное изучение физико-химических свой-. ств и проведение исследований по разработке методик анализа новых отечественных антиоксидантов группы ПЗФ в 'субстанции, лекарственной форме и биоматериале,, а такие изучение доклинической фармакокинетики этих соединений является актуальным. . цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования является разработка высоко чувствительных и специфических методик качественного и количественного анализа ФК и феноксана на основе изучения их физико-химических свойств, а также изучение доклинической фармакокинетики, метаболизма и биофармацевтичес- , юга свойств этих потенциальных ЛС. '

Для достижения поставленных целей необходимо было решить следующие задачи:

1. На основе изучения физико-химических свойств <Ю ' разработать общие к специфические испытания качества.

2. Изучить спектральные свойства ФС (УФ-, ИК-, ЯМР-, масс-спектроскопия) и возможность их использования для идентификации, количественного анализа и изучения метаболизма.

а. Исследовать возможность применения метода дериватографии -для. прогнозирование применения метода ГЖХ в анализе 30. ; .

4. Установить закономерности хромагографического поведения (ТСХ, ГКХ, ВЭЖХ) ОС и их примеси с целью прогнозирования выбора оптимальных систем растворителей, неподвижных фаз для

• анализа этих соединений.'

5. Исходя из физико-химических свойств СС, разработать методики

количественного определения субстанций и лекарственных форм.

6. На основании проведенных исследований разработать проекты ВФС На субстанции феноксана и таблетки Ж 0,1 г.

7. Изучить экстракцию ФС из биообъектов и на основании этих данных разработать условия их извлечения.

8. Разработать высокочувствительную методику количественного определения ФК в биообъектах (плазма крови, моча).

9. Изучить доклиническую фармакокинетту ФК на кроликах при внутрисосудистом и внесосудистых путях введения и на основа-' нии этих данных дать рекомендации по выбору наиболее эффективного внесосудистого способа введения 1С.

10. Исследовать биодоступность субстанции, таблеток и свечей ФК.

11. Установить основные пути биотрансформации 2С в организме кроликов и идентифицировать мажорные метаболиты. Синтезировать мажорные метаболиты и структурные аналоги ФС.

Научная новизна. Впервые проведено комплексное изучение фи-аико-химических свойств феноксана и ФК. Выявлены основные зави-■симости "химическая структура - хроматографическая подвижность", которые использованы для разработки единых систем для разделения и идентификации ФС и примеси.

Показана целесообразность применения дериватографии для прогнозирования возможности применения метода ГЖХ для анализа «С. - '.

Впервые разработаны методики количественного определения субстанции феноксана и ЛФ ФК.

Разработаны оптимальные условия извлечения <К из биообъектов методом жидкостно-жидкостной экстракции.

Впервые разработана методика количественного определения ФК в биологических объектах методом хромато-масс-спектрометрии.

С применением этих методик впервые изучена доклиническая фармакокинетика ФК и феноксана, установлены основные пути биот-рансфорыации исследуемых ФС и идентифицированы мажорные метаболиты.

- Изучена биодоступность ЛФ в экспериментам in vivo и опреде-, . лена скорость высвобождения ®£ из таблеток в экспериментах in vitro.

Практическая ценность работы. Разработанные способы идентификации изучаемых фармакологических средств, определения посхо-■роняей примеси в субстанции и в лекарственных формах просты в. выполнении, специфичны, высокочувствительны.

. Разработаны проекты BSC на субстанции феноксана и на лекарственную форму фенозан-кислоты - таблетки 0,1 г.

Разработанный способ количественного определения ФК в плазме крови и моче кроликов дает возможность определять микрограммо-- ...вые количества фенозан-кислоты в биологических жидкостях, что особенно важно для изучения фармакокинетики препарата

Внедрение результатов работы. Методики качественного и количественного анализа феноксана и лекарственных форм фенозан-кис-лоты внедрены и используются в научно-исследовательской работе лаборатории "Синтеза антиоксидантов" Института Химической Физики РАН

. Методика количественного определения ФК и феноксана в биологических объектах методом хромато-масс-спектрометрии внедрена на кафедре токсикологической химии Московской медицинской Академии им. И. Ы. Сеченова -

Апробацкя работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании кафедры общей и биоорганической химии Московского медицинского, стоматологического института

им. Е А.Семашко (1992 г.) и на конференции молодых ученых Курского медицинского института (1990 г-.).

Публжяцкя. По. теме диссертации опубликовано 2 печатные _ работы, 4 статьи сданы в печать.

Связь исследования с проблемны* планом фармацевтических каук. Тема исследования соответствует плану научно-исследовательской работы ММСИ им. Н. А.Семашко и соответствует тематике научных исследований союзной проблемы 10.05 "Клиническая фармакология", номер государственной регистрации 01900061169.

На заяиту вьвюсятся:

- обоснование целесообразности комплексного химико-фармацевтического и доклинического фармакокинетического исследования новых фармакологических средств;

- результаты изучения химических свойств «С и разработанные на их основе реакции подлинности, методики количественного определения 4С;

- обоснование целесообразности применения метода дериватографии для прогнозирования условий анализа ФС методом ГЖХ;

- идентификация ОС спектральными методами (УФ-, ИК-, ЯМР-, масс-спектроскопия);

- результаты исследований в области хроматографии в тонких слоях сорбента (концепция выбора эффективных систем, установление взаимосвязи "структура - хрсматографическая подвижность");

• результаты изучения селективного разделения ФС и их возможной примеси методом ВЭЖХ;

- методики анализа ФС в биообъектах;

- результаты исследования доклинической фармакокинегики и метаболизма ФС.

Объем и структура, диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, 4 глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы, приложения. Работа, не считая списка литературы и приложения, изложена на 116 страницах машинописного текста, содержит 39 таблиц,-23 рисунка и 2 схемы. Список литературы включает 125 источников отечественной и 81 зарубежной литературы. ■

С.О ДЕРЖАНИЕ РАБОТ»

I. Физико-химические свойства исследуешх соединений

При физико-химическом анализе новых ФЗ, помимо определения Традиционных физико-химических параметров, характеризующих качество препарата (температура плавления, рН, подлинность, цветность, прозрачность и др.), необходимо изучить ряд свойств ЛС, которые могут, быть использованы не только для оценки качества, но и при изучении фармакокинетики и метаболизма СС. К таким свойствам, на наш взгляд, относится способность к реакциям ком-плексообразования, окисления и восстановления, кислотно-основные свойства, термическая устойчивость, спектральные характеристики и поведение веществ в условиях хроматографирования методами тех, гжх, вэкх.

Наряду со свойствами лекарственных средств феноксана и ФК, рассмотрение физико-химических свойств метилокса связано с тем, что данное соединение является возможной примесью при синтезе ФК и феноксана.

а) Химические свойства

Изучение химических свойств позволило разработать как обиие реакции подлинности на этот класс соединений, так и специфичес-

кие - для отдельных представителей. В отличие от незамещенных фенолов, ПЗФ не образуют окрашенных комплексов с хлоридом окис-ного железа. С другой стороны, ГОФ за счет феноксильного гид-роксила восстанавливает хлорид окисного железа до хлорида за-кисного железа, который при взаимодействии с ферроцианидом калия образует турнбулевую синь.

Для феноксана подлинность лекарственного средства подтверждается также и качественными реакциями на ион калия.

б) Термические характеристики

Одним из наиболее перспективных методов- определения термических характеристик ФС является метод дериватографии. Дерива-тограммы получены на приборе "Дериватограф ОД-Ю2-М" (ВНР) в динамической атмосфере азота, эталон - окись магния.

Изучение данных термического анализа К показывает, что метод дериватографии можно использовать для прогнозирования, предварительных условий анализа ФС методом ПК. Так, зная температуру разложения ФС, можно определить максимально допустимую температуру испарителя хроматографа, а по значениям температур, соответствующих началу потери массы - возможный интервал температур термостата хроматографической колонки.

Анализ образцов ФК показал, что при.нагревании до 200°С наблюдается -эндотермический эффект в интервале температур 171-173°С. Термический эффект соотнесен нами с плавлением образцов, что подтверждается изменением агрегатного состояния вещества в данном интервале температур. При температуре более 200°С начинается интенсивная потеря в массе и разложение образца.

Анализ образцов метилового эфира ФК (МЭФ) показал, что эндотермический эффект наступает в интервале температур 65-70,0С. Данный эффект соотнесен нами с температурой плавления образцов.

При температуре Солее 290°С наступает разложение образца. ,

Таким образом, для прямого хромагографирования достаточная для анализа методом ГКХ летучесть $С .достигается при высоких температурах, поэтому анализ нужно проводить на НЖФ с высокими значениями максимально допустимой рабочей температуры. Данные дериватографического анализа показали, что более летучим соединением является МЭФ. Следовательно, ГЖХ анализ лучше всего проводить после перевода ФК в МЭФ.

в) Спектральные характеристики Электронные спектры поглощения сняты на спектрофотометре "Specord" в области от 250 до 360 нм. У £>-спектры 0,01 Z растворов ФК, феноксана и МЭФ в 95 X спирте имеют интенсивную полосу поглощения при 277±2 нм. Си этих соединений соответственно равны 1834,8; 1677,45 и 1810,4. При введении в бензольное кольцо ОН-группы происходит батохромное смешение полос бензола

УФ-спектроскопия дает возможность идентифицировать исследуемые соединения в присутствии ФС других химических классов соединений» однако для обнаружения возможной примеси - МЭФ - в субстанциях фенозан-кислоты и феноксана метод не пригоден, поскольку УФ-спектры ФК, феноксана и МЭФ практически идентичны. . Запись ИК-спектров ФК и ИЭФ проводили на приборе "Specord М-80" в таблетках КВт, в диапазоне частот 400-4000 см . •

Спектры ЯМР Си Н измеряли на спектрометре "Bruker AM-300"

То I

(75,47 мГц по С и 300,13 мГц по В). В качестве растворителей

13

использовали CDClg. При измерении спектров ЯЫР С применяли внешний стандарт - ацетон. Различия между сигналами CH^.CH и СН2> Счетв. получены с использованием стандартной программы XHCORRDAU для редактирования спектра

Многообразие структурной информации ИК-спектров, и спектров

13 I

ЯМР 0 и H позволяет рекомендовать эти методы для идентификации 4С.

Масс-спектры исследуемых соединений сняты на хромато-масс-спектромегре Хьюлетт-Паккард НР-5980 II. Масс-селективный детектор работает по принципу ионизации электронным ударом (энергия электронов 70 эВ). Характер фрагментации €С позволяет легко идентифицировать эти соединения по их масс-спектрам.

Подробное изучение физико-химических и химических свойств <Ю позволило разработать надежные и специфические реакции подлинности ас, определить их спектральные характеристики, которые включены в НГД на изучаемые ФС. Кроме того, на основании полученных данных сделан прогноз о целесообразности применения хро-матографических методов в анализе исследуемых веществ.

Исследование условий анализа ФС методами ТСХ, ВЭЯХ при контроле их качества

В настоящее время хроматографические методы вследствие их высокой специфичности и чувствительности находят широкое применение в анализе ФС (идентификация, определение посторонних примесей,. количественный анализ ЛФ, определение концентраций ФС в биообъектах, разделение ФС и их метаболитов). В связи с этим исследовали хроматографические свойства не только изучаемых ФС, но и их возможных посторонних примесей, ч

а) Хроматографе» в тожом слое сорбента

Анализ литературных данных показал, что применение ТСХ в анализе и стандартизации изучаемых соединений изучено в недостаточной степени: не выявлены зависимости сорбционных характеристик от строения молекул; не изучены факторы, влиявшие на эффективность хроматогра4ического разделения.

Работа проводилась на стандартных пластинках "Силу-фол- УФ-254" размером 15x15 см. Хроматографирование проводили восходящим методом.

В качестве критерия эффективности разделения были выбраны величины И*. дЯГ и коэффициент г^, характеризующий эффективность разделения: 11+1г); где ДИ^ " Разность величин ЙТ

соседних ион адсорбции, Ь - длина пробега, мм, 1г- длины продольного сечения соседних зон адсорбции, мм.

На основе сочетания этих параметров были проанализированы индивидуальные растворители и различные системы растворителей. Системы, имеющие наибольшую эффективность (с максимальным значением ц) использованы при анализе исследуемых веществ.

Дифференцирующим действием по отношению к ФК и МЭФ среди индивидуальных растворителей обладают гексан, толуол, бензол, этанол, хлороформ, дизтиловый вфир. Однако,- применять эти индивидуальные растворители для разделения ФК и МЭФ нецелесообразно либо в связи с очень высокой хроматографической подвижностью «ЭФ в полярных растворителях (хлороформ, дизтиловый эфир, этанол), либо в связи с практическим отсутствием хроматографической подвижности ФК в неподярных растворителях (толуол, бензол, гексан).

В связи с этим для разделения ФК и ЮФ были исследованы системы растворителей, состоящие из полярного и неполярного растворителей, причем, по крайней мере один из них обладал дифференцирующим действием по отношению к разделяемым веществам.

Для разделения ФК и МЭФ могут быть использованы следующие системы растворителей: гексан-зфир 6:4; толуол-хлороформ 2:1; 1:1; 2:3; 2:5; бензол-дизтиловый' эфир а 2; 1:3; гексан-хлороформ 1:2; 2:1 и др.

Среди перечисленных систем растворителей оптимальной является система гексан-эфир 6:4, поскольку большее- значение коэффициента разделения г^ в трех других системах достигается за счет малой хроматографической подвижности ФК (вещество находится практически на линии старта хроматографической пластинки). Замена карбоксильной группы в молекуле <ХК на сложноэфирную у ме-тилокса приводит к уменьшению сорбции на силикагеле. ФК сильнее сорбируется на силикагеле, очевидно, за счет большей склонности к образованию водородных связей с сорбентом.

Для обнаружения исследуемых соединений были использованы следующие реагенты: пары йода, просматривание в УФ-свете при 254 нм, реактив Гиббса (в основе лежит реакция образования окрашенных индофенолов), реактив Паули (образование окрашенных продуктов в результате реакции азосочетания).

Установлено, что высокая чувствительность к исследуемым веществам (0,1 мкг) достигается при проявлении в камере с парами йода, детектированием реактивами Гиббса и Паули. При просматривании хроматографических пластинок с исследуемыми веществами в УФ-свете чувствительность составляет 10 мкг. .

В работе мы отдали предпочтение проявлению парами йода как наиболее доступного и удобного в употреблении детектирующего агента.

Метод ТСХ был применен и для определения содержания возмож-. ной примеси - 1©Ф в субстанции ФК. На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что содержание возможной примеси ИЭФ в субстанций* Ж, феноксана и таблетках ФК не превышает 0,1 1 Предложенные методики анализа посторонней примеси включены в проект ВХС на субстанцию феноксана и таблетки ФК.

- 14 -

б) Высокоэффективная жидкостная хроматография

Широкое применение в контроле качества ЛС и их анализа в биообъектах находить метод ВЭЖХ. Экспериментально установлено, что разделение изучаемых соединений оптимально проводить в обращен-но-фазном варианте. Исследование проводили на хроматографе "Ми-лихром-1" (стальная колонка размером 2x120 мм, сорбенты БИазогЬ С-18, ЗЦазогЬ СМ, детектор ультрафиолетовый, рабочая аналитическая длина волны 278 нм, скорость потока элюента 100 мкл/мин, условно несорбирующееся вещество - КЯС^).

Эффективное разделение имело место на колонке БЛазогЬ С-18. В качестве критерия эффективности разделения использовали относительное удерживание характеризующее селективность разделяющей системы. Для выбора оптимального состава подвижной фазы нами изучено поведение ФК и МЭФ в элюентах различного состава с учетом оптимальных условий идентификации ФК.

Самое эффективное разделение среди исследованных подвижных фаз происходит при использовании элюентов ацетонитрил-ацетатный буфер рН 4,0 в соотношении 80: 20 и метанол-фосфатный буфер рН 6,86 в соотношении 80:20 (исходя из хроматографических характеристик и формы пиков на хроматограмме). Исследуемые соединения выходят на хроматограмме в порядке убывания полярности.

Минимально определяемые количества ФК и ЫЭФ при использовании исследуемых элюентов составляют 0,5 мкг.

Для сокращения времени анализа обнаружения возможной примеси при синтезе ФК - МЭФ использовали элюент аиегонитрил-ацегатный буфер рН 4,0 (80:20). Установлено, что содержание МЭФ в Ш не превышает 0,1 X .

Разработанные варианты разделения ФК и ее возможной примеси служат основой для создания методик контроля качества ФС: его

идентификации, чистоты и количественного определения действующего начала в ЛФ.

II. Количественный анализ лекарственных средств

На основании изучения химических, спектральных, хроматогра-фических свойств были разработаны методики количественного оп-. ределения субстанций и ЛФ исследуемых средств.

Преимуществом выбранных методов титриметрического анализа является быстрота выполнения, простая и общедоступная техника, достаточная точность.

Применение метода неводного титрования для количественного определения субстанций феноксана и ФК обусловлено физико-химическими свойствами исследуемых веществ. Феноксан является солью слабой органической кислоты ФК, не растворимой в воде. В качестве растворителя при определении органических кислот и их солей чаяр всего применяют ледяную уксусную кислоту, которая является хорошим растворителем для многих органических соединений и изменяет силу кислотных свойств анализируемых веществ. Титрантом при данном методе анализа служит хлорная кислота. Правильность выбора индикатора проверяли методом потеяциометрического титрования. . Относительные ошибки среднего результата не превышают для субстанции феноксана 1,48 % , для ФК - 0,63 %.

Наряду с анализом субстанции ФК в среде уксусной кислоты на- . ми разработана методика количественного определения ФК в среде спирта 95.2 . Относительная ошибка среднего результата не превышает 0,58 X .

Количественное определение ФК в лекарственных формах проводили методом нейтрализации в' спиртовой среде. Относительная ошибка среднего результата при определении ФК в таблетках не превышает 1,37 X , в свечах - 3,92 % .

С целью разработки более экспрессной, селективной и специфической методики количественного определения ФК в лекарственных формах исследована возможность применения метода ВЭЖХ. Анализ проводили на колонке "Silasorb С18" (2x120 мм,6 мкм); в качестве элюента применили смесь ацетонитрил-фосфатный буфер pH 6,86 в соотношении 1:1. Скорость потока элюента 100 мкл/мин, аналитическая длина волны УФ-детектора - 278 нм. Количественный анализ проводили методом абсолютной калибровки по внешнему стандарту. Относительная ошибка среднего результата при определении 5К в таблетках не превышает 2,25 % , в свечах - 1,95 Z .

Анализ Ж в лекарственных формах можно проводить методом УФ-слектроскопии. Относительная ошибка среднего результата при определении CK в таблетках не превышает 1,24 X, в свечах -1,92 Z . ■

Таким образом, на основании комплексного изучения фиэико-хи-ыических свойств исследуемых соединений были разработаны хорошо воспроизводимые, селективные методики количественного определения субстанций и J№ этих соединений.

III. Хро«ато-иасс-слекгрометрическкй метод определения фенозак-кислоты в биологических объектах

Изучение фармакокинетики ©3 возможно лишь при наличии надежного и чувствительного метода определения его микроконцентраций в бдамагериаде. Разработанная наш методика состоит из трех этапов: выделение ФК из биологических жидкостей путем экстракции, метилирование ФК в МЭФ и количественное определение содержания препарата в экстрактах.

Для выделения ФК из биологических проб применялась лидкостно -жидкостная экстракция. Зкстрагент, его оптимальный объем, кратность и длительность экстракции найдены на основании изуче-

ния физико-химических свойств ФК. Установлено, что оптимальными условиями выделения ФК из биологических жидкостей (плазма крови, моча) является трехкратная экстракция 2,5-кратным объемом диэтилового эфира при встряхивании в течение 3 мин. Так как ФХ проявляет свойства слабой кислоты (рК-4,5б), для повышения процента извлечения препарата биожидкость подкисляли до рН 1,5-2,0 добавлением 0,1 Ы раствора хлористоводородной кислоты. Эффективность экстракции ФК из плазмы крови и мочи определяли путем сравнения с контрольными пробами, приготовленными добавлениями точного количества ФК к эфирному экстракту стандартной плазмы и интактной мочи.

Процент извлечения ФС из модельных растворов составляя 94,8-97,0 7.. Метилирование ФК в ЮФ проводили диазометаном.

Количественное определение ФС проводили с помощью системы ГХ-МС фирмы Хьшетт - Паккард, состоящей из газового хроматографа НР 5980 серия II, масс-селективного детектора (МСД) НР 5971 А и станции обработки данных НР 59970 С.

Разделение проводили на капиллярной кварцевой колшке 12 м х 0,2 мм, метилсиликоновая фаза НР-1 имела толщину 0,33 мкм. Газ-носитель - гелий, давление на входе в колонку 3 Пси (21 кПа).

Ввод пробы в режиме "без разделения потока с последующим разде-

о

лением" (ЗрШЛеэз/ЗрПи. Температура инжектора 250 С. Темпе- .

ратурный режим для определения МЭФ: начальная температура ко-о

лонки 75 С поддерживается без изменений 2 » после ввода лро-

о

бы, увеличивается до 280 С со скоростью 50 град/дан и сохраняется постоянной до конца программы. МСД работает по принципу ионизации электронным ударом (энергия электронов 70 эВ). Интервал регистрируемых масс ионов от 10 до 650 .

Для количественной оценки содержания ФК в бкооС'гектах приме-

ияли метод внутренней стандартизации. Времена удерживания ФК, МЭФ и внутреннего стандарта-додекана - составляют соответственно 6,44; 6,02; 3,55 мин. Пики ШФ и внутреннего стандарта хорошо отделены как друг от друга, так и от пиков эндогенных соединений.

Относительная ошибка среднего результата при оценке правильности определения концентрации ФК в плазме крови составляет не более 2 X, максимальное единичное отклонение составляет 18 7..

Разработанные методики количественного определения ФК в биообъектах характеризуются специфичностью, точностью и воспроизводимостью и использованы при изучении доклинической фармакоки-нетики ФК и феноксана.

IV. Изучение экспериментальной фаркакокинетмки - и метаболизма фенозан-кислоты и феноксана

Исследование экспериментальной фармакокинетики и метаболизма К позволяет наиболее рационально подойти к их клиническому использованию.

Экспериментальную фармакокинетику изучали на беспородных кроликах-самцах массой 2,0±0,2 кг (п-5) при внутривенном, перо-ралыюм и ректальном способах введения (табл.1). Животным вводили Ж и феноксав в пересчете на ФК в доге 100 мг/кг. Пробы крови отбирали в течение 24 часов. Концентрацию {К в плазме крови определяли методом Ж-СЫ по приведенной выше методике.

Анализ полученных данных, проведенный на ЭВМ ГОР 11/04 с использованием программы АСОДД (Дорохов В. В .Холодов Л Б.), показал, что динамика концентрации ФК в плазме кроликов при внутривенном введении удовлетворительно аппроксимируется даухчаетевой моделью, при введении субстанции ФК внутрь, пероральном введении таблеток № и ректальном введении свечей - одночастевой мо-

делью со всасыванием.

Таблица 1

Динамика концентраций ФК в плазме крови кроликов после различных способов ее введения в дозе 100 мг/кг

Время после Концентрация фенозан-кислоты (мкг/мл) введения, ч внутривенно внутрь перорально ректально

0,083 12,30*1,22 0,75±0,21

0,25 8,41±0,80 0,55±0,30 0,42±0,21

0,5 6,01±0,60 1,25±0,12 0,89±0,12 1,03+0,10

0,75 5,11±0,б1 1,78+0,41 1,11+0,20 1,39+0,12

1,0 4,00±0,42 2,22+0,12 1,41±0,12 1,59±0,50

2,0 3,72+0,40 2,37+0,31 1,71+0,40 1,78+0,21

4,0 3.11±0,31 2,02+0,12 1,49+0,20 1,59+0,12

8,0 2,20+0,20 1,51+0,21 1,13+0,31 1,19+0,30

16,0 1,11+0,11 0,7810,51 0,54±0,21 0,67+0,10

24,0 0,62+0,21 0,42+0,21 0,35+0,11 0,37+0,11

Рассчитанные с помощью этих моделей фармакокинетические параметры ФК у кроликов приведены в табл.2. Из табл.2 видно, что значение основных фармакокинетических параметров при различных путях введения ФК имеют практически незначимые расхождения.

Общий клиренс ФК значительно превышает величину клубочковой фильтрации у кроликов, приблилаясь к значению почечного кровотока, из чего можно заключить, что ФК элиминирует из организма, в основном за счет биотрансформации.

Таблица 2

Значения некоторых фармакокинетических параметров ЗК у кроликов

Параметр внутривенно внутрь перорально ректально

Период полураспределения'

г 1/21/, ч 0,203+0,049 .....— . ——— .......

Период полуабсорбции ;

Ь 1/2 аЬэ.ч ' ------- 0,487+0,071 0,543+0,133 0,478+0,077

Период полуэлиминации ' '

Ъ 1/2^), ч 8,28+0,83 7.68±1,66 8,87±1,73 9,34±1,29

Константа

скорости

абсорбции '

К 01, ч1 ....... 1,42±0,20 1,2810,29 1,45^.33

Константа .

скорости . .

элиминации . ■

Ч"1 0,0837+0,008 0,090+0,018 0,078+0,014 0,074+0,010 Объем распределения

^/Г, л/кг 6,77+0,87 35.3+2,6 50,4+6,2 48,3+3,7 Общий клиренс С^ /Г,

мл/мин-кт 30,7+1,7 53,1+8,2 65,6±9,5 59,8+5,9

Довольно высокое значение константы скорости абсорбции хорошо согласуется с физико-химическими свойствами ФК. Являясь по своей природе слабой кислотой и обладая липофильными свойствами, ФК быстро в неионизированном виде проникает через биологические мембраны путем простой диффузии, легко всасывается и медленно выводится из организма. По мере всасывания фармакологического средства происходит его распространение с потоком крови в организме кроликов.' Этот процесс характеризует значение калущегося объема распределения, высокое значение которого свидетельствует о возможности внутриклеточного проникновения препарата, захвата его органами и тканями.

Важной характеристикой препаратов является абсолютная их биодоступность при внесосудистых путях введения. Невысокие значения абсолютной биодоступности в рассматриваемых случаях, очевидно, связаны с наличием пресистемного метаболизма. Величина биодоступности ФК при различных способах введения у кроликов изменяется в следующей последовательности: таблетки ФК - 47 7., свечи ФК - 51 7., субстанция ФК при приеме внутрь - 77 %.

Изучение экскреции с мочой показало, что основным путем выведения ФК из организма кроликов является не мочевая экскреция (с мочой в неизменном виде выводится 5 7. от введенного препарата), а экскреция с желчью, что характерно для препаратов, прак- . тически не растворимых в воде.

Изучение метаболизма ФК в организме кроликов проводили при однократном пероральном введении в дозе 100 мг/кг. Опыты проводили на кроликах-самцах массой 2,0*0,2 кг.

Хромэто-масс-спектрометрический анализ эфирных экстрактов суточной мочи и плазмы крови кроликов до и после введения препарата проводился на , ХМ-СМ Хьшетт Паккард с автоматической

системой обработки данных (энергия электронов 70 эВ, интервал регистрируемых масс-ионов от 100 до 650). Хроматографическое разделение проводили на колонке со стационарной фазой НР-1 длиной 12 м, при скорости потока гелия 1 мл/мин. Температурный ре-о

жим колонки 75 С спустя 2 мин после ввода пробы увеличивается

о

со скоростью 5 град/мин до 160 С, выдерживается 2 мин без изме-

о

нения, увеличивается со скоростью 2 град/мин до 170 С, выдержи-

о

вается 1 мин и со скоростью 20 град/мин. доводится до 280 С.

Экстракцию и обработку биологических проб проводили по методике, описанной для определения содержания Ж в биологических жидкостях.

Газо-зидкостная хроматограмма суммы метаболитов Ж содержит 4 основных лика: пик со временем удерживания 25,4 мин полностью совпадает -с масс-спектром МЭФ.

Масс-спектр интенсивного пика соединения 1 со временем удерживания 11,9 мин, снятый на вершине этого пика, полностью соответствует масс-спектру- синтезированного '2,6-ди-трет-бутил-п-бензохинона.

Обращает на себя внимание пик соединения 2 со временем удерживания 20,2 мин. Ыасс-рпектр этого соединения идентичен" масс-спектру синтезированного соединения - метилового эфира 4-окси-3,5-ди-трет-бутил-фенилкоричной кислоты.

Масс-спектр, снятый на вершине пика соединения 3, со временем удерживания 18,7 мин, принадлежит неидентифицированному метаболиту.

- 23 -

Схема метаболизма фенозан-кислоты ОН , ОН О

В=С(СН3)Э

2 Фенозан-кислота 1

Таким образом, установлено, что в организме кроликов основными направлениями биотрансформации является образование производного ФК хиноидной структуры (2,б-ди-трег-бутил-п-бензохи-нон 113 ) и дегидрирование остатка пропионовой кислоты

(4-окси-3,5- ди-трет-бутилфенилкоричная кислота 121 ).

»

ОБЩЕ вывода

13 1

1. Изучены спектральные свойства 50 (УФ-, ИК-, ЯМР С, Н-, масс-спектроскопия). ГЬказана возможность их использования для идентификации фармакологических средств,

2. На основании изучения термических свойств ФО доказана целесообразность использования дериватографии для прогнозирования возможности применения метода ГЖХ в анализе ФС.

3. В результате исследования хроматографического поведения СС, величины коэффициента разделения г^ (метод ТСХ) предложена оптимальная система растворителей и показана эффективность этой системы для определения чистоты СС. Показано, что содержание примеси в ФК не превышает 0,'1 7.. Исследована взаимосвязь между хроматографической подвижностью и химическим строением соединений.

4. Установлены оптимальные условия селективного разделения ис-

следуемых веществ методом ВЭЖХ с использованием сорбента "31-1азогЬ С-18" и элюентов: ацетонитрил-ацетатный буфер рН 4,0 - (80:20) и метанол-фосфатный буфер рН6,8б (80:20). Разработана методика определения примеси в субстанции , и таблетках ФК. Показано; что содержание примеси в ФК не превышает 0,1 X.

5. На основании изучения химических, физико-химических, спектральных и ' хроматографических свойств разработаны методики количественного определения субстанции феноксана и ФК, а также лекарственных форм ФК (титрование в неводных средах, УФ-спектрофотометрия, ВЭЯХ).

6. Разработаны проекты ВФС на субстанцию феноксана и таблетки ФК по 0,1 г.

7. Обоснованы принципы подхода выделения ФК из биологических объектов методом жидкостно-жидкосгной экстракции, обеспечивающие высокую степень извлечения препарата.

8. Впервые разработана высокочувствительная и специфическая ХМ-СМ методика анализа ФКв биологических объектах.

9. Впервые изучена доклиническая фармакокинетика ФК и феноксана. С помощь» математических моделей рассчитаны фармакокинетические параметры, характеризующие всасывание, распределение, элиминацию СС. Установлено, что препарат быстро всасывается и распределяется по органам и тканям и медленно элиминирует из организма кроликов. Абсолютная биодосгупность при пероральном введении субстанции ФК составляет 77 %,..при пероральном введении таблеток - 47 7., при введении свечей -51 X. Найдено, что 5 X введенного препарата выводится вместе с мочой в неизменном виде.

10. Впервые изучен метаболизм ФК. Установлено, что в организме кроликов основными направлениями биотрансформации являются

образование производного ФК хиноидной структуры и дегидрирование остатка пропионовой кислоты. Однозначно установлено, что в результате метаболизма ФК в организме кроликов образуются 2,6-ди-трет-бутил-п-бензохинон и 4-окси-3,5-ди-трегбу-тилфенилкоричная кислота

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Щукиль Л. В., Берлянд А. С. Анализ пространственно-затрудненных фенолов методом тонкослойной хроматографии //Деп. ВИНИТИ 22.06.92, -N. 2023-В 92. -4с.

2. Щукиль Л Е , Книжник А. 3., Берлянд А. С. Идентификация фе-ноксана методом тонкослойной и высокоэффективной хроматографии //Тез. докл. научно-практ. конф. 25-летия фарм. факул. Курского мед. ин-та-г. Курск.-1991.-С. 85-86.

Подписана в печать Qlj, tjj, 199Xf.

Здк. IjS Ivy-jOO

МАЛОЕ ПРЕДПРИЯТИЕ «ПЕГИТ»