Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Физико-химические методы в анализе водорастворимых витаминов (сравнительная оценка)

0о4ы

На правах рукописи

СЯ ЮЙ

ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ В АНАЛИЗЕ ВОДОРАСТВОРИМЫХ ВИТАМИНОВ (СРАВНИТЕЛЬНАЯ ОЦЕНКА)

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 8 окт 2010

Москва-2010

004611596

Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук, академик РАМН, профессор Арзмасцев Александр Павлович|

доктор фармацевтических наук, профессор Дорофеев Владимир Львович Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор Белобородое Владимир Леонидович доктор фармацевтических наук, профессор Берлянд Александр Семенович Ведущая организация:

Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В.Закусова РАМН

Защита состоится « /5 » HDdiijhX 2010 г. в /4 '00 часов на заседании Диссертационного совета (Д 208.040.09) при Первом Московском государственном медицинском университете имени И.М.Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Первого МГМУ им. И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, 49.

Автореферат разослан « ДО » ¿щия^ья 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 208.040.09

доктор фармацевтических наук, , „

профессор и //),[) Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Возрастающие требования к безопасности, эффективности и качеству лекарственных средств обусловливают необходимость разрабатывать новые и совершенствовать существующие методы их анализа.

Витамины являются незаменимыми веществами, необходимыми для роста, развития и жизнедеятельности человека. Большинство витаминов в организме не синтезируется, источником их обычно является внешняя среда. Традиционно различают водорастворимые и жирорастворимые витамины.

Витаминные препараты широко используютсят для стимуляции и регуляции физиологических процессов, профилактики и лечения ряда заболеваний при гипо- и авитаминозах, повышения общей устойчивости организма к экзогенным и эндогенным неблагоприятным факторам.

На сегодняшний день рынок переполнен витаминными препаратами, они имеют различные составные элементы и выпускаются в разных лекарственных формах. На фармацевтическом рынке существует большое количество дженериков или многоисточниковых препаратов, содержащих витамины.

Качество препаратов-дженериков обеспечивается комплексом аналитических методов, позволяющих подтвердить их подлинность, определить чистоту и количественное содержание действующего вещества. Используемые для этого методы и методики нуждаются в постоянном совершенствовании. Необходимо также учитывать сохраняющуюся проблему фальсификации лекарственных средств. Учитывая вышеизложенное, актуальной является проблеме сравнительного изучения физико-химических методов, используемых для анализа лекарственных средств водорастворимых витаминов.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось сравнительное изучение современных физико-химических методов анализа лекарственных средств водорастворимых витаминов.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи:

- провести анализ состояния методов стандартизации и контроля качества лекарственных средств, включая международные программы и зарубежные фармакопеи;

- разработать унифицированную методику анализа субстануий и препаратов водорастворимых витаминов методом БИК-спектроскопии в средней области и составить атлас БИК-спектров;

- разработать методики установления подлинности и количественного определения субстанций и препаратов водорастворимых витаминов методами ИК-спектроскопии в ближней областях;

- разработать методики устоновления подлинности и количественного определения лекарственных средств водорастворимых витаминов методами УФ-спектроскопии;

- изучить хроматографические характеристики и разработать унифицированную методику установления подлинности водорастворимых витаминов методом ТСХ;

- изучить хроматографические характеристики и разработать методику установления подлинности и количественного определения витаминов группы В методом ВЭЖХ.

Научная новизна исследования. Составлен атлас ИК-спектров субстанций и лекарственных препаратов водорастворимых витаминов различных производителей в вазелиновом масле. Изучены спектральные характеристики лекарственных средств кислоты аскорбиновой в средней и ближней инфракрасных областях.

Показана возможность использования метода БИК-спектроскопии для установления подлинности субстанций и препаратов кислоты аскорбиновой.

Построены модели для таблеток кислоты аскорбиновой, позволяющие идентифицировать производителя субстанции или препарата методом БИК-спектроскопии.

Впервые построена калибровочная модель, позволяющая определять процентное содержание кислоты аскорбиновой в таблетках методом БИК-спектроскопии. Установлено, что при идентификации и количественном определении таблеток кислоты аскорбиновой методом БИК-спектроскопии, содержащие действующего вещества в них должно составлять не менее 25%.

Впервые разработаны унифицированные методики установления подлинности тиамина гидрохлорида, рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида, никотинамида и фолиевой кислоты методами ТСХ и ВЭЖХ.

Разработаны методики пробоподготовки субстанций и лекарственных препаратов водорастворимых витаминов для анализа методами ТСХ и ВЭЖХ. Изучено влияние подвижных фаз различного состава на хроматографические характеристики водорастворимых витаминов при их анализе данными методами.

Предложены новые условия подтверждения подлинности водорастворимых витаминов в субстанциях и лекарственных препаратах с использованием российских пластин «Сорбфил» для высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

Практическая значимость работы. Полученные ИК-спектры в средней и ближней областях и УФ-спектры могут быть использованы при стандартизции и контроле качества по разделу «подлинность» соответствующей НД на субстанции и лекарственные препараты водорастворимых витаминов.

Методики установления подлинности и количественного определения методами УФ- и БИК-спектрофотометрии, методика установления подлинности водорастворимых витаминов методами ТСХ и ВЭЖХ предлагаются для стандартизации и контроля качества субстанций и лекарственных препаратов данной группы лекарственных средств с последующим их включением в соответствующие разделы НД.

Разработанные методики внедрены и используютсяв испытательной лаборатории Московского областного центра сертификациии контроля качества лекарственных средств (акт внедрения от 10 июня 2010 г.).

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г.). Апробация работы проведена на научнопрактическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ им. И.М. Сеченова 14 июня 2010 г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 печатных работ. Связь исследований с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (гос. регистрация № 01.200.110545).

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 141 страницах машинописного текста (без приложения) и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части (материалы и методы, результаты исследования и их обсуждение), выводов, списка литературы, а также отдельно включает в себя 3 приложения. Работа иллюстрирована 31 таблицами и 30 рисунками. Библиографический указатель литературы включает 115 источников, из них 74 - иностранные. Основные положения, выносимые на защиту.

- результаты исследования лекарственных субстанций и препаратов водорастворимых витаминов методом ИК-спектроскопии в средней области;

- результаты прменения ИК-спектроскопии в ближнем диапазоне для идентификации и количественного определения лекарственных средств водорастворимых витаминов;

- результаты исследования водорастворимых витаминов методами УФ-спектро-фотометрии;

- результаты изучения водорастворимых витаминов методами ТСХ и ВЭЖХ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. ОБЪЕКТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектами исследования являлись стандартные образцы, субстанции и препараты водорастворимых витаминов, зарегистрированных в РФ.

Табл. 1. Изучаемые водорастворимые витамины.

Фармацевтическая субстанция Структурная формула Химическое название, молекулярная формула, М.м.

Тиамина гидробромид Thiamine Hydrobromide /i, tv"5 /bf , h8r но— Г T hjc n«2 3-[(4-амино-2-метил-5- пиримидинил)метил]-5- (2-гидроксиэтил)-4-метил- тиазолий бромид гидробромид C12Hi7BrN4OSHBr М.м. 426,2

Тиамина гидрохлорид Thiamine Hydrochloride ^/i. ry* но^/у"-^" cr , на hjc nh, 3-[(4-амино-2-метил-5-пиримидинил)метил]-5-(2-гидроксиэтил)-4-метил-тиазолий хлорид гидрохлорид c12h17cin4oshci М.м. 337,3

Рибофлавин Riboflavin „но h ho-V^^-' „,саагл1гмн о 7,8-диметил-10-(D-1 -рибитил) изоаллоксазин C17H2oN4Oe М.м. 376,4

Никотинамид Nicotinamide 3-пиридинкарбоксамид c6h6n2o М.м. 122.1

Пиридоксина гидрохлорид Pyridoxine Hydrochloride ноад^ои , нс. он 4,5-бис(гидроксиметил)-2- метилпиридин-3-ола гидрохлорид C8HhN03HCI М.м. 205,6

Табл. 1. Изучаемые водорастворимые витамины (продолжение).

Фолиевая кислота Folic acid о H C02H мм П Ы-{п-[(2-амид-4- гидроксиокси -6-птеридинил)метил]- амино}-бензоил-1. глутаминовая кислота C19H,9N70e М.м. 441.4

Аскорбиновая кислота Ascorbic acid HO OH (5R)-5-[(1S)-1,2- дигидроксиэтил]-2,3- дигидроксифуран-2(5Н)-он C$HSC>6 М.м. 176,1

2. ОБОРУДОВАНИЕ И УСЛОВИЯ ИСПЫТАНИЙ

2.1 ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ

В работе использовали однолучевой интерференционный (с обратным преобразованием Фурье) ИК-спектрофотометр Инфралюм ФТ-02 (НПФ «ЛЮМЭКС», Россия). Параметры записи спектров: диапазон 4000-400 cm"1, разрешение 1 cm"1, циклическая запись с количеством сканов 20, аподизация стандартная. Фоновый спектр (воздух) получали непосредственно перед записью каждого спектра.

Управление прибором и обработку спектров осуществляли с использованием программы «Спектралюм» (НПФ «ЛЮМЭКС», Россия) и программы «OPUS», Version 6.0 (Bruker Optics, Германия).

Пробоподготовку субстанций осуществляли в соответствии с требованиями ГФ XII. Навеску субстанции массой 15 мг измельчали в агатовой ступке и растирали с 1-2 каплями вазелинового масла качества «для ИК-спектроскопии». Полученную пасту наносили между двумя пластинками из КВг и получали ИК-спектр образца.

Пробоподготовку таблеток осуществляли путем предварительного извлечения кислоты аскорбиновой из препаратов спиртом 96%, высушивания при 30°С и растирания полученного извлечения с вазелиновым маслом качества «для ИК-спектроскопии». Полученную пасту наносили между двумя пластинками из КВг и получали ИК-спектр образца.

Интерпретацию спектров проводили с применением ИК-базы данных, доступной в режиме online на сайте Spectral Database for Organic Compounds SDBS (National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Japan) по адресу:

http://riodb01.ibase.aist.go.jp/sdbs/cgi-bin/cre_index.cgi?lang=eng

2.2 БИК-СПЕКТРОСКОПИЯ

Исследования были проведены на приборе ИК-Фурье спектрометр Antaris II фирмы Thermo Electron Corporation (США) с интегрирующей сферой; разрешение -8 см"1, количество сканирований 16, область измерения от 4000 до 10000 см"1, базовую линию проводили по эталону из тефлона, количество сканирований - 32. Время анализа - 2 минуты, что включает снятие спектра встроенного в прибор эталона (образца сравнения), снятие спектра анализируемого образцах, и обработку полученных данных при помощи внешнего компьютера. Фоновый спектр (воздух) получали непосредственно перед записью каждой группы спектров различных производителей.

Субстанцию слоем 4-6 мм в специальной кювете с закрытой крышкой помещали на интегрирующую сферу и снимали спектр не менее трех раз для каждого образца, перемешивая его перед каждым измерением. Таблетку помещали на интегрирующую сферу, фиксировали с помощью специального устройства и снимали спектр. Анализировали 10 таблеток препарата, измеряя каждую таблетку не менее трех раз с двух сторон.

Обработку результатов проводили хемометрическим методом с помощью программы «Thermo Scientific TQ Analyst™». Обработка БИК-спектров основана на сочетании спектроскопии и статистического метода анализа многофакторных зависимостей.

2.3 УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

В работе использовали двухлучевой спектрофотометр UV1901 (Китай). Получали спектр в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм. В качестве раствора сравнения использовали соответствующий растворитель.

Обработку спектров осуществляли с использованием программы «UVWIN 5 Spectrophotometer Software for Windows System» (Китай).

2.4 ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Хроматографирование проводилось на пластинах для высокоэффективной ТСХ «Сорбфил» размером 10x10 см (ТУ 26-11-17-89, ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар), покрытых силикагелем, с люминофорным содержаемым. Пластины были представлены двумя видами, отличающимися между собой материалом подложки: алюминиевая фольга (ПТСХ-АФ-В-УФ). Также использовали пластины Silica gel 60 HF254 (0,25 mm) Merck размером 10x20 см (вырезали 10x10 см).

На линию старта пластин с помощью микрошприца наносили 2 мкл раствора сравнения и испытуемого раствора. Пробы наносили таким образом, чтобы расстояние от места нанесения до левого или правого края пластины, а также между пятнами составляло не менее 2 см. Сушку проб осуществляли с помощью нагревательного устройства для сушки пластины УСП-1 (ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар) при температуре около 50°С. Использовали стеклянную хроматографическую камеру размером 150x120x80 мм. Насыщение камеры парами подвижной фазы (ПФ) проводили в течение 20-30 мин.

Пробег фронта растворителя составлял 8,5 см. Проявление пятен водорастворимых витаминов проводили под УФ-лампой при длинах волн 254 и 365 нм (УФС 254/365, ЗАО «Сорбполимер», г. Краснодар) после высушивания хроматографи-ческой пластинки в сушильную шкафу при температуре 100°С в течение 5 мин.

2.5 ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Исследование проводили в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ. В работе использовали градиентный ВЭЖХ храматограф Vertex Model 500 (США). Колонка SinoChrom ODS-BP (4,6 мм х 200 мм, Си, 5 мкм). Температура колонки 30°С. Скорость потока 1,0 мл/мин. Объем пробы 20 мкл. Детектирование при длине волны 254 нм.

Управление прибором и расчет хроматографических параметров осуществляли с использованием программы «N2000 Chrom» (Getto Tech., Китай).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

3.1 ИК-СПЕКТРОСКОПИЯ

3.1.1. Анализ ИК-спектров водорастворимых витаминов

Было проведено исследование водорастворимых витаминов с использованием метода ИК-спектроскопии. Пробоподготовку осуществляли путем диспергирования испытуемых лекарственных веществ в вазелиновом масле.

На рис. I в качестве примера представлен ИК-спектр кислоты аскорбиновой. В изучаемых спектрах полосы около 2955, 2924, 2855 см"1 соответствуют валентным колебаниям vc-h. 1462, 1378 и 722 см"1 - деформационным колебаниям 5С.Н вазелинового масла. Полосы с частотами около 2361, 2346, 2334 и 666 см"1 соответствует колебаниям присутствующего в атмосфере углекислого газа.

На основании анализа спектров субстанции кислоты аскорбиновой имеющихся в нашем распоряжении серий и производителей были выделены следующие характеристических полосы поглощения: \с=о в у-бутиролактоне (1755 см"1), Ус=с (1675 см"1), ум(с.0.с) (1322 см"1) и у5(С-о-с) (1026 см"1).

3.1.2. ИК-спестры препаратов водорастворимых витаминов

В данной работе также решалась задача получения ИК-спектров водорастворимых витаминов в готовых лекарственных формах без предварительного извлечения действующего вещества. Нами было показано на примере кислоты аскорбиновой (рис.2), что при достаточно большом содержании действующего вещества в лекарственной форме «таблетки» (не менее 30-40%) можно получать ИК-спектр, на котором видны практически все полосы поглощения активной субстанции. При относительно высоком содержании активной субстанции в препарате ИК-спектр мож-

но получать напрямую - вспомогательные вещества не искажают картину и не маскируют полосы действующего вещества.

Рис.2. ИК-спектр таблеток Витамин С в вазелиновом масле (Nanjing Baijingyu Pharm, Китай).

Из рис. 1 и 2 видно, что ИК-спектры субстации и таблеток Витамин С (Nanjing Baijingyu Pharm, Китай) различают крайне незначительно - практически совпадают. Аналогичная ситуация наблюдается и для других водорастворимых витаминов. При этом содержание действующего вещества в таблетках кислоты аскорбиновой составляет в среднем около 67%.

Дальнейшие исследования методик непосредственного получения ИК-спектров содержимого порошка измельченных таблеток при низких концентрациях кислоты аскорбиновой в таблетках в виде пасты с маслом вазелиновым показали, что образы нуждаются в предварительной экстракции действующего вещества и его концентрировании (рис. 3). Для экстракции кислоты аскорбиновой из таблеток был выбран спирт 96%.

ВИТА, Россия) после проведения экстракции спиртом 96%.

В настоящей работе был составлен атлас ИК-спектров субстанций и препаратов водорастворимых витаминов с целью их последующего использования в качестве стандартных. Таким образом, разработаны методики подтверждения подлинности кислоты аскорбиновой в таблетках методом ИК-спектроскопии, которые могут быть использованы для выявления фальсифицированных препаратов, содержащих указанное вещество.

3.2 БИК-СПЕКТРОСКОПИЯ

3.2.1 Идентификация и дискриминация кислоты аскорбиновой

методом БИК-спектроскопии

На рис. 4 представлены БИК-спектры субстанций кислоты аскорбиновой разных производителей с фальсификатом. Видно, что гранулят 97% отличается от порошкообразных субстанций только по интенсивности спектров. Фальсифициро-

ванная субстанция кислоты аскорбиновой отличается от других субстанций и грану-лята. БИК-спектры таблеток кислоты аскорбиновой имели заметные отличия, проявляющиеся в основном в интенсивностях основных полос поглощения на отдельных участках спектров (рис. 5). Это может быть связано с разным составом вспомогательных веществ и с различным содержанием кислоты аскорбиновой в таблетках. Методика сравнения БИК-спектров может использоваться для установления подлинности препаратов только с концентрацией кислоты аскорбиновой в препарате свыше 25-30%. В этом случае в БИК-спектре можно увидеть полосы действующего вещества.

сравнении с фальсифицированным образцом.

от 25,16% до 66,67%.

В резульлате хемометрической обработки БИК-спектров (дискриминатный анализ, расчет расстояния Махаланобиса) нескольких серий субстанции кислоты аскорбиновой от разных производителей было показано, что все спектры порошкообразных субстанций достоверно различаются: расстояние Махаланобиса во всех случаях превышало За (критическое расстояние Махаланобиса - За при вероятности 95%) (табл. 2).

Подходы к классификации таблеток кислоты аскорбиновой были аналогичны методу классификации субстанций (табл. 3). Ясно, что таблетки различных фирм имели достоверные различия. При дискриминатном анализе чем больше расстояние Махаланобиса между центроидами классов образцов, тем больше различаются эти классы.

Табл.2. Статистические расстояния (единицы Махаланобиса) по оси абсцисс при дискриминатном анализе БИК-спектров порошкообразных субстанций кислоты аскорбиновой от 7 разных производителей. (1)фирма «Vitabiotics»; (2)фирма «Hubei Maxpharm»; (З)фирма «Hebei Belcom»; (4)фирма «Shenyang Beisheng»; (5)фирма

Номер 2 3 4 5 6 7

1 20 23 19 18 27 19

2 14 5 10 20 15

3 14 7 9 8

4 11 21 14

5 14 8

6 13

Табл.3. Статистические расстояния (единицы Махаланобиса) по оси абсцисс при дискриминатном анализе БИК-спектров таблеток кислоты аскорбиновой от 10 разных производителей. (1)фирма «Nanjing Baijingyu»; (2)фирма «Vita соте»; (З)фирма «Tsindao Haidewei»; (4)фирма «Hemofarm»; (5)фирма «Zentiva»; (б)фирма «Marbiopharm»; (7)фирма «Hainan Yangshengtang»; (8)фирма «Bristol-Myers Squibb»;

Номер 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 17 8 8 10 11 12 20 6 24

2 15 14 13 13 13 17 15 9

3 5 5 9 11 18 7 22

4 4 10 9 17 6 21

5 9 8 15 7 21

6 9 18 9 20

7 13 9 21

8 16 21

9 23

Полученные результаты свидетельствуют о возможности после расширения банка данных по производителям проводить идентификацию любого БИК-спектра субстанции или препарата кислоты аскорбиновой на принадлежность тому или иному производителю. Соответствующие электронные базы позволят определять «источник происхождения» лекарственного средства и осуществлять контроль рынка обращения, что особенно актуально в настоящее время.

3.2.2 Количественное определение кислоты аскорбиновой

методом БИК-спектроскопии

Из 78 образцов (с концентрацией кислоты аскорбиновой от 0,83% до 66,67%) были случайным образом выбраны 66 образцов и создан обучаюший набор для создания статистической модели количественного анализа. Остальные 12 образцов были отобраны для проверочного набора, который используется для оценки достоверности модели прогнозирования.

При разработке калибровок спектров использовали метод проекции на латентные структуры (РЬБ). Точность калибровки принято характеризовать величинами среднеквадратичного остатка калибровки (ЯМЭЕС) и среднеквадратичного остатка прогноза (ЯМ Б ЕР). Чем меньше ЯМ5ЕС и ЯМБЕР, тем точнее описываются обучающие данные. Кроме того, качество калибровки характеризуется еще и коэффициентом корреляции г2 - чем он ближе к единице, тем достовернее модель.

При предварительной обработке спектров используется метод множественной коррекции сигнала (МБС) для уменьшения влияния случайного шума и сглаживания сигнала. В табл. 4 представлены результаты хемометрических параметров (ЯМБЕС, ЯМ8ЕР и г2) при обработке спектров в диапазонах выбранных самой программой со вторыми производными спектрами.

Табл.4. Результаты расчета хемометрических параметров.

Метод предварительной обработки спектров Диапазон спектров (ст-1) RMSEC RMSEP Г2

Метод множественной коррекции сигнала (MSC) со вторыми производными спектрами 4065,21 -4034,35 4466,33-4435,47 5712,12-5685,12 2,14% 1,70% 0,99185

В табл. 5 представлены результаты анализа проверочных образцов с использованием данной хемометрической модели при определении концентрации кислоты аскорбиновой в таблетках. Из полученных данных следует, что проведение количественного определения кислоты аскорбиновой в таблетках реально возможно при

её содержании в лекарственной форме на уровне не менее 25%. При снижении массовой доли кислоты аскорбиновой в общем случае существенно возрастает относительная ошибка определения.

Табл.5. Результаты анализа проверочных образцов.

Номер Образца Номинальное содержание кислоты аскорбиновой в таблетке(%) Полученное значение содержания кислоты аскорбиновой(%) Отклонение от номинального содержания (%)

1 66,67 67,22 0,85

2 33,38 31,55 5,48

3 27,03 26,65 1,41

4 25,32 25,49 3,98

5 25,16 24,80 1,43

6 25,16 29,03 15,38

7 15,38 16,19 5,27

8 10,42 7,53 17,52

9 10,26 11,36 10,70

10 5,88 4,85 17,52

11 1,67 1,61 3,59

12 0,83 1,04 25,30

3.3 УФ-СПЕКТРОФОТОМЕТРИЯ

3.3.1. Анализ УФ-спектров водорастворимых витаминов

Наличие сложных сопряженных систем в структурах водорастворимых вита минов дает возможность широкого применения УФ-спектрофотометрии для их фарма копейного анализа. 1Р и ШР регламентируют при установлении подлинности сравне ние УФ-спектров испытуемой субстанции со спектрами стандартных образцов. ГФ, С] ЕР (ВР) и ,1Р при установлении подлинности регламентируют сравнение УФ-спектро испытуемой субстанции со стандартными спектрами.

В табл. 6 представлены спектральные характеристики лекарственных средст водорастворимых витаминов. Жирным шрифтом обозначен главный максиму» поглощения.

Полученные УФ-спектры могут быть использованы при анализе водорастворимых витаминов по разделу НД «подлинность» (рис. 6-9).

Рис.6. УФ-спектр тиамина гидрохлорида (8 мкг/мл) в растворе кислоте хлористоводородной 0,9%.

Рис.8. УФ-спектр пиридоксина гидрохлорида (15мкг/мл) в воде (рН~6,0).

0,005 М.

Табл.6. Характеристика УФ-спектров водорастворимых витаминов.

Лекарственное вещество Спектральные характеристики

Растворитель Основные максимумы поглощения, нм Приблизительное значение А (1%, 1 см)

Тиамина гидрохлорид HCl 0,9% 246,0 421

444,5 323

Рибофлавин CH3COONa 373,5 290

0,01% 266,5 223,0 855 827

Пиридоксина гидрохлорид Вода (pH = 6,0) 291,0 430

Аскорбиновая кислота 0,005 М H2S04 243,0 525

3.3.2. Количественное определение водорастворимых витаминов методом УФ-спектрофотометрии

Количественное определение проводится в диапазоне концентраций, в коте ром не происходит отклонений от линейной зависимости. Из полученных результг тов следует, что линейная зависимость соблюдается во всем изученном диапазон (табл. 7). Относительная погрешность количественного определения тиамина гидре хлорида - 2,19%, рибофлавина - 1,19%, пиридоксина гидрохлорида - 1,27% и кис лоты аскорбиновой - 2,26%, а полученные средние значения близки к номинальны] (табл. 8).

Табл.7. Результаты изучения зависимости оптической плотности от концентраци стандартного раствора (проверка линейности). С - концентрация (мкг/мл).

Лекарственное вещество Диапазон концентраций Уравнение К2

Тиамина гидрохлорид 2-20 мкг/мл А = 0,0471 хС-0,0243 0,9997

Рибофлавин 10-60 мкг/мл А = 0,0082 X С + 0,002 0,9999

Пиридоксина гидрохлорид 5-40 мкг/мл А = 0,0382 X С - 0,045 0,9999

Аскорбиновая кислота 2-20 мкг/мл А = 0,050ЭхС + 0,0037 0,9996

Табл.8. Метрологическая оценка методик количественного определения водорастворимых витаминов в таблетках методом УФ-спектрофотометрии.

Препарат Р Хном.мг Хср,мг Э2 Эхср а% 1(а, ^ ДХ £%

Витамин В, 4 10 10,04 1,68 0,028 0,17 0,08 95 2,78 0,22 2,19

Витамин В2 4 40 39,46 0,97 0,146 0,38 0,17 95 2,78 0,47 1,19

Витамин В6 4 15 14,97 1,10 0,027 0,16 0,07 95 2,78 0,19 1,27

Витамин С 4 10 9,74 1,71 0,029 0,17 0,08 95 2,78 0,22 2,26

Разработанные методики пригодны для анализа таблеток, содержащих указание водорастворимые витамины, по разделу НД «количественное определение». Полученные средние значения содержания действующих веществ близки к номинальным.

3.4 ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Нами проведены исследования по разработке методик анализа водорастворимых витаминов методом ТСХ с использованием высокоэффективных пластинок (ПТСХ-АФ-В-УФ) «Сорбфил» размером 10x10 см. Для снижения эффекта размывания пятен водорастворимых витаминов рекомендовано проводить предварительную об-работку пластинок «Сорбфил» ПТСХ-АФ-В-УФ 25% раствором аммиака.

Изучено хроматографическое поведение исследуемых веществ в различных системах растворителей, описанных в научной литературе, и установлено, что они нуждаются в модификации при использовании российских пластин.

В результате проведенных исследований для подтверждения подлинности субстанций и монопрепаратов были выбраны подвижные фазы, указанные в таблице 9.

В этих условиях значения Яг пятен водорастворимых витаминов находятся в диапазоне 0,39-0,59, что является оптимальным.

Табл.9. Результаты хроматографического анализа тиамина гидрохлорида, риб( флавина, пиридоксина гидрохлорида, аскорбиновую кислоту с использование метода ТСХ.

Наименование Подвижная фаза Рабочая концентрация, мг/мл Знамени

Тиамина гидрохлорид этилацетат-метанол -раствор аммиака 25% (10:2:3) 1 0,49

Рибофлавин бутанол-метанол-бензол-вода (25:10:10:8) 0,5 0,48

Пиридоксина гидрохлорид пропанол-бутанол-вода -раствор аммиака 25% (10:7:1:2) 1 0,59

Аскорбиновая кислота метиленхлорид-этилацетат-этанол-муравьиная кислота (5:2:2:1) 2 0,39

В результате был подобран оптимальный состав ПФ, являющийс универсальным для анализа всех исследованных водорастворимых витамине группы В: бутанол-ацетон-вода (25:5:9). Диэлектрическая проницаемость данно ПФ, рассчитанная как среднее взвешенное значение, около 32. Значения Иг пяте комплексных водорастворимых витаминов находятся в пределах 0,05-0,68. Дл витамина В, лучше использовать собственную подвижную фазу. На рис. 10 схемат! чно представлена соответствующая хроматограмма.

Детектирование в УФ-свете с использованием разработанной методики позве ляет различать пятна при нанесении на линию старта тиамина гидрохлорид 2 мк рибофлавина 1 мкг, пиридоксина гидрохлорид 2 мкг, никотинамида 2 мкг и фоли< вой кислоты 1 мкг.

При проведении детектирования было отмечено, что тиамин, рибофлавш пиридоксин и фолиевая кислота различаются по способности флуоресцировать УФ-свете. Пятна никотинамида и аскорбиновой кислоты проявляются только пр облучении светом УФ-лампы при длине волны 254 нм (темные пятна на люмине< цирующем фоне пластины). Для проявления пятен аскорбиновой кислоты требуете обработка парами йода. При облучении УФ-светом с длинной волны 365 нм инте! сивность флуоресценции рибофлавина значительно увеличивается (ярко-желте свечение) Все другие исследовавшиеся в данной работе (тиамин, пиридоксин фолиевая кислота) при длине волны 365 нм детектируются в виде пятен темш синего цвета.

0.68

8® О

032 О

О

815

О

одз

О

1 I 3 4 5

Рис.10. ТСХ комплексных водорастворимых витаминов В группы в ПФ бутанол-ацетон-вода (25:5:9). Рядом с пятнами указаны значения Ло

1-тиамина гидрохлорид или тиамина мононитрат

2-рибофлавин

3-пиридоксина гидрохлорид

4-никотинамид

5-фолиевая кислота

Разработанные методики являются воспроизводимыми, экспрессными, доступными и могут использоваться для выявления фальсифицированных препаратов, не содержащих указанные на упаковке лекарственные вещества, и для анализа лекарственных витаминных препаратов по разделу НД «подлинность».

3.5 ВЫСОКОЭФФЕКТИВНАЯ ЖИДКОСТНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ

Нами была разработана унифицированная методика установления подлинности и количественного определения рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида и никотинамида в поливитаминых препаратах «Центрум».

В качестве растворителя для извлечения витаминов из препарата использовали смесь ацетонитрила, кислоты уксусной ледяной и воды в соотношении 5:1:94.

Экспериментально нами была подобрана подвижная фаза, включаящая кислоту уксусную ледяную, метанол и воду в соотношении 5:270:725 с добавкой гептан-сульфоната натрия 2 ммоль/л.

На рис. 11 представлена хроматограмма раствора таблеток «Центрум» с концентрациями рибофлавина (13,6 мкг/мл), пиридоксина гидрохлорида (16 мкг/мл) и никотинамида (160 мкг/мл).

В табл. 10 представлены параметры пригодности хроматографической системы, полученные после 5 последовательных введений стандартных растворов. Из представленных данных видно, что полученные параметры соответствуют не только современным общим фармакопейным требованиям к пригодности хроматографической системы, но и удовлетворяют более строгим требованиям.

Рис.11. Хроматограмма испытуемого раствора таблеток «Центрум» при использ вании ПФ вода-метанол-кислота уксусная ледяная (725: 270: 5) + гептансульфон! натрия 2 ммоль/л.

Табл.Ю. Хроматографические характеристики и параметры пригодности систем при 5 последовательных введениях стандартных растворов в концентрации вит мина В2 - 13,6 мкг/мл, Вб - 16 мкг/мл, РР - 160 мкг/мл.

Лекарственное вещество Ъг, мин в/Ы 1^0% А5 N

Рибофлавин 20,998 1600 0,5 1,21 7300

Пиридоксина гидрохлорид 12,132 1400 0,4 1,33 8200

Никотинамид 5,648 1300 0,8 1,08 1100

Табл.11. Метрологическая оценка методик количественного определения водорас воримых витаминов в таблетках «Центрум» методом ВЭЖХ.

Лекарственное вещество в таблетке Хном, Мг Хер, мг в2 в ЭХср А% 1(0, ^ ДХ Е1

Рибофлавин 4 1,7 1,728 0,0041 0,064 0,011 95 2,78 0,031

Пиридоксина гидрохлорид 4 2,0 1,944 0,0216 0,147 0,066 95 2,78 0,184

Никотинамид 4 20 20,082 0,555 0,745 0,333 95 2,78 0,926 4,<

Метрологическая оценка разработанной методики (табл.11) показывает, ч" относительная погрешность количественного определения рибофлавина - 1,79° пиридоксина гидрохлорида - 9,28% и никотинамида - 4,64%. Полученные средш значения близки к номинальным.

Разработанные методики пригодны для анализа таблеток, содержащих ука-заные водорастворимые витамины, по разделам НД «подлинность» и «количественное определение».

ВЫВОДЫ

1. Разработана унифицированная методика анализа субстанций и лекарственных препаратов водорастворимых витаминов методом ИК-спектроскопии и составлен атлас соответствующих ИК-спектров в вазелиновом масле, которые предлагаются для использования в качестве стандартных при анализе по разделу нормативной документации «подлинность» и для выявления фальсификатов, не содержащих указанное на упаковке действующее вещество.

2. Показано, что метод ближней ИК-спектроскопии в сочетании с дискрими-натным анализом может быть использован для подтверждения подлинности субстанций кислоты аскорбиновой и идентификации их производителя. Установлено, что возможна идентификация таблеток кислоты аскорбиновой с определением их производителя при содержании кислоты аскобиновой в препарате от 25% и выше.

Построена калибровочная модель, позволяющая определять процентное содержание кислоты аскорбиновой в таблетках. Количественный анализ рекомендуется проводить при содержании данного действующего вещества в таблетках на уровне не менее 25%.

3. Разработаны методики анализа субстанций и препаратов водорастворимых витаминов методом УФ-спектрофотометрии, которые можно использовать в разделах нормативной документации «подлинность» и «количественное определение». Относительная погрешность количественного определения тиамина гидрохлорида - 2,19%, рибофлавина - 1,19%, пиридоксина гидрохлорида- 1,27% и кислоты аскорбиновой - 2,26%.

4. Разработаны условия метода ТСХ и методики пробоподготовки субстанций и препаратов водорастворимых витаминов. Подобраны оптимальные составы подвижных фаз: для тиамина гидрохлорида - этилацетат-метанол-раствор аммиака 25% (10:2:3); для рибофлавина - бутанол-метанол-бензол-вода (25:10:10:8); для пиридоксина гидрохлорида - пропанол-бутанол-вода-раствор аммиака 25% (10:7:1:2) и для кислоты аскорбиновой - метиленхлорид-этилацетат-этанол-муравьиная кислота (5:2:2:1).

Разработан унифицированный состав подвижной фазы для комплексных вод растворимых витаминов группы В бутанол-ацетон-вода (25:5:9), позволяют! одновременно анализировать тиамин, рибофлавин, пиридоксин, никотинам! и фолиевую кислоту.

Разработанные методики могут использоваться для выявления фальсифицир ванных препаратов, не содержащие указанные на упаковке лекарственш вещества, и для анализа лекарственных витаминных препаратов по разде; нормативной документации «подлинность».

5. Установлено, что одновременный анализ лекарственных средств водораствор мых витаминов (рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида и никотинамид методом обращенно-фазовой ВЭЖХ возможен в подвижной фазе - вод метанол: кислота уксусная ледяная (725: 270: 5) с добавлением гептансульф ната натрия 2 ммоль/л.

Разработанная методика ВЭЖХ предлагается для стандартизации и kotpoj качества субстанций и препаратов водорастворимых витаминов (рибофлавин пиридоксина гидрохлорида и никотинамида) в лекарственной фор» «таблетки» по разделам «подлинность» и «количественное определение Относительная погрешность количественного определения рибофлавина 1,79%, пиридоксина гидрохлорида - 9,28% и никотинамида - 4,64%.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Ся Юй, Арзамасцев А.П. Сравнительный анализ методик ТСХ для стандарт] зации водорастворимых витаминов // Вопросы биологической, медицинской фармацевтической химии. - 2009. - № 4. - С. 37-40.

2. Ся Юй, Дорофеев B.J1. Анализ аскорбиновой кислоты методом ближне инфракрасной спектроскопии //Фармация. -2010. -№ З.-С. 9-12.

3. Ся Юй, Дорофеев В.Л., Арзамасцев А.П. Установление подлинности ког плексных препаратов водорастворимых витаминов группы В с испол зованием метода ТСХ // Человек и лекарство: Тез. Докл. XVII Росс. нац. конг -М., 2010.-С. 549.

4. Ся Юй, Дорофеев B.JI., Арзамасцев А.П. Установление подлинности лека] ственных препаратов, содержащих действующее вещество аскорбиновс кислоты методом ИК-спектроскопии // Человек и лекарство: Тез. Докл. XV Росс. нац. конгр. - М., 2010. - С. 549.

Подписано в печать: 27.09.10

Объем: 1,5 усл.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 765 Отпечатано в типографии «Реглет» 119526, г.Москва, пр-т Вернадского,39 (495) 363-78-90; www.reglet.ru

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ

Возрастающие требования к безопасности, эффективности и качеству лекарственных средств обусловливают необходимость разрабатывать новые и совершенствовать существующие методы их анализа.

Витамины являются незаменимыми веществами, необходимыми для роста, развития и жизнедеятельности человека. Большинство витаминов в организме не синтезируется, источником их обычно является внешняя среда. Традиционно различают водорастворимые и жирорастворимые витамины.

Витаминные препараты широко используютсят для стимуляции и регуляции физиологических процессов, профилактики и лечения ряда заболеваний при гипо- и авитаминозах, повышения общей устойчивости организма к экзогенным и эндогенным неблагоприятным факторам.

На сегодняшний день рынок переполнен витаминными препаратами, они имеют различные составные элементы и выпускаются в разных лекарственных формах. На фармацевтическом рынке существует большое количество дженериков или многоисточниковых препаратов, содержащих витамины.

Качество препаратов-дженериков обеспечивается комплексом аналитических методов, позволяющих подтвердить их подлинность, определить чистоту и количественное содержание действующего вещества. Используемые для этого методы и методики нуждаются в постоянном совершенствовании. Необходимо также учитывать сохраняющуюся проблему фальсификации лекарственных средств. Учитывая вышеизложенное, актуальной является проблеме сравнительного изучения физико-химических методов, используемых для анализа лекарственных средств водорастворимых витаминов.

ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

Целью исследования являлось сравнительное изучение современных физико-химических методов анализа лекарственных средств водорастворимых витаминов.

Для достижения поставленной цели решали следующие задачи: провести анализ состояния методов стандартизации и контроля качества лекарственных средств, включая международные программы и зарубежные фармакопеи; разработать унифицированную методику анализа субстанций и препаратов водорастворимых витаминов методом ИК-спектроскопии в средней области и составить атлас ИК-спектров; разработать методики установления подлинности и количественного опреде-ления субстанций и , препаратов г водорастворимых витаминов методами ИК-спектроскопии в ближней областях; разработать методики установления подлинности и количественного опреде-ления лекарственных средств водорастворимых витаминов методами УФ-спектроскопии; изучить хроматографические характеристики и разработать унифицированную методику установления подлинности водорастворимых витаминов методом ТСХ; изучить хроматографические характеристики и разработать методику установления подлинности и количественного определения витаминов группы В методом ВЭЖХ.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА ИССЛЕДОВАНИЯ

Составлен атлас ИК-спектров субстанций и лекарственных препаратов водорастворимых витаминов различных производителей в вазелиновом масле. Изучены спектральные характеристики лекарственных средств кислоты аскорбиновой в средней и ближней инфракрасных областях.

Показана возможность использования метода БИК-спектроскопии для установления подлинности субстанций и препаратов кислоты аскорбиновой.

Построены модели для таблеток кислоты аскорбиновой, позволяющие идентифицировать производителя субстанции или препарата методом БИК-спектроскопии.

Впервые построена калибровочная модель, позволяющая определять процентное содержание кислоты аскорбиновой в таблетках методом БИК-спектроскопии. Установлено, что при идентификации и количественном определении таблеток кислоты аскорбиновой методом БИК-спектроскопии, содержащие действующего вещества в них должно составлять не менее 25%.

Впервые разработаны унифицированные методики установления подлинности тиамина гидрохлорида, рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида, никотинамида и фолиевой кислоты методами ТСХ и ВЭЖХ.

Разработаны методики пробоподготовки субстанций и лекарственных препаратов водорастворимых витаминов для анализа методами ТСХ и ВЭЖХ. Изучено влияние подвижных фаз различного состава на хроматографические характеристики водорастворимых витаминов при их анализе данными методами.

Предложены новые условия подтверждения подлинности водорастворимых витаминов в субстанциях и лекарственных препаратах с использованием российских пластин «Сорбфил» для высокоэффективной тонкослойной хроматографии.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ ИССЛЕДОВАНИЯ

Полученные РЖ-спектры в средней и ближней областях и

УФ-спектры могут быть использованы при стандартизции и контроле качества по разделу «подлинность» соответствующей НД на субстанции и лекарственные препараты водорастворимых витаминов.

Методики установления подлинности и количественного определения методами УФ- и БИК-спектрофотометрии, методика установления подлинности водорастворимых витаминов методами ТСХ и ВЭЖХ предлагаются для стандартизации и контроля качества субстанций и лекарственных препаратов данной группы лекарственных средств с последующим их включением в соответствующие разделы НД.

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК

Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии Первого МГМУ им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств» (№ гос. регистрации 01.200.110545).

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010 г.). Апробация работы проведена на научно-практическом заседании кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета Первого МГМУ имени И.М.Сеченова 14 июня 2010 года.

выводы

1. Разработана унифицированная методика анализа субстанций и лекарственных препаратов водорастворимых витаминов методом ИК-спектроскопии и составлен атлас соответствующих ИК-спектров в вазелиновом масле, которые предлагаются для использования в качестве стандартных при анализе по разделу нормативной документации «подлинность» и для выявления фальсификатов, не содержащих указанное на упаковке действующее вещество.

2. Показано, что метод ближней ИК-спектроскопии в сочетании с дискриминатным анализом может быть использован для подтверждения подлинности субстанций кислоты аскорбиновой и идентификации их производителя.

Установлено, что возможна идентификация таблеток кислоты аскорбиновой с определением их производителя при содержании кислоты аскобиновой в препарате от 25% и выше. Построена калибровочная модель, позволяющая определять процентное содержание кислоты аскорбиновой в таблетках. Количественный анализ рекомендуется проводить при содержании данного действующего вещества в таблетках на уровне не менее 25%.

3. Разработаны методики анализа субстанций и препаратов водорастворимых витаминов методом УФ-спектрофотометрии, которые можно использовать в разделах нормативной документации «подлинность» и «количественное определение». Относительная погрешность количественного определения тиамина гидрохлорида — 2,19%, рибофлавина — 1,19%, пиридоксина гидрохлорида — 1,27% и кислоты аскорбиновой — 2,26%.

4. Разработаны условия метода ТСХ и методики пробоподготовки субстанций и препаратов водорастворимых витаминов. Подобраны оптимальные составы подвижных фаз: для тиамина гидрохлорида — этилацетат-метанол-раствор аммиака 25% (10:2:3); для рибофлавина бутанол-метанол-бензол-вода (25:10:10:8); для пиридоксина гидрохлорида — пропанол-бутанол-вода-раствор аммиака 25% (10:7:1:2) и для кислоты аскорбиновой — метиленхлорид-этилацетат-этанол-муравьиная кислота (5:2:2:1). Разработан унифицированный состав подвижной фазы для комплексных водорастворимых витаминов группы В бутанол-ацетон-вода (25:5:9), позволяющий одновременно анализировать тиамин, рибофлавин, пиридоксин, никотинамид и фолиевую кислоту.

Разработанные методики могут использоваться для выявления фальсифицированных препаратов, не содержащие указанные на упаковке лекарственные вещества, и для анализа лекарственных витаминных препаратов по разделу нормативной документации «подлинность».

5. Установлено, что одновременный анализ лекарственных средств водорастворимых витаминов (рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида и никотинамида) методом обращенно-фазовой ВЭЖХ возможен в подвижной фазе — вода: метанол: кислота уксусная ледяная (725: 270: 5) с добавлением гептансульфаната натрия 2 ммоль/л.

Разработанная методика ВЭЖХ предлагается для стандартизации и котроля качества субстанций и препаратов водорастворимых витаминов (рибофлавина, пиридоксина гидрохлорида и никотинамида) в лекарственной форме «таблетки» по разделам «подлинность» и «количественное определение». Относительная погрешность количественного определения рибофлавина — 1,79%, пиридоксина гидрохлорида — 9,46% и никотинамида - 4,61%.