Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое изучение хрена обыкновенного

На правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА ЕЛЕНА ЮРЬЕВНА

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ХРЕНА ОБЫКНОВЕННОГО

15.00.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Москва 2004 год

Работа вьтолнена в Московской Медицинской Академии имени И.М. Сеченова

Научные руководители:

Доктор фармацевтических наук, профессор О.В. Нестерова Доктор химических наук, ведущий научный сотрудник М.А. Орлова

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук, профессор А. С. Берлянд Доктор химических наук, профессор Н.В. Зык

Ведущая организация - Институт Государственного контроля лекарственных средств

Защита состоится « »_2004г. в_часов на

заседании диссертационного совета Д 212.203.13 в Российском университете дружбы народов по адресу: 117198, ГСП, Москва, ул. Миклухо - Маклая, д. б.

Автореферат разослан « »_2004 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, Кандидат фармацевтических наук, доцент

Т.П. Лагуткина

Общая характеристика работы Актуальность темы.

Интерес к лекарственным растениям повышается с каждым годом. Важной задачей современной науки представляется поиск новых эффективных средств растительного происхождения. Все чаще современная медицина обращается к фитопрепаратам, которые используются в качестве полуфункциональных средств для лечения и профилактики различных заболеваний. Известно, что задача всех фитокомплексов, содержащих биологически активные вещества (полифенолы, сапонины и др.) оказывать адаптогенное влияние на живой организм, мобилизируя его гомеостатические механизмы.

Постоянно расширяющийся ассортимент лекарственных растительных средств требует эффективного контроля их качества, поэтому исследования, направленные на разработку и совершенствование нормативной документации имеет большое значение.

Корневище и корни хрена издавна использовались в народной медицине как противовоспалительное, противоцинготное, противомикробное, мочегонное, раздражающее, отхаркивающее, витаминное, фитонцидное средство. Несмотря на широкое использование фитотерапевтами, сырье корневище и корни хрена в России не является официнальным.

Благодаря разнообразному химическому составу и широкому спектру действия корневище и корни хрена рассматриваются как перспективный источник лекарственного растительного сырья, вследствие чего возникает необходимость более подробного изучения фитохимического состава и разработки обоснованной нормативной документации.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы явилось изучение физико-химических и фармакогностических характеристик нового вида лекарственного растительного сырья, корневище и корни хрена обыкновенного, обоснование методов определения подлинности и доброкачественности с последующей разработкой

показателей качества нормируемых при с 1 |

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести фотохимическое изучение сырья корневище и корни хрена с выбором основных групп БАВ и последующим определением их содержания;

2. Изучить особенности выделения липидного комплекса из сырья корневище и корни хрена различными экстрагентами, и на основании проведенных исследований разработать оптимальные условия выделения;

3. Определить физико-химические показатели и разработать характеристики подлинности липидного комплекса сырья;

4. Изучить пероксидазную активность сырья корневище и корни хрена;

5. Разработать характеристики подлинности сырья корневище и корни хрена:

- исследование внешних признаков сырья,

- проведение микроскопического анализа и выявление диагностических признаков сырья;

- исследование качественных реакций на основные биологически активные вещества (БАВ);

6. Определить содержания: влаги, золы общей и нерастворимой в соляной кислоте, органической и минеральной примесей в сырье хрена и на их основе нормировать числовые показатели данного сырья;

7. На основании полученных данных обосновать необходимые показатели качества и методы стандартизации сырья корневища и корней хрена.

Научная новизна.

Впервые проведено исследование пероксидазной активности корневища и корней хрена и на основании полученных данных рекомендовано включение водно-спиртового экстракта из сырья хрена в комплексное профилактическое средство для применения в стоматологической практике при заболеваниях

пародонта, принятое на рассмотрение институтом патентной экспертизы (заявка на изобретение № 110.390 от 07.04.04 г.).

Разработаны оптимальные условия выделения липидного комплекса из корневища и корней хрена различными методами экстракции.

Впервые определены физико-химические показатели липидного комплекса и разработаны характеристики подлинности липидного комплекса.

Выявлены диагностические признаки корневища и корней хрена на основании проведенного анатомо-морфологического анализа. Проведены качественные реакции на основные БАВ.

Определены и нормированы числовые показатели: влаги, золы общей и нерастворимой в соляной кислоте, органической и минеральной примесей в сырье корневища и корни хрена.

На основании полученных данных были обоснованы показатели качества и методы стандартизации сырья корневище и корни хрена обыкновенного.

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований апробированы и внедрены:

в лаборатории ОАО «Красногорсклексредства» методики количественного определения липидного комплекса и суммы фенольных соединений в измельченных корнях хрена обыкновенного;

на ЗАО АПФ «Фито-ЭМ» в процесс контроля качества определения показателей подлинности сырья корневище и корни хрена обыкновенного.

Изучена пероксидазная активность экстрактов из сырья корневище и корни хрена, дана рекомендация для использования пероксидазы хрена в качестве пищевых добавок

Разработан проект фармакопейной статьи (ФС) на сырье корневище и корни хрена в основу которого положены разработанные характеристики подлинности корневища и корней-хрена с установлением диагностических признаков; определены и нормированы числовые показатели на данное сырье, которые могут быть включены в соответствующие проекты ФС.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены

на:

- Межкафедральной конференции кафедр медико-профилактического и фармацевтического факультетов ММА им. И.М. Сеченова (Москва, май 2004 г.).

2-ой Российской научно-практической конференции «Актуарные проблемы инноваций с нетрадиционными природными ресурсами и создания функциональных продуктов» (Москва 2003 г.)

Научной конференции «Биоактивные вещества, синтез, изучение применение» (Ташкент 2003 г.)

Связь задач исследования с проблемным планом научного совета по фармации и фармакологии

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом комплексных программ научно-исследовательских работ Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по теме: «Новые знания и подходы в оценке качества и сертификации биологически активных соединений синтетического и природного происхождения, лекарственных препаратов, изделий медицинской техники» (№ государственной регистрации 01.200.118796).

На защиту выносятся:

результаты исследования пероксидазной активности и ее устойчивость к различным воздействиям, а так же стабильность пероксидазной активности в сырье методом радиационной инактивации;

результаты разработки методики количественного определения липидного комплекса в корневище и корнях хрена, используемой в качестве основного критерия доброкачественности изучаемого сырья.

результаты фармакогностического исследования корневищ и корней хрена, включающее изучение морфолого-анатомического строения

корневища и корней хрена, разработку методов определения подлинности и доброкачественности изучаемого сырья;

результаты исследований по качественной и количественной оценки биологически активных веществ (БАВ) сырья корневища и корней хрена;

результаты исследований показателей цветности порошка корневища и корней хрена до и после выделения веществ гидрофобной природы, а также липидного комплекса, полученного экстракцией хлороформом в течение 5 часов.

результаты исследования антиоксидантной активности водного и водно-спиртового извлечений из корневища и корней хрена;

Объем и структура диссертация

Диссертация изложена на 110 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав экспериментальной части, общих выводов, списка литературы из 119 источников, из них 101 на русском и 18 на иностранном языке, приложения, иллюстрирована 26 таблицами и 50 рисунками.

Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе (обзоре литературы) обобщены сведения о ботанико-морфологической характеристике корня хрена, химическом составе, роли ферментативных комплексов хрена, использование в медицине, проанализировано состояние нормативной документации ( НД).

Вторая глава (экспериментальная часть) посвящена описанию материалов и методов исследований, где проводится подробная характеристика объектов, методов исследования, приборного оснащения, реактивов, используемых в процессе работы.

Третья глава отражает информацию по изучению фитохимического состава сырья корневища и корней хрена (качественный и количественный) с использованием современных физико-химических методов исследования.

Представлены разработанные методики количественного определения доминирующих соединений.

В четвертой главе содержатся данные по стандартизации и разработке показателей качества сырья корневища и корней хрена.

Результаты, полученные при проведении исследований, обработаны статистически и представлены в таблицах, рисунках, которые приводятся в тексте.

В приложении внесены материалы по разработке НД: проект ФС на корневище и корни хрена.

Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлось сырье, представленное корневищем и корнями хрена обыкновенного (Rhizoma et radices Armoraciae rusticanae Lam), заготовленное и приведенное в стандартное состояние в соответствии с требованиями ГФ XI по сбору и сушки подземных органов.

Отбор проб сырья для исследования проводили в соответствии с требованиями общей статьи ГФ XI «Правила приемки лекарственного растительного сырья и методы отбора проб для анализа».

При стандартизации корневища и корней хрена руководствовались общими статьями ГФ XI «Корни, корневища, луковицы, клубни, клубнелуковицы».

Определение подлинности, измельченности, содержание примесей проводили согласно указаний соответствующей статьи ГФ XI. При микроскопическом исследовании и разработке диагностических признаков анализируемого объекта учитывали требования, предъявляемые к технике микроскопического исследования подземных органов.

Определение влажности, золы общей, золы нерастворимой в 10% хлороводородной кислоте проводили в соответствии с методами, описанными в статьях «Определение влажности лекарственного растительного сырья», «Определение золы» ГФ XI.

В работе использованы реактивы, растворители, стандарты, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации.

Термический анализ проводили на приборе «Дериватограф 1050-МОМ» /Венгрия/.

Хроматографический анализ групп БАВ в изучаемом сырье проводили методами тонкослойной (ТСХ), высокоэффективной жидкостной (ВЭЖХ). Эфирное масло из сырья получали перегонкой с водяным паром методом 1 (ГФ XI изд., вып.1, стр. 290).

При изучении качественного состава корневища и корней хрена методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) использовали пластинки Kieselgel 60 F234 (фирма «Merk», Германия). Анализ флавоноидов проводили в системе растворителей: 1- этилацетат - уксусная кислота-вода (25:5:5) для проявления использовали 5% спиртовой раствор хлорида алюминия. Анализ липидов проводили в системе растворителей: петролейный эфир- диэтиловый эфир-уксусная кислота (90:10:1) для проявления использовали 5% спиртовой раствор фосфорно- молибденововй кислоты.

Дня разработки показателей качества сырья корневища и корней хрена обыкновенного по содержанию действующих веществ нами разработана методика определения содержания липидного комплекса в сырье, включающая экстракцию липидного комплекса хлороформом из сырья в течение 5 часов в аппарате типа Сокслета при соотношении сырья и экстрагента 1:10, с последующим отгоном экстрагента.

Определение физико-химических показателей липидного комплекса сырья проводили в соответствии с общей статьей «Масло жирное» ГФ X. Числовые показатели - плотность, показатель преломления, кислотное число, йодное число, число омыления - определяли, применяя соответствующие методики ГФ XI.

Измерения показателей цветности проводили на отражательном спектрофотометре «Пульсар», который может применяться для определения координат цвета и цветности при источниках света А, С и D65 . Время преобразования спектрофотометрической информации в электрический сигнал -10-3 с. Время обработки и вычисления - 3 с. Диафрагма измерения 10 мм, измерительная геометрия 8° /Д с 35 фильтрами. Измерение коэффициента пропускания проводили в диапазоне длин волн 380-720 нм и рассчитывали:

-координаты цвета и цветности в системе X, Y, Z;

- координаты цвета в системе CIELAB;

- насыщенность

На спектроколориметре снимали показатели цветности исследуемого образца по показателю цветового тона Н0 и цвет исследуемого образца. Определение пероксидазной активности в экстрактах сырья корневище и корни хрена обыкновенного проводили на спектрофотометре «Shimadzu UV 120-02» при 25°С по отношению к субстратам ABTS (2,2-азино-бис(3-этилбензтиазолин-6-сульфонат) аммония) и гваякол.

Определение содержания фенольных соединений проводили с помощью УФ -спектрофотометрии по экспериментально разработанной методике. При снятии УФ -спектров и определении фенольных соединений использовали Сагу IE UV-Visible Spectrophotometer. Использовались ГСО рутин (ФС 42-2508-87), кверцетин (ФС 42-1290-79).

ВЭЖХ фенольных соединений проводили на хроматографе Shimadzu Liquid chromatograph LC-10 AS, колонке Nucleosil 5U C18 100A 250x4,6 mm. Регистрацию хроматограмм проводили с использованием аппаратно-программного комплекса Мульти Хром для Windows (Ampersand Ltd.)

Реактивы подвижной фазы: ацетонитрил, сорт 6, Криохром, Санкт -Петербург, Россия; Уксусная кислота ледяная х.ч. по ГОСТу 61-75; вода очищенная по ФС- 42-2619-89.

Статистическую обработку результатов осуществляли с использованием критерия Стьюдента.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучение фотохимического состава сырья корневища и корней

хрена.

Исследование качественного состава корневища и корней хрена.

В рамках оптимизации контроля качества целесообразна разработка методов определения подлинности и доброкачественности сырья по биологически активным веществам.

Опираясь на фармакологический скрининг и исходя из поставленных задач, основное внимание уделялось анализу доминирующих БАВ из группы эфирных масел, полифенольных соединений, аминокислот, сапонинов. Для разработки раздела «Качественные реакции» НД корневища и корней хрена были проведены реакции с водным извлечением (соотношение сырье: экстрагент - 1:10) на основные группы БАВ, используя известные фармакопейные методики. На основании проведенных исследований для определения подлинность корневища и корней хрена предлагается включить качественные реакции на флавоноиды (цианидиновая проба), на сапонины (пенообразования), на полисахариды (с 95% этиловым спиртом).

Изучение качественного состава на присутствие основных БАВ проведено также с помощью хроматографических методов анализа (ТСХ, ВЭЖХ).

Методами ТСХ на пластинках Kieselgel 60F2J4 в фенольной фракции идентифицированы с ГСО в системе (этилацетат : уксусная кислота : вода -25:5:5) рутин (с величиной Rf^0,41), кверцетин (с величиной Rf^O.iS).

Анализ липидов проводили в системе растворителей: петролейный эфир-диэтиловый эфир- уксусная кислота (90:10:1) для проявления использовали 5% спиртовой раствор фосфорно- молибденововй кислоты. В качестве образцов использовали извлечения масел из сырья корневища и корней хрена различными экстрагентами (гексан; смесь хлороформ : метанол-2:1; хлороформ : метанол 1:1; петролейный эфир).

По рассчитанным данным величины Rf во всех извлечениях были идентифицированы: моноацилглицеролы и фосфолипиды (Rf-0,00); диацил-глицеролы (Rf-0,08); высшие алифатические спирты (Rf-0,15); триацил-глицеролы (Rf-0,3-0,4); воски (Rf-0,8-0,9). В извлечениях гексаном и петролейным эфиром дополнительно были идентифицированы стерины (Rf-0,12); углеводы, каротиноиды и эфиры стеринов (Rf-0,93).

Количественное определение суммы фенольных соединений УФ-спектрофотометрическим методом.

Принимая во внимание данные о широком спектре фармакологического действия фенольных соединений, в том числе флавоноидов, а также данные о

наличие этих веществ в корневище и корнях хрена, стандартизацию сырья предлагается проводить по содержанию суммы фенольных соединений на основе метода дифференциальной спектрофотометрии, который использует реакцию комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом, сопровождающийся батохромным сдвигом УФ- спектра в сторону больших длин волн. В качестве стандартного вещества выбран рутин на основании совпадения максимума дифференциальных спектров поглощения стандартов с максимумом поглощения дифференциального спектра извлечения из корневища и корней хрена (рис. 1).

Рис.1. УФ - спектры поглощения комплекса с раствором хлоридом алюминия флавоноидов сырья корневища и корней хрена (3), ГСО рутина (2),кверцетина(1)

В результате исследования установлено, что содержание фенольных соединений в пересчете на рутин составляет не менее 2,61%.

Как видно из результатов, приведенных в таблице, относительная ошибка методики количественного определения суммы фенольных соединений, вычисляемой доверительной вероятностью 0,95, не превышает ± 5,69 %.

Идентификация содержания фенольных соединений методом ВЭЖХ.

Для анализа использовали ВЭЖХ на обратно-фазном сорбенте в условиях изократического элюирования в двух подвижных фазах при использовании УФ-детектора при длине волны 252 нм.

В качестве элюэнтов использовали смесь ацетонитрил - 3% уксусная кислота в различных соотношениях 20:80 (ПФ1); и 40:60 (ПФ2). Элюент подается на колонку со скоростью 1мл/мин при рабочем давлении 128 Бар.

Соотношение 40:60 (ПФ2) представляется наиболее удачным и для разделения изучаемых групп БАВ (рис. 2).

Идентификацию БАВ проводили путем сравнения времени удерживания пиков на хроматограммах исследуемых образцов с временами удерживания аутентичных образцов.

Определение содержания БАВ. 20 мкл раствора А (по методике определения суммы фенольных (флавоноидов) соединений спектрофотометрическим способом) вводят в инжектор жидкостного хроматографа типа «Waters», снабженного обратно-фазной колонкой 4,6x250 мм, Nucleosil 5U С18 100А. Скорость элюирования подвижной фазы- 1 мл/мин, длина волны детектора К =254 нм.

Параллельно, в тех же условиях, вводят в хроматограф 20 мкл раствора стандартного образца, соответствующего БАВ. На хроматограмме анализируемого экстракта идентифицируют пик БАВ.

Содержание БАВ в образце в %, в пересчете на абсолютно сухое сырье определяют по формуле:

- масса стандартного образца БАВ в граммах;

SST - площадь пика стандартного образца БАВ, мВ/мин или е.о.п./мин;

m - масса сырья в граммах;

S - площадь пика БАВ в растворе А мВ/мин или е.о.пУмин;

V, - объем растворителя, используемый для растворения стандартного образца;

W - потеря в массе при высушивании в процентах.

О "| 234567»9К)~П 12 13 N 15 16 17 м«к

Рис. 2. Хроматограмма 50% водно-спиртового извлечения из корневища и корней хрена в подвижной фазе: ацетонитрил - 3% уксусная кислота (40:60). 7,33 мин. время удерживания соответствующее кверцетину, 3,50 мин. - рутину. Время удерживания в мин.: 2,03; 2,20; 2,51; 5,67; 10,62 соответствует неидентифицированным веществам фенолкарбоновой природы.

В результате исследования удалось идентифицировать следующие соединения: рутин, кверцетин.

Определение антиоксидантных компонентов

Для оценки антиоксидантной активности применялся метод, разработанный Институтом Клинической Фармакологии НЦ ЭСМП РФ. К основным преимуществам этой методики можно отнести:

1. Экспрессность;

2. Проведение анализа в реальном времени;

3. Высокая точность и воспроизводимость;

4. Высокая чувствительность. Предел обнаружения: нано-, пикограммы. Нами было проведено исследование водного и водно-спиртового

извлечений корневища и корней хрена обыкновенного по оценке антиоксидантной активности. Выявлено, что антиоксидантный потенциал водного извлечения составил - 92,21 мг%, водно - спиртового -108,3 мг%.

В результате сравнительного анализа водного и водно-спиртового извлечений из хрена обыкновенного, установлено что использование водно-спиртовой экстракционной смеси приводит к более полному извлечению БАВ, обуславливающих фитоантиоксидантный эффект.

Антиоксидантный потенциал водно-спиртового извлечения является интегральным показателем качества лекарственных средств растительного происхождения и может быть успешно использован для их стандартизации.

Изучение пероксидазной активности и ее устойчивости к внешним воздействиям.

Важнейшей составляющей корневища и корней хрена является фермент -пероксидаза, принадлежащая к классу оксидоредуктаз. Пероксидазы растений имеют высокую гомологичность, но различаются структурой, что ведет к изменению их стабильности. Определение пероксидазной активности проводили с использованием известных для пероксидазы хрена субстратов: ABTS и гваякола. Метод основан на способности субстратов окисляться перекисью водорода при активном участии пероксидаз. Предварительно проводили электрофорез экстрактов, который показал низкое содержание фермента в экстрактах (метод электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия).

Результаты определения пероксидазной активности в экстрактах из корневища и корней хрена представлены в таблице 1 и на рис. 3.

Таблица 1

Пероксидазная активность экстрактов в зависимости от навески сырья

Водное извлечение Кальциевое извлечение 5%

Навеска,г 0,25 0.5 1.0 1,5 2,0 0,25 0,5 1,0 1,5 2,0

А(Е* /мл) (ABTS 0,283 0,495 0,991 1,345 2,194 1,592 3,184 6,016 8,421 8,845

А(Е/мл) (гваякол) 0,177 0,310 0,620 0,840 1,371 0,995 1,990 3,760 5,263 5,528

A(ABTS) А( гваякол) 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6 1,6

Е - единица ферментативной активности, которая равна количеству фермента в мг, который катализирует превращение 1 микромоль субстрата в минуту.

Как видно из табл.1, в водном экстракте с ростом навески пероксидазная активность увеличивается незначительно. Не наблюдается при этом и различий в зависимости от используемого субстрата. В случае кальциевого экстракта пероксидазная активность значительно выше, вероятно, это связано с тем, что ион кальция входит в состав молекулы пероксидазы хрена. По отношению к ABTS активность в этом случае выше по сравнению с гваяколом примерно в 1,5 раза.

10

0 н--I-1-1-1-------

0 0,5 1 1,5 2 2,5

навеска сырья, г

Рис.3. Зависимость ферментативной активности пероксидазы хрена от исходной навески для получения экстракта (1- экстракт водный по ABTS; 2 -экстракт водный по гваяколу; 3 - экстракт хлоридом кальция по ABTS; 4 -экстракт хлоридом кальция по гваяколу; 5 - экстракт хлоридом кальция по гваяколу, спустя месяц в холодильнике; 6 - экстракт хлоридом кальция по ABTS, спустя месяц в холодильнике

Определение стабильности пероксидазной активности в сырье к различным воздействиям

Для изучения стабильности пероксидазной активности был использован метод радиационной инактивации.

Пероксидазную активность определяли после воздействия у - облучения l37Cs с мощностью дозы Ру - 0,05 Гр/с. Облучению подвергали экстракты с навеской сырья 1,5г. Результаты приведены на рис. 4.

I

0 10 20 D.Gy 30 40 50

Рис. 4 Дозовая зависимость пероксидазной активности в водном и кальциевом экстрактах из сырья хрена (масса навески 1,5): 1- экстракт водный по гваяколу; 2- экстракт водный по ABTS; 3- экстракт хлоридом кальция по гваяколу; 4- экстракт хлоридом кальция по ABTS

Как водном, так и в кальциевом экстрактах наблюдается достаточно высокая стабильность пероксидазной активности, на основании чего можно сделать вывод о возможности достаточно длительного хранения препарата в соответствующих условиях без изменения его полезных свойств. Об этом же

говорят и данные по хранению экстрактов в холодильнике в течение месяца (рис. 3). Наибольшие потери активности наблюдаются по отношению ABTS в кальциевом экстракте.

Соотношение пероксидазной активности ABTS/гваякол практически неизменно и в водном, и в кальциевой экстрактах (табл.2). Вероятно, это может говорить об одинаковой форме извлечения фермента в экстракты.

Таблица 2

Стабильность водного (I) и кальциевого (II) экстрактов из корневища и корней хрена (масса навески 1,5г) по отношению к у-облучению (метод радиационной инактивации).

Доза облучения, Гр Пероксидазная активность А (Е/мл)

Экстракт I Экстракт II

ABTS Гваякол ABTS/ Гваякол ABTS Гваякол ABTS/ гваякол

0 0,64 0,46 1,39 7,44 5,31 1,40

3 0,60 0,43 1.39 7,28 5,2 1,40

9 0,84 0,60 1,40 7,15 5,11 1,40

15 0,785 0,56 1,40 7,12 5,1 1,40

45 0,78 0,557 1,40 6,9 4,9 1,39

Разработка методики определения содержания липидного комплекса корней хрена.

Анализ литературных данных показал наличие в корневище и корнях хрена жирного масла (липидного комплекса). Стандартизацию сырья корневища и корней хрена предлагается проводить по содержанию липидного комплекса (Ж).

С целью выявления содержания липидного комплекса подобраны условия его выделения: изучена зависимость выхода липидного комплекса от степени измельченности сырья, времени экстракции и природы растворителя.

Основными факторами, влияющими на скорость и полноту экстракции ЛК, являются: степень измельчения сырья, продолжительность экстрагирования и природа экстрагента.

Технологическая схема получения липидного комплекса корней хрена обыкновенного

Рис.5.

Опытным путем установлено: оптимальная степень измельчения 2мм; время экстракции 5 часов; экстрагент хлороформ (метод Сокслета). Метрологические характеристики представлены в таблице

Определение физико-химических показателей ЛК корневища и корней хрена проводили в соответствии с общей статьей «Масло жирное» ГФ X и методиками ГФ XI: числовые показатели составили: плотность - 0,1134 г/мл; показатель преломления - 1,4998; кислотное число - 29,11 мг КОН/ 1 г; йодное число - 133,4 г J2/IOO г; число омыления - 496,7 мг КОН/1 г. Измерения показателей цветности проводили на отражательном спектрофотометре «Пульсар», который может применяться для определения координат цвета и цветности при источниках света А, С и Des . При измерении спектров отражения и показателей цветности исследуемого образца используют источник света D65,

соответствующий дневному свету. Диафрагма измерения 20 мм, измерительная геометрия 8/D с 35 фильтрами. Измеряли коэффициенты отражения R в диапазоне длин волн 380-720 нм. Спектральная зависимость коэффициентов отражения («кривая отражения») однозначно определяет цвет исследуемого образца и может быть измерена на спектрофотометре. На спектрофотометре снимали показатели цветности образцов по показателю цветового тона Н° и согласно данным таблицы № Определяли цвет исследуемого образца.

Результаты оценки цветности исследуемых образцов по общепринятой методике представлены в табл. 3.

Таблица 3

Результаты оценки цветности исследуемых образцов.

Исследуемый Значение Н0 Пределы значений Н0 Цветовой

образец оттенок

порошок 110,347 104-153 Желто-зеленый

корневища и

корней хрена

порошок

корневища и 99,558 72-104 желтый

корней хрена

после отгона

эфирного масла

липидный

комплекс (жирное 91,610 72-104 желтый

масло)

Стандартизация сырья корневища и корней хрена обыкновенного Разработкахарактеристикподлинности сырьякорневища икорнейхрена.

При определении подлинности сырья изучались внешние признаки: цельного сырья, измельченного сырья и порошка. Определение проводили в соответствии с требованиями ГФ XI.

С целью определения диагностических признаков корневища и корней хрена проведено изучение анатомического строения корневища и корней (микроскопический анализ). Исследования проводились на продольных и поперечных срезах, а также порошке сырья хрена. В ходе исследования выявлены диагностические признаки, которые встречаются во всех препаратах. Покровная ткань - многослойная пробка, состоящая из узких мелких клеток.

Паренхима коры рыхлая с большими воздухоностными полостями. Клетки коровой паренхимы с утолщенной оболочкой, по направлению к центру корня паренхимные клетки несколько уменьшаются в ра ¡мерах. Клетки заполнены крахмальными зернами простыми и сложными, состоящими из 2-4 простых. В первичной коре присутствуют каменистые клетки желтоватого цвета, толстостенные, по форме от изодиаметрических до сильно-вытянутых, располагающиеся по одиночке или группами. Редко в коре встречаются волокновидные склереиды. Отдельные клетки паренхимы заполнены эфирным маслом. Линия камбия четкая. Основная ткань древесины представлена рыхлой паренхимой, ничем не отличающейся от паренхимы коры. В древесине видны толстостенные сосуды одиночные или в радиальных группах и концентрические пучки флоэмы, возникающие дополнительно из участков древесной паренхимы, принимающей характер меристемы. В древесине также встречаются отдельные волокна. Сердцевинные лучи выражены слабо, так как их клетки не отличаются от основной паренхимы (рис.6,7).

Рис. 6. Поперечный срез (увеличение 10x20) 1-включения эфирного масла в клетках паренхимы: 2-крахмальные зерна в клетках паренхимы

Рис.7 Поперечный срез (увеличение 10x9) -каменистая клеткав паренхиме коры. 2 -каменистая клетка в паренхиме коры:

Продольные срезы

На продольном тангентальном разрезе видна многослойная пробка бурого цвета. Клетки паренхимы изодиаметрические или вытянутые, содержат крахмальные зерна простые и сложные. В коровой части встречаются каменистые клетки одиночные или группами, а также отдельные клетки с эфирным маслом. Сосуды членистые: сетчатые, пористые, лестнично-пористые, сетчато-пористые (рис. 8).

Рис.8 Продольный срез (увеличение 10x20)

1-сосуды, утолщения стенок сосудов; 2- клетки паренхимы, утолщение клеточных стенок и поры

Давленые препараты

В давленом препарате видны клетки пробки толстостенные 4-х 6-ти гранной формы. Клетки паренхимы с утолщенными стенками, овальной формы с крахмальными зернами Сосуды членистые: сетчатые, пористые, лестнично-пористые, сетчато-пористые. Каменистые клетки различной формы Редко встречаются отдельные волокна (рис.9)

Рис. 9 Давленый препарат (увеличение (10x20) 1 - каменистые клетки Порошок

При рассмотрении порошка видны обрывки пробки, фрагменты членистых сосудов, каменистые клетки отдельные или группами, обрывки паренхимы, обрывки волокон, отдельные клетки с эфирным маслом, отдельные крахмальные зерна, простые и сложные, состоящие из 2-4 простых (рис 10)

Рис. 10. Порошок. Фракция 0,25-0,5мм (увеличение 10x20) 1- фрагмент сосуда, 2- каменистые клетки

Разработка показателей качества сырья корневища и корнейхрена.

Определение показателей качества корневища и корней хрена проводили в соответствии со статьями ГФ XI изд., исходя из результатов исследований предлагается регламентировать следующие числовые показатели и их нормы для корневища и корней хрена (табл. 4).

Таблица 4

Числовые показатели сырья корневища и корней хрена

Показатель Предельная норма, не более

Влага, % 14

Зола общая, % 14

Зола нерастворимая в 10%

хлороводородной кислоте 7,5

Части сырья, утратившие окраску

(побуревшие, почерневшие в изломе), % 5

Корней плохо очищенных от корневой

шейки и черешков листьев, % 5

Органические примеси, % 1

Минеральные примеси, % 1

На основании проделанного комплексного исследования сырья корневища и корней хрена обыкновенного разработаны необходимые для их стандартизации характеристики подлинности и показатели качества.

выводы

1. Для определения подлинности и доброкачественности проведено изучение химического состава корневища и корней хрена. Хроматографически подтверждено присутствие флавоноидов (рутина, кверцетина).

2. Хроматографически разделены группы липидов. По рассчитанным данным величины ИГ во всех извлечениях были идентифицированны: моноацилглицеролы и фосфолипиды (И-0,00); диацилглицеролы (Ш-0,08); высшие алифатические спирты (Ш-0,15); триацилглицеролы (Ш-0,3-0,4); воски (Ш-0,8-0,9). В извлечениях гексаном и петролейным эфиром дополнительно были идентифицированы стерины (Ш-0,12); углеводы, каротиноиды и эфиры стеринов (Ш-0,93).

3. УФ - спектрофотометрически определено количественное содержание флавоноидов в сырье хрена: относительная ошибка результата единичного определения, вычисленная с доверительной вероятностью 0,95 не превышает 5,69%.

4. Осуществлена идентификация методом ВЭЖХ веществ фенольного характера: рутина, кверцетина в корневище и корнях хрена.

5. Разработана методика определения содержания липидного комплекса и установлены параметры его выделения: измельченность сырья 2мм, время экстракции 5 чаасов, экстрагент хлороформ (метод Сокслета). Содержание липидного комплекса составляет 5,95%, относительная ошибка результата единичного определения, вычисленная с доверительной вероятность 0,95 не превышает 4,59%.

6. Определены физико-химические показатели качества липидного комплекса: плотность - 0,1134 г/мл; показатель преломления -1,4998; кислотное число - 29,11 мг КОН/ 1г; йодное число -133,4 г ^/100 г; число омыления - 496,7 мг КОН/1 г; показателей

цветности проводили на отражательном спектрофотометре «Пульсар» значение Н0 91,610 - цветовой оттенок желтый.

7. Проведено исследование по определению антиоксидантного потенциала водного и водно-спиртового извлечений корневища и корней хрена обыкновенного. Выявлено, что антиоксидантный потенциал водного извлечения составил - 92,21 мг%, водно-спиртового- 108,3 мг%.

8. Измерена пероксидазная активность корней хрена и ее стабильность к различным воздействиям. Установлено, что в водном и кальциевом экстрактах соотношение пероксидазной активности по ABTS и гваяколу (А(АВТS)/А(гваякол)) практически неизменно и наблюдается её высокая стабильность при физико-химическом воздействии.

9. Разработаны характеристики подлинности сырья: примеси органические и минеральные, влажность, зола общая и нерастворимая в хлороводородной кислоте.

10. Проведено изучение анатомического строения и выявлены диагностические признаки сырья корневище и корни хрена для цельного, измельченного и порошковакного сырья. Характерным для анализируемого сырья являются: членистых сосудов, каменистые клетки отдельные или группами, волокна, клетки с эфирным маслом, клетки с крахмальными зернами, простые и сложные, состоящие из 24 простых.

Основное содержание диссертационной работы опубликовано в печатных работах:

1. Александрова Е.Ю., Нестерова О.В., Решетняк В.Ю., Кондрашев СВ. Изучение «масличности» и разработка метода количественной оценки липидного комплекса корней хрена обыкновенного. // Сб. трудов нетрадиционные природные ресурсы, инновационные технологии и процессы.-М.: РАЕН.- № 10.- 2003.- С.157-159.

2. Александрова Е.Ю., Нестерова О.В., Самылина И.А. Разработка показателей качества корней хрена обыкновенного.- Ташкент.: «Киме ва Фармация».-№3.- 2003.- С. 13-16.

3. Александрова Е.Ю., Кондрашев СВ., Решетняк В.Ю., Нестерова О.В. Изучение термических характеристик влагосодержания и золы сырья корни хрена обыкновенного (Armoracia rusticana Lam.) // Тез. докл. научной конференции «Биоактивные вещества, синтез, изучение применение».-Ташкенг.-2003.-С. 7-8.

4. Александрова Е.Ю., Кондрашев СВ., Нестерова О.В., Решетняк В.Ю. Оценка перспективности получения липидного комплекса корней хрена обыкновенного. // Тези. докл. научной конференции «Биоактивные вещества, синтез, изучение применение».- Ташкент.-2003.- С. 18-19.

Александрова Елена Юрьевна (Россия)

Фотохимическое изучение хрена обыкновенного.

Постоянно расширяющийся ассортимент лекарственных растительных средств требует эффективного контроля их качества, поэтому исследования, направленные на разработку и совершенствование нормативной документации имеет большое значение.

Благодаря разнообразному химическому составу и широкому спектру действия корневище и корни хрена рассматриваются как перспективный источник лекарственного растительного сырья, вследствие чего возникает необходимость более подробного изучения фотохимического состава и разработки обоснованной нормативной документации.

Проведено определение лероксидазной активности в корневище и корнях хрена в зависимости от навески сырья и используемого экстрагента. Измерение пероксидазной активности проводили в водном и кальциевом экстракте с использованием гваякола и ABTS в качестве субстратов. Стабильность ферментативной активности изучали методом радиационной инактивации.

Проведен микроскопический анализ корневища и корней хрена и выявлены диагностические признаки сырья. Определены и нормированы числовые показатели качества сырья хрена. Изучен качественный состав сырья хрена. Разработаны показатели качества и доброкачественности сырья хрена.

На основании полученных данных были обоснованы показатели качества и мет оды стандартизации сырья корневище и корни хрена обыкновенного.

ElenaY. Alexandrova (Russia)

Fitochemical study ofhorseradish.

Constantly extending assortment medicinal vegetative of remedys demand effective of control their quality, consequetly research« direction on work out and improve normality of documentation have important significance.

Owing to diversity chemical composition and wide spectrum of effect rhizome and roots horseradish examine how perspective source medicinal vegetative raw material, due to arise necessity more detailed of study fitochemical of composition and work out basis normality of documentation.

Investigation of enzyme activity of Horseradish Peroxidase (HRP), depending the weight of the raw materials and extracts was studied. The level of peroxidase activity was observed in the water and calcium extracts in to guayacol and ABTS as substrates. Stability of peroxidase activity in the samples was determined by radiation inactivation method.

Microscopic analysis of roots of horseradish was conducted and diagnostic signs of raw was determined. Numerical figures of quality raw of horseradish was determined. Qualitative composition of underground organs of horseradish was studied. Figures of authenticity and quality of good of rhizoma and roots horseradish was determined.

According to receive facts was grounded indexis quality and methods of standard raw material, rhizoma and roots of horseradish.

ММ А им. И. М. Сеченова Подписано в печать 2004 г.

Тираж 100 экземпляров

»273 63

Интерес к лекарственным растениям повышается с каждым годом. Важной задачей современной науки представляется поиск новых эффективных препаратов растительного происхождения. Все чаще современная медицина обращается к фитопрепаратам, которые используются в качестве полуфункциональных средств для лечения и профилактики различных заболеваний. Известно, что задача всех фитокомплексов, содержащих биологически активные вещества (полифенолы, сапонины и др.) оказывать адаптогенное влияние на живой организм, мобилизируя его гомеостатические механизмы.

Постоянно расширяющийся ассортимент лекарственных растительных средств требует эффективного контроля их качества, поэтому исследования, направленные на разработку и совершенствование нормативной документации имеет большое значение.

Корневище и корни хрена издавна использовались в народной медицине как мочегонное, противовоспалительное, противоцинготное, противомикробное, раздражающее, отхаркивающее, витаминное, фитонцидное средство. Несмотря на широкое использование фитотерапевтами, сырье корневище и корни хрена обыкновенного в России не является официнальным.

Благодаря разнообразному химическому составу и широкому спектру действия корневище и корни хрена рассматриваются как перспективный источник лекарственного растительного сырья, вследствие этого возникает необходимость подробного изучения фотохимического состава и разработка обоснованной нормативной документации.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы явилось изучение физико-химических и фармакогностических характеристик нового вида лекарственного растительного сырья, корневище и корни хрена обыкновенного, обоснование методов определения подлинности и доброкачественности с последующей разработкой показателей качества нормируемых при стандартизации.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести фитохимическое изучение сырья корневище и корни хрена с выбором основных групп БАВ и последующим определением их содержания;

2. Изучить особенности выделения липидного комплекса из сырья корневище и корни хрена различными экстрагентами, и на основании проведенных исследований разработать оптимальные условия выделения;

3. Определить физико-химические показатели и разработать характеристики подлинности липидного комплекса сырья; 4. Изучить пероксидазную активность сырья корневище и корни хрена;

5. Разработать характеристики подлинности сырья корневище и корни хрена:

- исследование внешних признаков сырья,

- проведение микроскопического анализа и выявление диагностических признаков сырья;

- исследование качественных реакций на основные биологически активные вещества (БАВ);

6. Определить содержания: влаги, золы общей и нерастворимой в соляной кислоте, органической и минеральной примесей в сырье хрена и на их основе нормировать числовые показатели данного сырья;

7. На основании полученных данных обосновать необходимые показатели качества и методы стандартизации сырья корневища и корней хрена.

Научная новизна.

Впервые проведено исследование пероксидазной активности корневища и корней хрена и на основании полученных данных рекомендовано включение водно-спиртового экстракта из сырья хрена в комплексное профилактическое средство для применения в стоматологической практике при заболеваниях пародонта, принятое на рассмотрение институтом патентной экспертизы (заявка на изобретение № 110.3Р0 от 07.04.04 г.).

Разработаны оптимальные условия выделения липидного комплекса из корневища и корней хрена различными методами экстракции.

Впервые определены физико-химические показатели липидного комплекса - и разработаны характеристики подлинности липидного комплекса.

Выявлены диагностические признаки корневища и корней хрена на основании проведенного анатомо-морфологического анализа. Проведены качественные реакции на основные БАВ.

Определены и нормированы числовые показатели: влаги, золы общей и нерастворимой в соляной кислоте, органической и минеральной примесей в сырье корневища и корни хрена.

На основании полученных данных были обоснованы показатели качества и методы стандартизации сырья корневище и корни хрена обыкновенного.

Практическая значимость работы.

На основании проведенных исследований апробированы и внедрены: в лаборатории ОАО «Красногорсклексредства» методики количественного определения липидного комплекса и суммы фенольных соединений в измельченных корнях хрена обыкновенного;

- на ЗАО АПФ «Фито-ЭМ» в процесс контроля качества определения показателей подлинности сырья корневище и корни хрена обыкновенного.

Изучена пероксидазная активность экстрактов из сырья корневище и корни хрена, дана рекомендация для использования пероксидазы хрена в качестве пищевых добавок

Разработан проект фармакопейной статьи (ФС) на сырье корневище и корни Ярена в основу которого положены разработанные характеристики подлинности корневища и корней хрена с установлением диагностических признаков; определены и нормированы числовые показатели на данное сырье, которые могут быть включены в соответствующие проекты ФС.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

1. Для определения подлинности и доброкачественности проведено изучение химического состава корневища и корней хрена. Хроматографически подтверждено присутствие флавоноидов (рутина, кверцетина).

2. Хроматографически разделены группы липидов. По рассчитанным данным величины Rf во всех извлечениях были идентифицированны: моноацилглицеролы и фосфолипиды (Rf-0,00); диацилглицеролы (Rf-0,08); высшие алифатические спирты (Rf-0,15); триацилглицеролы (Rf-0,3-0,4); воски (Rf-0,8-0,9). В извлечениях гексаном и петролейным эфиром дополнительно были идентифицированы стерины (Rf-0,12); углеводы, каротиноиды и эфиры стеринов (Rf-0,93).

3. УФ - спектрофотометрически определено количественное содержание флавоноидов в сырье хрена: относительная ошибка результата единичного определения, вычисленная с доверительной вероятностью 0,95 не превышает 5,69%.

4. Осуществлена идентификация методом ВЭЖХ веществ фенольного характера: рутина, кверцетина в корневище и корнях хрена.

5. Разработана методика определения содержания липидного комплекса и установлены параметры его выделения: измельченность сырья 2мм, время экстракции 5 ча сов, экстрагент хлороформ (метод Сокслета). Содержание липидного комплекса составляет 5,95%, относительная

Ill ошибка результата единичного определения, вычисленная с доверительной вероятность 0,95 не превышает 4,59%. Определены физико-химические показатели качества липидного комплекса: плотность - 0,1134 г/мл; показатель преломления - 1,4998; кислотное число - 29,11 мг КОН/ 1г; йодное число - 133,4 г J2/100 г; число омыления - 496,7 мг КОН/1 г; показателей цветности проводили на отражательном спектрофотометре «Пульсар» значение Н° 91,610 - цветовой оттенок желтый.

Проведено исследование по определению антиоксидантного потенциала водного и водно-спиртового извлечений корневища и корней хрена обыкновенного. Выявлено, что антиоксидантный потенциал водного извлечения составил — 92,21 мг%, водно-спиртового - 108,3 мг%. Измерена пероксидазная активность корней хрена и ее стабильность к различным воздействиям. Установлено, что в водном и кальциевом экстрактах соотношение пероксидазной активности по ABTS и гваяколу (А(АВТ8)/А(гваякол)) практически неизменно и наблюдается её высокая стабильность при физико-химическом воздействии.

Разработаны характеристики подлинности сырья: примеси органические и минеральные, влажность, зола общая и нерастворимая в хлороводородной кислоте. Проведено изучение анатомического строения и выявлены диагностические признаки сырья корневище и корни хрена для цельного, измельченного и порошкованного сырья.

Характерным для анализируемого сырья являются: членистых сосудов, каменистые клетки отдельные или группами, волокна, клетки с эфирным маслом, клетки с крахмальными зернами, простые и сложные, состоящие из 24 простых.