Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фитохимическое исследование левзеи сафлоровидной

АВТОРЕФЕРАТ
Фитохимическое исследование левзеи сафлоровидной - тема автореферата по фармакологии
Дремова, Евгения Александровна Самара 2007 г.
Ученая степень
кандидата фармацевтических наук
ВАК РФ
15.00.02
 
 

Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фитохимическое исследование левзеи сафлоровидной

На правах рукописи □ОЗОБО1G1

ДРЕМОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА

п

ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕВЗЕИ САФЛОРОВИДНОЙ (LEUZEA CARTHAMOIDES (WILLD) ILJIN)

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

2 4 МАЙ 2007

Самара 2007 Q^C-C

003060161

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович Официальные апонентьг

доктор биологических наук, профессор Шаталаев Иван Федорович доктор фармацевтических наук, доцент Кудашкина Наталья Владимировна

Ведущее учреждение - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится _2007 г в асов

на заседании диссертационного совета К 208 085 03

при ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава»

(443 079, г Самара, проспект К Маркса, 165 Б)

С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (Самара, ул Арцыбушевская, 171)

Автореферат

разослан «,.$7» ¿¿Vг

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат фармацевтических наук

Е. В. Авдеева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Необходимость широкого применения в медицинской практике адаптогенных лекарственных средств по-прежнему не теряет своей актуальности. Это обусловлено тем, что одним из самых распространенных неблагоприятных факторов в настоящее время являются многочисленные стрессовые ситуации, которые существенно снижают качество жизни человека, ухудшают общее самочувствие, могут приводить к нервному и физическому истощению Лекарственные растения, обладающие адаптогеным действием, могут помочь современному человеку справиться с данной проблемой В этом отношении особую ценность представляют лекарственные растения, сочетающие стимулирующее влияние, как на ЦНС, так и на активность скелетных мышц. Подобным комплексным действием обладает левзея сафлоровидная (Ьеигеа carthamoid.es (\Villd) Црп) - яркий представитель богатой и разнообразной флоры Сибири и Дальнего Востока На сегодняшний день это единственное фармакопейное растение, обладающее выраженным анаболическим действием Данный эффект обеспечивают такие биологически активные соединения (БАС), как экдистероиды - вещества, способные стимулировать синтез белка минуя гормональпый эффект синтетических анаболиков Кроме того, левзея богата и флавоноидами, ответственными за аптиоксидант[ гое, иммуностимулирующее и гепатопротекторное действие Однако химический состав левзеи сафлоровидной, на наш взгляд, еще недостаточно изучен В настоящее время особенно ценным лекарственным сырьем считаются корневища с корнями левзеи, из которых получают такие препараты, как «Экстракт левзеи жидкий» и таблетки «Экдистен» (относится к средствам спортивной медицины) Тем не менее проблематичной представляется состояние нормативной документации (НД) на корневища с корнями левзеи сафлоровидпой ( ФС 42-2707-99 ) и препарат «Экстракт левзеи жидкий» (ФС 42-1995-99), особенно в части решения вопросов подлинности и химической стандартизации Так, в случае ФС в разделе качественное определение

(сырье) и подлинность (препарат) реакция со спиртовым раствором ванилина пе воспроизводится Кроме того, используемый для целей идентификации ТСХ-анализ дает нечеткие результаты в плане определения экдистена, несмотря на то, что в методиках используется Государственный стандартный образец (ГСО) экдистерона (экдистен) В разделе «Количественное определение» представляется нецелесообразным длительная (7 часов) экстракция сырья таким токсичным реагентом, как метиловый спирт На наш взгляд, как для идентификации, так и в целях количественного определения может быть использована УФ-спектрофотометрия

Результаты современных исследований химического состава, взаимосвязи «химический состав - фармакологическое действие» обусловливают предпосылки для расширения спектра фармакологической активности данного лекарственного растительного сырья

Таким образом, представляется актуальным дальнейшее фитохимическое исследование сырья левзеи сафяоровидной, разработка новых подходов к решению проблемы химической стандартизации, а также поиск новых путей в области применения препаратов левзеи в медицинской практике

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фитохимическое исследование корневищ с корнями левзеи и разработка новых подходов к решению проблемы стандартизации сырья и препаратов растения

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи

1 Изучение химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной

2 Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов корневищ с корнями левзеи сафлоровидной с учетом принципа унификации методик в ряду лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма

3. Разработка методик качественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной (ФС 42-2702-99), а также галенового препарата «Экстракт левзеи жидкий» (ФСП 42-1995-99)

4 Разработка методик количественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной и галенового препарата «Экстракт левзеи жидкий»

5 Разработка проектов и изменений БД на корневища с корнями левзеи и «Экстракт левзеи жидкий»

Научная новизна. В результате изучения химического состава левзеи сафлоровидной выделено и идентифицировано 3 индивидуальных вещества фенольной природы и 2 индивидуальных вещества стероидной природы Для установления структуры и изучения физико-химических свойств выделенных соединений были использованы УФ-, 'Н-ЯМР-спсктроскопия и масс-спектрометрия, а также результаты различных химических превращений Из корневищ с корнями левзеи впервые в России выделен 5-0-глюкозид З.З'-диметилкверцетина, ранее выделенный польскими учеными (Varga Е, Szenlrei К, Reich J., 1982 г), и впервые для видов рода Leuzea описан понастероп-С 2-цгашамат, который ранее бы выделен только в Dacrydium intermedium (хвойное растение, эндемичный представитель флоры Новой Зеландии)

Обоснована целесообразность использования тонкослойной хроматографии (ТСХ) для определения подлинности корней и корневищ не только по экдистену, но и по другим соединениям - понастерон С 2-циннамат (экдистероид) и 5-О-глюкозид З^'-диметилкверцетина (флавоноид), которые, в отличие от экдистерона, являются не только диагностическими, но и доминирующими

Показано, что кривая поглощения УФ-спектров растворов водно-спиртового извлечения и экстракта левзеи обусловлена гидроксикоричными кислотами (кофейная кислота, хлорогеновая кислота, понастерон С 2-циннамат), для которых характерны максимумы поглощения при 300 и 330 нм, и на этом основании разработана методика определения подлинности

На основе изучения химического состава сырья и с учетом методологических подходов по выделению целевой группы действующих веществ выполнены фотохимические и аналитические исследования по разработке новых методик стандартизации и включению их в проекты нормативной документации

Практическая значимость.

1 Выделепы и охарактеризованы доминирующие вещества корневищ с корнями левзеи сафлоровидной понастерон С 2-циннамат и 5-О-глюкозид 3,3'-диметилкверцетина

2 Разработаны методики качественного и количественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной (ФС 42-2707-99) в ФС предложено пересмотреть раздел «Качественные реакции» и «Количественное определение»

3 Разработаны методики качественного и количественного определения препарата «Экстракт левзеи жидкий» (ФСП 42-1995-99) с использованием ТСХ-анализа и спектрофотометрии

4 Оформлены проекты НД для представления на экспертизу в Фармакопейный государственный комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ

5 Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (акты внедрения № 1 и № 2 от 28 03 2007 г )

Положения, выносимые на защнту:

1 Результаты изучения химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной

2 Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной

3 Методики качествешюго и количественного анализа ЛРС «Корневища с корнями левзеи» и препарата «Экстракт левзеи жидкий»

4 Результаты разработки и определения показателей качества ЛРС и соответствующих препаратов

Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (Государственная регистрация № 012001053332) и Республиканских программ

1 «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277)

2 «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпрапоноиды и флавоноиды» (Государственной регистрация № 01990007536)

Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на IX и ХШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002, 2006), на VII Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), на межрегиональной конференции «Аспирантские чтения» (Самара 2003, 2006), на XXIV International Conference on Polyphenols, (Canada, 2006)

Основное содержание диссертации опубликовано в 8 научных работах Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 15 рисунков Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 200 источников, из которых 60 - на иностранных языках

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту

Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований левзеи сафлоровидной, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике

В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также методы контроля качества лекарственных форм на основе левзеи сафлоровидной

В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, совершенствованию методов стандартизации данного сырья и препаратов на его основе и внедрение данных исследований в научно-техническую документацию, а также изучение специфической фармакологической активности.

В приложение вынесены материалы по разработке проектов нормативной документации

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение химического состава В результате изучения химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, заготовленной в Алтайском крае, выделено 5 индивидуальных веществ, относящихся к фенилпропаноидам (хлорогеновая кислота, кофейная кислота), флавоноидам (5-О-глюкозид 3,3'-диметилкверцетина) и к экдистероидам (экдистерон, понастерон С 2-циннамат)

Препаративное разделение веществ осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии Для элюирования использовали смеси растворителей, а именно хлороформ-этиловый спирт, этиловый спирт-вода в различных соотношениях Эффективное разделение и очистка веществ достигались чередованием сорбентов (силикагель, полиамид, сефадекс ЬН-20) и соответствующих систем растворителей Кристаллизация и перекристаллизация веществ осуществлялась с помощью гексана, хлороформа, ацетона, этанола, метанола, воды Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких системах с использованием различных способов детекции

Для установления структуры выделенных веществ использовали данпые УФ-, 'Н-ЯМР- и масс-спектров, а также результаты химических превращений Фрагмент структурных исследований выделенных соединений на примере экдистерона и понастерона С 2-циннамата представлен на рисунках 1 и 2 соответственно

'Н-ЯМР-спектр экдистерона в СБзОБ 5, 82 (д 2,4 Гц, Н-7), 4,66 (уш , с, 6Н, бОН), 3,97 (м, Н-3), 3,89 (м, Н-2), 3,40 (м, 1Н, Н-22) 3,1-3,2 (м, Н-9), 1,30-2,15 (м, 16 Н, 2Н-1, 2Н-4, 2Н-11, 2Н-12, 2Н-15, 2Н-16, 2Н-23, 2Н-24), 1,23 (с, 6Н, СНз-26/27), 1,22 (с, ЗН, СН3-21), 0,97 (с, ЗН, СН3-19), 0,89 (с, ЗН, СНз-18)

Г -

'l 'if V -------r¿ V4vUÍ

л

II«. i Н-ЯМР -ciicnp пичд.терпи.! С 2-1:мн11.!Л',-1тя я..;;мтсромч1а1КЧч' Г

Л

Л/.

и ¡U

I!

< " «л i

'J 'J

[-И'Г'УГ"'■>"'"»''"Г I "Т" I«' 1 " I 111,4 I "Ч >> I

U Г. i f 1 > . : F SS llR» il I

I 4 *

? ЛА

и ч

«ïï

■ wr» rbîb;. •Kl'-'

i ¡"í " n "" xj-çy №

< í ¡i 1 ' '

i ч к t'

ЛЛ

V^JK^J л

1

i J. J ■ Mu

2 'Н-ЯМР-cneup lh,uicjc;4MnB,uíiiepiiM¿i¿iK\w

'Н-ЯМР-спектр (Сетпиш 200) понастерона С 2-циннамата в СБзСЮ (8, м д) 7,2-7,26 (м, ЗН ароматических), 6,92-6,96 (м, 2Н ароматических), 6,40 (ц, 16 Гц, 1Н, Н-71), 6,36 (д, 16 Гц, 1Н, Н-81), 5,72 (д, 1,8 Гц, Н-7), 3,55-3,75 (м, 6Н, Н-1; Н-3, 2Н-4, Н-22, Н-24), 2,95-2,98 (м, 2Н, Н-9, Н-17), 1,80-1,90 (м, 9Н, Н-11, Н-12, 2Н-15, 2Н-16, 2Н-23, Н-25), 1,30 (с, 9Н, СН 3-18, СН3-19,СН3-21), 0,92 (д, 7 Гц, 6Н, 2 СН3-26/27)

Таблица 1 - Физико-химические константы выделенных соедиений

№ Название, химическая формула Состав Тпл °С Х^СЕЮН). нм

1 Хлорогеновая кислота ноосу^Лон он он С 16 Н 18 О 9 203-205 243, 299 нл, 330

2 Кофейная кислота ноХХ^оон С дН 80 4 180 218-221 235, 242, 327

3 Экдистерон ОН он; о С27Н 2407 270 236-238 242

4 Понастерон С 2-ципнамат он он Т т бн он II о СзбН4808 608 аморф вещ-во 260,275, 325

5 5-О-глюкозид 3,31 диметилкверцетина он А/ОИ Ме ас—о о С22Н2107 177-179 250,350 нм

Попастерон С 2-циннамат впервые выделен из левзеи сафлоровидпой, 5-0-глюкозид З.З'-диметилкверцетина впервые выделен из левзеи сафлоровидной, произрастающей в Российской Федерации

2. Совершенствование методов стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной.

Оценка качества корневищ с корнями левзеи осуществляется на основании ВФС 42-2707-99 «Корневища с корнями левзеи сафлоровидной». Она распространяется на собранные осенью и высушенные корневища с корнями левзеи сафлоровидпой (Рапонтикума сафлоровидного) — Ьеигеа сапЬатогйея (У/Шс! БС), (Шшроппсит сшЪато1с1ез (\Villd.))

Необходимость во внесении изменений по разделам подлинности и химической стандартизации, включению некоторых новых разделов и изменению редакции отдельных, уже имеющихся - продиктована рядом обстоятельств Экспериментальные данпые (ТСХ-анализ) показывают, что

на хроматограмме водно-спиртового экстракта корневищ с корнями левзеи пятно экдистена слабо просматривается относительно пятна ГСО экдистена, а качественная реакция со спиртовым раствором ванилина (заявленная в ФС), не дает характерного окрашивания Целесообразность в совершенствовании разделов «Качественные реакции» и «Количественное определение» обусловлена полученными данными, результатами изучения химического состава, а также повышением уровня требований к объективности и унифицированности методов анализа сырья, фитосубстанций и лекарственных средств

Для определения подлинности сырья левзеи сафлоровидной использовали ТСХ-анализ, основанный на обнаружении и идентификации ГСО экдистена, а также доминирующих веществ растения, выделенных процессе колоночной хроматографии 5-О-глюкозид З.З'-диметилкверцетипа и понастерон С 2-циннамат (Рис 3)

1 Понастерон С 2-цшшамат

2 5-О-глюкозид 3,3 '-диметилкперцетшта

3. ГСО экдистена

4. Водно-спиртовое извлечение корневищ с корнями левзеи.

Рис 3 ТСХ-анализ извлечения корневищ с кортами левзеи сафлоровидной

¡хлороформ -тнал 4 ) У» 366 254 ! Фоерорновалыррша1в*к1» '

2.1. Качественный анализ корневищ с корнями левзеи сафлоровидной

Для определения подлинности предложено использовать ТСХ-анализ (рис 3), основанный на обнаружении и идентификации понастерона С 2 -

циннамата и 5-О-глюкозида 3,31 -диметилкверцетина как доминирующих веществ растения

В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами, содержащими в различных соотношениях хлороформ, этанол, метанол и воду, было установлено, что наиболее четкое разделение доминирующих БАС удается достичь в системе растворителей хлороформ-этанол (4 1). При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм понастерон С 2-циннамат обнаруживается в виде доминирующего фиолетового флуоресцирующего пятна с величиной около 0,7. При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 366 нм 5-0-глюкозид 3,3'-диметилкверцетина обнаруживается в виде доминирующего ярко-голубого пятна с величиной Ш около 0,2

Для качественного анализа предлагается использовать также данные УФ-спектра водно-спиртового извлечения корневищ с корнями левзеи сафлоровидпой с характерными максимумами 300 и 330 нм, характерные для гидроксикоричных кислот (кофейная кислота, хлорогеновая кислота, понастерон С 2-циннамат) (рис 4).

АЬюгЬэпсе

Рис 4 УФ-спектр водно-спиртового извлечения корпевищ с корнями левзеи сафлоровидной

Для детализации вклада в кривую светопоглощения суммарных извлечений отдельных БАС далее приводим УФ-спектры ГСО экдистена, понастерона С 2-циннамата и 5-О-глюкозида 3,3'диметилкверцетина

А

17515

125 - -1

075 05 0.25

Рис 5 УФ-спектр ГСО экдистена

200 225 250 275 300 325 350 375 «0 425 450 475

Рис 6 УФ-спектр понастерона С 2-цинпамата

АЬкиЬапсе

пт

Рис 7 УФ-спектр 5-О-глюкозида 3,3'-диметилкверцетина

Исходя из полученных данных можно с уверенностью сказать, что выделенные методом колоночной хроматографии доминирующие вещества корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, особенно понастерон, более объективно характеризуют данное сырье, чем ГСО экдистена

2.2. Количественный анализ корневищ с корнями левзеи сафлоровидной

В основу предложенной нами методики количественного анализа БАС корневищ с корнями левзеи сафлоровидной положепо прямое хроматоспектрофотометрическое определение суммы экдистероидов в пересчете на экдистен

В ходе предварительных исследований было показано, что наибольший выход целевого продукта достигается при размере частиц не более 3 мм и экстракции сырья 70% этанолом в соотношении 1:30 в течение 1 ч на кипящей водяной бане

А

1 75 18

1

ora

0.5

0.15

МО OS 250 775 S00 SJ5 МО 37S

nro

Рис 8 УФ-спектр водно-спиртового извлечения корневищ с корнями левзеи, очищенный на оксиде алюминия

1

1

\

, ., _____ —

УФ-спектр спиртового извлечения (рис 8) имеет максимум поглощения при 242 нм (экдистерон) С целью отделения фенольных соединений мы

провели очистку водно-спиртового извлечения на оксиде алюмипия В качестве аналитической волны предложено использовать максимум поглощения при 242 нм. В данной области спектра спиртовые растворы извлечения из сырья и экдистерон имеют прямопропорциональную зависимость оптической плотпости от концентрации Данное обстоятельство позволяет использовать прямую спектрофотометрию для количественного определения суммы экдистероидов в пересчете па экдистен

Метрологические характеристики методики количественного определения суммы экдистероидов в сырье «Корневища с корнями левзеи сафлоровидной» рассчитаны из результатов анализа одного образца сырья в 11 независимых повторпостях (табл 2)

Таблица 2 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоиоидов в корневищах с корнями левзеи

сафлоровидпой

/ X 5 Р,% 1(Р,Л Ах Е,%

10 2,50 0,0560 95 2,23 0,11 ±4,40

Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет +4,4 %. Опыты с добавками ГСО экдистена к навеске сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики

С целью количественного определения нами был осуществлен также метод ВЭЖХ с предварительной экстракцией сырья этиловым спиртом в течение 1 часа на водяной бане, а не метиловым спиртом в аппарате Сокслета, как заявлено в ФС 42-2707-99

Следует отметить, что цельное и измельченное сырье, па котором проводилась отработка по показателю качества «содержание экдистероидов»,

соответствовало ФС 42-2707-99 по внешнему виду, микроскопии и числовым показателям

3. Совершенствование методов стандартизации препарата «Экстракт левзеи жидкий».

При разработке подходов к решению проблемы стандартизации галенового препарата «Экстракт левзеи жидкий» (ФС 42-1995-99) мы придерживались принципа унификации методик анализа в ряду лекарственное растительное сырье-субстанция-лекарственная форма (И А Самылина, 1994,1995)

Для качественного анализа данного препарата, как и в случае анализа сырья растения, предложен метод тонкослойной хроматографии с использованием ГСО экдистена и выделенных веществ понастерон С 2-циннамат и 5-О-гликозид 3,3 '-диметил кверцетина (рис 5), а также идентификация по УФ-спектру

1 Понастероп С 2-циннамат

2 5-О-глюкозид 3,3' -диметилкверцетина

3 ГСО экдистена

4 Экстракт левзеи жидкий

Рис 5 ТСХ-анализ экстракта левзеи жидкого

ГСО экдистена в УФ-свете при длине волны 254 нм обнаруживается в виде слабовыраженного фиолетового флуоресцирующего пятна с величиной Кг около 0,1 на уровне пятна ГСО экдистена Пятно понастерона С 2-циннамата в УФ-свете при длине волна 254 нм обнаруживается в виде

хлороформ - этаноп 41 Уф 368,254 фосфорноиогьфремсюя »-тя

О

о о О

^ п

доминирующего фиолетового пятна с Кг около 0,7 на уровне пятна соответствующего достоверного образца Пятно 5-О-глюкозида З.З1-диметилкверцетина в УФ-свете при длине волны 366 им обнаруживается в виде доминирующего ярко-голубого пятна с около 0,2 на уровне пятна соответствующего достоверного образца Допускается наличие других пятен

УФ-спектр экстракта левзеи аналогичен таковому для сырья растения (рис 4) и имеет два характерных максимума при 300 и 330 нм

Количественную оценку содержания БАС в экстракте левзеи жидком, как ранее показано для сырья, целесообразно проводить по содержанию экдистсроидов в вариапте прямой спектрофотометрии в пересчете на экдистен при аналитической длине волны 242 нм с предварительной очисткой экстракта на оксиде алюминия

Метрологические характеристики методики количественного анализа суммы экдистероидов в экстракте левзеи представлены в табл 3

Таблица 3 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы экдистероидов в экстракте

левзеи жидком

/ X 5 Р, % tiP.fi Ах Е, %

10 2,20 0,0114 95 2,23 ±0,0814 ±3,71

Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ± 3,71 % Опыты с добавками ГСО экдистена в препарат и в раствор А показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки методики

С учетом результатов проведенных исследований возникла необходимость в пересмотре некоторых разделов имеющейся НД на корневища с корнями левзеи и препарат «Экстракт левзеи жидкий»

Результаты исследования показали нецелесообразность определения подлинности сырья и препарата только по содержанию экдистена, а также использование в качестве реактива спиртового раствора ванилина Метод спектрофотометрии в разделе «Качественные реакции отсутствует», кроме того при использовании методики ВЭЖХ говорится о двух пиках удерживания, которые соответствуют ГСО экдистена. В то же время, наши исследования, проведенные в рекомендуемых по ФС 42-2707-99 условиях, показывают, что на хроматограмме наблюдается один доминирующий пик удерживания, который соответствует не только экдистену, но и другим экдистероидам (понастерон С 2-циннамат) С учетом полученных данных при изучении корневищ с корнями левзеи представляется целесообразным проводить стандартизацию как сырья, так и галеновых форм левзеи сафлоровидной не только по экдистену, но и по двум другим веществам растения - понастерону С 2-циннамату и 5-О-глюкозиду 3,3'-диметилхверцетина. Выбор в пользу этих веществ сделан па том осповании, что данные соединение является доминирующими и специфичными компонентами левзеи сафлоровидной

Количественное определение, на наш взгляд, также нуждается в переработке, так как заявленная в фармакопейной статье стадия экстрагирования сырья с целью проведения ВЭЖХ является длительным и трудоемким в исполнении, поэтому в разделе «Количественное определение» оптимизирована методика ВЭЖХ и включен метод прямой хроматоспектрофотометрии При приготовлении извлечений из корневищ с корнями левзеи для количественного определения рекомендуем использовать в качестве экстрагента не метиловый, а 70 % этиловый спирт.

Необходимость в пересмотре некоторых разделов имеющейся НД на лекарственный препарат продиктована главным образом целесообразностью унификации методик качественного и количественного анализа как корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, так и экстракта левзеи жидкого

Выделяя в сырье и галеновом препарате левзеи сафлоровидной экднстероиды как ведущую группу биологически активных соединений и флавоноиды в качестве преобладающей сопутствующей группы нами предложен ТСХ-анализ и метод спектрофотометрии для оценки качества препарата "Экстракт левзеи жидкий", а также прямой хроматоспекхрофотометрический анализ с целью определения экдистероидов в пересчете на экдистеп

Нами разработаны проекты фармакопейных статей на корневища с корнями левзеи сафлоровидной (взамен существующей ФС 42-2707-99) и на препарат «Экстракт левзеи жидкий» (взамен существующей ФС 42-1995-99).

Традиционно препараты левзеи позиционируются как тонизирующие, анаболические и адаптогенные средства, однако на наш взгляд, с учетом полученных результатов по флавоноидной составляющей растения (5-0-глюкозид З.З'-диметилкверцетина), целесообразно изучение суммарных препаратов в плане аптиоксидантной и нейротропной активности

Дапный фрагмент исследований выполнен в отношении официального препарата «Левзеи экстракт жидкий» на базе кафедры фармакологии СамГМУ (проф. А.В Дубищев) в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Р У. Хабриев, Москва, 2005).

В результате выявлены звенья антиоксидантной защиты, на которые влияет изучаемый препарат уровень накопления малонового диальдегида -конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) снижается на 32 % по сравпению с контрольной группой, активность каталазы возрастает и достигает нормы, действие на активность супероксиддисмутазы восстанавливается активность фермента на 87%, влияние на глутатионпероксидазу не отмечено

В ходе изучения нейротропной активности выявлено наличие стимулирующих эффектов левзеи экстракта с использованием модели гексеналового сна у мышей, а также антигипногенные свойства изучаемого

препарата на фоне тиопенталового сна По всей вероятности, его действие реализуется путем преимущественного влияния на подкорковые структуры головного мозга Кроме того, левзеи экстракт обладает стимулирующим и антидепрессивным действием способствует воспроизведению условных рефлексов при воздействии электросудорожного шока, проявляет антагонизм с клофелином и резерпином Это свидетельствует о влиянии исследуемого препарата на процессы метаболизма в головном мозге таких медиаторов, как норадреналин, дофамин и серотонин.

Таким образом, результаты проведенных исследований позволили разработать новые подходы к стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной и показали целесообразность дальнейшего изучения экстракта левзеи жидкого с целью уточнения спектра фармакологической активности

выводы

1 В результате изучения химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной выделено 5 индивидуальных веществ, из которых 3 относятся к фенольным соединениям и 2 вещества - к экдистероидам.

2 Выделенные вещества идентифицированы с использованием УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также различных химических превращений как хлорогеновая кислота, кофейная кислота, 5-О-глюкозид З.З'-диметилкверцетина, экдистероп и понастерон С 2-циннамат.

3 5-О-глюкозид З.З'-диметилкверцетина выделен впервые из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, произрастающей в Российской Федерации Понастерон С 2-циннамат впервые описан для видов рода ШаропПсит.

4 Предложены новые подходы к стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной, заключающиеся не только в определении экдистерона

(экдистен), но и двух других доминирующих веществ попастерона С 2-циннамата и 5-О-глюкозида 3,3'-диметилкверцетина, имеющих диагностическое значение, с учетом принципа унификации методик в ряду лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма

5 Разработана методика качественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной и препарата «Экстракт левзеи жидкий», основанная на обнаружении с использованием ТСХ доминирующего экдистероида (понастероп С 2-циннамат) и флавоноида (5-О-глюкозид 3,3 1 диметилкверцетина) растения 6. Показано, что кривая поглощения УФ-спектров растворов водно-спиртового извлечения и экстракта левзеи обусловлена гидроксикоричными кислотами (кофейная кислота, хлорогеновая кислота, понастерон С 2-циннамат), для которых характерны максимумы поглощения при 300 и 330 нм, и на этом основании разработана методика определения подлинности 7 Оптимизирована методика ВЭЖХ-анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной экстракцию сырья рекомендовано проводить с использованием 70% этилового спирта в течение 1 ч на кипящей водяной бане, вместо длительной (в течение 7 ч) экстракции метиловым спиртом 8. Разработана методика количественного определения суммы экдистероидов в корневищах с корнями левзеи и «Экстракте левзеи жидком» с использованием прямой хроматоспекгрофотометрии Ошибка единичного определения содержания суммы экдистероидов с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,40 % и ±3,71 % соответственно

9 На основании экспериментальных данных, полученных в ходе химического изучения и анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной (ШшропНсит carthamoid.es (\УПМ) II) щ), оформлен проект

ФС «Корневища с корнями рапонтикума сафлоровидного» и ФС «Левзеи экстракт жидкий»

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Алексеева, Е.А (Дремова Е А) Левзея сафлоровидная - перспективный источник адаптогенных и анаболических лекарственных средств / Е А Алексеева // Фармация и медицина - 2001 - № 23 (142) - С 45-46.

2 Запесочная, Г Г. Флавоноиды как гепатопротекторы и антиоксиданты / Г. Г Запесочная, В А Куркин, А А Лебедев и др // Человек и лекарство-Тезисы докладов IX Российского национального конгресса (8-12 апреля) -М , 2002 -С 164

3 Дремова, Е А Обоснование целесообразности разработки препаратов на основе левзеи сафлоровидной / Е. А Дремова // Межрегиональная конференция молодых ученых «Аспирантские чтения — 2003» — Самара, 2003 -С 106-108

4 Дремова, Е А Проблемы стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов левзеи сафлоровидной / Е А Дремова // П Всероссийский съезд фармацевтических работников- Материалы съезда (5-7 июня) - Сочи, 2005 -С 69-71

5 Куркин, В А. Фармакоэкономические исследования номенклатуры иммуномодуляторов, предстваленных на фармацевтическим ранке Самарской области / В А Куркин, В Н Ежков, Е А. Авдеева и др. // Человек и лекарство Тезисы докладов ХШ Российского национального конгресса (апреля) - М., 2006 - С 711.

6 Дремова, Е А Особенности фитохимического и фармакологического исследования экдистероидов, выделенных из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной / Е А. Дремова // Межвузовская конференция молодых ученых «Аспирантские чтения-2006». - Самара, 2006 - С. 239-242

7. Kurkin, VA. Phytochemical and Pharmacologycal investigations of some medicinal plants conentmg flavonoids /VA Kurkrn, A V. Dubishchev, E V Avdeeva // Polyphenolis communications 2006 - XXIV International Conferens on Polyphenols - Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006/ P - 513-514 8 Куркин, В. А Антиоксидантпая активпость некоторых фитопрепаратов, содержащих флавопоиды и фенилпрапоноиды / В А Куркин, О Л Кулагин, Е. В Авдеева, А. С Царева, H С Додонов и др // Фармация - 2007. - № 2 С 26-31.

Подписано в печать 17 04 2007 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Уел печ л 1 39 Тираж 100 экз Заказ 423

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ООО «ОФОРТ» 443080, г Самара, ул Революционная, 70, литера П Тел 372-00-56,372-00-57