Автореферат диссертации по фармакологии на тему Фитохимическое исследование левзеи сафлоровидной
На правах рукописи □ОЗОБО1G1
ДРЕМОВА ЕВГЕНИЯ АЛЕКСАНДРОВНА
п
ФИТОХИМИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ЛЕВЗЕИ САФЛОРОВИДНОЙ (LEUZEA CARTHAMOIDES (WILLD) ILJIN)
15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
2 4 МАЙ 2007
Самара 2007 Q^C-C
003060161
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
Доктор фармацевтических наук, профессор Куркин Владимир Александрович Официальные апонентьг
доктор биологических наук, профессор Шаталаев Иван Федорович доктор фармацевтических наук, доцент Кудашкина Наталья Владимировна
Ведущее учреждение - Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится _2007 г в асов
на заседании диссертационного совета К 208 085 03
при ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава»
(443 079, г Самара, проспект К Маркса, 165 Б)
С диссертационной работой можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «СамГМУ Росздрава» (Самара, ул Арцыбушевская, 171)
Автореферат
разослан «,.$7» ¿¿Vг
Ученый секретарь
диссертационного совета
кандидат фармацевтических наук
Е. В. Авдеева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Необходимость широкого применения в медицинской практике адаптогенных лекарственных средств по-прежнему не теряет своей актуальности. Это обусловлено тем, что одним из самых распространенных неблагоприятных факторов в настоящее время являются многочисленные стрессовые ситуации, которые существенно снижают качество жизни человека, ухудшают общее самочувствие, могут приводить к нервному и физическому истощению Лекарственные растения, обладающие адаптогеным действием, могут помочь современному человеку справиться с данной проблемой В этом отношении особую ценность представляют лекарственные растения, сочетающие стимулирующее влияние, как на ЦНС, так и на активность скелетных мышц. Подобным комплексным действием обладает левзея сафлоровидная (Ьеигеа carthamoid.es (\Villd) Црп) - яркий представитель богатой и разнообразной флоры Сибири и Дальнего Востока На сегодняшний день это единственное фармакопейное растение, обладающее выраженным анаболическим действием Данный эффект обеспечивают такие биологически активные соединения (БАС), как экдистероиды - вещества, способные стимулировать синтез белка минуя гормональпый эффект синтетических анаболиков Кроме того, левзея богата и флавоноидами, ответственными за аптиоксидант[ гое, иммуностимулирующее и гепатопротекторное действие Однако химический состав левзеи сафлоровидной, на наш взгляд, еще недостаточно изучен В настоящее время особенно ценным лекарственным сырьем считаются корневища с корнями левзеи, из которых получают такие препараты, как «Экстракт левзеи жидкий» и таблетки «Экдистен» (относится к средствам спортивной медицины) Тем не менее проблематичной представляется состояние нормативной документации (НД) на корневища с корнями левзеи сафлоровидпой ( ФС 42-2707-99 ) и препарат «Экстракт левзеи жидкий» (ФС 42-1995-99), особенно в части решения вопросов подлинности и химической стандартизации Так, в случае ФС в разделе качественное определение
(сырье) и подлинность (препарат) реакция со спиртовым раствором ванилина пе воспроизводится Кроме того, используемый для целей идентификации ТСХ-анализ дает нечеткие результаты в плане определения экдистена, несмотря на то, что в методиках используется Государственный стандартный образец (ГСО) экдистерона (экдистен) В разделе «Количественное определение» представляется нецелесообразным длительная (7 часов) экстракция сырья таким токсичным реагентом, как метиловый спирт На наш взгляд, как для идентификации, так и в целях количественного определения может быть использована УФ-спектрофотометрия
Результаты современных исследований химического состава, взаимосвязи «химический состав - фармакологическое действие» обусловливают предпосылки для расширения спектра фармакологической активности данного лекарственного растительного сырья
Таким образом, представляется актуальным дальнейшее фитохимическое исследование сырья левзеи сафяоровидной, разработка новых подходов к решению проблемы химической стандартизации, а также поиск новых путей в области применения препаратов левзеи в медицинской практике
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является фитохимическое исследование корневищ с корнями левзеи и разработка новых подходов к решению проблемы стандартизации сырья и препаратов растения
Для достижения поставленной цели решались следующие задачи
1 Изучение химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной
2 Разработка подходов к стандартизации сырья и препаратов корневищ с корнями левзеи сафлоровидной с учетом принципа унификации методик в ряду лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма
3. Разработка методик качественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной (ФС 42-2702-99), а также галенового препарата «Экстракт левзеи жидкий» (ФСП 42-1995-99)
4 Разработка методик количественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной и галенового препарата «Экстракт левзеи жидкий»
5 Разработка проектов и изменений БД на корневища с корнями левзеи и «Экстракт левзеи жидкий»
Научная новизна. В результате изучения химического состава левзеи сафлоровидной выделено и идентифицировано 3 индивидуальных вещества фенольной природы и 2 индивидуальных вещества стероидной природы Для установления структуры и изучения физико-химических свойств выделенных соединений были использованы УФ-, 'Н-ЯМР-спсктроскопия и масс-спектрометрия, а также результаты различных химических превращений Из корневищ с корнями левзеи впервые в России выделен 5-0-глюкозид З.З'-диметилкверцетина, ранее выделенный польскими учеными (Varga Е, Szenlrei К, Reich J., 1982 г), и впервые для видов рода Leuzea описан понастероп-С 2-цгашамат, который ранее бы выделен только в Dacrydium intermedium (хвойное растение, эндемичный представитель флоры Новой Зеландии)
Обоснована целесообразность использования тонкослойной хроматографии (ТСХ) для определения подлинности корней и корневищ не только по экдистену, но и по другим соединениям - понастерон С 2-циннамат (экдистероид) и 5-О-глюкозид З^'-диметилкверцетина (флавоноид), которые, в отличие от экдистерона, являются не только диагностическими, но и доминирующими
Показано, что кривая поглощения УФ-спектров растворов водно-спиртового извлечения и экстракта левзеи обусловлена гидроксикоричными кислотами (кофейная кислота, хлорогеновая кислота, понастерон С 2-циннамат), для которых характерны максимумы поглощения при 300 и 330 нм, и на этом основании разработана методика определения подлинности
На основе изучения химического состава сырья и с учетом методологических подходов по выделению целевой группы действующих веществ выполнены фотохимические и аналитические исследования по разработке новых методик стандартизации и включению их в проекты нормативной документации
Практическая значимость.
1 Выделепы и охарактеризованы доминирующие вещества корневищ с корнями левзеи сафлоровидной понастерон С 2-циннамат и 5-О-глюкозид 3,3'-диметилкверцетина
2 Разработаны методики качественного и количественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной (ФС 42-2707-99) в ФС предложено пересмотреть раздел «Качественные реакции» и «Количественное определение»
3 Разработаны методики качественного и количественного определения препарата «Экстракт левзеи жидкий» (ФСП 42-1995-99) с использованием ТСХ-анализа и спектрофотометрии
4 Оформлены проекты НД для представления на экспертизу в Фармакопейный государственный комитет Министерства здравоохранения и социального развития РФ
5 Результаты исследований используются в научных изысканиях и в учебном процессе на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (акты внедрения № 1 и № 2 от 28 03 2007 г )
Положения, выносимые на защнту:
1 Результаты изучения химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной
2 Результаты исследований по разработке подходов к стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной
3 Методики качествешюго и количественного анализа ЛРС «Корневища с корнями левзеи» и препарата «Экстракт левзеи жидкий»
4 Результаты разработки и определения показателей качества ЛРС и соответствующих препаратов
Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематическим планом научно-исследовательских работ Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Самарский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию" (Государственная регистрация № 012001053332) и Республиканских программ
1 «Совершенствование лекарственного обеспечения населения и лечебно-профилактических учреждений в рыночных условиях» по теме «Создание лекарственных средств природного происхождения антимикробного, адаптогенного и гепатопротекторного действия» (№ Государственной регистрации 01990005277)
2 «Разработка методик качественного и количественного анализа сырья и препаратов лекарственных растений, содержащих фенилпрапоноиды и флавоноиды» (Государственной регистрация № 01990007536)
Апробация работы и публикации. Материалы работы доложены и обсуждены на IX и ХШ Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2002, 2006), на VII Всероссийском съезде фармацевтических работников (Сочи, 2005), на межрегиональной конференции «Аспирантские чтения» (Самара 2003, 2006), на XXIV International Conference on Polyphenols, (Canada, 2006)
Основное содержание диссертации опубликовано в 8 научных работах Объем и структура работы. Диссертационная работа изложена на 122 страницах машинописного текста, содержит 11 таблиц, 15 рисунков Диссертация состоит из введения, литературного обзора, описания объектов и методов исследования, 3-х глав, отражающих результаты собственных экспериментальных исследований и их обсуждение, общих выводов, приложения и списка литературы, включающего 200 источников, из которых 60 - на иностранных языках
Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, отмечена новизна и практическая значимость полученных результатов, а также изложены положения, выносимые на защиту
Глава 1 содержит аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований левзеи сафлоровидной, в котором обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава растения, фармакологической активности, применению в медицинской практике
В главе 2 представлены характеристика объектов и методов исследования Приведены методики химического, физического и физико-химического изучения лекарственного сырья, индивидуальных веществ и препаратов, а также методы контроля качества лекарственных форм на основе левзеи сафлоровидной
В главах 3-5 экспериментальной части приводятся результаты собственных исследований по изучению химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, совершенствованию методов стандартизации данного сырья и препаратов на его основе и внедрение данных исследований в научно-техническую документацию, а также изучение специфической фармакологической активности.
В приложение вынесены материалы по разработке проектов нормативной документации
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Изучение химического состава В результате изучения химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, заготовленной в Алтайском крае, выделено 5 индивидуальных веществ, относящихся к фенилпропаноидам (хлорогеновая кислота, кофейная кислота), флавоноидам (5-О-глюкозид 3,3'-диметилкверцетина) и к экдистероидам (экдистерон, понастерон С 2-циннамат)
Препаративное разделение веществ осуществляли методом адсорбционной колоночной хроматографии Для элюирования использовали смеси растворителей, а именно хлороформ-этиловый спирт, этиловый спирт-вода в различных соотношениях Эффективное разделение и очистка веществ достигались чередованием сорбентов (силикагель, полиамид, сефадекс ЬН-20) и соответствующих систем растворителей Кристаллизация и перекристаллизация веществ осуществлялась с помощью гексана, хлороформа, ацетона, этанола, метанола, воды Отсутствие примесей в получаемых соединениях контролировали методом ТСХ в нескольких системах с использованием различных способов детекции
Для установления структуры выделенных веществ использовали данпые УФ-, 'Н-ЯМР- и масс-спектров, а также результаты химических превращений Фрагмент структурных исследований выделенных соединений на примере экдистерона и понастерона С 2-циннамата представлен на рисунках 1 и 2 соответственно
'Н-ЯМР-спектр экдистерона в СБзОБ 5, 82 (д 2,4 Гц, Н-7), 4,66 (уш , с, 6Н, бОН), 3,97 (м, Н-3), 3,89 (м, Н-2), 3,40 (м, 1Н, Н-22) 3,1-3,2 (м, Н-9), 1,30-2,15 (м, 16 Н, 2Н-1, 2Н-4, 2Н-11, 2Н-12, 2Н-15, 2Н-16, 2Н-23, 2Н-24), 1,23 (с, 6Н, СНз-26/27), 1,22 (с, ЗН, СН3-21), 0,97 (с, ЗН, СН3-19), 0,89 (с, ЗН, СНз-18)
Г -
'l 'if V -------r¿ V4vUÍ
л
II«. i Н-ЯМР -ciicnp пичд.терпи.! С 2-1:мн11.!Л',-1тя я..;;мтсромч1а1КЧч' Г
Л
Л/.
и ¡U
I!
< " «л i
'J 'J
[-И'Г'УГ"'■>"'"»''"Г I "Т" I«' 1 " I 111,4 I "Ч >> I
U Г. i f 1 > . : F SS llR» il I
I 4 *
? ЛА
и ч
«ïï
■ wr» rbîb;. •Kl'-'
i ¡"í " n "" xj-çy №
< í ¡i 1 ' '
i ч к t'
ЛЛ
V^JK^J л
1
i J. J ■ Mu
2 'Н-ЯМР-cneup lh,uicjc;4MnB,uíiiepiiM¿i¿iK\w
'Н-ЯМР-спектр (Сетпиш 200) понастерона С 2-циннамата в СБзСЮ (8, м д) 7,2-7,26 (м, ЗН ароматических), 6,92-6,96 (м, 2Н ароматических), 6,40 (ц, 16 Гц, 1Н, Н-71), 6,36 (д, 16 Гц, 1Н, Н-81), 5,72 (д, 1,8 Гц, Н-7), 3,55-3,75 (м, 6Н, Н-1; Н-3, 2Н-4, Н-22, Н-24), 2,95-2,98 (м, 2Н, Н-9, Н-17), 1,80-1,90 (м, 9Н, Н-11, Н-12, 2Н-15, 2Н-16, 2Н-23, Н-25), 1,30 (с, 9Н, СН 3-18, СН3-19,СН3-21), 0,92 (д, 7 Гц, 6Н, 2 СН3-26/27)
Таблица 1 - Физико-химические константы выделенных соедиений
№ Название, химическая формула Состав Тпл °С Х^СЕЮН). нм
1 Хлорогеновая кислота ноосу^Лон он он С 16 Н 18 О 9 203-205 243, 299 нл, 330
2 Кофейная кислота ноХХ^оон С дН 80 4 180 218-221 235, 242, 327
3 Экдистерон ОН он; о С27Н 2407 270 236-238 242
4 Понастерон С 2-ципнамат он он Т т бн он II о СзбН4808 608 аморф вещ-во 260,275, 325
5 5-О-глюкозид 3,31 диметилкверцетина он А/ОИ Ме ас—о о С22Н2107 177-179 250,350 нм
Попастерон С 2-циннамат впервые выделен из левзеи сафлоровидпой, 5-0-глюкозид З.З'-диметилкверцетина впервые выделен из левзеи сафлоровидной, произрастающей в Российской Федерации
2. Совершенствование методов стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной.
Оценка качества корневищ с корнями левзеи осуществляется на основании ВФС 42-2707-99 «Корневища с корнями левзеи сафлоровидной». Она распространяется на собранные осенью и высушенные корневища с корнями левзеи сафлоровидпой (Рапонтикума сафлоровидного) — Ьеигеа сапЬатогйея (У/Шс! БС), (Шшроппсит сшЪато1с1ез (\Villd.))
Необходимость во внесении изменений по разделам подлинности и химической стандартизации, включению некоторых новых разделов и изменению редакции отдельных, уже имеющихся - продиктована рядом обстоятельств Экспериментальные данпые (ТСХ-анализ) показывают, что
на хроматограмме водно-спиртового экстракта корневищ с корнями левзеи пятно экдистена слабо просматривается относительно пятна ГСО экдистена, а качественная реакция со спиртовым раствором ванилина (заявленная в ФС), не дает характерного окрашивания Целесообразность в совершенствовании разделов «Качественные реакции» и «Количественное определение» обусловлена полученными данными, результатами изучения химического состава, а также повышением уровня требований к объективности и унифицированности методов анализа сырья, фитосубстанций и лекарственных средств
Для определения подлинности сырья левзеи сафлоровидной использовали ТСХ-анализ, основанный на обнаружении и идентификации ГСО экдистена, а также доминирующих веществ растения, выделенных процессе колоночной хроматографии 5-О-глюкозид З.З'-диметилкверцетипа и понастерон С 2-циннамат (Рис 3)
1 Понастерон С 2-цшшамат
2 5-О-глюкозид 3,3 '-диметилкперцетшта
3. ГСО экдистена
4. Водно-спиртовое извлечение корневищ с корнями левзеи.
Рис 3 ТСХ-анализ извлечения корневищ с кортами левзеи сафлоровидной
¡хлороформ -тнал 4 ) У» 366 254 ! Фоерорновалыррша1в*к1» '
2.1. Качественный анализ корневищ с корнями левзеи сафлоровидной
Для определения подлинности предложено использовать ТСХ-анализ (рис 3), основанный на обнаружении и идентификации понастерона С 2 -
циннамата и 5-О-глюкозида 3,31 -диметилкверцетина как доминирующих веществ растения
В результате проведенных опытов с различными хроматографическими системами, содержащими в различных соотношениях хлороформ, этанол, метанол и воду, было установлено, что наиболее четкое разделение доминирующих БАС удается достичь в системе растворителей хлороформ-этанол (4 1). При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм понастерон С 2-циннамат обнаруживается в виде доминирующего фиолетового флуоресцирующего пятна с величиной около 0,7. При просмотре хроматограммы в УФ-свете при длине волны 366 нм 5-0-глюкозид 3,3'-диметилкверцетина обнаруживается в виде доминирующего ярко-голубого пятна с величиной Ш около 0,2
Для качественного анализа предлагается использовать также данные УФ-спектра водно-спиртового извлечения корневищ с корнями левзеи сафлоровидпой с характерными максимумами 300 и 330 нм, характерные для гидроксикоричных кислот (кофейная кислота, хлорогеновая кислота, понастерон С 2-циннамат) (рис 4).
АЬюгЬэпсе
Рис 4 УФ-спектр водно-спиртового извлечения корпевищ с корнями левзеи сафлоровидной
Для детализации вклада в кривую светопоглощения суммарных извлечений отдельных БАС далее приводим УФ-спектры ГСО экдистена, понастерона С 2-циннамата и 5-О-глюкозида 3,3'диметилкверцетина
А
17515
125 - -1
075 05 0.25
Рис 5 УФ-спектр ГСО экдистена
200 225 250 275 300 325 350 375 «0 425 450 475
Рис 6 УФ-спектр понастерона С 2-цинпамата
АЬкиЬапсе
пт
Рис 7 УФ-спектр 5-О-глюкозида 3,3'-диметилкверцетина
Исходя из полученных данных можно с уверенностью сказать, что выделенные методом колоночной хроматографии доминирующие вещества корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, особенно понастерон, более объективно характеризуют данное сырье, чем ГСО экдистена
2.2. Количественный анализ корневищ с корнями левзеи сафлоровидной
В основу предложенной нами методики количественного анализа БАС корневищ с корнями левзеи сафлоровидной положепо прямое хроматоспектрофотометрическое определение суммы экдистероидов в пересчете на экдистен
В ходе предварительных исследований было показано, что наибольший выход целевого продукта достигается при размере частиц не более 3 мм и экстракции сырья 70% этанолом в соотношении 1:30 в течение 1 ч на кипящей водяной бане
А
1 75 18
1
ora
0.5
0.15
МО OS 250 775 S00 SJ5 МО 37S
nro
Рис 8 УФ-спектр водно-спиртового извлечения корневищ с корнями левзеи, очищенный на оксиде алюминия
1
1
\
, ., _____ —
УФ-спектр спиртового извлечения (рис 8) имеет максимум поглощения при 242 нм (экдистерон) С целью отделения фенольных соединений мы
провели очистку водно-спиртового извлечения на оксиде алюмипия В качестве аналитической волны предложено использовать максимум поглощения при 242 нм. В данной области спектра спиртовые растворы извлечения из сырья и экдистерон имеют прямопропорциональную зависимость оптической плотпости от концентрации Данное обстоятельство позволяет использовать прямую спектрофотометрию для количественного определения суммы экдистероидов в пересчете па экдистен
Метрологические характеристики методики количественного определения суммы экдистероидов в сырье «Корневища с корнями левзеи сафлоровидной» рассчитаны из результатов анализа одного образца сырья в 11 независимых повторпостях (табл 2)
Таблица 2 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы флавоиоидов в корневищах с корнями левзеи
сафлоровидпой
/ X 5 Р,% 1(Р,Л Ах Е,%
10 2,50 0,0560 95 2,23 0,11 ±4,40
Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет +4,4 %. Опыты с добавками ГСО экдистена к навеске сырья показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки разработанной методики
С целью количественного определения нами был осуществлен также метод ВЭЖХ с предварительной экстракцией сырья этиловым спиртом в течение 1 часа на водяной бане, а не метиловым спиртом в аппарате Сокслета, как заявлено в ФС 42-2707-99
Следует отметить, что цельное и измельченное сырье, па котором проводилась отработка по показателю качества «содержание экдистероидов»,
соответствовало ФС 42-2707-99 по внешнему виду, микроскопии и числовым показателям
3. Совершенствование методов стандартизации препарата «Экстракт левзеи жидкий».
При разработке подходов к решению проблемы стандартизации галенового препарата «Экстракт левзеи жидкий» (ФС 42-1995-99) мы придерживались принципа унификации методик анализа в ряду лекарственное растительное сырье-субстанция-лекарственная форма (И А Самылина, 1994,1995)
Для качественного анализа данного препарата, как и в случае анализа сырья растения, предложен метод тонкослойной хроматографии с использованием ГСО экдистена и выделенных веществ понастерон С 2-циннамат и 5-О-гликозид 3,3 '-диметил кверцетина (рис 5), а также идентификация по УФ-спектру
1 Понастероп С 2-циннамат
2 5-О-глюкозид 3,3' -диметилкверцетина
3 ГСО экдистена
4 Экстракт левзеи жидкий
Рис 5 ТСХ-анализ экстракта левзеи жидкого
ГСО экдистена в УФ-свете при длине волны 254 нм обнаруживается в виде слабовыраженного фиолетового флуоресцирующего пятна с величиной Кг около 0,1 на уровне пятна ГСО экдистена Пятно понастерона С 2-циннамата в УФ-свете при длине волна 254 нм обнаруживается в виде
хлороформ - этаноп 41 Уф 368,254 фосфорноиогьфремсюя »-тя
О
о о О
^ п
доминирующего фиолетового пятна с Кг около 0,7 на уровне пятна соответствующего достоверного образца Пятно 5-О-глюкозида З.З1-диметилкверцетина в УФ-свете при длине волны 366 им обнаруживается в виде доминирующего ярко-голубого пятна с около 0,2 на уровне пятна соответствующего достоверного образца Допускается наличие других пятен
УФ-спектр экстракта левзеи аналогичен таковому для сырья растения (рис 4) и имеет два характерных максимума при 300 и 330 нм
Количественную оценку содержания БАС в экстракте левзеи жидком, как ранее показано для сырья, целесообразно проводить по содержанию экдистсроидов в вариапте прямой спектрофотометрии в пересчете на экдистен при аналитической длине волны 242 нм с предварительной очисткой экстракта на оксиде алюминия
Метрологические характеристики методики количественного анализа суммы экдистероидов в экстракте левзеи представлены в табл 3
Таблица 3 - Метрологические характеристики методики количественного определения суммы экдистероидов в экстракте
левзеи жидком
/ X 5 Р, % tiP.fi Ах Е, %
10 2,20 0,0114 95 2,23 ±0,0814 ±3,71
Ошибка единичного определения с доверительной вероятностью 95% составляет ± 3,71 % Опыты с добавками ГСО экдистена в препарат и в раствор А показали, что ошибка анализа находится в пределах ошибки единичного определения, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки методики
С учетом результатов проведенных исследований возникла необходимость в пересмотре некоторых разделов имеющейся НД на корневища с корнями левзеи и препарат «Экстракт левзеи жидкий»
Результаты исследования показали нецелесообразность определения подлинности сырья и препарата только по содержанию экдистена, а также использование в качестве реактива спиртового раствора ванилина Метод спектрофотометрии в разделе «Качественные реакции отсутствует», кроме того при использовании методики ВЭЖХ говорится о двух пиках удерживания, которые соответствуют ГСО экдистена. В то же время, наши исследования, проведенные в рекомендуемых по ФС 42-2707-99 условиях, показывают, что на хроматограмме наблюдается один доминирующий пик удерживания, который соответствует не только экдистену, но и другим экдистероидам (понастерон С 2-циннамат) С учетом полученных данных при изучении корневищ с корнями левзеи представляется целесообразным проводить стандартизацию как сырья, так и галеновых форм левзеи сафлоровидной не только по экдистену, но и по двум другим веществам растения - понастерону С 2-циннамату и 5-О-глюкозиду 3,3'-диметилхверцетина. Выбор в пользу этих веществ сделан па том осповании, что данные соединение является доминирующими и специфичными компонентами левзеи сафлоровидной
Количественное определение, на наш взгляд, также нуждается в переработке, так как заявленная в фармакопейной статье стадия экстрагирования сырья с целью проведения ВЭЖХ является длительным и трудоемким в исполнении, поэтому в разделе «Количественное определение» оптимизирована методика ВЭЖХ и включен метод прямой хроматоспектрофотометрии При приготовлении извлечений из корневищ с корнями левзеи для количественного определения рекомендуем использовать в качестве экстрагента не метиловый, а 70 % этиловый спирт.
Необходимость в пересмотре некоторых разделов имеющейся НД на лекарственный препарат продиктована главным образом целесообразностью унификации методик качественного и количественного анализа как корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, так и экстракта левзеи жидкого
Выделяя в сырье и галеновом препарате левзеи сафлоровидной экднстероиды как ведущую группу биологически активных соединений и флавоноиды в качестве преобладающей сопутствующей группы нами предложен ТСХ-анализ и метод спектрофотометрии для оценки качества препарата "Экстракт левзеи жидкий", а также прямой хроматоспекхрофотометрический анализ с целью определения экдистероидов в пересчете на экдистеп
Нами разработаны проекты фармакопейных статей на корневища с корнями левзеи сафлоровидной (взамен существующей ФС 42-2707-99) и на препарат «Экстракт левзеи жидкий» (взамен существующей ФС 42-1995-99).
Традиционно препараты левзеи позиционируются как тонизирующие, анаболические и адаптогенные средства, однако на наш взгляд, с учетом полученных результатов по флавоноидной составляющей растения (5-0-глюкозид З.З'-диметилкверцетина), целесообразно изучение суммарных препаратов в плане аптиоксидантной и нейротропной активности
Дапный фрагмент исследований выполнен в отношении официального препарата «Левзеи экстракт жидкий» на базе кафедры фармакологии СамГМУ (проф. А.В Дубищев) в соответствии с руководством по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ (Р У. Хабриев, Москва, 2005).
В результате выявлены звенья антиоксидантной защиты, на которые влияет изучаемый препарат уровень накопления малонового диальдегида -конечного продукта перекисного окисления липидов (ПОЛ) снижается на 32 % по сравпению с контрольной группой, активность каталазы возрастает и достигает нормы, действие на активность супероксиддисмутазы восстанавливается активность фермента на 87%, влияние на глутатионпероксидазу не отмечено
В ходе изучения нейротропной активности выявлено наличие стимулирующих эффектов левзеи экстракта с использованием модели гексеналового сна у мышей, а также антигипногенные свойства изучаемого
препарата на фоне тиопенталового сна По всей вероятности, его действие реализуется путем преимущественного влияния на подкорковые структуры головного мозга Кроме того, левзеи экстракт обладает стимулирующим и антидепрессивным действием способствует воспроизведению условных рефлексов при воздействии электросудорожного шока, проявляет антагонизм с клофелином и резерпином Это свидетельствует о влиянии исследуемого препарата на процессы метаболизма в головном мозге таких медиаторов, как норадреналин, дофамин и серотонин.
Таким образом, результаты проведенных исследований позволили разработать новые подходы к стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной и показали целесообразность дальнейшего изучения экстракта левзеи жидкого с целью уточнения спектра фармакологической активности
выводы
1 В результате изучения химического состава корневищ с корнями левзеи сафлоровидной выделено 5 индивидуальных веществ, из которых 3 относятся к фенольным соединениям и 2 вещества - к экдистероидам.
2 Выделенные вещества идентифицированы с использованием УФ-, 1Н-ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии, а также различных химических превращений как хлорогеновая кислота, кофейная кислота, 5-О-глюкозид З.З'-диметилкверцетина, экдистероп и понастерон С 2-циннамат.
3 5-О-глюкозид З.З'-диметилкверцетина выделен впервые из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной, произрастающей в Российской Федерации Понастерон С 2-циннамат впервые описан для видов рода ШаропПсит.
4 Предложены новые подходы к стандартизации сырья и препаратов левзеи сафлоровидной, заключающиеся не только в определении экдистерона
(экдистен), но и двух других доминирующих веществ попастерона С 2-циннамата и 5-О-глюкозида 3,3'-диметилкверцетина, имеющих диагностическое значение, с учетом принципа унификации методик в ряду лекарственное растительное сырье - субстанция - лекарственная форма
5 Разработана методика качественного анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной и препарата «Экстракт левзеи жидкий», основанная на обнаружении с использованием ТСХ доминирующего экдистероида (понастероп С 2-циннамат) и флавоноида (5-О-глюкозид 3,3 1 диметилкверцетина) растения 6. Показано, что кривая поглощения УФ-спектров растворов водно-спиртового извлечения и экстракта левзеи обусловлена гидроксикоричными кислотами (кофейная кислота, хлорогеновая кислота, понастерон С 2-циннамат), для которых характерны максимумы поглощения при 300 и 330 нм, и на этом основании разработана методика определения подлинности 7 Оптимизирована методика ВЭЖХ-анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной экстракцию сырья рекомендовано проводить с использованием 70% этилового спирта в течение 1 ч на кипящей водяной бане, вместо длительной (в течение 7 ч) экстракции метиловым спиртом 8. Разработана методика количественного определения суммы экдистероидов в корневищах с корнями левзеи и «Экстракте левзеи жидком» с использованием прямой хроматоспекгрофотометрии Ошибка единичного определения содержания суммы экдистероидов с доверительной вероятностью 95% составляет ±4,40 % и ±3,71 % соответственно
9 На основании экспериментальных данных, полученных в ходе химического изучения и анализа корневищ с корнями левзеи сафлоровидной (ШшропНсит carthamoid.es (\УПМ) II) щ), оформлен проект
ФС «Корневища с корнями рапонтикума сафлоровидного» и ФС «Левзеи экстракт жидкий»
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1 Алексеева, Е.А (Дремова Е А) Левзея сафлоровидная - перспективный источник адаптогенных и анаболических лекарственных средств / Е А Алексеева // Фармация и медицина - 2001 - № 23 (142) - С 45-46.
2 Запесочная, Г Г. Флавоноиды как гепатопротекторы и антиоксиданты / Г. Г Запесочная, В А Куркин, А А Лебедев и др // Человек и лекарство-Тезисы докладов IX Российского национального конгресса (8-12 апреля) -М , 2002 -С 164
3 Дремова, Е А Обоснование целесообразности разработки препаратов на основе левзеи сафлоровидной / Е. А Дремова // Межрегиональная конференция молодых ученых «Аспирантские чтения — 2003» — Самара, 2003 -С 106-108
4 Дремова, Е А Проблемы стандартизации лекарственного растительного сырья и препаратов левзеи сафлоровидной / Е А Дремова // П Всероссийский съезд фармацевтических работников- Материалы съезда (5-7 июня) - Сочи, 2005 -С 69-71
5 Куркин, В А. Фармакоэкономические исследования номенклатуры иммуномодуляторов, предстваленных на фармацевтическим ранке Самарской области / В А Куркин, В Н Ежков, Е А. Авдеева и др. // Человек и лекарство Тезисы докладов ХШ Российского национального конгресса (апреля) - М., 2006 - С 711.
6 Дремова, Е А Особенности фитохимического и фармакологического исследования экдистероидов, выделенных из корневищ с корнями левзеи сафлоровидной / Е А. Дремова // Межвузовская конференция молодых ученых «Аспирантские чтения-2006». - Самара, 2006 - С. 239-242
7. Kurkin, VA. Phytochemical and Pharmacologycal investigations of some medicinal plants conentmg flavonoids /VA Kurkrn, A V. Dubishchev, E V Avdeeva // Polyphenolis communications 2006 - XXIV International Conferens on Polyphenols - Winnipeg, Manitoba, Canada, 2006/ P - 513-514 8 Куркин, В. А Антиоксидантпая активпость некоторых фитопрепаратов, содержащих флавопоиды и фенилпрапоноиды / В А Куркин, О Л Кулагин, Е. В Авдеева, А. С Царева, H С Додонов и др // Фармация - 2007. - № 2 С 26-31.
Подписано в печать 17 04 2007 Формат 60x84/16 Бумага офсетная Печать оперативная Уел печ л 1 39 Тираж 100 экз Заказ 423
Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ООО «ОФОРТ» 443080, г Самара, ул Революционная, 70, литера П Тел 372-00-56,372-00-57