Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармацевтический анализ производных индола проточно-инжекционным методом

На правах рукописи

БРЫСАЕВ АРКАДИЙ СЕРГЕЕВИЧ

ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫМ МЕТОДОМ

15.00.02 - Фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

Казань-2004

Работа выполнена в Казанском государственном технологическом университете на кафедре аналитической химии, сертификации и менеджмента качества

Научный руководитель: доктор химических наук,

профессор Евгеньев Михаил Иванович

Официальные оппоненты: доктор химических наук,

профессор Фридланд Сергей Владимирович доктор фармацевтических наук, профессор Егорова Светлана Николаевна

Ведущая организация: Казанский государственный университет

Защита состоится 2 декабря 2004 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета К 212.080.05 в Казанском государственном технологическом университете по адресу: 420029, Казань, ул. Сибирский тракт, 12, аудитория Д-414.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного технологического университета.

Автореферат разослан " ?С " р^т_ 2004 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, > у л

кандидат химических наук, доцент ^¡Г^ЛЛ^Л/с—■ В.М. Захаров

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы: Производные индола (ПИНД) представляют собой физиологически чрезвычайно активные вещества, находящие, широкое применение в медицинской практике как эффективные препараты с разнообразной фармакологической активностью (действие на периферические ней-ромедиаторные процессы, а также обладающие гемморагическими, седатив-ными и радиозащитными свойствами). Высокая биологическая активность производных индола требует применения избирательных и чувствительных методов для мониторинга этих соединений в процессе промышленного получения лекарственных веществ (ЛВ) и контроле качества лекарственных форм.

Для решения этой проблемы перспективен метод проточно-инжекционного анализа (ПИА), использование которого позволяет достигать высокой производительности, экспрессности и экономичности процедур контроля качества лекарственных веществ. Выбору этого метода способствуют такие его преимущества, как простота технического исполнения и возможность получения большого объема аналитической информации за короткие промежутки времени. Проточно-инжекционный метод анализа все шире применим для оценки качества лекарственных препаратов и постадийного контроля фармацевтического производства.*

Реакция дериватизации зачастую является необходимой стадией фармацевтического анализа. Проведение в проточно-инжекционной системе реакций получения производных во время движения реакционной зоны до детектора или непосредственно в детекторе во время измерения является эффективным приемом улучшения аналитических характеристик лекарственных веществ. Это связано со сложным составом анализируемых матриц при низких содержаниях аналита, а также со спецификой значительной части ЛВ и их метаболитов, имеющих высокую полярность, слабовыраженные хромофорные, электрофорные или флуорофорные свойства. Большинство спектро-химических реакций получения ПИНД характеризуется невысокой избирательностью и чувствительностью. Эти факторы ограничивают возможности спектрофотометрического детектирования ПИНД в системе ПИА при использовании традиционных подходов.

В связи с этим возникает потребность в применении аналитических реакций, которые можно использовать в системе проточного анализа для селективных и чувствительных определений ПИНД в сложных по составу смесях без их разделения.

Соруководителем диссертационной работы по вопросам фармацевтического анализа являлся доктор химических наук, доцент Гармонов Сергей Юрьевич

Целью работы является изучение реакций получения производных индола с хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксидиазола в системе проточно-инжекционного анализа, а также разработка избирательных и чувствительных методик их определения в реакционных и лекарственных смесях.

Научная новизна:

- впервые обоснованы условия использования 4-хлор-5,7-динитробензофуразана и его ^оксида при проточно-инжекционных определениях производных индола, разработаны критерии их выбора для деривати-зации лекарственных веществ и компонентов их синтеза;

- изучены спектральные и кислотно-основные характеристики синтетически выделенных динитробензофуразановых и динитробензофуроксановых производных замещенных триптамина, установлен состав этих соединений на основании данных элементного анализа и ЯМР 2Н спектров;

- показана возможность, избирательных и чувствительных проточно-инжекционных определений со спектрофотометрическим детектированием производных индола, о-фенилендиамина и гидразина в лекарственных формах и технологических смесях;

- выявлен характер влияния состава потока, его физико-химических и гидродинамических характеристик, а также компонентов анализируемых сред на избирательность и чувствительность проточно-инжекционных определений производных индола;

- установлены рабочие условия проточно-инжекционных определений производных индола в лекарственных препаратах на основе серотонина, мек-самина, мелатонина, индометацина и имиграна.

Практическая значимость. Разработан метод анализа лекарственных веществ на основе производных индола проточно-инжекционным методом, обоснована возможность применения проточно-инжекционного анализа в фармацевтической химии для контроля качества лекарственных препаратов и процессов их производства.

Разработаны экспрессные и чувствительные методики спектрофотомет-рического, избирательного проточно-инжекционного определения производных индола, производных индолилуксусной кислоты, о-фенилендиамина, гидразина в реакционных и лекарственных смесях.

В производственных условиях апробированы методики определения мелатонина, мексамина, производных индолилуксусной кислоты, серотонина, суматрйптана при контроле качества готовых лекарственных форм и поста-дийном контроле производства.

Результаты работы используются во ФГУП ЦХЛС-ВНИХФИ (Москва) и учебном процессе КГТУ при изучении дисциплины "Контроль качества лекарственных препаратов".

На защиту выносятся:

• Результаты исследования и подбор оптимальных условий проведения аналитических определений лекарственных веществ на основе производных индола с хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола спектрофотомет-рическим и проточно-инжекционным методами.

• Обоснование роли растворителя и компонентов анализируемой матрицы в формировании аналитического сигнала при определениях производных индола в виде их производных в равновесных и неравновесных условиях.

• Результаты изучения влияния состава потока и его гидродинамических параметров, рН, свойств используемого реагента и определяемого вещества на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования производных индола и компонентов их синтеза в системе проточно-инжекционного анализа.

• Методики проточно-инжекционного, спектрофотометрического определения производных индолилуксусной кислоты, серотонина, мексамина, мелатонина, суматриптана, о-фенилендиамина, гидразина в различных смесях и готовых лекарственных препаратах.

Апробация работы. Основные результаты работы доложены на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); XII Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии МКХТ - 98 (Москва, 1998); II Научной конференции "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2001); Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002, 2003", (Москва, 2002,2003); Научной сессии КГТУ "Механизмы, термодинамика и кинетические реакции в гомо- и гетерогенных системах" (Казань, 2003). •

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи и 8 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; четырех глав; экспериментальной части, в которых описана постановка задачи, объекты, техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения и библиографического списка литературы. Диссертация изложена на 138 страницах, содержит 21 рисунок, 25 таблиц и библиографию 199 наименований.

Диссертационная работа поддержана грантами Академии наук Республики Татарстан (№ 19-01/2000 (Ф), 07-7.5-86/2001 (Ф)).

Научные консультации по контролю качества лекарственных препаратов осуществлял доктор фармацевтических наук Дегтерев Евгений Викторович.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Проточно-инжекционные определения проведены с использованием обращенного варианта одноканального проточно-инжекционного анализатора с плунжерным насосом Dl (Mickrotechna) и проточным фотометрическим блоком с кюветой объемом 6 мкл и длиной оптического пути 0,5 см. В качестве детектора применяли спектрофотометр Specol-210 (Karl Zeiss Yena). Регисто-граммы записывали на самописце TZ-4100. В качестве инжектора использовали шестиходовой кран (Mickrotechna) с калиброванной петлей объемом 110 мкл. Проточные коммуникации выполнены из тефлоновых трубок с внутренним диаметром 0,6 мм. Длина реакционной спирали составляла 2,0 м.

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометре СФ-26. По-тенциометрические измерения выполнены на электронном рН-милливольтметре MV-87S (Германия). Тонкослойная хроматография выполнена на пластинках Силу фол УФ-254.

Чистоту веществ контролировали с использованием хромотографиче-ской системы HP-1100 с диодно-матричным и флуоресцентным детекторами (Hewlett-Packard, Waldbronn, FRG). Все органические соединения промышленного изготовления, а также используемые органические растворители при необходимости подвергали дополнительной очистке по известным методикам. 4-Хлор-5,7-динитробензофуразан (БФЗ) и 7-хлор-4,6-динитробензофу-роксан синтезированы к.х.н., доцентом Левинсоном Ф.С.

В диссертационной работе использованы производные индола, химические названия и обозначение которых представлены в табл. 1.

Таблица 1 - Анализируемые производные индола

>6 л/п Название R. Ri Rj Rt

I 2 3 4 5 6

1 Индол -Н -H -H -H

2 2-(Индолил-3)эпанамин-1 •CHjCHjNHj -H -H -H

3 2-(5-Гидрокст1ндолил-3) зтанамии-1 -CHjCH2NH2 -H -H -OH

4 3-(2-Аынноз™л)-5-метоксииндол-кар6о;ю«а»-2-|даслот» -CH2CH2NH2 -COOH -H -OCH,

5 2-(5-Бснзшюкси1шдолшт-3)этанамин-1 -СНгСНгЫНг -H -H -OCH&Hj

1 2 3 ' 4 s 6

6 3-(2-Аминоэтал)-5-бензилокси-индолкарбоноЁЕМ-2-кислота -CH2CHjNH2 •COOH -H -OCHjQHj

7 2Ч5-Мегоксииндолил-3) этанамин-1 -CHjCHÍNH2 -H -H ■OCH,

g 2-(1-Бешил-2-метилицдолил-3) этанамин-1 -CHjCHjNHj -CHj -CHîCéHj -H

9 2-(1-Бенэил-2-метил-5-метоксииндолил-З )этанамин-1 -CHjCH2NH2 -CH, -CHîCéHj -OCH)

10 2-О-Бснзилинполил-З) этанамин-1 -CHjCH2NH2 -H -СНгС»Н, -H

11 3-(1-Бенэил-3-ицдолкл) пропанол-1 -CH2CH2CHjOH -H -CHjCíH, -H

12 1 -Амино-2-(1 '-метилиндол-З^лш -CH2CH2NHj -H -CH, -H

13 2,3-Дифенилиндол -CÍHjOH ■слон -H -H

14 3-(Ы,Ы-днметш1а»1ино) метилиидол -CH¡N(CHj)i -H -H -H 1

15 Мелатонин ■CHjCHjNHCOCH, -H -H ■OCH, /

16 3[2-(Димстиламино)этал]-Ы-метил- индол-5-метансульфонамид сукцинат -CHjCH^CCHj)! -H -H ch2nhso2 CH,

17 Тартрат-2-мегил-1,7-диметнпен-З-(3 '-амино)пропилиндол ^-^CHjCHJCHJNHJ

18 Тартрат-2-метил-1,7-триметален-3-(3 -амино)пропилиндол

19 2-Метнл-1,7-1риметилен-3-(2'-амино)этилиндол ШСГ

20 Динордезокси-10-метил-гомоэзеролин cyo

21 1-Метил-динордезокси-9-метилэзоролин if*

22 З-Метил-5-хлорпиразал xt

23 3,5-Диметил-пиразол-4-сульфокнспота SO.K_X H. XT

2. ХРОМОГЕННЫЕ РЕАКЦИИ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА С ЗАМЕЩЕННЫМИ ХЛОРДИНИТРОБЕНЗ-2,1,3-ОКСАДИАЗОЛА

Для выяснения природы электронных спектров были синтезированы производные индола с 4-хлор-5,7-динитробензофуразаном. Состав соединений установлен на основании данных элементного анализа, а строение доказано на основании ЯМР Н спектров.

На основании данных спектроскопии ПМР можно сделать заключение, что в случае грамина реакция идет по первому индольному циклу. В случае мелатонина имеется две возможности атаки БФЗ по NH- группе индольного цикла и по NH- группе амидного фрагмента боковой цепи. Однако отсутствие сигнала в области 10,0 м.д., характерного для NH- индола, свидетельствует о протекании реакции по положению первого гетероцикла, NH- протон амид-ной группы остается свободным (5 = 8,0 м.д.), вероятно, вследствие стериче-ских затруднений (объемная ацетильная группа). На примере 1-бензил трип-тамина реализуется единственно возможный вариант - атака 4-хлор-5,7-динитробензофуразана по аминогруппе боковой цепи. Неоднозначно могло протекать взаимодействие серотонина с БФЗ. В серотонине имеется три возможных направления атаки: NH- индола в положении 1, NH2 группы боковой цепи и НО- группы в положении 5. Поскольку аминогруппа боковой цепи является более основной, как и следовало ожидать, взаимодействие протекало по этой группе. В спектре ПМР имеются сигналы 5 = 10,0 м.д. (N11- индола) и сигнал 5 = 5,0 м.д. (ОН- группы).

Для выбора оптимальных условий определения ПИНД изучены спектральные характеристики их динитробенз-2,1,3-оксадиазольных производных, влияние на спектральные свойства образующихся производных природы растворителя и компонентов реакционной среды, а также устойчивости продуктов аналитических реакций во времени. В водно-спиртовых средах взаимодействие исследуемых ПИНД с БФЗ и БФО протекает с образованием интенсивно окрашенных и устойчивых соединений. Реакции для ПИНД протекают в соответствии со схемой:

По полученным данным элементного анализа, ИК- и , ПМР-спектроскопии образующиеся продукты являются КЫ-кислотами.

В электронных спектрах динитробензофуроксановых и динитробензо-фуразановых производных I - IX в полярных неводных средах и их водных смесях регистрируются интенсивные полосы поглощения в видимой области спектра (рис.1). Максимумы поглощения соответствующих производных лна-ходятся в интервале 470-500 нм, при этом положение и интенсивность полос их поглощения определяются природой используемого реагента - электрофила и растворителем. Наибольшие значения молярных коэффициентов поглощения наблюдаются в ацетонитриле, спиртах и их водных смесях, что позволяет использовать эти среды в качестве аналитических. Кроме того, эти среды обеспечивают хорошую растворимость определяемых веществ и их производных. Наличие К-оксидного фрагмента в БФО повышает поляризуемость фуроксанового цикла, участвующего в сопряжении с ароматическим кольцом, что приводит к некоторой контрастности полосы поглощения ПИНД по сравнению с бензофуразановыми производными (ДА,т = 10 нм) (рис. 1), Однако для 4,6-динитробензофуроксановых производных соединений I - IX характерна более низкая интенсивность полос поглощения и скорость образования соответствующих продуктов реакций дериватизации, чем у 5,7-динитробензофуразановых производных аналитов..

С точки зрения выбора реагентов при определениях ПИНД важную роль играет скорость образования окрашенных производных. Так, если с БФЗ образование окрашенных производных происходит практически при сливании растворов изученных ПИНД с реагентом, то в случае с БФО для количественного завершения реакции необходимо 15 и более минут. По всей видимости, причиной обращения реакционной способности БФО по сравнению с БФЗ при взаимодействии с ПИНД служат, как и в случае замещенных вто-

ричных и третичных аминов, стерические затруднения, связанные с наличием К-оксидного кислорода в БФО. Наличие этого фрагмента в реагенте-электрофиле может вызывать необходимость определенной пространственной ориентации нуклеофила, имеющего соответствующий набор заместителей или даже структурную перестройку взаимодействующий частиц в ходе образования промежуточных а-комплексов. Следовательно, как по реакционной способности, так и по спектрально-аналитическим характеристикам образующихся производных БФЗ предпочтительнее, чем БФО в анализе ПИНД. Следует отметить, что благодаря спектральным характеристикам образующихся продуктов ПИНД как с БФЗ, так и с БФО спектрофотометрическому определению не мешают избыток реагентов и их гидролизованных форм.

БФЗ и БФО в спиртовых, диметилсульфоксидных, диметилформамид-ных и других неводных средах претерпевают гидролитические превращения с образованием неактивного гидроксипроизводного. В связи с этим раствор реагента для аналитических определений готовили в ацетонитриле, в котором достигается достаточная устойчивость аналитического реагента к гидролизу. В смешанных средах гидролиз БФЗ и БФО не оказывал существенного влияния на полноту завершения реакций образования производных из-за различий в нуклеофильных свойствах определяемых аминосоединений и воды, а также заведомого избытка реагентов в реакционной смеси (30- кратный и более).

В связи с проявлением КЫ-кислотности у динитробензоксадиазольных ПИНД положение полос поглощения и их интенсивность определяются рН и составом среды. В качестве типичного примера, иллюстрирующего это влияние, можно привести 5,7-динитробензофуразановое производное серотонина (рис.2). При уменьшении рН реакционной среды наблюдается снижение интенсивности длинноволновых полос поглощения динитробензофуразановых ПИНД, что очевидно, обусловлено уменьшением полноты протекания реакции дериватизации в кислой среде. В связи с этим максимальные значения молярных коэффициентов поглощения изученных 4,6-

динитробензофуроксановых и 5,7-динитробензофуразановых ПИНД зафиксированы в нейтральных средах. По этой причине аналитические определения ПИНД необходимо проводить в интервале рН 6,5-7,5. В щелочных средах определения ПИНД осложняются процессами гидролиза БФО и БФЗ, приводящие к снижению эффективной концентрации аналитического реагента в реакционной смеси.

В условиях избытка аналитического реагента (БФО или БФЗ) или продукта его гидролиза фиксируется только поглощение в длинноволновой области, что позволяет получать воспроизводимые результаты при аналитических определениях лекарственных веществ. Изучено влияние на результаты

аналитических определений ПИНД потенциальных компонентов анализируемых смесей.

Спектрофотометрическому детектированию продуктов реакции БФЗ с ПИНД не мешают фенолы, карбоновые кислоты, спирты, другие органические соединения, неорганические соли. Аминокислоты, имеющие гипсохром-но сдвинутые в область 400-440 нм полосы поглощения по сравнению с ПИНД, также не влияют на результаты спектрофотометрических определений.

Таким образом, изучение реакций исследуемых ПИНД с хлорзамещены-ми бензофуразана и бензофуроксана в стационарных условиях свидетельствует об их сложном механизме и зависимости аналитических свойств образующихся производных от состава среды. Это следует учитывать при проведении реакций дериватизации в системе проточно-инжекционного анализа.

3. ПРОТОЧНО - ИНЖЕКЦИОННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА СО СПЕКТРОФОТОМЕТРИЧЕСКИМ ДЕТЕКТИРОВАНИЕМ

На скорость и полноту протекания реакций дериватизации аминосоединений хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола в стационарных и неравновесных условиях, а также на спектрально-аналитические характеристики производных, сильно влияют природа растворителя и состав реакционных сред. В связи с этим было изучено влияние состава потока на величину аналитического сигнала в ПИА.

Результаты изучения реакции ПИНД с БФЗ в системе ПИА, приведенные в табл. 2, показывают сложный характер влияния свойств растворителей, входящих в состав потока, на формирование аналитического сигнала. Экспериментальные данные указывают на то, что в неравновесных условиях проведения реакции ПИНД с БФЗ оптимальное соотношение полярных и основных свойств среды потока достигается в смеси ацетонитрил-буферный раствор с рН 6,8. Следует отметить, что именно эти смеси обеспечивают хорошую растворимость всех компонентов реакционной среды в потоке. Определяемые ПИНД, а также их динитробензофуразановые производные имеют ограниченную растворимость в воде. В случае диметилсульфоксида и его смеси низкие значения интенсивности сигнала, по-видимому, связаны с более высокой вязкостью этого растворителя, что приводит к изменению гидродинамических параметров потока. Для диметилсульфоксида возможно протекание конкурентной реакции с инжектируемым БФЗ из-за нуклеофильных свойств этого растворителя и как следствие снижение эффективной концентрации аналитического реагента в потоке. По данным, приведенным в табл. 2, можно заметить, что интенсивность фиксируемого сигнала в основном связана со степенью завершенности химической реакции при условии сохранения постоянства гидродинамических параметров в системе ПИА.

Таблица 2 - Влияние природы носителя на интенсивность сигнала при про-точно-инжекционных определениях производных индола (С = моль/л) в виде производных 4-хлор-5,7-динитробензофуразана. Концентрация реагента 10'2 моль/л, скорость потока 1,3 мл/мин, А. = 490 нм

Вещество Концентрация, моль/л Состав потока: ацето-нитрип-буфер с рН 6,8 (объемные %) Интенсивность сигнала, А«103, е.о.п.

1 2 3 4

Серотонин• 5 Ю-4 70:30 30

50:50 33

30:70 52,5

20:80 85,5

15:85 73,5

Суматриптан 2,42 Ю-6 70:30 25,5

50:50 19,5

30:70 51

20:80 63

15:85 16,5

I 2 3 4

Мексамин 5 10"6 70:30 34,5

50:50 30

30:70 46,5

20:80 67,5

15:85 52,5

Мелатонин 5 10"* 70:30 33

50:50 37,5

30:70 39

20:80 42

15:85 31,5

На интенсивность сигнала и скорость образования динитробензофура-зановых ПИНД в системе ПИА, влияет величина рН среды. Повышение кислотности раствора приводит к уменьшению интенсивности длинноволновых полос поглощения и подавлению реакции дериватизации в проточной системе. В щелочных средах (рН>8) наблюдается понижение интенсивности сигнала, что уже связано с влиянием гидролитического превращения БФЗ приводящей к снижению эффективной концентрации реагента в потоке. В связи с этим для определений выбраны потоки, содержащие фосфатный буферный раствор с рН = 6,86 (рис. 3).

Для приготовления растворов инжектируемого реагента использовали ацетонитрил. Варьирование концентрации инжектируемого в поток реагента вызывало уменьшение интенсивности регистрируемого сигнала при его концентрации менее 7-10'3 моль/л. При концентрациях БФЗ свыше 2-10"2 моль/л происходит нарушение гомогенности потока, затрудняя проведение аналитических определений из-за дрейфа нулевой линии (рис. 4). Рабочий интервал содержаний БФЗ в инжектируемом в поток растворе составлял (1-3)10'2 моль/л.

Гидродинамические характеристики системы ПИА, скорость потока, длина (объем) реактора и объем инжектируемого раствора оказывают влияние на полноту протекания химической реакции и диффузионные процессы. Длина реактора и скорость потока определяют время пребывания реакционной зоны в системе ПИА и, таким образом, влияют на полноту протекания химической реакции. Длина реактора свыше 90 см при его внутреннем диаметре 0,6 мм не оказывала влияния на интенсивность сигнала. Оптимальный объем инжектируемого раствора реагента при этом составил 110 мкл. При малых скоростях потока происходит размывание реакционной зоны в следствии диффузионных явлений, в то время как при больших скоростях уменьшение интенсивности регистрируемого сигнала связано с понижением степени завершения реакции. Оптимальные значения скорости потока составляют 0,9-1,5 мл/мин.

h,mm

0 2 4 в в 10

Рис. 3. Зависимость высоты пика при Рис 4. Влияние концентрации инжекти-проточно-инжекционных определениях руемого реагента на сигнал при проточ-серотонина (5 106 М) от рН реакционной но-инжекционных определениях мекса-среды. Скорость потока 1,93 мл/мин. мина (5 10б моль/л). Поток ацетонитрил-

вода (20 80, об.), рН = 6,8, скорость потока 1,72 мл/мин.

Аналитические характеристики проточно-инжекционных определений ПИЦЦ демонстрируют линейность градуировочных зависимостей и представлены в табл. 3. Результаты показывают линейность градуировочных зависимостей в интервале определяемых концентраций ПИЦЦ. Пределы обнаружения в соответствии с 38-критерием достигают 0,01 мкг/мл.

Изучено влияние на результаты аналитических определений ПИЦЦ потенциальных компонентов анализируемых смесей в системе ПИА. Оказалось, что на детектируемый сигнал не оказывают влияния фенолы, карбоновые кислоты, спирты, другие органические соединения, неорганические соли. Установлено, что вспомогательные вещества, входящие в состав наблеюк (лимонная кислота, глюкоза, крахмал и др), определениям не мешают.

Таблица 3 - Аналитические характеристики проточно-инжекционных определений производных индола

Состав Уравнение рег- Интервал Коэф- Про-

Определяемое вещество потока рессии (А-1,5 10\ опред фици- изводи

еоп, концен- ент тель-

С„ мкг/мл) траций, корре- ность

мкг/мл ляции проб/ч

1 2 3 4 5 6

Индол 20 80 А=0,171С,-0,013 0,06-0,25 0,9998 29

2-(Индолил-3)этанамин-1 15 85 А=0,432СХ-0,033 0,13-0,47 0,9998 28

2-(5-Гидроксииндолил-3)этанамин-1 20 80 А=0,346С, - 0,020 0,03-0,12 0,9999 30

1 2 3 4 5 6

3-(2-Аминоэтил)-5-метоксииндолкарбоновая-2-кислага 20 80 А=0,246С«+0,003 0,06-0,20 0,9999 32

2-(5-Бешилоксииндрлил-3)этанаммн-1 20 80 А=0,423С«-0,029 0,02-0,10 0,9998 36

3-{2-Аминоэтил)-5-бензилокси-индолхарбоновая-2-кислота 20 80 А=0,098С,+0,010 0,13-0,47 0,9998 35

2-(5-Метоксииндолил-3)этанамин-1 20 80 А=0,067СХ-0,005 0,10-0,60 0,9998 29

2-( 1 -Бензил-2-метилиндолил-З) этанамин-1 15 85 А=0,075С,+0,006 0,16-0,61 0,9999 32

2-(1 -Беюил-2-метил-5-метоксииндолил-3)этанамин-1 15 85 А=0,150С„-0,013 0,07-0,30 0,9999 34

2-(1-Бензил-индолил-3)этанамин-1 15 85 А=0,164СХ-0,006 0,06-0,27 0,9998 34

1 -Ам ино-2-( 1 '-метилиндол-3)этан 20 80 А=0,376С,-0,035 0,02-0,10 0,9999 31

2,3-Дифенилиндол 20 80 А=0,346С„-0,018 0,03-0,13 0,9999 33

3-(Ы,Ы-димстиламино)мстили1]дол 20 80 А=0,573С*-0,038 0,01-0,07 0,9999 35

Мелатонин 20 80 А=0,167СХ-0,001 0,060Д1 0,9998 29

3[2-(Диметиламино)этил]-Ы-метил-индол-5-метансульфонамид 20 80 А=0,573С„-0,039 0,01-0,07 0,9997 30

Тартрат-2-метил-1,7-диметилен-3-(3'-амино)пропилиндол 20 80 А=0,090С„-0,004 0,08-0,44 0,9998 32

Тартрат-2-мети1-1,7-триметилен-З-(3 '-амиио)пропилиндол 20 80 А=0,381С,-0,033 0,02-0,11 0,9999 28

2-Метил-1,7-триметилен -3-(2'-амиио)этилиндол 15 85 А=0,225Сх-0,022 0,05-0,20 0,9999 29

Динордезокси-10-метилгомоэзсролин 20 80 А=0,317С«-0,009 0,03-0,13 0,9997 27

1 -Метил-динордезокси-9-метилэзоролин 20 80 А=0,268Сх-0,012 0,04-0,16 0,9996 27

З-Метил-5-хлорпиразол 30 70 А=0,182С„-0,014 0,05-0,24 0,9996 26

3,5-Диме гилпиразол-4-сульфокислота 20 80 А=0,323Сх-0,026 о,оз-о,:з 0,9995 25

4. ПРОТОЧНО-ИНЖЕКЦИОННЫЕ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ВЕЩЕСТВ И КОМПОНЕНТОВ СИНТЕЗА ПРОИЗВОДНЫХ ИНДОЛА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ И РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЯХ

Был разработан комплекс избирательных и чувствительных методик определения о-фенилендиамина, 3-(2-метил-5-метоксииндолил)уксусной кислоты, гидразина проточными методами при использовании реакции дерива-тизации определяемых веществ хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола. Комплекс использован для контроля состава реакционных смесей, технических продуктов и готовой продукции.

Токсичный ароматический амин о-фенилендиамин находит широкое применение в фармацевтической химии при синтезе лекарственного вещества

дибазола. Содержание токсичных ароматических аминов в нем нормируется. В связи с высокой гепато-, нефро- и генотоксичностью о-фенилендиамина актуальной задачей является оценка безопасности фармацевтических продуктов в процессе синтеза лекарства, а также сертификации готового препарата и лекарственных форм в процессе хранения. Для выбора условий избирательного и чувствительного детектирования о-фенилендиамина в системе ПИА проведены исследования реакций с 4-хлор-5,7-динитробензофуразаном и его ^оксидом - 7-хлор-4,6-динитробензофуроксаном. Для детектирования производных в системе ПИА выбраны их длинноволновые полосы поглощения (Х=510нм).

Изучено влияние ряда органических веществ, являющихся потенциальными компонентами реакционных сред, содержащих о-фенилендиамин, на интенсивность сигнала. Оказалось, что на детектируемый сигнал не оказывают влияния аминокислоты, ацетилсалициловая и аскорбиновая кислоты, фенол и другие органические соединения (табл. 4).

Таблица 4 - Влияние мешающих компонентов на результаты проточно-инжекционного определения о-фенилендиамина (п = 4, Р = 0,95)

Состав среды, (мг/л) Аналит, мкг/мл

Введено найдено

Стандарт аминокислот (6,11) 1,1 5,12 1,15±0,06 4,80±0,38 0,06 0,05

Дибазол (122,2) 0,054 0,06±0,02 0,06

Фенол (3,5) 0,550 0,60±0,06 0,06

Уксусный ангидрид (50) 1,0 1,02±0,02 0,05

Папазол(Ю) 0,054 0,06±0,02 0,06

Палазол(130) 0,054 0,06±0,02 0,06

Синтез индометацина (нестероидный противовоспалительный препарат) включает стадию его получения из из 3-(2-метил-5-метоксииндолил)-уксусной кислоты. В связи с этим является актуальной разработка ПИ методов постадийного фармацевтического контроля ЛВ. Дли избирательного ПИ определения производного индолилуксусной кислоты со спектрофотометри-ческим детектированием перспективно использование 4-хлор-5,7-динитробензофуразана. Реакция образования 4-хлор-5,7-динитробензо-фуразанового производного из 3-(2-метил-5-метоксииндолил)уксусной кислоты в органических и водно-органических средах протекает по схеме:

о3нс

При взаимодействии 4-хлор-5,7-динитробензофуразана с 3-(2-метил-5-метоксииндолил)уксусной кислотой в растворе с рН 6,7 в спектрах поглощения появляется полоса поглощения в области 480 - 490 нм, связанная с образованием соответствующего производного.

Возможность ПИ определения 3-(2-метил-5-метоксииндолил)уксусной кислоты в анализируемом объекте проверена на примере анализа готовой лекарственной формы (табл. 5). В результате фармацевтического анализа установлено, что использование 4-хлор-5,7-динитробензофуразана для получения производного позволяет проводить экспрессные и производительные проточно-инжекционные определения 3-(2-метил-5-метоксииндолил)уксус-ной кислоты в виде производного в лекарственных смесях синтеза препарата индометацин.

Таблица 5 - Влияние различных компонентов на результаты проточно-инжекционного определения 3-(2-метил-5-метоксииндолил) уксусной кислоты (п=4, Р=0,95)

Компонент смеси Концентрация компонента, мкг/мл Введено аналита, мкг/мл Найдено аналита, мкг/мл 8,

Димексид 4,6 10,5 9,9 ±0,4 0,05

Полиэтиленоксид 400 5,9 5,8 5,5 ±0,4 0,05

Полиэтиленоксид 1500 5,9 5,8 5,7 ±0,1 0,05

Нипагин 7,0 11,4 11,8 ±0,4 0,06

Триэтаноламин 0,5 1,3 1,35 ±0,11 0,04

Серотонин нашел применение в качестве антигеморрагического лекарственного средства. Для применения в медицинской практике серотонин получают синтетическим путем. На одной из ступеней синтеза используется высокотоксичное вещество - гидразин. В связи этим содержание гидразина требует оперативного контроля в синтетических смесях при проведении технологического процесса.

Перспективно избирательное спектрофотометрическое определение гидразина в виде 5,7-динитробензофуразанового производного в присутствии ПИЦЦ, а также других органических и неорганических веществ.

Результаты определения гидразина в различных смесях приведены в табл. 6 Как видно из представленных данных, трехкратное количество 5-бензилокситрипта-мина практически не сказывается на результатах определений

Таблица 6. - Результаты определения гидразина в смесях. Концентрация гидразина в 0,26 мкг/мл, поток этанол-фосфатный буферный раствор рН 6,8, скорость потока 1,5 мл/мин, концентрация БФЗ 0,03 М

Компонент смеси Концентрация компонента, мкг/мл Найдено гидразина, с±Ас, мкг/мл я, (п=4,Р=0,95)

5-Бензилоксигриптамин 5,3 1,3 ±0,04 0,06

7,95 1,35 ±0,03 0,06

5-Бекзилокситриптамин 5,3- 0,65 ±0,05 0,05

7,95 0,39 ±0,05 0,06

Таким образом, экспериментальные данные указывают на то, что подбор природы растворителей, используемых в качестве носителя, и компонентов реакционной среды позволяет повысить избирательность и чувствительность определения гидразина в присутствии 5-бензилокситриптамина в ПИА.

ВЫВОДЫ

1. Впервые показана возможность фармацевтического анализа производных индола проточно-инжекционным методом со спектрофотометриче-ским детектированием их динитробенз-2,1,3-оксадиазольных производных.

2. Установлены условия проточно-инжекционных определений биологически активных производных индола по составу реакционной среды (кислотность и состав потока, природа неводного растворителя) и гидродинамическим характеристикам проточных систем. Регулирование избирательности и чувствительности спектрофотометрического детектирования определяемых лекарственных веществ достигается при использовании в качестве аналитических реагентов 4-хлор-5,7-динитробензофуразана и его К-оксида, а также подбором состава растворителя в потоках носителя и реагента, направленным изменением спектральных характеристик производных определяемых веществ.

3. Разработаны избирательные и чувствительные проточно-инжекционные методики для фармацевтического анализа производных индола в реакционных и лекарственных смесях сложного состава с производи-

тельностью до 36 проб/час, интервалом определяемых содержаний 0,02 - 0,6 мкг/мл, пределом обнаружения до 0,01' мкг/мл. Методики проточно-инжекционного определения мелатонина, мексамина, производных индоли-луксусной кислоты, серотонина, суматриптана апробированы при контроле качества лекарственных форм ив постадийном контроле их-производства.

4. Для оценки безопасности процессов химико-фармацевтического производства производных индола разработаны высокопроизводительные про-точно-инжекционные методы определения ароматических аминов, 3-(2-метил-5-метокси)индолилуксусной кислоты и гидразина в смесях синтеза серотонина, индометацина и дибазола. Установлены факторы повышения избирательности и чувствительности определения компонентов синтеза лекарственных веществ на основе приемов кинетического регулирования аналитических реакций.

Основное содержание диссертации изложено в публикациях:

1. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Шакирова Л.Ш., Брысаев А.С. Проточно-инжекционные определения токсичных ароматических аминов в лекарственных препаратах // Журн. аналит. химии. -2002. -Т.57. №12. -С. 1290-12951

2. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Брысаев А.С, Гуревич П.А., Насыбулдин И.Н., Дегтерев Е.В. Спектрофотометрическое определение замещенных трип-тамина в виде динитробенз-2,1,3-оксадиазольных производных // Хим.-фарм. журнал.-2003.-Т.37. №4.-С.41-44.

3. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Брысаев А.С, Гуревич П.А. Проточно-инжекционное определение замещенных триптамина в лекарственных препаратах // Вестник Казанского технолог, ун-та. -2004. -№1. -С.65-71.

4. Евгеньев М.И., Гармонов СЮ., Брысаев А.С, Гуревич П.А. Проточно-инжекционные определения о-фенилендиамина в лекарственных смесях. // Вестник Казанского технолог, ун-та. -2004. -№2. -С.96-102.

5.Шакирова Л.Ш., Брысаев А.С, Гармонов СЮ. Хроматографические и спектрофотометрические методы определения аминосоединений в лекарственных препаратах и биологических средах // Тез. докл. XII Международной Конференции молодых ученых по химии и химической технологии МКХТ -98. Москва. 1998. С.50.

6. Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Брысаев А.С Проточно-инжекционный анализ биологически активных аминосоединений // Тез. докл. II научн. конф. "Матер, и технологии 21 века". Казань. 2001. С.27.

7. Гармонов СЮ., Брысаев А.С, Шакирова Л.Ш. Проточно-инжекционное определение биологически активных соединений, содержащих аминогруппы // Тез. докл. Поволжской конференции по аналитической химии. Казань. 2001. С.131.

№20 6 8 4

8.Брысаев А.С., Гармонов СЮ. Проточно-инжекционное определение биологически активных аминосоединений в лекарственных препаратах // Тез. докл. Международной конф. студ. и аспир. по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002". Москва. 2002. С И .

9.Брысаев А.С., Гармонов С.Ю., Евгеньев М.И. Реакции производных трип-тамина с хлординитро-2,1,3-оксадиазолами в неравновесных условиях про-точно-инжекционного анализа // Аннотации научной сессии КГТУ "Механизмы, термодинамик и кинетика реакций в гомо- и гетерогенных системах". Казань. 2003. С.40.

10.Брысаев А.С., Гармонов С Ю. Проточно-инжекционный анализ замещенных триптамина в биологически активных смесях // Тез. докл. Международной конф. студ. и аспир. по фундаментальным наукам "Ломоносов-2003". Москва. 2003. С П .

11.Евгеньев М.И., Гармонов С.Ю., Брысаев А.С, Проточно-инжекционные определения замещенных триптамина со спектрофотометрическим детектированием // Тез. докл, XVII Менделеевского съезда по общей и прикладной химии. Казань. 2003. С.298.

12.Брысаев А.С, Гармонов С.Ю., Евгеньев М.И. Проточно-инжекционное определение замещенных триптамина в биологически активных смесях // Тез. докл. II научн. конф. "Матер, и технологии 21 века". Казань. 2003. С.22.

Соискатель

А.С. Брысаев

Заказ № 2.вИ

Тираж 100 экз.

Офсетная лаборатория Казанского государственного технологического университета

420015, г. Казань, ул. К. Маркса, 68

Актуальность темы: Производные индола (ПИНД) представляют собой физиологически чрезвычайно активные вещества, находящие широкое применение в медицинской практике как эффективные препараты с разнообразной фармакологической активностью (действие на периферические нейромедиа-торные процессы, а также обладающие гемморагическими, седативными и радиозащитными свойствами). Высокая биологическая активность производных индола требует применения избирательных и чувствительных методов для мониторинга этих соединений в процессе промышленного получения лекарственных веществ (JIB) и контроле качества лекарственных форм.*

Для решения этой проблемы перспективен метод проточно-инжекционного анализа (ПИА), использование которого позволяет достигать высокой производительности, экспрессности и экономичности процедур контроля качества лекарственных веществ. Выбору этого метода способствуют такие его преимущества, как простота технического исполнения и возможность получения большого объема аналитической информации за короткие промежутки времени. Проточно-инжекционный метод анализа все шире применим для оценки качества лекарственных препаратов и постадийного контроля фармацевтического производства.

Реакция дериватизации зачастую является необходимой стадией фармацевтического анализа. Проведение в проточно-инжекционной системе реакций получения производных во время движения реакционной зоны до детектора или непосредственно в детекторе во время измерения является эффективным приемом улучшения аналитических характеристик лекарственных веществ. Это связано со сложным составом анализируемых матриц при низких Соруководителем диссертационной работы по вопросам фармацевтического анализа являлся доктор химических наук, доцент Гармонов Сергей Юрьевич содержаниях аналита, а также со спецификой значительной части JIB и их метаболитов, имеющих высокую полярность, слабовыраженные хромофорные, электрофорные или флуорофорные свойства. Большинство спектрохимических реакций получения ПИНД характеризуется невысокой избирательностью и чувствительностью. Эти факторы ограничивают возможности спектрофотомет-рического детектирования ПИНД в системе ПИА при использовании традиционных подходов.

В связи с этим возникает потребность в применении аналитических реакций, которые можно использовать в системе проточного анализа для селективных и чувствительных определений ПИНД в сложных по составу смесях без их разделения.

Целью работы является изучение реакций получения производных индола с хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксидиазола в системе проточно-инжекционного анализа, а также разработка избирательных и чувствительных методик их определения в реакционных и лекарственных смесях.

Научная новизна:

- обоснованы условия использования 4-хлор-5,7-динитробензофуразана и его N-оксида при проточно-инжекционных определениях ПИНД, разработаны критерии их выбора для дериватизации лекарственных веществ и компонентов их синтеза;

- изучены спектральные и кислотно-основные характеристики синтетически выделенных динитробензофуразановых и динитробензофуроксановых производных замещенных триптамина, установлен состав этих соединений на основании данных элементного анализа и ЯМР 'Н спектров;

- впервые показана возможность избирательных и чувствительных проточно-инжекционных определений со спектрофотометрическим детектированием производных индола, офенилендиамина и гидразина в лекарственных формах и технологических смесях;

- выявлен характер влияния состава потока, его физико-химических и гидродинамических характеристик, а также компонентов анализируемых сред на избирательность и чувствительность проточно-инжекционных определений производных индола;

- установлены рабочие условия проточно-инжекционных определений производных индола в лекарственных препаратах на основе серотонина, мек-самина, мелатонина, индометацина и имиграна.

Практическая значимость работы. Выявлена и обоснована возможность применения проточно-инжекционного анализа в фармацевтической химии для контроля качества лекарственных препаратов на основе производных индола и процессов их производства.

Разработаны экспрессные и чувствительные методики спектрофотомет-рического, избирательного проточно-инжекционного определения производных индола, производных 3-(2-метил-5-метоксииндолил)уксусной кислоты, о-фенилендиамина, гидразина в реакционных и лекарственных смесях.

В производственных условиях апробированы методики определения мелатонина, мексамина, производныхЗ-(2-метил-5-метоксииндолил)уксусной кислоты, серотонина, суматриптана при контроле качества готовых лекарственных форм и постадийном контроле производства.

Результаты работы используются во ФГУП ЦХНС-ВНИХФИ (Москва) и учебном процессе КГТУ при изучении дисциплины "Контроль качества лекарственных препаратов".

На защиту выносятся:

• Результаты исследования и подбор оптимальных условий проведения аналитических определений лекарственных веществ на основе производных индола с хлординитрозамещенными бенз-2,1,3-оксадиазола спектрофотометри-ческим и проточно-инжекционным методами.

• Обоснование роли растворителя и компонентов анализируемой матрицы в формировании аналитического сигнала при определениях производных индола в виде их производных в равновесных и неравновесных условиях.

• Результаты изучения влияния состава потока и его гидродинамических параметров, рН, свойств используемого реагента и определяемого вещества на выбор условий избирательного и чувствительного детектирования производных индола и компонентов их синтеза в системе проточно-инжекционного анализа.

• Методики проточно-инжекционного, спектрофотометрического определения производных индолилуксусной кислоты, серотонина, мексамина, мела-тонина, суматриптана, офенилендиамина, гидразина в различных смесях и готовых лекарственных препаратах.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); XII Международной конференции молодых ученых по химии и химической технологии МКХТ - 98 (Москва, 1998); II Научной конференции "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2001); Поволжской конференции по аналитической химии (Казань, 2001); Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов-2002, 2003", (Москва, 2002, 2003); Научной сессии КГТУ "Механизмы, термодинамика и кинетические реакции в гомо- и гетерогенных системах" (Казань, 2003).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано и прошли рецензирование 4 статьи и 8 тезисов докладов.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; литературного обзора; пяти глав; экспериментальной части, в которых описана постановка задачи, аппаратура, объекты и техника эксперимента и изложены результаты с их обсуждением; выводов; заключения и библиографического списка цитируемой литературы.

выводы

1. Впервые показана возможность фармацевтического анализа производных индола проточно-инжекционным методом со спектрофотометрическим детектированием их динитробенз-2,1,3-оксадиазольных производных.

2. Установлены условия проточно-инжекционных определений биологически активных производных индола по составу реакционной среды (кислотность и состав потока, природа неводного растворителя) и гидродинамическим характеристикам проточных систем. Регулирование избирательности и чувствительности спектрофотометрического детектирования определяемых лекарственных веществ достигается при использовании в качестве аналитических реагентов 4-хлор-5,7-динитробензофуразана и его N-оксида, а также подбором состава растворителя в потоках носителя и реагента, направленным изменением спектральных характеристик производных определяемых веществ.

3. Разработаны избирательные и чувствительные проточно-инжекционные методики для фармацевтического анализа производных индола в реакционных и лекарственных смесях сложного состава с производительностью до 36 проб/час, интервалом определяемых содержаний 0,02 - 0,6 мкг/мл, пределом обнаружения до 0,01 мкг/мл. Методики проточно-инжекционного определения мелатонина, мексамина, производных индолилуксусной кислоты, се-ротонина, суматриптана апробированы при контроле качества лекарственных форм и в постадийном контроле их производства.

4. Для оценки безопасности процессов химико-фармацевтического производства производных индола разработаны высокопроизводительные проточно-инжекционные методы определения ароматических аминов, 3-(2-метил-5-метокси)индолилуксусной кислоты и гидразина в смесях синтеза серотонина, индометацина и дибазола. Установлены факторы повышения избирательности и чувствительности определения компонентов синтеза лекарственных веществ на основе приемов кинетического регулирования аналитических реакций.

117

ЗАКЛЮЧЕНИЕ