Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.01) на тему:Фармакотехнологические аспекты создания противовоспалительного средства на основе экстракта босвеллии.

На правах рукописи

ИВАНОВА СВЕТЛАНА АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОТЕХНОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ СОЗДАНИЯ ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА НА ОСНОВЕ ЭКСТРАКТА БОСВЕЛЛИИ

15 00 01 - технология лекарств и организация фармацевтического дела

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА 2008

ооз

003169846

Диссертационная работа выполнена в Межрегиональном центре «Адаптоген» Научные руководители

доктор медицинских наук, профессор Макаров Валерий Геннадьевич кандидат фармацевтических наук Пожарицкая Ольга Николаевна

Официальные оппоненты

доктор фармацевтических наук, профессор Сокольская Татьяна Александровна доктор фармацевтических наук, профессор Демина Наталья Борисовна

Ведущая организация

Военно-Медицинская Академия имени С М Кирова

Защита состоится « Ю » ¿¿ШМа^х^ 2008 г в /Г часов на заседании Диссер тационного Совета Д 208 040 09 при ГОУ ВПО «Московская Медицинская Академия име ни И М Сеченова Росздрава» (121998, Москва, Никитский бульвар, 13)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Московская Медицинская Академия имени И М Сеченова Росздрава» (117998, Москва, Нахимовский проспект, 49)

Автореферат разослан г

Ученый секретарь Диссертационного Совета Д 208 040 09 доктор фармацевтических наук, профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

Одним из основных направлений развития современной фармацевтической науки является расширение ассортимента и поиск эффективных лекарственных средств природного, в том числе растительного происхождения Актуально при этом создание новых препаратов на основе известных лекарственных растений, действие и состав которых хорошо изучены

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) относятся к числу наиболее важных «симптоматических» лекарственных средств, особенно при лечении ревматических болезней (Насонов Е Л, 2000, 20026) Это определяется уникальным сочетанием противовоспалительных, анальгетических, жаропонижающих и антитромботических свойств Многообразие лечебных свойств этой группы препаратов, а также большая распространенность клинических ситуаций, где они эффективны, вывели НПВП в разряд препаратов, наиболее часто назначаемых больным Каждый третий житель планеты использует НПВП Особенно возрастает потребность в НПВП у лиц пожилого возраста, то есть у контингента лиц, нередко имеющих сопутствующие заболевания и часто использующих медикаменты для их лечения (Насонов Е Л, 2002а, 20026) Несмотря на выраженную противовоспалительную активность при использовании синтетических НПВП возникает ряд осложнений, что создает серьезные проблемы для их рационального использования в реальной клинической практике (Машковский М Д, 2000)

Множественность неблагоприятных реакций, свойственная современным противовоспалительным средствам, указывает на актуальность поиска новых малотоксичных препаратов Более всего таким требованиям удовлетворяют препараты растительного происхождения У ряда соединений растительного происхождения выявлены многочисленные виды биологической активности противовоспалительная, антиоксидантная, мембраноста-билизирующая, капилляроукрепляющая, иммунорегуляторная и ряд других Выраженность названных эффектов биологически активных веществ отдельных растений, в большинстве своем, недостаточна и экспериментально мало обоснована Очевидно, что активность фитопрепаратов может быть значительно усилена при рациональном, целенаправленном подборе биологически активных соединений ряда растений, что обеспечит патогенетически направленное действие

Учитывая данные литературы о противовоспалительном действии босвеллиевых кислот (Ammon HPT, 2006), экстрактов куркумы (Araujo С А С , Leon L L, 2001), сведения

о благоприятных биологических эффектах препаратов из семян сосны кедровой сибирской (СКС) и имея в виду возможность потенцирования эффектов названных источников и ряд других положительных биологических сторон их действия, отсутствующих у официналь-ных противовоспалительных средств перспективным является разработка нового комплексного противовоспалительного средства растительного происхождения

С целью повышения биодоступности актуальным является выбор оптимальной лекарственной формы для липофильных соединений с учетом физико-химических и технологических свойств и особенностей технологии в условиях современных фармацевтических производств

В связи с вышеизложенным актуальной проблемой является создание новой лекарственной формы на основе сухого экстракта босвеллии и масляных экстрактов корневищ куркумы и семян СКС, обеспечивающих длительное поддержание и регулирование уровня терапевтических концентраций БАВ в крови, удобных в применении и стабильных при хранении

Цель работы

Теоретическое и экспериментальное обоснование, разработка технологии и изучение биофармацевтических свойств препарата на основе экстракта босвеллии, корневищ куркумы и семян СКС

Задачи исследования

1 Исследование физико-химических свойств, противовоспалительной активности и биофармацевтических свойств экстракта босвеллии

2 Фракционирование экстракта босвеллии с целью поиска наиболее активных в отношении противовоспалительного действия компонентов

3 Разработка состава и технологии комплексного средства, содержащего БАВ экстракта босвеллии, корневищ куркумы и семян СКС

4 Исследование противовоспалительной и антирадикальной активности комплексного средства и его биофармацевтических свойств

5 Выбор параметров стандартизации и разработка нормативной документации на комплексное средство

Научная новизна

Теоретически и экспериментально обосновано создание противовоспалительного средства в форме мягких желатиновых капсул, заполненных липидной матрицей, содержащей БАВ корневищ куркумы, семян СКС и экстракт босвеллии

Для оценки фармакокинетики босвеллиевых кислот и куркуминоидов впервые применен метод тонкослойной хроматографии

Впервые изучена и определена антирадикальная активность индивидуальных куркуминоидов в отношении радикала ИРРИ' методом ТСХ с применением постхроматогра-фической дериватизации

Практическая значимость

В результате проведенных исследований разработаны методы анализа и технология, составлена и утверждена нормативная документация на производство БАД Артро-Актив в мягких желатиновых капсулах, заполненных липидной матрицей, содержащей экстракт босвеллии и БАВ корневищ куркумы и семян СКС (ТУ 9197-020-17664661-2004, ТИ 02017664661-2004) Разработан проект ФСП на сухой экстракт босвеллии

Проведены доклинические испытания, подтвердившие противовоспалительную активность разработанного препарата ' Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносятся результаты исследования физико-химического состава экстракта босвеллии, и его биофармацевтических свойств, данные по изучению противовоспалительного действия экстракта босвеллии, состав и технология комплексного препарата, результаты фармакологических и фармакокинетических исследований разработанного препарата

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IX и X Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств природного происхождения, Санкт-Петербург, 2005 и 2006, 5 международном симпозиуме по хроматографии природных продуктов, Люблин, Польша, 2006, 3 Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии», Барнаул, 2007 Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ Объем и структура диссертации

Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов исследования и методов анализа, трех глав, содержащих результаты экспериментальных исследований и их обсуждение, выводов, списка литературы и приложения Работа изложена на 155 страницах машинописного текста, содержит 20 таблиц, 50 рисунков Список литературы включает 192 источника литературы

Приложение включает ФСП (проект) на сухой экстракт босвеллии, данные по изучению стабильности экстракта босвеллии, выдержки из ТУ на мягкие желатиновые капсулы Артро-Актив, данные по изучению стабильности Артро-Актива, акт о наработке желатиновых капсул, акт внедрения и санитарно-эпидемиологическое заключение на Артро-Актив

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили экстракт босвеллии (Boswelha serrata Roxb, сем Burseraceae) с содержанием суммы органических кислот в пересчете на ß-босвеллиевую кислоту не менее 85% (New Ambadi Estates Pvt, Ltd, Индия), измельченные корневища куркумы Curcuma longa L , сем Zingiberaceae (CYCORIA, Польша) и семена сосны кедровой сибирской Pinns Sibirien Du Tour, сем Pinaceae (ООО Русский орех, Россия)

Исследования проводили с использованием различных физико-химических методов гравиметрия, титриметрия, спектрофотометрия, а так же хроматографические методы, такие как хромато-масс-спектрометрия, ВЭЖХ, колоночная хроматография и планарная хроматография с использованием комплекта оборудования фирмы Camag (Швейцария), состоящего из полуавтоматического аппликатора (Lmomat V), системы пошагового градиентного элюирования (AMD2) и сканирующего спектроденситометра (TLC Scanner 3)

Исследование антирадикальной активности (АРА) проводили методом ТСХ с использованием постхроматографической дериватизации раствором 2,2-дифенил-1-пикрилгидразила (DPPH) Для оценки АРА рассчитывали ID50 - количество компонента, обеспечивающие связывание половинного количества радикалов DPPíl*

Фармакологические исследования включали изучение фармакокинетики in vitro и m vivo и изучение фармакологических свойств

Изучение фармакокинетики in vivo проводили на 40 беспородных белых крысах, массой 150-200 г Препарат вводили голодавшим в течение 12 часов крысам однократно перорально (через зонд) Пробы отбирали через 0,5, 1, 2, 4, 8, 16, 24,36 ч Определение содержания индивидуальных босвеллиевых кислот и куркумина в плазме проводили методом ТСХ

Противовоспалительные свойства in vivo исследовали на моделях каррагенинового отека и формалинового артрита лапы крысы В экспериментах использовали крыс-самцов массой 180-200 г Показателями противовоспалительного эффекта служили антиэкссуда-тивное, анальгезирующее и жаропонижающее действия Для оценки эффективности дейст-

вия изучаемых образцов рассчитывали терапевтические индексы (ТИ), которые определяли по отношению суммы степени улучшения показателя за все время проведения эксперимента (в процентах) по сравнению с контрольной группой животных к этому же показателю для группы животных, принимавших препарат сравнения (Александрова А Б, 2004)

Для оценки противовоспалительной активности исследуемых образцов in vitro исследовали влияние их на синтез основных медиаторов воспаления интерлейкин-1 бета (IL-1Ь), фактор некроза опухолей альфа (TNFa), простагландин Е2 (PGE2), лейкотриен В4 (LTB4), а так же интерлейкины 6 и 8 (IL-6, IL-8) Изучение экстракта босвеллии

На первом этапе работы исследовали физико-химические, технологические и биофармацевтические свойства и провели первичную оценку противовоспалительной активности экстракта босвеллии

Основными действующими веществами экстракта босвеллии, обеспечивающими противовоспалительный эффект экстракта традиционно считаются пентациклические три-перпены - босвеллиевые кислоты Для количественного определения четырех основных (3-босвеллиевых кислот (босвеллиевой кислоты (БК), ацетил босвеллиевой кислоты (АБК), кето-босвеллиевой кислоты (КБК) и ацетил кето-босвеллиевой кислоты (АКБК) разработали методику с использованием метода ТСХ в системе растворителей гек-сан/этилацетат/уксусная кислота (85/20/5), валидационные характеристики которой представлены в таблице 1 Для детектирования КБК и АКБК использовали денситометрию при 254 нм, для детектирования БК и АБК - постхроматографическую дериватизацию реагентом, содержащим анисовый альдегид, с последующей денситометрией при 560 нм

Таблица 1

Валидационные характеристики методики определения индивидуальных кислот методом

ТСХ

Компо нент Rf Уравнение регрессииа) г Пределы линейности, мкг Предел обнаружения, мкг sdv,%

КБК 0,35±0,02 у=631,287+4,467х 0,9928 0,2-2,0 0,15 5,88

АКБК 0,4б±0,02 у=-88,329+4,581х 0,9911 0,15 2,01

БК 0,44±0,02 у=4089,715+6,261х 0,9964 0,10 1,92

АБК 0,56±0,02 у=2664,847+6,551х 0,9901 0,10 0,72

"х - количество аналита в нг, у - площадь пика в а и

Экстракт босвеллии представляет собой пушистый порошок желтовато-сероватого цвета с характерным бальзамическим запахом Частицы экстракта неправильной формы (микроскопия) Экстракт легко растворим в органических растворителях этиловом и ме-

таловом спиртах, хлороформе; не растворим в воде (не смачивается данным растворителем). Содержание влаги в экстракте составляет 0,55±0,05%; содержание неорганических веществ растительного происхождения 1,00±0,02%; сумма органических кислот в пересчете на р-босвеллиевую кислоту (титриметрия) 89,3±3,6 %; содержание 4 индивидуальных кислот (ТСХ) составляет: КБК 2,4±0,1%; АКБК 3,5±0,1%; БК 19,2±2,5% и АБК 12Д±2,0%.

Противовоспалительные свойства экстракта босвеллии в условиях in vivo исследовали на модели каррагенинового отека лапы крысы. На основании данных (Sterk V. et al., 2004) для увеличения биологической доступности исследуемых кислот, при изучении фармакокинетики экстракт босвеллии вводили в масляной основе. ТИ по сравнению с фе-нилбутазоном (56 мг/кг) приведены на рисунке 1.

2.5

ти

2 -

1.5 1

0.5 0

IBP^BliP

противовоспалительный обезболивающий эффект эффект (онкометрически)

жаропонижающее действие

□ интактные животные

Я экстракт босвеллии 25 мг/кг

В экстракт босвеллии 75 мг/кг

Рис.1 Терапевтические индексы по некоторым показателям течения воспалительного процесса

На основании полученных данных установили, что экстракт босвеллии обладает выраженным противовоспалительным действием. Так, эффект экстракта босвеллии в дозе 25 мг/кг по большинству из исследованных показателей сравним с эффектом препарата сравнения (ТИ около 1), а эффект экстракта в дозе 75 мг/кг по большинству показателей превышает эффект препарата сравнения (ТИ >1). Так же отмечено выраженное анальгези-рующее действие экстракта босвеллии (рис. 1).

Фракционирование и оценка противовоспалительного действия фракций экстракта босвеллии

Исследуемый экстракт босвеллии является сложной смесью биологически активных, сопутствующих и балластных веществ. При создании лекарственного средства природного происхождения с известной направленностью действия, возникает интерес к концентрированию веществ, отвечающих за это действие. Известно, что различные кислоты обладают разной активностью в отношении ингибирования синтеза 5-ЛО. Поэтому следующий этап работы был посвящен разделению экстракта босвеллии методом колоночной хроматографии с выделением биологически активных фракций экстракта, обогащенных определен-

ными компонентами Для быстрого поиска активных фракций разработали и применили алгоритм по разделению многокомпонентных смесей (рис 2)

Тонкослойная хроматография

Пошаговое градиентное элюиро-вание (АМР2 (Сап^))

Колоночная хроматография

Фармакологические испытания

Рис 2 Алгоритм анализа и разделения многокомпонентных смесей Наилучшие результаты разделения экстракта босвеллии методом пошагового градиентного элюирования получены при использовании на первой ступени элюирования системы растворителей гексан/этилацетат в соотношении 7 3с последующим линейным уменьшением полярности системы до чистого гексана Значения босвеллиевых кислот в этих условиях составили К1кбк=0,26±0,04, Я1АКБК=0,47±0,05, Щ:ж=0,40±0,03, КГШС=0,63±0,02.

Методом препаративной колоночной хроматографии получены 4 фракции, характеристика которых представлена в таблице 2

Состав полученных фракций исследовали методом ТСХ При детектировании пластин при 254 нм во фракции 2 обнаружено преимущественное содержание АКБК, во фракции 3 совместное присутствие АКБК и КБК с преобладанием второй и во фракции 4 преимущественное содержание КБК После обработки пластины анисовым альдегидом наблюдали распределение веществ экстракта в различных фракциях, схематичное изображение которого представлено на рисунке 3

в

■О ООО 6-0-О О-о 123456789

Рис 3 Схема распределения компонентов в экстракте и 4-х фракциях (на схеме представлены соединения, детектируемые и в УФ-свете, и после дериватизации пластины), гексан/этилацетат/уксусная кислота (85/20/5), расстояние элюирования 70мм (1 - экстракт, 2-5 - фракции 1 -4, соответственно, 6 - БК, 7 - АБК, 8 - КБК, 9 - АКБК)

В зоне значений ЯГ соединений фракций 1 и 4 на треке экстракта босвеллии никакие компоненты не детектируются По-видимому, компоненты, образующие фракции 1 и 4 находятся в экстракте в минорных, не значимых количествах (об этом же свидетельствуют и относительные количества этих фракций)

Для дальнейших исследований выбраны фракции 2 и 3 как превалирующие в количественном отношении Количественная характеристика содержания босвеллиевых кислот (методом ТСХ) во фракциях экстракта представлена в таблице 2

Таблица 2

Характеристика фракций экстракта босвеллии_

Образец Элюент Выход, Содержание босвеллиевых кислот, %

% БК АБК КБК АКБК

Фракция 1 гексан/этилацетат 9/1 7-10 не определяли

Фракция 2 гексап/этилацетат 8/2 40-45 33,84 16,40 не обна- 5,76

±4,06 ±2,29 ружено ±0,14

Фракция 3 гексан/этилацетат 7/3 35-40 30,63 не обна- 13,05 5,20

±3,68 ружено ±0,16 ±0,13

Фракция 4 гексан/этилацетат 6/4 12-15 не определяли

Противовоспалительное действие фракций экстракта босвеллии в условиях in vivo исследовали на модели каррагенинового отека лапы крысы

Установили, что по противовоспалительному действию препараты располагались следующим образом фракция 2 (20 мг/кг)>экстракт босвеллии (20 мг/кг)>препарат сравнения> фракция 3 (20 мг/кг)

На основании данных о составе индивидуальных босвеллиевых кислот во фракциях и по результатам исследования противовоспалительной активности этих фракций сделали вывод, что основной вклад в противовоспалительную активность экстракта в выбранной модели вносят ацетил-производные босвеллиевых кислот и, преимущественно, АБК

При исследовании противовоспалительного действия фракции 2 и суммарного экстракта босвеллии в условиях ш vitro выявлено дозозависимое действие на IL-lb и TNFa Причем, максимальная эффективность действия и экстракта, и фракции 2 проявлялась в минимальной исследуемой концентрации (1 мкг/мл)

Активность суммарного экстракта и фракции 2 в отношении LTB4 (метаболита ара-хвдоновой кислоты, индуцируемого 5-J10) была практически одинакова Таким образом, концентрирование компонентов суммарного экстракта босвеллии с целью выделения наиболее активных соединений, оказывающих противовоспалительное действие преимущественно за счет ингибирования 5-ЛО, не является эффективным путем повышения биологической активности экстракта

На основании литературных данных и данных предварительных экспериментов в качестве компонентов, дополняющих экстракт босвеллии для создания комбинированного средства, выбраны семена СКС и корневища куркумы длинной

Разработка комплексного противовоспалительного средства, содержащего экстракт босвеллии, БАВ семян СКС и корневищ куркумы

Действующие компоненты разрабатываемого средства имеют ярко выраженный ли-пофильный характер, что обуславливает предпочтительное применение липидной матрицы В качестве лекарственной формы для создания перорального противовоспалительного средства выбраны мягкие желатиновые капсулы, содержащие экстракт босвеллии в масляном экстракте семян СКС и корневищ куркумы В качестве экстракционного масла выбрано кукурузное масло

На основании данных литературы, предварительных фармакологических и технологических экспериментов выбрана доза экстракта босвеллии в препарате, которую обеспечивает 10 % раствор экстракта босвеллии в масляном экстракте

В качестве основы разрабатываемого средства использовали масляный экстракт СКС - Кедрол (ТУ 9369-001-23377026-2000), разработанный ранее на базе ЗАО МЦ «Адаптоген» Предварительно смоченные этиловым спиртом измельченные корневища куркумы экстрагировали Ксдротом методом мацерации при нагревании (40 °С) и перемешивании (300 об/мин) в соотношении сырье экстрагент 1 10 Известно, что при получении масляных экстрактов на выход липофильных веществ значимое влияние оказывает присутствие спирта в системе (Иванова С А и др, 2003а, Иванова С А и др, 20036, Шиков А Н, 2006) Установили, что для замачивания корневищ куркумы достаточно использовать спирт в соотношении 0,5 к массе загруженного сырья Равновесие по сумме куркуминои-дов в системе «твердое тело-жидкость» в этих условиях достигается через 1,5-2 часа (рис 4а)

Изучение растворения сухого экстракта босвеллии в масляном экстракте семян СКС и корневищ куркумы проводили при различной температуре Установили, что на процесс получения стабильной липидной основы, содержащей экстракт босвеллии, в значительной мере влияет время достижения равновесия в системе и в меньшей степени температура растворения (табл 4)

Для обеспечения стабильности в состав препарата вводили различные антиоксидан-ты Установили, что только совместное применение бутилгидрокситолуола (БГТ), лецити-

на, аскорбил пальмитата и а-токоферол ацетата приводит к получению стабильной к пере-кисному окислению липидной основы препарата (рис 46)

Таблица 4

Высота смолистого слоя, см_

т, ^-^х/тасы 1 2 3 6 8 12

20 8,2±0,4 6,3±0,3 5,5±0,3 2,7±0,1 1,5±0,1 0,7±0,1

40 8,4±0,4 7,1 ±0,4 5,9±0,3 3,2±0Д 1,7±0,1 1,2±0,1

60 8,6±0,4 6,5±0,3 5,0±0,3 2,9±0,1 2,0±0,1 0,7±0,1

80 8,2±0,4 7,3±0,4 5,5±0,3 3,0±0,1 1,7±0,1 1,4±0,1

i Время, ч 2

без антиоксидантое

лецитин+аскорбил пальм итат+вит Е {0 1%) лацитан+аскорбил пальмитат+вьтг Е (0 2%) лецитин+аскорбил лальмитат+аит Е {01%)+БГТ (о 1 %)

Рис

а) б)

4 Кинетика экстрагирования корневищ куркумы Кедролом (а) и изменение перекис-ных чисел комплексного препарата в процессе ускоренного старения (б).

На основании экспериментальных данных разработан следующий состав противовоспалительного средства для перорального применения в мягких желатиновых капсулах

Состав содержимого капсул (мг/капс)

Масляный экстракт семян СКС и корневищ куркумы 268,665

Сухой экстракт босвеллии 30,000

а-токоферол ацетат 0,320

Аскорбил пальмитат 0,800

Лецитин очищенный 0,200

Бутилгидрокситолуол 0,015

Разработанный препарат получил название Артро-Актив

Технология получения Артро-Актива включает следующие основные стадии

> Экстракция цельных семян СКС кукурузным маслом с использованием роторно-пульсационной техники,

> Экстракция измельченных корневищ куркумы масляным экстрактом семян СКС,

> Внесение антиоксидантов,

> Растворение сухого экстракта босвеллии,

> Получение мягких желатиновых капсул экструзионным методом,

> Фасовка и упаковка готовой продукции

ВР 1 1 Приготовление аезижЬициоиюших соелств

ВР 1 2 Подготовка помещений

ВР 1 3 Подготовка оборудования

ВР 4 Подготовка персонала

ВР 1 5 Подготовка воды

таз 1 Получение масляного экстракта кедровых семян

ТПЗ 2 Получив юлмтозкарапа кчжукын ¡едавьк семя н

ТП-3 3 Получение массы для капсулиоования

ТП4 I Капсулирование

ТП4 2 Вьютойка капсул

ТП43 Отделение масла от капсул

ТП4 4 Сушка капсул

ТП4 5 Промывка капсул

ТП46 Калибровка и просмотр капсул

УМ0 51 Фасовка капсул

УМО 52 Упаковка готовой

пгюдокции

ВР 1 Кыкб Кх

Вспомогательные работы

ТП2

КтКх

Приготовление желатиновой массы

пи

КтКх

ТП4 Кмхб КтКх

Получение капсул

Приготовление массы для капсулирования

УМО 5 Кмкб КтКх Фасовка, упаковка

Готовая продукция на склад

ПО 6 Кт Регенерация трихлорэтилена

Рис 5 Технологическая схема производства Артро-Актива Кх, Кт, Кмкб - контроль химический, технологический, микробиологический соответсвенно

Артро-Актив по составу представляет собой сложную многокомпонентную систему, по вязкости и консистенции отличающуюся от растительного масла Поэтому предварительно в лабораторных условиях исследовали влияние вязкости желатиновой массы и толщины оболочки на качество получаемых капсул Установили, что для получения капсул, удовлетвряющих требованиям ГФ XI (вып 2, с 143) необходимо использовать жела-

тиновую массу с вязкостью 550-600 мм /с; масса желатиновой оболочки должна составлять не менее 20-22 % от массы содержимого капсулы. Меньшая масса оболочки, а, значит, ее толщина, не обеспечивали удовлетворительной стабильности капсул, наблюдалось нарушение целостности оболочки, и, как следствие, большое количество «лопанцев».

На основании серии экспериментов в производственных условиях разработаны технологические режимы и апробирована в условиях предприятия ЗАО «Фармаген» технологическая схема производства Артро-Актива в мягких желатиновых капсулах (рис. 5).

Противовоспалительную активность Артро-Актива и масляного экстракта семян СКС и корневищ куркумы в условиях in vivo изучали на модели формалинового артрита. ТИ по сравнению с фенилбутазоном (56 мг/кг) по изученным показателям течения воспалительного процесса представлены на рис.6.

Для исследуемых образцов отмечено обезболивающее действие. Артро-Актив значимо эффективнее подавлял процесс воспаления по сравнению с масляным экстрактом СКС и корневищ куркумы.

□ интактные животные

0 масляный экстракт СКС и корневищ куркумы (300 мг/кг)

■ Артро-Актив (25 мг/кг по экстракту босвеллии)

противовоспалительный эффект (онкометрически)

обезболивающий эффект

жаропонижающее действие

Рис. 6 Терапевтические индексы по некоторым показателям течения воспалительного процесса

Антирадикальную активность (АРА) компонентов Артро-Актива исследовали в отношении радикала ОРРН- методом ТСХ. Объединение хроматографического разделения и определения АРА позволяет оценить вклад каждого компонента в АРА суммарного экстракта.

Установили, что АРА в отношении радикала ОРРН* обладают только БАВ корневищ куркумы. По совпадению значений ЯГ со стандартным образцом (являющимся смесью трех куркуминоидов) в составе комплексного средства идентифицированы куркумин, де-метоксикуркумин и бисдеметоксикуркумин.

АРА суммы куркуминоидов и отдельных куркуминоидов изучали с использованием стандартного раствора куркумина. При детектировании пластины, обработанной раствором ОРРН (Р1ика, Германия; 0,2 мг/мл метанола) при 517 нм, гашение окраски фона пла-

стины, свидетельствующее о наличии АРА компонента выглядит как «отрицательный пик» (рис 7)

Наиболее активным в отношении радикала ПРРН* является куркумин, наименее -бисдеметоксикуркумин (табл 5)

Значения ГО50 куркуминоидов различаются мало Теоретически рассчитанное значение ГО50 суммы куркуминоидов (с учетом массовой доли каждого компонента) должно было бы составлять 179 нг, однако Ш 50 суммы куркуминоидов значительно (более чем в 1,5 раза) меньше, что дает основания предполагать о наличии эффекта синергизма АРА куркуминоидов в отношении радикала БРРН»

Рис 7 Денситограмма трека стандартного раствора куркумина до обработки раствором БРРН при детектировании при 425 нм (А) и после обработки раствором ОРРН при детектировании при 517 нм (Б) (1 - куркумин, 2 - деметоксикуркумин, 3 - бисдеметоксикуркумин)

Таблица 5

Характеристика АРА куркуминоидов _

Объект Система Содержание, % Rf Уравнение регрессии а) R2 Пределы линейности, нг ID50, нг

нчочь

Сумма куркуминоидов гек-сан/этил ацетат/ уксусная кислота (80 25 5) - 0,17±0,02 Y=0,3762x+1,693 0,9815 50-350 110,4

Куркумин толуол/уксусная кислота (4/1) 68,0 0,55±0,04 Y=0,4518x-5,209 0,9832 70-400 175,9

0,48

Деметоксикуркумин 25,5 0,41 ±0,03 Y=0,1688х+17,549 0,9911 50-550 180,9

0,55

Бис- 6,5 0,28±0,03 Y=0,2115x+3,685 0,9886 60-250 198,8

деметок-сикурку-мин

0,66

- количество куркуминоидов в нг, Y - высота «отрицательного пика» пика в а и Исследование биофармацевтических свойств экстракта босвеллии и Артро-Актива Основные босвеллиевые кислоты нерастворимы в воде и обладают выраженными гидрофобными свойствами (logPBK=9,38±0,39, logPAEK=10,27±0,40, logPKBK=7,10±0,39, IogPAKBK=8,00±0,28), поэтому для изучения скорости их высвобождения невозможно применение традиционных сред растворения, таких как вода и буферные растворы, имитирующие условия желудочно-кишечного тракта На основании данных предварительных экспериментов установили, что введение в состав среды растворения сурфактантов, фос-фолипидов или компонентов желчи не приводило к увеличению степени растворения бос-веллиевых кислот Поэтому была использована двухфазная среда растворения, состоящая из фосфатного буфера (рН 6,8) и п-октанола в соотношении 3 1 (Pillay V, Fassihi R, 1999) Оценку скорости растворения босвеллиевых кислот проводили методом «лопастная мешалка» при температуре 37±1 °С и скорости вращения 100 об/мин Эти же условия оказались оптимальными и для изучения биодоступности in vitro суммы куркуминоидов

Содержание босвеллиевых кислот в пробах (из октанола) определяли методом об-ращено-фазовой ВЭЖХ (колонка Luna Си 4,6 х 150 мм (размер частиц сорбента 5 мкм), градиентное элюирование от 75 % ацетонитрила в 0,03% растворе трифторуксусной кислоты до 100% ацетонитрила за 20 минут, детектирование КБК и АКБК при 254, БК и АБК при 210 нм Содержание суммы куркуминоидов оценивали спектрофотометрически при 432 нм

Высвобождение суммы куркуминоидов из Артро-Актива носит линейный характер, основная часть растворяется за первые 45 мин и составляет около 90 %, константа скорости растворения 1,9144 мин'1 Высвобождение суммы куркуминоидов из субстанции кур-кумина (Fluka, Германия) протекает значительно медленнее - константа скорости растворения 0,1923 мин'1 - и к 5 часу эксперимента достигает 50 %

Высвобождение босвеллиевых кислот и из экстракта и из Артро-Актива начинается с небольшой лаг-фазы, обусловленной растворением желатиновой оболочки При растворении из экстракта босвеллии максимум концентрации КБК и АКБК достигается ко 2-му часу (около 65 % для обеих кислот), максимум концентрации БК и АБК достигается к 3-му часу и составляет около 30% для БК и около 80 % для АБК Константы скорости растворения

этих соединений составили 0,0593 мин'1 для БК, 0,2429 мин'1 для АБК, 0,6556 мин*1 для КБК и 0,5896 мин"1 для АКБК

Основная часть босвеллиевых кислот из Артро-Актива переходит в л-октанол за первые 45 минут эксперимента (65-70% для БК, АБК, АКБК и 40% для КБК) Константы скорости растворения кислот из Артро-Актива составляют для БК - 1,3914 мин"', для АБК - 1,634 мин"1, для КБК - 0,8599 мин"1, для АКБК - 1,4973 мин1

Увеличение скорости растворения босвеллиевых кислот и суммы куркуминоидов из Артро-Актива по сравнению с экстрактом, по-видимому, происходит за счет наличия ли-пофильной матрицы препарата, обеспечивающей быстрое и достаточно полное высвобождение босвеллиевых кислот и куркуминоидов

Фармакокинетика экстракта босвеллии и Артро-Актива ш vivo. Предварительно была разработана методика пробоподготовки плазмы крови и ТСХ методика определения четырех индивидуальных босвеллиевых кислот и суммы куркуминоидов в плазме крови на модельных смесях Валидационные параметры определения босвеллиевых кислот в плазме совпали с представленными в таблице 1 Параметры определения суммы куркуминоидов в плазме представлены в таблице 6

Таблица 6

Валидационные параметры определения суммы куркуминоидов в плазме крови

Система растворителей/условия детектирования Rf Уравнение регрессии Г Пределы линейности, нг Предел обнаружения, нг sdv, %

Гек- сан/этил ацетат/уксусная кислота (85/20/5 по объему) / 425 нм 0,17± 0,02 У=39,14х+1237,12 х - количество аналита, Y - площадь пика 0,9990 50-100 10 2,3

Как при введении экстракта босвеллии, так и при введении Артро-Актива в плазме крови крыс в неизменном виде были обнаружены только КБК и АКБК Куркуминоиды в неизменном виде в плазме крови при применении Артро-Актива обнаружены не были, но были обнаружены метаболиты курукмина

Кинетика обнаружения АКБК, КБК и наиболее часто встречающегося метаболита куркумина (метаболит 1) в крови носит характерную для перорально применяемых средств форму (рис 8) Сравнивая параметры фармакокинетики босвеллиевых кислот из Артро-Актива и экстракта установили, что компоненты Артро-Актива обеспечивают пролонгированное поступление АКБК в системный кровоток и увеличивают биологическую доступность КБК (табл 7)

Для определения корреляции между результатами, полученными для КБК и АКБК в условиях in vitro и in vivo, рассчитывали процент их абсорбции в желудочно-кишечном тракте по методу Wagner-Nelson (Emami J , 2006) Коэффициенты корреляции составили 0,8377 и 0,8461 для АКБК и КБК, соответственно Исследование биодоступности показало, что существует сильная корреляционная связь уровня А между результатами m vivo и скоростью растворения босвеллиевых кислот в двухфазную среду растворения

«Р««.'' врвмцч

а) б) в)

Рис 8 Кривые «концентрация-время» для АКБК (а) и КБК (б) при пероральном введении экстракта босвеллии и для метаболита куркумина (в) при пероральном введении

Артро-Актива

Таблица 7

Показатели фармакокинетики АКБК и КБК при однократном пероральном введении Арт-___ро-Актива / экстракта босвеллии_

Ттах, Стах, AUCoo, MRT, Cl, мл/ч/кг Vss, Tl/2,

ч мкг/мл ч мкг/мл ч мл/кг ч

4/2 2,220/2,010 33,544/34,131 9,070/17,944 209,280/228,53 1898,211/4100,74 6,286/12,4

1/2 2,843/1,250 96,377/4,725 25,819/2,866 70,971/1608,46 1832,404/4609,85 17,893/2,9

В качестве параметров стандартизации Артро-Актива выбраны внешний вид кап-

сул, органолептические свойства содержимого капсул, средняя масса содержимого капсул, перекисное и кислотное числа, подлинность по наличию босвеллиевых кислот, куркумина и пиностробина, количественное содержание суммы босвеллиевых кислот в пересчете на р-босвеллиевую кислоту и содержание суммы куркуминоидов в пересчете на куркумин

При изучении стабильности препарата в условиях естественного хранения показана его стабильность по приведенным параметрам стандартизации в течение не менее 2,5 лет

ВЫВОДЫ

1 Исследован компонентный состав терпеноидов экстракта босвеллии, на модели кар-рагенинового отека лапы крысы установлена выраженная противовоспалительная активность экстракта в дозе 75 мг/кг сравнимая с эффектом фенилбутазона Изучены фармакокинетические параметры КБК и АКБК Установлено существование сильной корреляционной связи уровня А между результатами in vivo и скоростью рас-

творения КБК и АКБК in vitro Показано, что БК и АБК в неизменном виде в плазме не обнаружены

2 С использованием разработанного алгоритма поиска активных компонентов получены 4 фракции экстракта босвеллии Установлено преимущественное влияние АБК на противовоспалительную активность экстракта босвеллии

3 Разработан состав и технология комплексного препарата Артро-Актив в форме мягких желатиновых капсул, содержащих экстракт босвеллии в липидной матрице, содержащей БАВ корневищ куркумы и семян сосны кедровой сибирской Выбран оптимальный режим экстрагирования куркуминоидов, подобран эффективный комплекс антиоксидантов (а-токоферол ацетат, аскорбил пальмитат, лецитин и бутил-гидрокситолуол), обеспечивающий стабильность препарата к перекисному окислению в течение срока годности

4 Методом ТСХ с постхроматографической оценкой антирадикальной активности куркуминоидов по DPPH радикалу впервые установлен синергизм их действия Изучена фармакокинетика босвеллиевых кислот и куркуминоидов при однократном пе-роральном применении Артро-Актива Установлено, что введение экстракта босвеллии в состав липидной матрицы приводит к повышению биодоступности босвеллиевых кислот

5 Разработаны методы качественного и количественного анализа Артро-Актива Разработан и зарегестрирован проект ТУ на БАД Артро-Актив В условиях ЗАО «Фар-маген» проведена апробация технологии капсул Артро-Актива Разработан проект ФСП на сухой экстракт босвеллии

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Иванова С А , Вайнштейн В А, Каухова И Е Особенности массопереноса липо-фильных БАВ при экстрагировании сырья двухфазной системой экстрагентов // Хим -фармац журн - 2003 -№ 8 -С 30-34

2 Иванова С А, Скочипец С Е, Скочипец М Е, Вайнштейн В А , Каухова И Е, Демченко Ю T Изучение экстракции плодов рябины и шиповника двухфазной системой экстрагентов // Фармация - 2003 -№6 -С 23-25

3 Иванова С А , Шиков А Н , Пожарицкая О Н, Макаров В Г Исследование состава экстракта босвеллии (Bosweilia serrata Roxb ) с применением методов пленарной и колоночной хроматографии // Материалы IX Международного съезда "Актуальные

проблемы создания новых лекарственных средств природного происхождения" Фи-тофарм 2005, Санкт-Петербург -2005,-С 537-541

4 Pozhantskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG Separation and quantification of terpenoids of Bosweha serrata Roxb extract by planar chromatography techniques (TLC and AMD) // J Sep Sci - 2006-29(14)-P 2245-2250.

5 Pozhantskaya О, Karhna M, Ivanova S, Shikov A, Makarov V, Tikhonov V Plasma analysis of boswellic acids by HPTLC a useful technique for pharmacokinetic studies // 5 International Symposium on Chromatography of natural Products, Lublm - 2006 -P 183

6 Рыдловская А В , Макарова M H, Макаров В Г, Иванова С А, Пожарицкая О Н , Тихонов ВП Оценка противовоспалительного действия комбинированного природного препарата артрофлекс на модели каррагенинового отека у крыс линии вис-тар//Вестн СПбГМА им ИИ Мечникова - 2006- №3(7) - С 138-142

7 Рыдловская А В , Макарова М Н , Макаров В Г, Тесакова С В , Иванова С А, Пожарицкая О Н, Тихонов В П Противовоспалительная активность и механизм действия препарата «Артро-Актив»//Фармация -2007 -№1 - С 38-41

8 Иванова С А, Пожарицкая О Н, Шиков А Н, Макаров В Г Постхроматографиче-ская оценка антиоксидантной активности семян сосны кедровой сибирской Pinus si-birica по DPPH радикалу методом ТСХ // Материалы 3 Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии», Барнаул - 2007-С 216221

9 Pozhantskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG Separation and evaluation of free radical-scavenging activity of phenol components of Emblica officinalis extract by using HPTLC-DPPH-method//J Sep Sci -2007 -30(9) -P 1250-1254

10 Pozhantskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG, Galambosi В Separation and evaluation of free radical-scavenging activity of phenol components of green, brown, and black leaves of Bergenia crassifolia by using HPTLC-DPPH- method // J Sep Sci - 2007 -30(15) -P 2447-2451

11 Pozhantskaya ON, Ivanova SA, Shikov AN, Makarov VG Separation and free radical-scavenging activity of major curcuminoids of Curcuma longa using HPTLC-DPPH method//Phytochem Anal -2007 -v 19 - P 236-243

12 Карлина M В , Пожарицкая О H, Косман В М, Иванова С А Изучение биологической доступности босвеллиевых кислот in vitro/in vivo корреляция // Хим -фармац журн.-2007 -41 (11) -С 38-41

Формат бумаги 60*90 1/ 16 Бумага офсетная Печать рнзографическая Тираж 100 экз Отпечатано в ПК «Объединение Вента» с оригинал-макета заказчика 197198, Санкт-Петербург, Большой пр ПС,д 29а,тел718-4636

Природные соединения, выделяемые из лекарственных растений, используются в традиционной медицине в течение сотен лет, и интерес к ним не угасает (Самылина И.А., Баландина И.А., 2004). В настоящее время, с развитием рынка биологически активных добавок к пище, интерес к природным соединениям обусловлен их несомненными преимуществами перед синтетическими лекарственными средствами. Преимуществами природных средств являются мягкое, постепенное воздействие на организм, отсутствие тяжелых побочных эффектов и осложнений, что дает возможность длительного применения природных средств для профилактических целей.

В последнее время отмечается повышенный интерес к комплексным растительным препаратам, содержащим нативный комплекс как биологически активных, так и сопутствующих компонентов растения, которые зачастую усиливают фармакологическое действие препарата.

Расширение ассортимента современных эффективных и безопаных лекарственных средств может быть достигнуто с внедрением в отечественную медицинскую практику новых лекарственных препаратов природного, в том числе растительного происхождения.

Актуальность темы

Одним из основных направлений развития современной фармацевтической науки является расширение ассортимента и поиск эффективных лекарственных средств природного, в том числе растительного происхождения. Актуально при этом создание новых препаратов на основе известных лекарственных растений, действие и состав которых хорошо изучены.

Нестероидные противовоспалительные препараты (НПВП) относятся к числу наиболее важных «симптоматических» лекарственных средств, особенно при лечении ревматических болезней (Насонов Е.Л., 2000, 20026). Это определяется уникальным сочетанием противовоспалительных, анальгетиче-ских, жаропонижающих и антитромботических свойств. Многообразие лечебных свойств этой группы препаратов, а также большая распространен6 ность клинических ситуаций, где они эффективны, вывели НПВГТ в разряд препаратов, наиболее часто назначаемых больным. Каждый третий житель планеты использует НПВП. Особенно возрастает потребность в НПВП у лиц пожилого возраста, то есть у контингента лиц, нередко имеющих сопутствующие заболевания и часто использующих медикаменты для их лечения (Насонов E.JL, 2002а, 20026). Несмотря на выраженную противовоспалительную активность при использовании синтетических НПВП возникает ряд осложнений, что создает серьезные проблемы для их рационального использования в реальной клинической практике (Машковский М.Д., 2000).

Множественность неблагоприятных реакций, свойственная современным противоврспалительным средствам, указывает на актуальность поиска новых малотоксичных препаратов. Более всего таким требованиям удовлетворяют препараты растительного происхождения. У ряда соединений растительного происхождения выявлены многочисленные виды биологической активности: противовоспалительная, антиоксидантная, мембраностабилизи-рующая, капилляроукрепляющая, иммунорегуляторная и ряд других. Выраженность названных эффектов биологически активных веществ отдельных растений, в большинстве своем, недостаточна и экспериментально мало обоснована. Очевидно, что активность фитопрепаратов может быть значительно усилена при рациональном, целенаправленном подборе биологически активных соединений ряда растений, что обеспечит патогенетически направленное действие.

Учитывая данные литературы о противовоспалительном действии бос-веллиевых кислот (Ammon Н.Р.Т., 2006), экстрактов куркумы (Araujo С.А.С., Leon L.L., 2001), сведения о благоприятных биологических эффектах препаратов из семян сосны кедровой сибирской (СКС) и имея в виду возможность потенцирования эффектов названных источников и ряд других положительных биологических сторон их действия, отсутствующих у официнальных противовоспалительных средств перспективным является разработка нового комплексного противовоспалительного средства растительного происхождения.

С целью повышения биодоступности актуальным является выбор оптимальной лекарственной формы для липофильных соединений с учетом физико-химических и технологических свойств и особенностей технологии в условиях современных фармацевтических производств.

В связи с вышеизложенным актуальной проблемой является создание новой лекарственной формы на основе сухого экстракта босвеллии и масляных экстрактов корневищ куркумы и семян СКС, обеспечивающих длительное поддержание и регулирование уровня терапевтических концентраций БАВ в крови, удобных в применении и стабильных при хранении.

Цель работы

Теоретическое и экспериментальное обоснование, разработка технологии и изучение биофармацевтических свойств препарата на основе экстракта босвеллии, корневищ куркумы и семян СКС. ,

Задачи исследования

1. Исследование физико-химических свойств, противовоспалительной активности и биофармацевтических свойств экстракта босвеллии.

2. Фракционирование экстракта босвеллии с целью поиска наиболее активных в отношении противовоспалительного действия компонентов.

3. Разработка состава и технологии комплексного средства, содержащего БАВ экстракта босвеллии, корневищ куркумы и семян СКС.

4. Исследование противовоспалительной и антирадикальной активности комплексного средства и его биофармацевтических свойств.

5. Выбор параметров стандартизации и разработка нормативной документации на комплексное средство.

Научная новизна

Теоретически и экспериментально обосновано создание противовоспалительного средства в форме мягких желатиновых капсул, заполненных ли-пидной матрицей, содержащей БАВ корневищ куркумы, семян СКС и экстракт босвеллии.

Для оценки фармакокинетики босвеллиевых кислот и куркуминоидов-впервые применен метод тонкослойной хроматографии.

Впервые изучена и определена антирадикальная активность индивидуальных куркуминоидов в отношении радикала БРРН* методом ТСХ с применением постхроматографической дериватизации.

Практическая ценность

В результате проведенных исследований разработаны методы анализа и технология, составлена и утверждена нормативная документация на производство БАД Артро-Актив в мягких желатиновых капсулах, заполненных липидной матрицей, содержащей экстракт босвеллии и БАВ корневищ куркумы и семян СКС (ТУ 9197-020-17664661-2004; ТИ 020-17664661-2004). Разработан проект ФСП на сухой экстракт босвеллии.

Проведены доклинические испытания, подтвердившие противовоспалительную активность разработанного препарата.

Основные положения, выносимые на защиту

На защиту выносятся результаты исследования физико-химического состава экстракта босвеллии, и его биофармацевтических свойств; данные по изучению противовоспалительного действия экстракта босвеллии; состав и технология комплексного препарата; результаты фармкологических и фарма-кокинетических исследований разработанного препарата.

Апробация работы

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на IX и X Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных средств природного происхождения, Санкт-Петербург, 2005 и 2006; 5 международном симпозиуме по хроматографии природных продуктов, Люблин, Польша, 2006, 3 Всероссийской конференции «Новые достижения в химии и химической технологии», Барнаул, 2007. Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

выводы

1. Исследован компонентный состав терпеноидов экстракта босвеллии; на модели каррагенинового отека лапы крысы установлена выраженная противовоспалительная активность экстракта в дозе 75 мг/кг сравнимая с эффектом фенилбутазона. Изучены фармакокинетические параметры КБК и АКБК. Установлено существование сильной корреляционной связи уровня А между результатами in vivo и скоростью растворения КБК и АКБК in vitro. Показано, что БК и АБК в неизменном виде в плазме не обнаружены.

2. С использованием разработанного алгоритма поиска активных компонентов получены 4 фракции экстракта босвеллии. Установлено преимущественное влияние АБК на противовоспалительную активность экстракта босвеллии.

3. Разработан состав и технология комплексного препарата Артро-Актив в форме мягких желатиновых капсул, содержащих экстракт босвеллии в липидной матрице, содержащей БАВ корневищ куркумы и семян сосны кедровой сибирской. Выбран оптимальный режим экстрагирования куркуминоидов, подобран эффективный комплекс антиоксидантов (а-токоферол ацетат, аскорбил пальмитат, лецитин и бутилгидроксито-луол), обеспечивающий стабильность препарата к перекисному окислению в течение срока годности.

4. Методом ТСХ с постхроматографической оценкой антирадикальной активности куркуминоидов по DPPH радикалу впервые установлен синергизм их действия. Изучена фармакокинетика босвеллиевых кислот и куркуминоидов при однократном пероральном применении Артро-Актива. Установлено, что введение экстракта босвеллии в состав липидной матрицы приводит к повышению биодоступности босвеллиевых кислот.

5. Разработаны методы качественного и количественного анализа Артро-Актива. Разработан и зарегестрирован проект ТУ на Б АД Артро-Актив. В условиях ЗАО «Фармаген» проведена апробация технологии капсул Артро-Актива. Разработан проект ФСП на сухой экстракт босвеллии.