Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое исследование трилистника водяного

Р Г Б ОД

1 Б ЯНВ 19S5

ЛНШСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАШИ ЛЬВ1ВСЬКИЛ ДЕРЖАВНИЙ МЕДИЧНИЙ 1НСТИТУТ

На правах рукопису

ШАПОВАЛОВА Натал1'я Валентишпна

ФА Р Л\А к О Г H О CT И Ч H Е Д О С ЛIД ж Е H НЯ БОБ1ВНИКА ТРИЛИСТОГО

15.00.02 — фармацевтична xímííi i фармакогноз1я

Авторе ферат дисертацп на здобуття паукового ступени кандидата фарманевтичних наук

ЛЬВ1В 19 9 4

Дисартацхеп е рукопис.

Робота виконака на кафгдрг фармакогноз11, ресурсознавства дхкарських рослин i ботанхки Львхвського державного медичного хнституту.

НАУКОВИЯ .ЕШЧЗНЖ - доктор фаркацевтичних наук,

професор ЛЛ.РОГОВСЬКА.

0ФГЛЯН1 ОПОНШГЛ - доктор фармацевткчних наук,

професор -О.В.ВХШШРСШ;

доктор бгологтчних наук, доктор гонорис кауза, професор С.М.СТОЖО.

ПРСВ11НА 0РГАН13АЩЯ - 7к'ра1ыська фармацевгична академия.

Захист 31дбудетьоя ClZSiJ- 1995 року

о fO годинт на засгдаин1 спецхалхзованох вченох ради К 088.21.ОГ у Львтвському державному медичному гнетитутг /290000, ЯаП, м.Львгв, вул. Лзкарська, 69/.

3 диоертадхеп можна ознайомитися в HayrcoBiB 6idiioTeui институту за адресов: 290000, М.ЛЬВ1В, вул.СИчових стртльцтв.б.

Автореферат роз1слаыий " //* " IS94 р.

Зчений секретар спеЦ1аД130£ано1 вченох ради К 088.21.01,

Доцент Г.Д.ГАСШ

ЗАГА1БНА ХАРАКТЕР1ЕТЖА РОБОТИ

Актуальнхсть т отуп1нь дослтдженоетг тематики дисертацН. Одним з вазлквих заЕдань фармацП е розробка нових лхкарських за-собхв. Прэпарати з Л1карсысо! рослинно! сировини широко впкористо-вують в меднчнхй практтп для проф1лактики I Л1кування ртзяих па-толоГ1ЧНИХ процес1В. Пошук нових б1олог1чно активных речовин рос-линного походження з кетою створепня яа !х основ! ягкарських за-собхв е актуальное проблемою. Враховуючи потребу комплексного ви-яорисгаяня рослинних ресурсов, особливо! уваги заелуговувгь лг-карськх рослини, якт мають багатовгкозиЯ доовхд зикоркстання в народн1Я медицин1. До таких роолин вгдноснться бобхвник триллс-тиЯ - 1гепуап1Ьез trifoliata Ъ., сиогематичних фхтохемтчних I фармакологгчних доелгцж'ень йкого не лроводилося. В офгцинальнхй медицин! листя бобхвника трилиегбго використовуоть у вйг!ядт настою для збудяенкя апетиту I як згойчоНнне.

Ми вивчили кожлиз10ть створення на основ! лис'тя бобовника трилистого засоб1в"з гепатопротекторною, антйоксидантноп т гсроти-виразковов активнтстю, арсенал яких обмеяениЯ, а тоиу попук вових сировинних дкерел для IX створення е актуальним.

Диоертацгйна робота виганана у вхдсов1Дност1 з планом науко-во-досл1даицьких робхт Львгвського державного неличного 1нстигуту т включена в деркавну проблему "$армац1Яп /6 дергреестрац!Г 01.91.00.19.51.6, иифр теми 1Н 10.06.0001.91/.

Мета 1 осноент завдаиня наукового доелтддення. Метоо робо-ти е фарнакогностичне дослйження бобхвника трилистого, вивчен-ня ноклкзоот! створення на його осковг нових дгкарських засобтв з гепагопрогёкторНоп, антиоксидантно!) I противиразковов акт:гэн!С-Т1), удосконалення ставдартизагш дткарсько! рослинно! сировини . за вмтстом- дхичих- рэчовин.

Для досягнення мети вирхшувалися наступит завдання:

- дослхдити хемхчний оклад листкхв бобхвника трилистого;

- видиити бхологхчно активнх речовини I вивчити 1х хемхчну структуру;

- розробити методи одержандя I анал1зу, вивчити фармаколо-гхчну активн1сть екстракНв листкгв бобхвника трилистого;

- опрацсвати спосхб одерлсання екстракту з антиоксидантнов, противиразковоп Д1еп;

- удосконалити метод стандартизаци сировини за вихстом Й1олог1чно активних речовин;

- розробити проекти норкативно-техн1чно1 документацхх на фармакологхчний засхб I вгдомтсть змхн до фармакопзйно! статт! "Листя бобовника трилистого", роздхл "Кгльк1сне визначення".

Теоретична'I практична Ц1нн1сть дослхдження. Опрацьовано .спос1б одержання екстракту листов бобхвника трилистого з проти-виразковою, антиоксидантноп дхег.

ГЬрошок лнсткхз бобхвника входить до складу нового комплексного рослинкого засобу з гепатопротекторнов Д1ев.

Удоскокалеио метод стандартизацп листкхв бобхвника трилис-

»

того за винтом суми фенольних сполук I флавонохдхв.

Наукова новизна. Вперше проведеН1 систематичн1 фхтохенхчнх I фармакологхчнх дослидення бобхвника трилистого флори Украхни Опрацьованх оптимально укови I способи одержання екстрактхв, ан; Л1зу якхсного складу, видхлеиня бхологхчно активних речовин; з листкхв бобхвника трилистого^ввд1Лено 12 фенольних сполук в 1нд В1дуальному стан1, в тому числх б флавоко1Д1В, 2 кумарини, 4 ок сикоричнх кислоти. Встановлена I пхдтверджена фхзико-хзмхчними методами структура .рутину листкхв бобхвника. Розробдено спос1б одераання промЬших 3-моноглюкозиД1в при ступеневому кислотному Г1Дрол131 ^-0-бхозид1В флааоно1Д1В. Вперые впялен: з лист;:тв

бобгвника трилистого нгкотифлорин, умбелхферон т розтринатна кислота.

Встановлено, що волн: г спиртово-водн! екстракти листктв боб1впика масть холеретичну, антиоксидаятну, противиразкову, ан-тистресорну, цитопротективну та гепатозахисну Д10.

Впроваджекня наукових розробок. На основг водного лхофтлхзо-ваного екстракту листкгв бобтвника трилистого опрацьовано спосгб одержання засобу з антистресорноо, антиоксидантнос, противиразко-воо ак?ивн1сти, на який пгдготовлена заявка у Держпатент Укра1ни.

Розроблено проект вхдомостх ЗН1Н до фармакопейноТ статтх "Листя боб1ВНика трилистого", роЗдгл "Илькхсне визначеннк".

Сильно з 1ван0-3>ранк1всысим иедичним хнститутом птдготовле-но проект фармакопейно! стаМх на комплексний рослинний зас1б з гепатопротекторноп дхео.

Агттюбацтя та публткацтя результатгв дослгджень. Основяг положения диоертад1йно1 роботи викладеях на Республтканськтй науко-в!й конференцП "Актуальнт проблеми гастройнтерологП" /Львгв, 1989/, наукових конференцхях Твано-ФранктЬського /1вано-Франктвськ, 1990/, Туркменського /Ашгао'ад, 1990/, Вгльнпського /Вгльнюс, I 1990/ медичних тнститутгв, конферетпях "Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Дальнем Востоке" /Томск, 1951/, "Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики" /Курск, 1991/, 1-хй Укра1нськ1й конферешШ "Народна т нетрадиНй-на медицина та вляхи II розвйтку" /Полтава, 1993/, засхданнх ка-федри фаркакогнозп, ресурсознавства лхкароьких рослин I ботаН1-ки Льв1вського державного мздичного институту /Львтв, I994/.

По тем1 дисертацх! опублгковано 13 наукових робгт.

Структура г обсяг дисертацтйнох' роботи. Лисертацтяна робота викладена на 117 сторхнках кашияопису, складаеться з вступу, огая-ду лгтератури, 4 глав експерииентальних дослхдхень, висновк!з,

- б -

списку лгтерагури I додаткгв.

У текст1 дисертацп наведено 16 рисунк{в I 35 таблиць. Сп) сок лиератури вклвчае 202 джерела, 'з них 48 хноземних авторхв

Конкретний особистий внесок дисертанта у розробку наукови: результаттв, що виносяться на захист:

- розроблено способа одержання екстрактхв, аналхзу яктсно! складу, видхлення бхологхчно активних речовин з листкхв боб1вш ка трилистого;

- ввдхлено в хндивхдуальному станг 12 фенольних сполук та П1дтверджена 1х хемтчка структура;

- опрацьоваа1 спектрофотомегричнх методи ильиного визш чення оуми фенольних сполук х флавонохдхв у листках бобгвника трилистого;

- розроблено проект в1доностх зм1н до фармакопейноТ статт "1истя бобхвника трилистог,о,,1 роздхл "К}лькхсне визначення";

- гидготовлено заявку у Деркпатент Украгни на новий засгб з антиоксидантнои, противиразковоп Д1еп.

Методология, методи та об'екти дослтдження, При виконанят дисертацхйнох робота використана методология комплексних фхзик< хемхчних та фарнакологхчних дослгджень, що дозволило розроби'ти новкй Д1карськиЯ засхб рослинного походження з антиоксидантнои противиразковоп дгев.

Методи дослъджень: УФ-чТа 1Ч-спектроскоп1Я, поляриметр1Я, хроматографгя, кислотний, дужний, ферментативний Г1дрол13н, ла тон1зац1Я, метилпвання.

Об'ектами дослхдження були листки бобхвника трилистого, в Н1 та спиргово-водн1 екстракти, 1ндив1дуальнх бхологхчно актив речовшии

ОСНОВ НГ РЕЗУЛЬТАТ И Д1СЕРТАЩЙН01 РОБОТИ

Дослгдження якхсного складу I вшилення бхологхчно активних речовин з листкхв бобхвника трилистого

За допомогоп реакц1й 1деятиф1кацЯ в листках бобхвника три-стого виявлен1 флавонохди, дубильн1 речовини, кумарини, оксико-ричн1 кислоти, сапонхни, полхсахарвди, 1ридо!ди; методом хрома-гографП на папер1 - 7 органхчних кислот.

Встановлено, що комплекс бхологхчно активних речовин листкхв 5об1вника складаоть, в основному, сполуки фенольно! природи. Для Ех вгсйлення, роздхлення та одержання в хндивхдуальному стак1 ви-сористовували методи фхльтрацхйно-вакуумно! екстрамп! 70? етано-юк, адсорбцхйно! хроматограф11 на поЛ1ам1Д1, кристаЛ1зацх1, пре-1аративно1 хроматографы на паперг та в гонкому шар1 сорбенту. 1к елюенти використовували воду, етанол р13но1 концентрацх!, ме-"анол, хзопропанол, етилацетат, хлороформ та сумхшх розчиняшсхв ■ ■ р1зних спхввхдношеннях.

В результат проведених досл1джень з листов бобхвника три-[истого видхлено 12 фенольних сполук, з них речовини ?^ - е лавонохдамн, ФК^- - - оксикоричники кислотами, К-^ - К^ -умаринами. Ф13ико-хем1ЧН1 характеристики ввдхлених сполук наве-,ен1 в таблиц! I.

Дослхдаеняя структури экдхлених сполук бобхвника трилистого

Досл1дхення структури вшилених сполук проводили в лаборато-х? хемП I технологи фенольних гсрепаратхв Державного паукового ентру лхкарських засобхв /м.Харкхв/ п!д керхвництвом чл.-кор. няэнерно1 академП Укра1ни, доктора хемхчнкх наук, професора ЛЛитвиненка I канд.хемхчних наук Т.П.Попово1.

Для встановлення структури викорнстовували фтвичн! /У5- та

- а -

Габлиця I

Фтзико-хем1ЧН1 характеристики речовин, видхлених з листкхв бобхвника трилистого

№ Речовина ! t Сумарна формула Темп. „ ! топл.,°C! их ! Rf в системах ! розчиннйкхв

I. Кверцетин /Ф|/ С15НЮ°7 307-312 - 0,2бБ; 0,685; 0,64Г; 0,051

2. Кемпферол С15НЮ°б 272-274 - 0.39Б; 0,751; 0.84Г; 0,121

3. Гшерозид /Ф^/ ^I^O0^ 233-234 -70,0 0.50А; 0)l0E 0,22В;

Трифолхн /Ф^/ %IH20°II 228-230 -30,0 0.54А; O.I3E 0,253;

5. Рутин /ic/ C27H30°I6 187-190 -32,2 0.72А; 0.37Д; 0.82Б; 0,422

б. HlKOTStiUIO pHH/$g/ С27Н30°Г5 222-225 -25,0 0.75А; 0,8^Б

7. Хлорогенатна кислота /§Kj/ С1б%8°9 203-205 -32,0 0,63 А; 0,72В 0.92Б;

8. Неохлорогенатна кислота /ФЕи/ CI6HI8°9 аморф. +2,6 0.70А; 0,82В

9. Розмаринатна кислота /$Кд/ CI8HI8°8 аморф. - 0,36В; 0.3IE

10. Кофеатна кислота /Ш^/ Cg Hg 0Ц 193-195 - 0.54А; 0,40В; 0,80Б; 0.82Д

II. 7мбел1ферон /Kj/ Cg Нб O3 231-233 - 0.63Е; 0,241; 0,163; 0.50К

12. Скополетин /Kg/ C^oHg 203-205 - оо 0,253; 0.55К

Системи розчинник1в: 152 ацетатна кислота; Б - 30л ацетатна кислота; В - 2,5* ацетатна кислота; Г - бензол-етилацетат-ацетатна кислота /50:50:1/; Д - н-бутанол-ацетатна кислота-вода /4:1:2/; Е - 10% розчин натргп хлориду; Ж - хлороформ-ацетатна кислота /100:1/; 3 - циклогеясан-етилацетат /3:1/; I - етилаце-тат-хлороформ-циклагексан /2:1:7/; К - петролейний еф1р - формам« /1:1/

1Ч-с'пеЕгроскоп1с, поляриметрхв, елементний аяалгз/ i хемгчн1 /кислотния, лужний, фгрментативний г}дрол13и; лужне розщепленвя, мэтилввання, лактонхзацхв/ методи дослвджень.

Флавоиогди. Речовини - за результатами реакцхй гденти-ф1кац11, хроматографхчно» рухомхств, флуоресцеацхес плям на хрома-тограмах в У5-свхтлх до i пхсля проявления хромогеяними реактивами ми В1днесли до флавоно1д1в.

В У5-сгсектрах досл1джуваних сполук вхдмгчали макс и муки вбирания в областх 360 i 260 нн. Положения вгльвих i замхщених окси-труп визначали диференцхальнов УФ-спектроскоп1ев з вккористанням дхагностичних йонхзусчих i комплексоутворвючих peareirriB.

1Ч-спектри речовин - характер и зувться смугами вбирания в облает: 3400-3000 см-1 /фенольнг оксигрупн/, 1670-1600 см-1 /карбоп1Льна трупа J-пхронового циклу/, I6I5-I470 см"-'- /коли-ваяня арокатичних цйклхв/.

Шаньдинова реагапя по Брханту речовин $j i ^ була позитивна. За pvxoMicTB'плям на Хроматогранах в рхзних системах розчин-hkkíb, яскраво-жовтов флуоресценцхеп в 7£-cbímí видхленх речовини вхднесен1 до аглвконхв флавонохдхв. 3 хлороксидом цирконхв спостерхгали утворення жовтого забарвленая, яке не зникало пхд Д1ев цитратнох кислоти /наявнхеть В1льних оксигруп при С-З i С-5/, з хлоридом залхза /Ш/ - зелеяе, з дхазотоваяов сульфавг-латнов кислстог - червоно-бурз, но евхдчило про незамхвену окси-групу при С-7. Про наявнгсть Д10ксхугруповаиня в В-циклх речовини евхдчило утворення жовтого осаду з розчином ацетату свинцв.

При лужному розпепленях речовини впялено флороглвдин х 3,4-Д10ксибензоатну /протокатехатну/ кислоту, речовини ~ фяоро-глвдин i n-оксибензоатну кислоту.

Одержанх кетильн! похмях дослхджуваягас сполук i 23 ' фхзико-хемхчними властивостяни поввхств совпадали з пеатаиетн-

ловим ефгром кверцетину I тетрамегиловим ефхром кемпферолу В1Дпо-В1Дно. При зм1шуванн1 проб речовин х з вхрогхдними зразка-ми кверцеткну I кемпферолу депресп температури топлення не спос-терхгали, на хроматограмах зиявляли одну нерозд1Льну пляму._ Отже, речовину % ми хдентиф1кували як 3,5,7,3',4'-пентаоксифлавс або кверцетин; ^ ~ 3,5,7,4'-тетраоксифлавон або кемпферол.

Речовини ~ не давади позитивно? цханхдиновох реакц« по Брханту, вхдновлпвали рхдину Фелгнгз тхльки пхоля кислотного гхдролхзу, шли на хроматографах в 7?-свхтлх темно-коричневе за-барвлення, яке переходило в жовте П1Д Д1ев пархв амонхаку. Все ц( . вказувало на глвг.озидну природу речовин з замтщенням вуглеводним компонентой при С-3.

На осаовх даних елементного аналхзу, молекулярно! ыаси, результата кхльк1сн0г0 кислотного г1дроЛ13у 10* хлоридною кисл0т01 .в 503 розчин1 ацетатндI кислоти /доля аглюкону речовин ^ т становила 63,0£, речовин 1 фд - 48,0*/ досЛ1дгуван1 сполуки

I В1днесен1 до моноглвкозидхв; I - бЗгозидхв флавоно!-дхв. Диференцхальноп УФ-спектроскотев з використанням дхагности1 них додаткхв встановлена наявнхсть В1льних оксигруп прч С-5, С-7, С-3', С-4* $5/; С-5, С-7, С-4' §б/ \ замтцгно! пр]

с-з /Ф3 - $б/.

7 продуктах кислотного Г1дрол1зу речовин % х були вияв-.. лен1 аглпкони кверцетин I кемпферол вгдповхдно х Б-галактоза.

Диференц1адьнх 1Ч-спектри речовин $3 I характеризувться трьома смугами вбирания в обйастх 1096-1005 см-* /пхранозна форма вуглеводного субституенту/, ому го в при 896-890 /$> -конфх-гурацхя глвкозидного зв'язку мхж аглвконом I цукром/. Розщеплен-ня Д0сЛ1Джуваних монозидхв Фо х ^ рамнодгастазов також вказува-ло на наявнхсть Ь -глвкозидного зв'язку.

3 резт^льтатх порхвняння фхзико-хемгчних власгивостей речови!

- п -

$3 г з В1рог1дними зразками вони були охарактеризован! як

* I

3-0-£ - Б-галактопхранозид кверцетину або хчперозид /§3/ I 3-0£ - Б-галактопхранозад кемгйеролу або трифолхн /Ф^/.

7 продуктах кислотного Г1дролхзу бгозвдхв I були ви-явленх Б1дпов1дно кверцетнн х кемгсферол; В-глюкоза, ь -рамноза. Для вияснення послхдовностх приеднання моноцукрхв в бхозх х фор-ми оксидних циклхв вуглеводних компонентхв проводили ступеневий кислогний Г1ДроЛ13 0,1# хлорвднов кислогоИ /30 хв, 90°С/ б103ИД1В $5 I сорбованих на целвлозх. Ввдхлених препаративно 3-моно-гликозидхв кверцетину I кемпферолу при звичайних умовах проведения ступеневого кислотного гхдролхзу ми не одерзали /бхознди роз-щеггдввались Зразу до аглвкону г не угворввали промхжних моноглв-козтахв/, що св!дчило про фуранозну форму оксидного циклу о-глв-кози, яка зв'язана з аглсконом, а термхнальним цукром е ь-раиноза.

Т продуктах ферментативного гхдролхзу ракнодтастазов, яка вхдщеплвс 610ЗИ з 1-6 порядком зв'язку мхж цукрами, була 1денти-ф1кована рутиноза..Про 1-6 порядок зв'язку свтдчили також реэуль-тати реакцх! з дифенхламхиовими реактивами /забарвлення плями ру-тинози на хроматограыах в синьо-зелений кол1р/. '

7 дчферещтальних 14-спектрах.дослгдяуваних бхозкдхв $5 х В1дмхчали, крхм смуг вбирания, характерних для флавонохдхв, три смути в областх 1100-1010 см-* /пхранозна форма оксидного циклу. Ъ-рамнози/, двх смуги вбирания при 1082, 1062 см~* /фураиоз-на форма В-глвкози/, смугу при 950 см"1 /метильна група ь-ракяо-зи/ I при 890 см-1 /£ -кокфхрурацхя глвкозадного зв'язку К1Х аг-лвконом 1 вуглеводним субституентом/.

В результат! проведених дослхдяень речовиня $5 I ^ були гденпг^гкованг як 3-0-/£ - о-глвкофуранозил/-б-£ - Ь-рамноп1раж>-зид кверцетину або рутин /$5/ г 3-0-/£ - П-глвкофураноздд/-б-£ -ь-рамноп!ранозид кемпферолу або нхкотяфлорин Нгкоткфлорга

,-.12 -

ми вщсглиди з листкхв бобхвника трилистого вперше.

Оксикоричнт кислоти. Речовини ФК^ - за хронатографхчною рухомхств в рхзних системах розчинник1в, блакитнов флуоресценцхе плям на хроматограмах в Уф-св1тл1, позитив ни ми результатами реак Ц1й з бронтимоловим синхм I реактивом Имхдта були охарактеризова Н1 як кислоти.Про фзнольну природу дослхджуваних речовин евхдчило жовте забарвлення. з розчином гхдрокевду натрхв, червоно-буре ■ з Д1азотованоо сульфанхлатноп кислотов, зелене - з залхза /Ш/ хлоридом.

Наявнхсть в УФ-спектрах речовин §Ку - максимумхв вбиран-ня при 325, 299 х 245 нм дозволило вхднести IX до оксикоричних кислот» Розмгчення вхльних оксигруп в структур? дослхджуваних сполук визначали диферешпальнов УФ-спектроскопхев з використан-ням кошлексоутворввчих гйонхзуючих реагенттв.

При епдавляннх з лугом речовин ФК^, ми виявляли

3,4-дхоксибензоатну кислоту, що пхдтверджувало результати спект-ральних Д0СЛ1Дкень про наява1дть 3,4-д1оксхугруповання в 1х стру! тур1. При оииленн1 речовини ФК^ касиченим розчином гхарокевду ба-Р1В одержали 3,4-Д10кси£ен1ллактатну кислоту.

i

В продуктах лужного гхдролгзу речовин ФК^ I виявилй кофеатну I Ю-хгинатну кислоти; речовини - кофеатну кислоту. Про наявнхсть в структурах I И -Х1ннатн01 кислоти евхд—^ чило також утворення блакитного забарвлення плям на хроматограмаэ при проявленнх барбхтуратнох кислотов.

Для встановлення мхеця^риеднання кофеатно! до 1>-Х1Ннатно1 кислоти в структурах речовин х проводили лактонхзацхв в льодовхй ацетатнхй кислотт. Утворення лактону спостерхгали в при-сутност1 -§Кг>, кислота ФК-^ заливалась без змхн. В зв'язяу з тин, що утворення лактону можливе тхльки через оксш*рупу при С-5 о -ххннатно! гсислоти, то залшок кофеатно! приедяаний по цьому

положенно в речозикх I в положекнх С-3 в речовинх ФЕ^.

В результат! проведэнлх дослхдязнь, пор1Внянн1 фгзико-хзмтч-них властивостеЯ видглених речовин з вхрог1дними зразками окси-коричнх кислоти листкгв бобтвника трилистого охарактеризували як 5-0-кофе1л-Б-Х1ннатна або хлорогенатна /ФК-^/, З-О-кофегл- и-ххн-натна або неохлорогзнатна /¥&?/, складний ефхр кофеатног х 3,4-Д10ксифен1ллактатн01 кислот або розмаринатна /Ш?/, 3,4-д1окси-корична або кофеатна /Ш^/. Розмаринатну кислоту видхлено з лист-К1В бобгвника трилистого впзряе.

Куяарини. На основ! реакцхй хдзнтифхкаци, б$акитно1 флуо-ресценцх! плям на хроматограках в У5-св1ТЛ1, яка посилпвалась парами амонхаку I розчином лугу, результат1В деструкиЛ броыхд-ноп кислотов речовини ^ I В1днесенг до кумарин1В.

УФ-спектри лосл1Джуваних сполук характеризувались максимумами вбирания при 350 I 245 нм. У диферешпальних 7$-спзктрах виявили батохромне зм1чення максимумхв довгохвильовох смуги пхд дтеп етилату натрхп I розчину лугу, що свхдчило про наявигсть оксигруп в структурах речовин К^-х К?. Зелене забарвлення, яке . давала сполука К? з залхза /Ш/ хлоридом, характеризувало зам1-щеиня у фенхльному залипку в о-положенн1:

В 1Ч-спектрах речовин К^- I Е^ вхдмхченх смуги вбирания при 1725-1632 см~^ /карбон1Льна група оС-пгрону/, 1620-1580 см-* /валэнтн1 коливання ароматичних цикл1в/, 3300-3200 см~* /вхльна о кс игру па/. Додаткова смуга вбирания при 2985-2850 см~* в 14-спектрг речовини ^ характзризувала наявн1сть метоксигрупи.

Проби зм1щування речовин I ЕС, з вгрсг1дними зразкаки умбелхферону х скополэтину вхдповхдко не давали д-пресгх темпз-ратури топлення, на хроматограмах спостерхгали одну нероздгльну пляму. На основ! фхзико-хемхчних властизостзй речовина К^ була 1дентиф1 кована як 7-окстсумарш або речовина К? -

як 6-метокси-7-оксикумарин або скополетин. Умбелхферон ми ввдхли-ли з листкгв ^обхвышса трилистого вперие.

Визначення вм1сту бхолог1чно активних речовин I розробка методу стандартизацх! лнсткхв бобхвника трилистого

Ктлькхсне визначення оуми фдавоно1дхв у листках боб1вника трилистого проводили спектрофогонегричним методом у перерахуяку на рутин. Вм1ст дубильних речовин визначали перманганатометрич-но; вхльних органхчних кислот - методом нейтрал^зац11 за методиками ДФ П.

У листках боб1вника трилистого визначали вмхст суки хлоро-фЬпв спектрофотометричним методом. Вимхрввання оптично! густини екстракту игментхв проводили при довжшп хвил1 668 нм, яка втд-повхдае максимуму вбирания хлорофхлу А.

. Вивчено динамтку вивгльнення Суми фру кто зан1В з листкхв бо-бiвникa I визначено 1х в»«ст у спиртовому екстрактх спектрофотометричним методой, .який становить 24,19 + 0,43?. Цей метод базу-еться на здатностт фруктози та П штдних при нагрхваннх з кислотами трансфориуватися в 5-Г1дроксиметилфурфурол, який мае максимум вбирания в облает} 280-285 нм.

Результати кхльктсного визначення обробляли методом вар1а-цхйшп статистики, вхдносна аохибка мегодхв знаходитьея в метах 2,19 - 3,Ш.

У ст. 19 Д$ XI "Дистя бобхвника трилистого" рекомендуеться проводити визначення вм!сту суми флавонохдхв фотоколориметричник методом у перерахунку на рутин. У зв'язку з тим, во в листках бобхвшцса, крхм флавоно!д1в, метиться г 1ншх фенольнх сполуки, ни запропонували стандартизувати сировину за вм1СТом суми фенол! них сполук з окреиим визкаченняк суми флавоно1дхв. Опрацьовано спекгрофогометричний метод визначення полхфенолтв у витяжках

з листкхз бобхвника трилистого у перерахунку на хлорогенатну кислоту I флавоногдхв у перерахунку на рутин з зикористанням диференцгальнох У^-спектроскопп. Метод кхлькхсного визначення флавоногдхв базуеться на утвореннх комплэксних с по лук з х.-орокси-дом цирконхп, для яких характерний максимум вбирания при довжи-Н1 хвилх 420 нм.

За р1зницеп кхлькхсного вмхсту фенольних сполук х флавоно!дхв знаходили суму оксикоричних кислот г кумаринхв.

Вмхст б1олог1чно активних речовин за розроблениии нами методиками визначали у листках бобхвника трилистого, ^аготовлених у липнх-сертп 1992 р. в Явор1вському райо«1 ЛьвхвськоТ област1. Результати дослхдзень наведгнх в таблиц! 2.

Таблиця 2

К1льк1снкй вмхст б^ологхчно активних речовин у листках бобхвника трилистого

Р е ч о в и н и * Кхлькхсний вмхст, %

"! А + дХ, п = 5/

Сума фенольних сполук 5,77+ 0,20

5лазоно1ДИ 2,57 + 0,09

Сума оксикошчних кислот х

кумаринхв 3,20 + 0,16

На основх результатхв проведених дослхджзнь пхдготовлено проект В1Домостх змхн до фармакопег-но'1 статт1 "Листя бобхвника трилистого", роздхл "Кхлъкхсне визначення".

о

Вивченкя фармакологхчнчх властивостей ексарактхв листкхв бобхвника трилистого

Для проведения фармакологхчних Дос.Лд;$ень використовували

воднх та саиртово-водн1 витяжки з листкхв бобхвника та !х лхофх-лхзовак1 екстракти, якх одержували сублхмацхйним висушуванням на апаратг КЗ-ЗО /завод ФргГера, Чехгя/. Водний I спиртово-водний Л1оф1Лгзати игстять флавонохди, дубилькх речовини, орган1чн1 та оксикоричнг кислоти, сапонгки, кумарини, хридо'гди.

Дослхдження фармакологхчках властивостей екстракт1в лисгкхв бобхвника проводили на баз! Львхвського та 1вано-Франкхвського медичних 1нститут1в- Вивчали токсичнь канцерогенах та алергхзую-чх властивост!, вплив на функцхональнх та морфолог1чн1 показники серцево-судинно!, сечоввдильно!, ендокринно! систем, органхв ди-хання I травления; антиоксидайтну, антистресорну, противиразкову цитопротективну, холеретичну, гепатозахисну активнхсть.

Вивчення токсичних, канцерогенних х алергхзуочих властивостей проводили в лабораторх! фхтохемП I фхтотерапх! 1вано-Фран-к!вського ыедичного тнституту. Результати дослхджень гострох, ах гостро! та хронхчно! токсичностх показали, то екстракт листкхв бобхвника не токсичний. Встановлено, що дойготривале застосуван-ня екстракту дослхджувано! рослини не приводить до змхн функцхй I показник1В серцево-судинно!, сечоввдхльно!, ендокринно! систем органов дихання 1 травления.

Вивчали ыоедив1 канцерогеннх властивостх екстракту листов бобхвника на бхлих нишах х щурах. Результати експериментхв показали, цо частота утворення пухлин совпадала або була нижчос В1Д показникхв пухлиноутворення контрольних Лнтактних/ тварин, но П1ДТвердаувало втдсутнхсть канцерогенно!" дП екстракту.

Виявлення мокливо! алергхзуючо! Д11 бобхвника трилистого проводили на морських свинках I мишах за тестами: активно! пкхр-но! анафхлаксП, реага«! Нперчутливостх "спов1ЛЬненого" типу, пкхрних аплхкаахй, кон'онктивальнох проби. Встановлено, ио пхд дтеч екстракту листкхв бобхвника алергхчних реакцхй у тварин не

винихае, сенсибхлхзувчоТ дхТ не виявлено.

Зивчення холеретичшн активностх настов листов бо(3!вника /1:10/, водного i спиртово-водного лхоф1Л1зат1в на б1лих щурах в nopiBHHHHi з рослинним засобом жовчог1нно1 дт! фламхном проводили на кафедр! фармаколог!! Львхвського медичного хнституту niA кзр1вництвом доцента М.Д.Литвинчука. В кожнхй rpyni пхддоол1дних тварин визначали 1нтэнсивн1сть жовчоввдхлення, концентраахв в жовч1 холатхв, холестарину i бхЛ1руб1ну. Було встановлено, що однократне введения досл1джуваних екстрактхв збхльшувало вид1лзн-ня sob4í, конценграЦ1В II компэнентхв. Особливо зйсокх- результа-ти спостерхгались при введэнн! сскртово-водного лхофхлхзованого екстракту листктв бобхзника /збхльшэння холерезу на 40? в nopiB-няннх з контролем/, що перевищувало данх при взеденнх фламхну на •24%. Концзнтрацхя жовчэвих кислот, холестерину, б1Л1рубхну зб1ль-шувалась вхдповхдно на 31?, 28?, 20? в nopiBHflHHi з контролем.

Антиоксидантну, антистресорну, противиразкову активнхсть екстракт1в листктв бобхвника вивчали на кафедрх бхолог1чно1 хе-míI 1ьв1вського медичного 1Нституту-П1Д керхвництвом професора Я./5.'Гимочка. Дослхдження проводили на бхлих мизах, у яких поражения слизово! оболонки шлунку викликали- надм1рнов дозов стресо-вого фактору 0,1? розчину адрзналхну. Яро розвнток стрес-реагаш в opraHÍ3Mi i фармакотерапевтичну ефективн1сть досл1джуваних екстрактхв робили висновок за рхвнем пероксидног оксидацп Л1гпдхв /ПОЛ/ i активн1ств супероксиздисмутази /СОД/. Пивицення рхвня П01 П1Д Д1ею адренал1ну п1дтвердяувало розвиток стрес-реакц11, активнхсть СОД при цьому значно нкача В1д норми. В умовах експери-мэнтальног Tepanií дослхдауванх екотракти знга^вали рхвенЬ'ПО! i пхдвшцувади активнхсть СОД, тому цо аатиоксидантна Д1Я екстрактхв, в основному, забезпечуеться через 1ндукц1В антиоксидантних фермен-tíb, в тому числ! г супероксиддисмутаза /СОД/. Найбхльа ефективну

- ТВ -

антиоксидактяу Д1в /сильне зниження процесхв ПОЛ/ за рахунок 1 активацп ферментхв, якх захищавть слизову оболонку шлунково-кшкового тракту вхд стресорного поражения, виявляе розчин водного лтофхл^зату листкгв бобхвника I може бути запропонованим важ-дивиы водорозчинним актиоксидантом.

Цитопротективну д!в водного агёоф^зованого екстракту листков бобгвника вивчали на моделг гмобглгзацхйно-холодового сгресу на кафедрх фармакологх! 1вано~§ранк1вського медйчного институту П1Д керхвництвом професора Я.С.Г^дивок. Введения доолхджуваного екстракту бхлим щурам приводило до зменшення кхлькостх поражень слизовог оболонкй илунку /крововилив1Б, крапчастих'геморагхй, еро-зхй/ вдв1Чх в порхвняннх з контролем. Зниження кхлькост! уражень пхд дхев водного дхофхлхзату проходило навхть при додатковхй уль-церогеннхй дП хндометациву, що вказувало на наявнхсть цитопро-тективно! дп дослхджувано!^) екстракту, який стимулве синтез про-сгагландинхв, захицавчи слизову оболонку шлунку в1д поикоджень. В досдхдах на щурах встановлено, що Д0СЛ1ДЖуваний екстракт знижуе загальну кислотн1сть шлункового соку др 37,3 +1,1 титрац. од. /в контродх.- 72,6 + 1,3 титрац.од./.

На основ1 результатгв дослхджень водного л^фхлхзованого екстракту листкхв бобхвника трилистого опрацьовано спор1б одержан-ня засобу з антиоксидантнов, противиразковов Д1ев, на який изготовлено заявку у Держпатент Укра1ни.

Вивчення гепатозахисно! дп екстракту листкхв боб!вника проводили на бхлих Щурах, у яких поражения печхнки викликали олгйним розчином тетрахлориду вуглецв. Про фармакотерапевтичну ефекТив-нхсть лхофхл^вату рйбили висновок за р!внем ГОЛ х активною 00Д у кровхтварин. Ре зультати. проведение дослхджень свхдчать, що водния л!о$1л*зований екстракт листов бобхвника знижуе рхвень ПОЛ I шдвищус акгивнхсть СОД при експериментальному токсичному

гепатитг, тобто виявляе гепатозахисну активнхсть.

Лгдгоговлено проект фармакопейно! статтг на комплексниЯ рослинний засгб з гепатопротекторноп Д1еп, до складу якого входить порошок листкхв боб!вника трилистого.

ВИСНОВКЯ

1. За допомогоп реампй хдентифхкацЛ, хроматографп на паперх та в тонкому шар! сорбенту в листках бобхвника трилистого виявлеяп флавоноТди, оксикоричнх кислоти, дубкльнх речовини, по-лхсахариди, сапонхни, кумарини, 1ридо1'ди, 7 орган|чних кислот.

2. 3 листкхв бобхвника трилистого вдавлено в хндивхдуально-му станх х пхдтверджено структуру фхзико-хемхчними методами

12 фенольних сполук: б флавоно1д1в /кверцетин, кемпферол, г1перо-зид, Тр!1ЙОЛ1Н, рутин, нхкот'лфлорин/, 4 оксикоричних кислот /кофе-атна, розмаринатна, хлорогенатна, неохлорогенатна/, 2 кумаринхв /у;-«бел1ферон, скополетин/.

Нхкотифлорин, умбелхферон I розмаринатна кислота видхленх з листкхв бобхвника трилистого вперяе.

3. Запропоновано спосхб одержання промхжних З-моноглвкозадав при ступэневому кислотному гхдрод131 флавонол-З-О-бхозидхв.

4. Визначено кхлькхсний вмхст флавоногдхв, дубильних речовин, В1льних орган1Чних кислот та суми хлороф^в у листках бобхвника трилистого.

5. Вивчеко динамику вивхльнення суми фруктозанхв з листкхв бобхвника, вмхст яких у спиртовому екстракт1 24,19 + 0,43?.

6. Розроблен! методики спектрофотометричного визначення суми фенольних сполук I флавоноТд1 = ; 1х К1ЛЪК1сть становить в!д-. повхдно 5,77 + 0,20? в перерахунку на хлорогенатну кислоту I 2,50 + 0,09? - на рутин. Подготовлено проект вхдомостт ЗМ1Н до фармакопейно! статтг "1истя бобхвника 'гри;.истогоп, ,розд!Л

"К1льк1сне визначення".

7. Встановлено, що евсстракти листов боб*вника трилистого не токсичнх, не кавть канцерогенних та.алергхзувчих властивостей; не приводить до функцхональних г морфологгчниг змхн серцево-суди| но!, сечовидхльно!, ендокринно! систем, оргаыхв дихання та травления.

8. Водний I спиртово-водний екстракти листк!в боб}вника трилистого виявлявть жовчогхнну, антиоксвдантну, антиотресорну I противиразкову активнхсть, знижувть загальну кислотн1йть шлунко-вого соку.

9. Спиртово-воднйй Л1оф1Лхзований екстракт бобхвника эдатни! збхдыаувати ввдглення яовчг у щурхв на 40%, перевибгуючи дхс рос-линного сасобу холерегично! дх! фламхну на 24%.

10. На основх водного' Л10ф1Л1зату листкхв бобхвника трилистого опрацьовано спосхб одеркання засобу з антиоксидантнов, про-тивиразковою активнктв, на який подготовлено заявку у Держпатей Украхни. ■'

П. Результати експериментальних дослхджень використанх при П1Дготовцх проекту фарнакопейно! статт1 на комплексний рослиняий засхб з гепатопротекторнов Д1ев, до складу якого входить поропок листкхв бобхвника трилистого.

Основний зыхст дисертацхйно! роботи викладений у наступних публхкацхях:

1. Бензель 1.В., Шаповалова Н.В., Роговська Л.Я. Дослхджен-ня полхфенольних ополук бобхвника трилистого //§армац.журн. -1991. - I 5. - С.7&-79.

2. Шаповалова Н.В., Задна 1.Я., Бензель Л.В. Бобхвник три-, листий - джерело бхолоНчно активних речовин //Фармац.журн. -1594. -I I. - С.65-68.

3. Флавоно1ди бобгвиика трилистого /Н.Шаповалова, Л.Роговсь-ка, Т.Попова, В.Литвиненко //I Конгрес св1Тово! федерацН украТн-ських фармацэвтичних товариств: Тези догюв. - Львгв, 1594. -0.244-245.

4. Вивчення зпливу росдинних екстрактгв на експериментальнг стресовх виразки /Б.Зузук, Л.Роговська, ..., Н.Иаповалова та 1Н. //Там яе. - С.444-445.

5. Шаповалова Н.З., Ладна Л.Я., Бензель Л.В. Розробка рос-линного засобу з гепатозахисними властивостями //Народна I нетра-диц1Йна медицина та лляхи И розвитку: Тези допов.'1 Укра1наько1 конференцт1. - Полтава, 1993. - Т.1. - С.182-183.

6. Шаповалова Н., Рейтер 0. Дослтдження дЛ настой з листов трилистника водяного при над)прн1Й стимуляцт? симпато-адрена-яозо1 систем« //Актуальна проблем» гастроентерологп: Тези догтов. Республ. наук. конф. - Львгв, 1989. - 0.16.

7. Разработка гранул из лиофилизатоз трилистника водяного /Л.Я.Роговская, Н.В.Шаповалова,-Л.В.Бензель, Е.В.Бокпан //Реализация научных достижения в практической фармации: Тез. докл.

Реепубл. научн. конф. - Харьков, 1991. - С.203-204.

8. Противоязвенная активность растительных лиофилизатоз

/Л.3.Бензель, Л.Я.Роговская, ..., Н.З.Иаповалова и др. //Состояние и перспективы развития фармации в Сибири л на Дальнем Востоке: Тез. докл. научн.-практич. конф.,. посвящ. 50-лет. фармацевт, факультета. - Томск, 1991. - Т.1. - С.38-40.

9. Роговская Л.Я., Бензель Л.В., Шаповалова Н.З. Фотохимическое исследование трилистника водяного //Актуальнее вопроса фармацевтической науки и практики: °'ез. докл.. научн.-практич. конф., посвяц. 25-лет. фармацевт, факультета. - Курск, 1991. -Т.1. - С.207-208.

10. Холеретическая активность лиофилизатоа лекарственных

растений /Л.Я.Роговская, М.Д.Литвинчук, Н.В.Шаповалова и др. //Актуальные вопросы хирургической гастроэнтерологии: Тез. докл. научн.-практич. конф. - Курск, 1991. - С.135.

П. Применение растительных лиофидизатов в фармацевтическо! практике /Н.В.Бензель, Л.Я.Роговская, ...,'Н.В.Шаповалова и др. //Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики: Тез. докл. научн.-практич. конф., посеящ. 25-лет. фармацевт. факульт< та. - Курск, ,1991. - ТЛ. - СЛ59-160.

12. Зитарчук М.А., Шаповалова Н.В. Изучение' холеретической активности лиофилизатов трилистника водяного //Тез. докл. хъи-конф. научн. общества. - Вильнюс, 1990. - С.28.

13. Шаповалова Н.В., Сгтарчук М.А. Против11разкова активист бобхвника трилистого //Тези допов. 59 конф. ваукового товарист-ва. - 1вано-5ранк1вськ, Т990. - 3.110.

Шаповалова Н.В. "Ьарнакогностическое исследование трилистника водяного.

Диссертация в виде рукописи на соискание научной степени кандидата фармацевтических наук по специальности 15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия, Львовский государственный медицинский институт, Львов, ISS4.

Проведены систематические фитохнничесхие и фармакологические исследования листьев трилистника водяного, который предлагается в качестве нового растительного средства с гепатопротекторным и противоязвенным действием. *

Shapovalova K.V. The pharnacognostic studies of ilenyanthes trifoliata L.

It. la dissertation in the form of manuscript for seekings scientific degree bachelor of pharmaceutical sciences by ' speciality 15.00.02. - pharmaceutical chemistry and pharmacognozy, Lviv State LTedical Institute, Lviv, 1994.

It was realized, the systesiatic phytocheniical and pharmacological studies of the leaves Kenyanthes trifoliata. L., which is proposed in the capacity of the new plant remedy with hepatite-protective and antiulcerial effect.

Хлючовх слова: 6o6ibhhk трилистий, фармакогностичнг, фгтохемгч-Hj дослгдження, противиразковий заст<3.