Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое исследование Scabiosa comosa Fischer ex Roemer et Schultes и Scabiosa ochroleuca L., произрастающих в Восточной Сибири

На прадйх рую

Крупенникова Виталия Геннадьевна

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ SCABIOSA COMOSA (Fischer ex Roemer et Schultes) И SCABIOSA OCHROLEUCA L. ПРОИЗРАСТАЮЩИХ В ВОСТОЧНОЙ СИБИРИ

; 15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

0031592Э2

Улан-Удэ - 2007

003159292

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию РФ»

Научный руководитель доктор фармацевтических наук, профессор

Федосеева Галина Михайловна

Официальные оппоненты доктор фармацевтических наук

Николаева Галина Григорьевна

Защита состоится 26 октября 2007года в 10 00 часов на заседании диссертационного совета К 003.028 01 при Институте общей и экспериментальной биологии СО РАН

С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке Бурятского научного центра СО РАН Автореферат разослан 25 сентября 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета К 003 028 01 кандидат биологических наук

кандидат фармацевтических наук Шелухеева Марина Геннадьевна

Ведущая организация Всероссийский научно-исследовательский

институт лекарственных растений

В Б Хобракова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы

В настоящее время, несмотря на постоянно растущий ассортимент синтетических лекарственных средств, по-прежнему актуальным является исследование малоизученных отечественных лекарственных растений, разработка и использование лекарственных препаратов на их основе Такая востребованость связана с малой токсичностью, широким спектром терапевтического действия и высокой биологической доступностью фитопрепаратов Пополнение арсенала лекарственных средств растительного происхождения является актуальной проблемой, так как спрос на них стремительно растет

Флора Восточной Сибири богата перспективными лекарственными растениями народной медицины, которые могут быть использованы в медицинской практике после проведения необходимых дополнительных испытаний Среди них особого внимания заслуживают растения, содержащие полифенолы (флавоноиды, антоцианы, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, кумарины и др ) Эти соединения представляют собой довольно широко распространенные в растительном мире биологически активные вещества (БАВ), которые достаточно хорошо изучены в химическом и фармакологическом отношении Но несмотря на то, что арсенал лекарственных препаратов на основе полифенольных соединений на российском рынке довольно распространен, во многих странах продолжаются интенсивные исследования по созданию новых поколений лекарственных средств на их основе

Наше внимание привлекло многолетнее травянистое растение — скабиоза бледно-желтая и скабиоза венечная, которая давно применяется в тибетской медицине как рвотное, жаропонижающее, при болезнях мочевого пузыря, желудка В монгольской медицине как мочегонное и потогонное средство. В народной медицине Сибири отвар травы пьют при респираторных инфекциях, ревматизме и лихорадке Настой травы скабиозы бледно-желтой принимают при болезнях желудка и женских заболеваниях, туберкулезе легких, сифилисе. Цель и задачи исследования

Целью наших исследований явилось обоснование возможности использования надземной части скабиозы венечной в качестве нового вида лекарственного растительного сырья для удовлетворения потребности здравоохранения в лекарственных препаратах, обладающих антиокси-дантным, противовоспалительным, желчегонным и диуретическим действием

Для достижения поставленной цели были определены и решались следующие задачи

1 Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ (БАВ) исследуемых растений и определить их количественное содержание по органам и фазам развития

2 Установить места произрастания и определить ресурсы скабиозы венечной в некоторых районах Иркутской

3 Провести морфологическое исследование скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой и выявить их основные диагностические признаки

4 Разработать рациональную методику количественного определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной

5 Определить показатели и нормы качества сырья скабиозы венечной, разработать нормативную документацию на сырье и инструкцию по его заготовке.

6 Осуществить фармакологическую оценку извлечения из цветков скабиозы венечной, определить их специфическую активность

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Изучены биологически активные вещества надземной части скабиозы венечной Установлено, что в их состав входят дубильные вещества, кумарины, сапонины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты Методом ВЭЖХ в траве скабиозы венечной идентифицировано 13 фенольных соединений Флавоноиды - апигенин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид, гисперидин, фенолкарбоновые кислоты - галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты, кумарины - эскулетин, дигидрокумарин В цветках скабиозы венечной помимо перечисленных веществ, присутствует виценин В траве скабиозы бледно-желтой обнаружены - гисперидин, апигенин, гиперозид, кверцетин, рутин, виценин, робинин, дигидрокумарин, галловая, цикоревая, хлорогеновая, феруловая, кофейная кислоты Изучен состав полисахаридов в обоих видах скабиозы, установлено наличие глюкозы, галактозы В цветках скабиозы венечной с помощью бумажной хроматографии был обнаружен антоциан, который идентифицирован как хризантемин Изучен макро- и микроэлементный состав, который представлен 30 элементами В надземной части обоих видов скабиозы кроме фосфора, магния, кальция, кремния, которые преимущественно накапливают все растения, в больших количествах присутствуют хром, молибден, медь, никель и в наименьших - натрий, железо, ванадий

Осуществлены ресурсные исследования скабиозы венечной в некоторых районах Иркутской области, выявлены места произрастания, определены запасы сырья Интродукционные исследования позволили прогнозировать выращивание этого вида в условиях культуры

Проведено морфологическое исследование скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой и выявлены их основные диагностические признаки.

Разработана методика дифференциального спектрофотометриче-ского определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной в пересчете на рутин.

Проведена стандартизация сырья скабиозы с учетом современных требований, предъявляемых к подлинности и качеству лекарственного растительного сырья Разработан проект ФС «Скабиозы венечной цветки» и инструкция по заготовке сырья

Практическая значимость результатов исследования На основе проведенных исследований разработаны показатели и нормы качества сырья - цветков скабиозы венечной Определены диагностические особенности и предложены методики качественного и количественного анализа полифенольных соединений с использованием методов бумажной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и УФ-спектрофотометрии Проведены ресурсные исследования в некоторых районах Иркутской области Разработана методика дифференциального спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной в пересчете на рутин Установлены оптимальные сроки заготовки сырья Выявлена возможность использования надземных органов скабиозы венечной в качестве нового сырьевого источника антиоксидантных, желчегонных и мочегонных препаратов Внедрение результатов исследования в практику Материалы диссертационной работы включены в методическое пособие для интернов «Микродиагностика лекарственных растений народной медицины Восточной Сибири» и внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии ИГМУ (акт внедрения от 14 09 07) По результатам исследований разработан проект ФС «Скабиозы венечной цветки» и инструкция по заготовке сырья

Апробация и публикации результатов исследования Основные положения диссертационной работы доложены и-обсуждены на Международной научно-практической конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета ДВГМУ «Фармация на рубеже третьего тысячелетия» (Хабаровск 2005), на ежегодных научных конференциях ИГМУ (2004 - 2006) По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Иркутского государственного медицинского университета ИГМУ по программе «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока», являющейся разделом (6 3) Государственной программы «Сибирь» (номер государственной регистрации 01 2 00304320)

Основные положения, выносимые на защиту:

• данные фитохимического исследования надземной части видов скабиозы,

• итоги интродукционных и ресурсоведческих исследований скабиозы венечной в районах Иркутской области,

• результаты анатомо-диагностического исследования скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой,

• методики анализа и нормы качества по основным биологически активным веществам на предлагаемое растительное сырье

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 33 таблицы, 27 рисунков, 26 фотографий, состоит из «Введения», «Обзора литературы», 4 глав собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 123 источников литературы, в том числе 26 на иностранных языках, и приложений

Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы

Первая глава посвящена обзору отечественной и зарубежной литературы по современному состоянию исследований скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой, обобщены и систематизированы сведения по изучению химического состава, применению в традиционной и народной медицине

Во второй главе приведены сведения о материалах и методах исследования

В третьей главе представлены экспериментальные данные по фи-тохимическому исследованию основных групп БАВ скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой и их количественному содержанию по органам и фазам развития

Четвертая глава посвящена установление ресурсного потенциала исследуемых растений и-изучению анатомо-диагностических признаков

В пятой главе приведены результаты определения показателей качества лекарственного растительного сырья «Скабиозы венечной цветки»

Приложение включает результаты фармакологического изучения скабиозы венечной, инструкцию по заготовке цветков скабиозы венечной и проект ФС «Скабиозы венечной цветки»

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектами исследования служили листья, цветки скабиозы венечной и трава скабиозы бледно-желтой, заготовленные в течении 20022006 годов в различных районах Иркутской области Лекарственное растительное сырье собирали в различные фазы вегетации в соответствии с требованиями нормативной документации

Для исследования качественного состава изучаемых объектов использовали различные методы и приемы фитохимического анализа хро-матографические (ВЭЖХ, хроматография в тонком слое сорбента (ТСХ), бумажная (БХ), колоночная хроматография), методы избирательной экстракции различными растворителями, физико-химические методы (спек-трофотометрия, фотоэлектроколориметрия), титриметрические и другие классические методы В качестве экстрагентов использовали воду, нагретую до температуры 60°С и 98-100 °С, этанол 40 %, 50 %, 60 %, 70 % и 96%

Природа антоциана устанавливалась методом бумажной хроматографии в системах растворителей кислота уксусная - кислота хлороводородная - вода (3 1 8), кислота уксусная - кислота хлороводородная -вода (30 3 10), кислота уксусная - кислота хлороводородная - вода (15 3 85), флавоноидов и фенолкарбоновых кислот - 2 % кислота уксусная; 15 % кислота уксусная, н-бутанол - кислота уксусная - вода (4 1 2) В ТСХ использовали пластинки «Silufol» и систему растворителей хлороформ-этанол (3 1)

Анализ с помощью метода ВЭЖХ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы « GILSTON», модель 305, Франция, инжектор ручной, модель RHEODYNE 7125 USA с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы Мультихром для «Windows» В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка размером 4,6x250 мм PLATINUM EPS С 18 100, размер частиц 5 микрон В качестве подвижной фазы метанол-вода-фосфорная кислота концентрированная, в соотношении 400 600 5 Параллельно с испытуемым раствором вводили в хроматограф 0,05% растворы стандартных образцов веществ свидетелей' рутина, квер-цетина, лютеолина-7-гликозида, гиперозида, галловой кислоты, кофейной кислоты, хлорогеновой кислоты, цикориевой кислоты, гисперидина, апи-генина, феруловой кислоты, виценина, витексина, 4-оксикумарина, роби-нина, умбеллиферона, эскулетина Анализ проводили при комнатной тем-

пературе. Скорость подачи элюента 0,5 мл\мин. Продолжительность анализа 60 мин. Детектирование проводилось с помощью УФ-детекгора «G1LSTON» UVWIS модель 15 К при длине волны 254 нм.

Для морфологического анализа растений, образцы сырья рассматривали невооруженным глазом и под лупой с десятикратным увеличением, Для объектов проводили несколько измерений, затем рассчитывали среднее значение. Микроскопическое исследование надземных и подземных органов видов скабиозы проводили следующим образом. Подземные органы предварительно размачивали в смеси вода - глицерин -этанол (1:1:1). Затем проводили мацерацию объекта в 5% растворе натрия гидроксида. Готовые препараты фиксированныго материала фотографировали фотоаппаратом Nicon на черно-белую пленку Kodak pro 400 BW через бинокулярный микроскоп, фотоувеличение xiGO, х200.

В основе экспериментальной работы по определению ресурсов использовали методические указания, составленные А.И. Шретером, И.Л. Крыловой. Определение запасов сырья проводили на конкретных зарослях а фазу цветения растения.

Фитохимическое исследование скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой Наличие флавоноидов определяли с помощью качественных реакций и хроматографического анализа (БХ). Дубильные вещества идентифицировали в водном извлечении с помощью качественных реакций.

Методом ВЭЖХ изучен качественный и количественный состав фенолъных соединений. Результаты приведены в таблице I.

Рисунок 2 - Хроматограмма извлечения (спирт этиловый 70 %) из цветков скабиозы венечной

Таблица 1 - Фенольные соединения цветков скабиозы венечной, идентифицированные методом ВЭЖХ

Груш ¡а Б А В Идентифицированные вещества Содержание веществ в выделенной смеси, %

Флайоноиды йиденин 11,®

гисперидин 10,36

ап иге нии 0,73

пшерозид 0,19

рутин 9,41

л ютео л и н-7 - гл и ко з ид 2,28

робинии 11,07

витексин 2,90

Фснолкарбоновыс кислоты галловая кислота 2,80

хлорогеновая кислота 6,78

феруловая кислота 5,98

Кумарины эскулетин 4,80

дигидрокумарин 1,22

■¡ж - —у

Рисунок 3 - Хромато грамма извлечения (спирт этиловый 70 %) из Листьев скабиозы венечной

Таблица 2 - Фенольные соединения листьев скабиозы венечной, идентифицированные методом ВЭЖХ

Группа КАВ Идентифицированные вещества Содержание веществ в выделенной смеси, %

Флавоиоиды виценин 15,72

гисперидин 15,46

апигенин 5,39

гиперозид 4,73

рутин 1,29

робинии 0,34

Фенолкарбоновые ки- СЛОТЬ! галловая кислота 3,59

хлорогеновая кислота 8,64

кофейная кислота 19,83

ферул оная кислота 14,24

Кумарины эскулетии 8,49

ди г идрокумарин 2,29

травы скабиозы бледно-желтой

Таблица 3 - Фенольные соединения травы скабиозы бледно-желтой, идентифицированные методом ВЭЖХ

Группа БАВ Идентифицированные вещества Содержание веществ в выделенной смеси, %

Флавоноиды виценин 10,71

гисперидин 9,24

апигенин 3,39

гиперозид 4,46

рутин 10,23

робинин 4,96

кверцетин 0,26

Фенолкарбоновые кислоты галловая кислота 6,07

хлорогеновая 16,14

кофейная кислота 11,27

цнкоревая кислота 7,76

феруловая кислота 5,06

Кумарины дигидрокумарин 5,90

Антоцианы изучали с помощью качественных реакций и хроматографии на бумаге в различных системах растворителей (таблица 4)

Таблица 4 - Данные по хроматографическому исследованию антоциа-нов цветков скабиозы венечной

Системы Экспериментальная величина Литературные данные

кислота уксусная — кислота хлороводородная -вода (3 1 8) 0 36 0 36

кислота уксусная -кислота хлороводородная -вода (30 3 10) 0 60 0 60

кислота уксусная -кислота хлороводородная -вода (15 3 85) 0 27 0 26-0 27

Исследуемый нами антоциан идентичен цианидин - 3- моноглю-козиду (хризантемину)

Углеводы идентифицировали в водном извлечении с помощью качественных реакций Методом бумажной хроматографии с использованием стандартных образцов веществ свидетелей идентифицирован моно-сахаридный состав, который представлен глюкозой, галактозой

В надземных частях указанных растений и в почве было обнаружено 30 элементов Для установления избирательной поглотительной способности элементов органами двух видов растений были определены средние значения коэффициентов биологического поглощения (КБП) Если средние величины КБП элементов надземной части скабиозы венечной расположить в порядке их убывания, то получается следующий ряд' Р(470) > Mg(26 8)> Мо(8 9)> Са(5)> Sn(l 08)> Cu(l 01)> Nb(0 95)> Ва(0 93)> La(0 75)> Zn(0 66)> Cr(0 64)> Ni(0 58) > Ве(0 42) > УЬ(0 40) > Ga(0 39) > Ti(0 30) > Pb(0 30) > Si(0 25) > Мп(0 23) > Zr(0 23) > A1(0 21) > V(0 14) > Fe(0 04) > Na(0 005), а для надземной части скабиозы бледно-желтой Р(500) > Мо(10) > Са(5 8) > Sn(l 88) > Zn(0 66) > Mg(l 25) > Nb(l 0) > La(0 75) > Ga(0 67) > Pb(0 67) > Be(0 33) > Cr(0 33) > Ni(0 33) > Cu(0 54) > Ba(0 52) > Yb(0 38) > Si(0 30) > Ti(0 25) > A1(0 18) > Zr(0 15) > Mn(0 12) > V(0 09) > Fe(0 03) > Na(0 008)

Эти ряды позволяют сделать вывод о том, что в надземной части обоих видов скабиозы кроме фосфора, магния, кальция, кремния, которые преимущественно накапливают все растения, в больших количествах содержатся, в частности, молибден, медь, хром, никель и в наименьших -натрий, железо, ванадий.

Определение количест венного содержания биологически активных веществ в различных органах скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой

Для более полного представления о химическом составе изучаемых видов растений нами было предпринято количественное определение основных групп БАВ в цветках, листьях скабиозы венечной и траве скабиозы бледно-желтой Количественная оценка химического состава двух видов скабиозы проводилась по сумме полифенолов, флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот, антоцианов Результаты сравнительного анализа представлены в таблице 5

Таблица 5 - Количественное содержание основных групп БАВ в различных органах скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой

Вид сырья БАВ Метод определения Количественное содержание, (Х± ДХ)

Цветки скабиозы венечной Сумма полифе-нольных соединений Перманганатометрический 8,73 ± 0,08

ФлавОноиды Дифферинциальная УФ-спектрофотометрия 4,05 ±0,16

Дубильные вещества Перманганагометрический 1,99 ±0,06

Фенолкарбоновые кислоты Хроматроспектрофотометрии 0,75 ± 0,03

Антоцианы Фотоэлектроколориметрический 1,95 ± 0,05

Листья скабиозы венечной Сумма полифе-нольных соединений Перманганатометрический 5,14 ±0,14

Флавоноиды Дифферинциальная У Ф-спектрофо гометрия ' 1,92 ±0,05

Дубильные вещества Перманганатометрический 2,65 ± 0,07

Фенолкарбоновые кислоты Хроматроспектрофотометрии 0,31 ±0,01

Трава скабиозы бледно-желтой Сумма полифе-нольных соединений Перманганатометрический 6,56 ± 0,01

Флавоноиды Дифферинциальная УФ-спектрофотометрия 3,58 ± 0,08

Дубильные вещества Перманганатометрический 2,12 ±0,07

Фенолкарбоновые кислоты Хроматроспектрофотометрии 0,16 ±0,01

Из представленных данных следует, что в количественном соотношении биологически активные комплексы двух видов скабиоз близки Фактические различия отмечены для фенолкарбоновых кислот Полученные результаты свидетельствуют о том, что наибольшее количество БАВ накапливается в цветках скабиозы венечной

Разработка показателей качества цветков скабиозы венечной

Проведенный качественный и количественный анализ скабиозы венечной позволил рекомендовать в качестве сырья у исследуемого растения - цветки

Для исключения ошибок при заготовке цветков скабиозы венечной проведено сравнительное изучение основных характеристик морфологических признаков со сходными видами. Анализ совокупности морфологических признаков скабиозы венечной и их систематизация позволили описать внешние признаки сырья цельные или частично осыпавшиеся корзинки диаметром до 5см, без цветоносов или с остатками цветоносов диной не более 3 см Листочки обвертки 0,7-1,5 см длиной, линейные, заостренные, зеленые, прижато коротко волосистые Прицветные чешуйки до 6 мм длиной, прижато опушенные и реснитчатые Венчики краевых цветков длинной до 2 см, неправильно двугубые, с увеличенной средней лопастью нижней губы, бесполые Срединные - обоеполые, длинной 0,5-0,7 см, от середины к основанию суженные Цвет сине-фиолетовый Запах сильный, ароматный Вкус слегка пряный

Для внедрения нового вида лекарственного растительного сырья в медицинскую практику необходима разработка нормативной документации, одним из разделов которой должна быть «Микроскопия» В связи с этим проведено анатомическое изучение скабиозы венечной

Установлено, что клетки эпидермиса венчика с обеих сторон со-сочковидные (фото 3) с сильноизвилистыми боковыми стенками Встречаются устьица и волоски двух типов простые одноклеточные с узкой полостью (фото 1) и головчатые, с одноклеточной ножкой и многоклеточной обрат нояйцевидной головкой Клетки эпидермиса чашелистика (фото 4) продолговато-прямоугольной формы, стенки клеток четковидно утолщенные В многоклеточных чешуйках много друз оксалата кальция, располагающиеся вдоль главной жилки (фото 2) Волоски на чашелистиках -простые, грубобородавчатые (щетинистые) с расширенным основанием, сосредоточены в верхней части Клетки эпидермиса листочка обвертки с многоугольными прямыми четко видно утолщенными стенками Имеются волоски двух типов простые грубобородавчатые и головчатые с многоклеточной головкой и короткой одно - двухклеточной ножкой

Фото 1. Скабиоза венечная. Фрагмент эпидермиса венчика. Жилка, простые волоски, друзы. Увел, х200.

Фото 3. Скабиоза венечная. Участок эпидермиса лепестка. Клетки сосочковидные. Простые и головчатые волоски. Увел. х200

Фото 2. Скабиоза венечная. Фрагмент чашелистика Друзы. Увел. хЮО.

Фото 4. Скабиоза венечная. Участок эпидермиса чашелистика. Устьица, головчатые и простые волоски, Увел. хЮО.

Разработка методик количественного определения БАВ в цветках скабиозы венечной

Учитывая тот факт, что биологическая активность цветков скабиозы венечной обусловлена в значительной мере гюлифепольными соединениями, представляется целесообразным проводить стандартизацию сырья по содержанию суммы антоцианов и флавоноидов. Количественное определение флавоноидов проводили методом дифференциальной спек* трофотом етрии по реакции ко м п л с кс о о б р азо в ан и я с алюминия хлоридом. Исследование компонентного состава выявило, что преобладающим фла-воноидным соединением скабиозы венечной является рутин, государственный стандартный образец (ГСО) которого выпускается в нашей стране, послужило основанием для использования его при разработке методи-

ки Спектры поглощения продуктов реакции спиртовых извлечений из цветков скабиозы венечной и PCO рутина с хлоридом алюминия совпадали, максимум поглощения находится при длине волны 410 нм При изучении оптимальных условий экстракции установлено, что наиболее полное извлечении флавоноидов достигается при измельчении сырья 1 мм, экстрагированием спиртом этиловым 70 % при соотношении сырья и экстра-гента 1 100 путем экстракции в течении 45 минут На основе полученных данных было установлено содержание флавоноидов в сырье, которое составило 4,05 ±0,16 Полученные данные подвергали статистической обработке (таблица 6)

Таблица 6 - Метрологические характеристики результатов количественного определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной

п f X S S Р t(p,f) Ах £

5 4 4,05 0,0176 0,1326 95 2,78 0,16 4,07

Количественное определение антоцианов в цветках скабиозы венечной было определено фотоэлектроколориметрическим методом и составило 1,95 ± 0,05 Полученные данные подвергали статистической обработке (таблица 7).

Таблица 7 - Метрологические характеристики результатов количественного определения антоцианов в цветках скабиозы венечной

п f X S2 S Р t(p,f) Дх £

5 4 1,95 0,0017 0,0416 95 2,78 0,05 2,65

Для определения оптимальных сроков заготовки сырья нами исследовалась динамика накопления БАВ в цветках скабиозы венечной Образцы, собранные в разные фазы развития анализировались на содержание антоцианов и флавоноидов, как основных действующих веществ изучаемого растения Результаты эксперимента представлены в таблице 8

Таблица 8 - Динамика накопления БАВ в цветках скабиозы венечной

Фаза вегетации Содержание БАВ

антоцианов, % флавоноидов, %

Бутонизация 0,93 2,97

Начало цветения 1,14 3,36

Массовое цветение 1,91 4,21

Начало образования плодов 1,73 3,12

На основании полученных результатов мы рекомендовали срок заготовки сырья в фазу массового цветения

Ресурсно-интродукционные исследования скабиозы венечной на территории некоторых районов Иркутской области

Для сбора цветков скабиозы венечной нами на протяжении 3 лет были проведены экспедиционные обследования некоторых районов Иркутской области, в которых были выявлены участки дикорастущих зарослей скабиозы венечной, определены запасы и возможные ежегодные заготовки Проведенные интродукционные исследования позволили прогнозировать выращивание этого вида в условиях культуры

По данным трехлетних фенологических наблюдений построен фенологический спектр скабиозы венечной отражающий сезонное развитие растения то начала вегетации до фазы полного отмирания растения (рисунок 1) Для проведения фенологических наблюдений и выявления биологических особенностей произрастания, посадочный материал (корневище с корнями) скабиозы венечной заготавливался в различных местах естественного произрастания Отбор посадочного материала проводили в осенний период В эксперименте была установлена перспективность вегетативного размножения и целесообразность культуры скабиозы венечной с целью заготовки сырья без ущерба для ее природных популяций

май июнь июль август сентябрь

Примечание 1ЛДЛ1 - бутонизация, 1 ^^ - вегетация, 1114 !!■ II - цветение, ^<'^^ - плодоношение,

Рисунок 1 - Феноспектры и график роста генеративных побегов скабиозы венечной

Разработка нормативной документации на сырье «Скабиозы венечной цветки».

Результаты фитохимического и анатомо-диагностического исследования скабиозы венечной послужили основой для создания нормативной документации проекта ФС «Скабиозы венечной цветки» и инструкции по заготовке сырья. При разработке норм качества проведен анализ образцов сырья из различных мест произрастания Показатели качества цветков скабиозы венечной представлены в таблице 9

Таблица 9 - Нормы качества сырья (цветки) скабиозы венечной

Показатели Методы Нормы

Внешние признаки Визуально Цельные или частично осыпавшиеся корзинки диаметром до 5см, без цветоносов или с остатками цветоносов диной не более 3 см Листочки обвертки 0,7-1,5 см длиной, линейные, заостренные, зеленые, прижато коротко волосистые Прицветные чешуйки до 6 мм длиной, прижато опушенные и реснитчатые Венчики краевых цветков длинной до 2 см, неправильно двугубые, с увеличенной средней лопастью нижней губы, бесполые Срединные -обоеполые, длинной 0,5-0,7 см, от середины к основанию суженные Цвет сине-фиолетовый Запах сильный, ароматный Вкус слегка пряный

Микроскопия Микроскопия Клетки эпидермиса венчика с обеих сторон со-сочковидные с силыюизвилистыми боковыми

стенками, встречаются устьица и волоски двух типов простые одноклеточные с узкой полостью и головчатые, с одноклеточной ножкой и многоклеточной головкой Клетки эпидермиса чашелистика продолговато-прямоугольной формы, стенки клеток четковид-но утолщенные В многоклеточных чешуйках мнет о друз оксалата кальция, располагающиеся вдоль главной жилки Волоски на чашелистиках - простые, грубобородавчатые сосредоточены в верхней части

Подлинность - анто цианы - флавоноиды Обработка парами аммиака ТСХ в сисгеме хлороформ-этанол (3 1) Ярко-синяя окраска Оранжевые пятна флавоноидов от 3 до 5

Количественное определение - флавоноиды - антоцианы Спектрофото-метрия Фотоэлектро колориметрия Не менее 3,51 % Не менее 1,62 %

Влажность ГФХ1, вып 1,с 285 Не более 14%

Золы общей ГФ XI, вып 2, с 24 Не более 9 %

Золы, нерастворимой в 10 % растворе кисло-гы хлороводородной ГФХ1, вып 2, с 25 Не более 3 %

Листьев, стеблей, корзинок с остатками цветоносов длиннее 3 см ГФХ1, вып 1, с 276 Не более 6 %

Цветки, потерявшие естественную окраску ГФХ1, вып 1, с 276 Не более 8 %

Органической примеси ГФХ1, вып 1, с 276 Не более 0,5 %

Минеральной примеси ГФ XI, вып 1, с 276 Не более 0,5 %

Экспериментально установлено, что извлечение из цветков скабиозы венечной обладает выраженной антиоксидантной и антирадикальной активностью, оказывает стимулирующее влияние на синтез и выделение с желчью желчных кислот, вызывает повышение диуреза, что свидетельствует о ее мочегонном действии, повышает устойчивость мембран и обладает умеренньщ противоспалительным действием

Общие выводы

1 Установлено содержание суммы полифенолов, флавоноидов, фе-нолкарбоновых кислот и дубильных веществ в надземных органах скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой Методом ВЭЖХ в листьях скабиозы венечной идентифицировано 13 фенольных соединений Флаво-ноиды - апигенин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид, гисперидин, фенол-карбоновые кислоты - галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты; кумарины - эскулетин, дигидрокумарин В цветках скабиозы венечной помимо перечисленных веществ, присутствует виценин В траве скабиозы бледно-желтой обнаружены флавоноиды - гисперидин, апигенин, гиперозид, кверцетин, рутин, виценин, робинин, кумарин - дигидрокумарин, фенолкарбоновые кислоты - галловая, цикоревая, хлорогеновая, феруловая, кофейная кислоты Изучен состав углеводов в обоих видах скабиозы, установлено наличие глюкозы, галактозы Определен элементный состав

2 На основании морфологических исследований двух видов скабиоз выявлены основные микроскопические признаки (характер клеток эпидермиса, тип устьичного аппарата, строение волосков, включений оксала-та кальция), дающие возможность проводить диагностику сырья

3 Проведены ресурсные исследования в некоторых районах Иркутской области, выявлены места произрастания скабиозы венечной, определены запасы сырья

4 Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной в пересчете на рутин с использованием дифференциальной спектрофотомерии Изучена динамика накопления БАВ в цветках скабиозы венечной и установлены оптимальные сроки заготовки сырья

5 'Проведена стандартизация сырья (цветки) скабиозы венечной Определены показатели подлинности и качества сырья диагностические признаки, содержание флавоноидов (не менее 3,51 %) , антоцианов (не менее 1,62 %) и товароведческие показатели

6 Разработан проект ФС «Скабиозы венечной цветки» и инструкция по заготовке сырья

7 Установлено, что извлечение из цветков скабиозы венечной проявляет антирадикадьную активность, мембраностабилизирующее, желчегонное и мочегонное действие

Список публикации по теме диссертации

1. Микроскопические признаки и микроэлементный состав скабиозы венечной // Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств Материалы докладов международной научно-практич конф -Томск, 2000 - С 53 (соавт Федосеева Г М, Анцупова Т П, Ендоно-ваГБ)

2 Микроскопическое исследование надземных и подземных органов скабиозы венечной // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции Сборник науч трудов - Пятигорск, 2004 - Вып 59 - С. 28-32 (соавт Федосеева Г М , Бочарова Г И )

3 Исследование полифенольного комплекса скабиозы венечной // Фармацевтической службе Республики Бурятия 80 лет Материалы юбилейной научно-практич конф - Улан-Удэ, 2004 - С 99-102 (соавт Федосеева Г М )

4 Исследование микроэлементного состава скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой // Естествознание и гуманизм- Сборник науч трудов - Томск 2005 - Т 2 №5 - С 58 (соавт Федосеева Г М , Анцупова Т П , Ендонова Г Б )

5 Фармакогностическое исследование скабиозы венечной // Фармация на рубеже третьего тысячелетия материалы научно-практич конф посвященной 40-летию фармацевтического факультета ДВГМУ -Хабаровск, 2005 - С 26-28 (соавт Федосеева Г М )

6 Фитохимическое исследование скабиозы венечной // Сибирский медицинский журнал - Иркутск, 2006 - № 4 - С 65-67 (соавт Федосеева Г М )

7 Фенолкарбоновые кислоты скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой // Сибирский медицинский журнал - Иркутск, 2007 - № 4 -С 48-50 (соавт ФедосееваГМ)

8 Антоцианы скабиозы венечной // Сибирский медицинский журнал -Иркутск, 2007 -№5 -С 69-71 (соавт ФедосееваГМ)

Подписано в печать 25 09 2007г Формат 60x84 1/ 16 Бумага офсетная Объем 1,3 печ л Тираж 100 Заказ №48

Отпечатано в типографии Изд-ва БНЦ СО РАН 670047 г Улан-Удэ, ул Сахьяновой, 6

Актуальность темы

В настоящее время, несмотря на постоянно растущий ассортимент синтетических лекарственных средств, по-прежнему актуальным является исследование малоизученных отечественных лекарственных растений, разработка и использование лекарственных препаратов на их основе. Такая востребованость связана с малой токсичностью, широким спектром терапевтического действия и высокой биологической доступностью фитопрепаратов. Пополнение арсенала лекарственных средств растительного происхождения является актуальной проблемой, так как спрос на них стремительно растет.

Флора Восточной Сибири богата перспективными лекарственными растениями народной медицины, которые могут быть использованы в медицинской практике после проведения необходимых дополнительных испытаний. Среди них особого внимания заслуживают растения, содержащие полифенолы (флавоноиды, антоцианы, фенолкарбоновые кислоты, дубильные вещества, кумарины и др.). Эти соединения представляют собой довольно широко распространенные в растительном мире биологически активные вещества (БАВ), которые достаточно хорошо изучены в химическом и фармакологическом отношении. Но несмотря на то, что арсенал лекарственных препаратов на основе полифенольных соединений на российском рынке довольно распространен, во многих странах продолжаются интенсивные исследования по созданию новых поколений лекарственных средств на их основе.

Наше внимание привлекли многолетние травянистые растения -скабиоза бледно-желтая и скабиоза венечная, которые применяются в тибетской медицине как рвотное, жаропонижающее, при болезнях мочевого пузыря, желудка. В монгольской медицине - как мочегонное и потогонное средство. В народной медицине Сибири отвар травы пьют при респираторных инфекциях, ревматизме и лихорадке. Настой травы скабиозы бледно-желтой принимают при болезнях желудка и женских заболеваниях, туберкулезе легких, сифилисе.

Цель и задачи исследования

Целью наших исследований явилось обоснование возможности использования надземной части скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой в качестве новых видов лекарственного растительного сырья для удовлетворения потребности здравоохранения в лекарственных препаратах, обладающих антиоксидантным, противовоспалительным, желчегонным и диуретическим действием.

Для достижения поставленной цели были определены и решались следующие задачи:

1. Изучить химический состав основных групп биологически активных веществ исследуемых растений и определить их количественное содержание по органам и фазам развития.

2. Установить места произрастания и определить ресурсы скабиозы вене шой в некоторых районах Иркутской области.

3. Провести морфологическое исследование скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой, выявить их основные диагностические признаки.

4. Разработать рациональную методику количественного определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной.

5. Определить показатели и нормы качества сырья скабиозы венечной, разработать нормативную документацию на сырье и инструкцию по его заготовке.

6. Осуществить фармакологическую оценку извлечения из цветков скабиозы венечной, определить их специфическую активность.

Научная новизна и теоретическая значимость работы

Изучены биологически активные вещества надземной части скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой. Установлено, что в их состав входят дубильные вещества, кумарины, сапонины, флавоноиды, фенолкарбоновые кислоты. Методом ВЭЖХ в листьях скабиозы венечной идентифицировано

13 фенольных соединений. Флавоноиды - апигенин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид, гесперидин; фенолкарбоновые кислоты - галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты; кумарины - эскулетин, дигидрокумарин. В цветках скабиозы венечной помимо перечисленных веществ, присутствует виценин. В траве скабиозы бледно-желтой обнаружены - гесперидин, апигенин, гиперозид, кверцетин, рутин, виценин, робинии, дигидрокумарин, галловая, цикоревая, хлорогеновая, феруловая, кофейная кислоты. Изучен состав углеводов в обоих видах скабиозы, установлено наличие глюкозы, галактозы. В цветках скабиозы венечной с помощью бумажной хроматографии обнаружен антоциан, который идентифицирован как хризантемин. Изучен макро- и микроэлементный состав растений, который представлен 30 элементами. В надземной части обоих видов скабиозы кроме фосфора, магния, кальция, кремния, которые преимущественно накапливают все растения, в больших количествах присутствуют хром, молибден, медь, никель и в наименьших — натрий, железо, ванадий.

Осуществлены ресурсные исследования скабиозы венечной в некоторых районах Иркутской области, выявлены места произрастания, определены запасы сырья. Интродукционные исследования позволили прогнозировать выращивание этого вида в условиях культуры.

Проведено микроскопическое исследование скабиозы венечной и скаб юзы бледно-желтой, выявлены их основные диагностические признаки.

Разработана методика дифференциального спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной в пересчете на рутин.

Проведена стандартизация сырья скабиозы с учетом современных требований, предъявляемых к подлинности и качеству лекарственного растительного сырья. Разработан проект ФС «Скабиозы венечной цветки» и инструкция по заготовке сырья.

Практическая значимость результатов исследовании

На основе проведенных исследований разработаны показатели и нормы качества сырья - цветков скабиозы венечной. Определены диагностические особенности и предложены методики качественного и количественного анализа полифенольных соединений с использованием методов бумажной хроматографии, высокоэффективной жидкостной хроматографии и УФ-спектрофотометрии. Проведены ресурсные исследования в некоторых районах Иркутской области. Разработана методика дифференциального спектрофотометрического определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной в пересчете на рутин. Установлены оптимальные сроки заготовки сырья. Выявлена возможность использования надземных органов скабиозы венечной в качестве нового сырьевого источника антиоксидантных, желчегонных и мочегонных препаратов.

Внедрение результатов исследования в практику

Материалы диссертационной работы включены в методическое пособие для интернов «Микродиагностика лекарственных растений народной медицины Восточной Сибири» и внедрены в учебный процесс кафедры фармакогнозии ИГМУ (акт внедрения от 14.09.07). По результатам исследований разработан проект ФС «Скабиозы венечной цветки» и инструкция по заготовке сырья.

Анробацня и публикации результатов исследования

Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на Международной научно-практической конференции «Поиск, разработка и внедрение новых лекарственных средств и организационных форм фармацевтической деятельности» (Томск, 2000); научно-практической конференции, посвященной 40-летию фармацевтического факультета ДВГМУ «Фармация на рубеже третьего тысячелетия» (Хабаровск 2005); на ежегодных научных конференциях ИГМУ (2004 - 2006). По материалам диссертации опубликовано 8 работ, из них 3 статьи - в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.

Связь задач исследования с проблемами фармацевтических наук

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Иркутского государственного медицинского университета ИГМУ по программе: «Лекарственные растения Сибири и Дальнего Востока», являющейся разделом (6.3) Государственной программы «Сибирь» (номер государственной регистрации 01.2.00304320).

Основные положения, выносимые на защиту:

• данные фитохимического исследования надземной части видов скабиозы;

• итоги интродукционных и ресурсоведческих исследований скабиозы венечной в районах Иркутской области;

• результаты анатомо-диагностического исследования скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой;

• методики анализа и нормы качества по основным биологически активным веществам на предлагаемое растительное сырье.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. Установлено содержание суммы полифенолов, флавоноидов, фенолкарбоновых кислот и дубильных веществ в надземных органах скабиозы венечной и скабиозы бледно-желтой. Методом ВЭЖХ в листьях скабиозы венечной идентифицировано 13 фенольных соединений. Флавоноиды -апигенин, лютеолин-7-гликозид, гиперозид, гесперидин; фенолкарбоновые кислоты - галловая, хлорогеновая, кофейная, феруловая кислоты; кумарины — эскулетин, дигидрокумарин. В цветках скабиозы венечной помимо перечисленных веществ, присутствует виценин. В траве скабиозы бледно-желтой обнаружены флавоноиды - гесперидин, апигенин, гиперозид, кверцетин, рутин, виценин, робинин; кумарин - дигидрокумарин; фенолкарбоновые кислоты - галловая, цикоревая, хлорогеновая, феруловая, кофейная кислоты. Изучен состав углеводов в обоих видах скабиозы, установлено наличие глюкозы, галактозы. Определен элементный состав.

2. На основании микроскопических исследований двух видов скабиоз выявлены основные диагностические признаки (характер клеток эпидермиса, тип устьичного аппарата, строение волосков, включений оксалата кальция), дающие возможность проводить диагностику сырья.

3. Проведены ресурсные исследования в некоторых районах Иркутской области, выявлены места произрастания скабиозы венечной, определены запасы сырья.

4. Разработана методика количественного определения суммы флавоноидов в цветках скабиозы венечной в пересчете на рутин с использованием дифференциальной спектрофотомерии. Изучена динамика накопления БАВ в цветках скабиозы венечной и установлены оптимальные сроки заготовки сырья.

5. Проведена стандартизация сырья (цветки) скабиозы венечной. Определены показатели подлинности и качества сырья: диагностические признаки, содержание флавоноидов (не менее 3,51 %) , антоцианов (не менее 1,62 %) и товароведческие показатели.

6. Разработан проект ФС «Скабиозы венечной цветки» и инструкция по заготовке сырья.

7. Установлено, что извлечение из цветков скабиозы венечной проявляет антирадикальную активность, мембраностабилизирующее, желчегонное и мочегонное действие.