Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Фармакогностическое исследование полыни серой как возможного источника антимикробных средств

РГБ ОД

2 к СРН 1995 МИНИСТЕРСТВО

ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ БАШКИРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи

ЗАРУБИНА ЛАРИСА АЛЕКСАНДРОВНА

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛЫНИ СЕРОЙ КАК ВОЗМОЖНОГО ИСТОЧНИКА АНТИМИКРОБНЫХ СРЕДСТВ

15.00.02- фармацевтическая химия и фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Уфа - 1995

Работа йыдоднсн» .-в Сиблр&ком медицинском университете

Научный руководитель

- ,кандидат фармацевтических наук,

доцент ГМ. КДЛИНКИНА

- кандидат .биологических иаук.

Л Л. коси иинА

Научный консудьвдгг

Официальные оппоненты - доктор фармацевтических наук.

профессор р.А. КУРКИ Н

- кандидат фармацевтических наук, доцент ФА ШИУЛЛИН

Ведущее учреждение

Пермский медицинский институт

СО

Зашита состоится

часов на

заседании Диссертационного Совета К 0S4.3S.02 при Башкирском 1 дрударственноы медицинском институте по адресу: 450025, г.Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Башкиррсрго государственного медицинского института.

Автореферат разооан

Ученый секретарь Диссертационного Совета, доктор ысмцлцских наук Э.Г. Даилегов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Широгое использование антибиотиков и сульфаниламидных препаратов привело к повышению эффективности лечения инфекционных заболеваний. Однако, антибиотикотерапия имеет ряд негативных последствий: у патогенных микроорганизмов отмечается возрастание лекарственной резистентности; у больных, принимающих антибиотики, снижается иммунологическая реактивность, возникает ряд побочных явлений (аллергические реакции, интоксикация и т.д.); нарушается сложившийся в организме человека баланс микрофлоры, выполняющий барьерные функции.

Одним из путей решения данной проблемы является использование препаратов растительного происхождения. Преимущества препаратов данной группы перед антибиотиками микробного происхождения заключается в действии на полирезистентные штаммы грамположлтельных и грамотрнцательных бактерий, благоприятном влиянии на неспсцифическую резистентность макроорганизма, их противовоспалительном и регеиирирующем действии. В связи с этим особенно перспективно применение препаратов растительного происхождения для лечения хронических заболеваний, преобладающих в современной патологии.

Особый интерес в плане поиска антимикробных веществ представляют эфирномасличные растения, среди иирокого спектра фармакологических свойств которых важное место занимают антимикробные свойства. Ассортимент эфирных масел, используемых в настоящее время з медицине, очень ограничен (мятное, эвкхиштовог, фенхелезсе, анисовое и некоторые другие). Недостаточный объем выпускаемых препаратов, а также нарушение межхозяистпеиных связей и централизованного обеспечения регионе» лекарственными препаратами ставит вопрос ои изучении и использован::;! местных сырьевых ресурсов длч ¡фонзааг.ггаа эффективных фитопрепаратов.

Флора Сибири, по данным Гербария ям. П.П. Крылова при Томском Государственном университете, насчитывает 3350 видов. Из них потенциальными эфироносами признаны '. 4 вида. Значительно.: место среди эфирномасличных растений флоры Сибири занимают

растения рода полынь. Исследования ряда авторов показывают перспективность поиска продуцентов антимикробных средств среди растений этого рода, поскольку многие из них имеют достаточную сырьевую базу, содержат значительное количество эфирного масла и проявляют широкий спектр антимикробной активности в сочетании с противовоспалительными и ранозоживляющими свойствами.

ЦЕЛЬ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ - выявить среди эфирломасличных растений перспективные продуценты антибактериальных средств и предложить один из видов - полынь серую для применения в медицинской практике.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:'

провести, оценку антибактериальных свойств эфирномасличных растений флоры Сибири;

- изучить антимикробные, противовоспалительные и рано-зажнвляющис свойства одного ьз перспективных видов - полыни серой; .

- изучить химический состав эфирного масла полыни серой, выделить и установить структуру основных компонентов, обусловливающих его биологические свойства;

- провести анатомическое исследование полыни серой, выявить диагностические признаки и локализацию эфирного масла;

- провести товароведческий анализ полыни серой и разработать проект нормативно-технической документации (НТД) на лекарственное сырье н эфирное масло этого вида.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ. В диссертации впервые проведен целенаправленный поиск во флоре Сибири перспективных эфирномасличных растений, обладающих антимикробным действием. Исследованы антибактериальные свойства 46 эфирных масел и 40 водно-спиртовых настоек, полученных из растений.

Показано, что большинство эфирномасличных растений обладают избирательной антибактериальной активностью; 15 из них наиболее перспективны для дальнейшего исследования.

Впервые детально изучен химический состав эфирного масла, антимикробные, противовоспхчитсльные и ранозаживляюшие свойства одного из перспективных эфирномасличных шшов флоры Сибири - полыни ссрой. Установлено, что состг. : эфирного масла

полыни серой не подвержен большой химической изменчивости в зависимости от места произрастания п фазы развития растения.

Впервые из эфирного масла надземной часта полыни серой выделены и идентифицированы его основные компоненты -полиацетиленовые соединения: метклбензилдиин (капиллен) и «:етилортогидроксибснзилдинн, а также метилэвгенол. Показано,- что капиллен является одним из компонентов, обусловливающих выраженные антибактериальные и антифунгалъные свойстьа эфирного масла полыни серой.

Проведено анатомическое исследование полыни серой. Установлены диагностические признаки и структура секреторных образований растения.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ. Проведенные эксперименты показан) целесообразность использования полыни серой в качестве источника эфирного масла н создания на его основе новых антимикробных н противовоспалительных средств. Разработан проект ВФС * Трава полыни серой

Разработаны и утверждены Томским центром метрологии и стандартизации технические условия " Эфирное масло полыни серой".

Лекарственное средство для лечения зубов и заболеваний пародонта "Эфирное масло полыни серой" защищено патентом РФ.

Методические указания "Л»агностические признаки растении рола полынь", утвержденные АПК "Союззфирлекраснроч". используются в учебном' процессе фармацевтических вузом и колледжей.

КЛ ЗАЩИТУ ВЫНОСЯТСЯ результаты поиска среди эфирномасличных растений флоры Сибири перспективных продуцентов шггампкрабных средств, а также результаты экспериментальных исслеаогшшй химического состана. антимикробных и фармакологических свойств одного из них -полыни серой.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ. Материалы диссертации доложены на Всесоюзной конференции "Фитонциды. Бактериальные болезни растении" (Львов, 1990): нлучио-праетичсской конференции "Состояние и перспективы развития фармации в Сибири и на Лальием Востоке" (Томск, 1991); научно-практической конференции, посвяшенной 25-летню фармацевтаческого факультета Курскою

медицинского института (Курск, 1992); третьей украинской конференции по медицинской ботанике (Киев, 1992); .научной конференции "Поиск, создание и изучение новых лекарственных средств растительного и синтетического происхождения" (Томск, 1993).

СВЯЗЬ ЗАДАЧ ИССЛЕДОВАНИЯ С ПРОБЛЕМНЫМ ПЛАНОМ ФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ НАУК. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники Сибирского медицинского университета и комплексной целевой программой СО АМН РФ " Здоровье человека в Сибири" (N Государственной регистрации 01.85.0069S48).

ПУБЛИКАЦИИ. Основное содержание диссертации изложено.в 11 статьях и тезисах докладов. По материалам диссертации получена 1 патентная справка.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫ. Диссертация изложена на страницах и состоит из введения,

обзора литературы, 5 глав, экспериментальной части, общих выводов, библиографии. В приложении представлены проект ВФС " Трава полыни серой", технические условия "Эфирное масло полыни серой", методические указания " Диагностические признаки растений рода полынь". Работа иллюстрирована 37 таблицами и

рисунками. Библиографический указатель включает 276 источников, из них 40 - зарубежных авторов.

13 обзоре литера+уры рассмотрены сведения об антимикробных свойствах эфирных масел, особенностях и механизме их действия на микроорганизмы; приведен анализ современных лекарственных средств, содержащих биологически активные вещества эфирномасличных растений, отечественного и зарубежного производства; проанализированы данные литературы об изучении п перспективах поиска продуцентов антимикробных средств среди чфнрномасличиых растений.

Вторач ivuisa посвящена описанию обье.чтоп и методов исследования.

В третьей главе приведены результаты поиска среди •»фирномаелмчных растении Сибири перспективных источин.коя антимикробных средств. На основании оценки антибактериальной активности эфирных масел и водно-спиртовых настоек для

химического и фармакологического исследования: с целью внедрения в медицинскую практику предложена полынь серая.

В четвертой главе изложены материаль. изучения химического состава и динамики эфирного масла полыни серой методом газожидкостион хроматографии, выделения и установления структуры основных компонентов.

Пятая глава посвящена '• изучению антимикробных, противовоспалительных и ранозажнвлпющнх свойств полыни серой.

3. шестой главе представлены данные анатомического и товароведческого анализа полыни серой, на основании которых разработан проект ВФС " Трава полыни серой".

В приложении представлены материалы, подтверждающие практическую значимость проведенных исследований.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Объекты и методы исследовании.

Объектами Т'сследопания служили растения флоры Сибири, из которых для изучения антибактериальных свойств в условиях in vitro было получено 46 эфирных масел методом перегонки с еодяным паром и 40 водпо-спиртовых настоек по методике С.Л. Вичкановой.

В качестве тест-мнкроорганчзмов использовали Staphylococcus aureus 209 Р, Escherichia coli М 17, Streptococcus pyogenes 11, KlcMelln pneumoniae T 43 2 rS2 из SS, Proteus vulgaris 4175 из NCTS, Pseud от о r.ns aeruginosa J. Исследования вылолжчш н<> Сазе кафедры микробиологии с курсом вирусологии Сибирского государственного медицинского университета.

Изучение химического состава эфирного масла г.ольи i cepoii а выделение из пего основных компонентой проводили метолом аналитической и препаративной газожидкостион хроматограф;:;:; установление их структуры - методами ИК-, ПМ?-, ЯМ? С- и масс-спектроскопин. Данный раздел работ;.! ¡¡post icn на оаз.' института химических наук АН Республик!: Казахегаи под руководством доктора химических паук Л.Д. Лемоицксго, за выражаем ему искреннюю признательность .i благодарность.

Исследования ранозажн: шющнх и нрошьопоспалчтелышх свойств полыни cepoii выполнены на кафедре военно-медицинского

снабжения военно-медицинского факультета при Сибирском медицинском университете под руководством доцента, полковника медицинской службы Щ.Д.Тарана. j'

Поиск перспекшвных источников антамикробных средств среди эфирномасличных растений Сибири

Исследование эфирномасличных растений флоры Сибири в плане поиска эффективных продуцентов антимикробных средств проводилось сред;1 растений семейства яснотковых, отдельных ро; ов и бидоз семейств вересковых и слохноиветных. Однако, необходимость продолжения подобных исследований обусловлена рядом причин,- Основные из них - отсутствие полной системной информации ' об антимикробных свойствах . растений различных семейст j ц родов, а вследствие слабой . изученности химического состава и фармакологических свойств многих эфирномасличных растеши: флоры Сибири ни одно из них до сих пор не внедренл в медицинскую практику. • ' •

На антибактериальную активность нами было испытано 46 эфирных масел, 24 из них получено из растений семейства Asteraceae, 11 - из'растений, семейства Lamiaceae, 8 - из растений семейств Pinaceas и Ericaceae. Результата показали, что антибактериальную активность п разной степени проявили все исследуемые эфирные ' масла. . '. .

Наиболее чувствительны к эфирным маслам в условиях in viuo стафилококк золотистый и стрептококк гемолитический. Активность в концентрациях от 31,25 до .1000 мкг/ мл к ним проявили S75S и S4,S% , эфирных масел . соответственно. Однако, активность в мшшматьных концентрациях 31,25-62,50 'мкг/мл проявили лишь эфирные масла пиона уклоняющегося, багульпш:а болотного, полыни серой, золотарника обыкновенного, xiiiгьяна маршалла и шизонепеты однолетней, которые не уступают, а некоторые из hisx превосходят по активности препарат сравнения-эфирног масло эвкалипта.

В отношении кишечной палочки оказались активны 43,5а-исследуемых эфирных масел, - в основном в предельных контгграцилх 500-1000 мкг/мл. Активность в более . низких концентрациях проявили эфирные масла тимьяна минусинского (250 мкг/мл), "шзонепеты однолетней (250 мкг/мл), полыни монгольской

и селитряной (250 мкг/мл), а также полыни метельчатой (125 мкг/мл).

Наиболее резистентны к эфирным маслам клебспелла пневмонийнхя, протей вульгарный и еннегнойная палочка Рост клебсиеллы пиевмонийнон ингибировхш лишь 10 из 46 испытанных эфирных масел (21,7%), протея вульгарного-19 ( 41,Зй), сннегНойной палочки-11 (23,9 %). Причем, активность в отношении далных тест-культур в концентрациях 125-1000 мкг/мл проявили эфирные мае 1а растений семейства яснотковых: тимьяна маршалла. тимьяна ползучего, тимьяна монгольского, шизонепеты однолетней, эльшольцин реснитчатой, мяты зеленой; семейства астровых: польн.л серой, полыни метельчатой, а также эфирное масло пиона уклоняющегося.

Таким образом, эфирные, масла проявили разный уровень антибактериальной активности, диапазон которой очень широк н выражается в концентрациях от 31,25 до 1000 мкг/мл. Наиболее перспективными для дальнейшего исследования в качестве возможных антибактериальных средств являются эфирные масла полыни серой, штнз уклоняющегося, шизонепеты однолетней к тимьяна маршалла, проявившие активность п низких (31,25 мкг/мл) и средних (62,5-125 мкг/мл) концентрациях в отношении корковидной флоры.

Кроме эфирных масел, представляло интерес исследование ;:}'УП1Х суммарных комплексов из эфирномасличных' растении, в частности подмо-спи^топыч настоек, содержащих различные классы соединений: терпепо^ды, фенольние соединения, полисахариды и другие. 3 результате анализа полученных данных оказазось, чго. как и для эфирных масел, наибольшая чувствительность к большинству п.г~:">;к отмечена у стафилом;;!» зслотистого(77,5Я5 настоек/ п сгуспгококка ге.-'слнтнческого (95/о настоек) в разведении 1:20-1;(>40. ;'*:> активности в отношении кокг.екпдных бактерий заслуживают г;.игма"1:е тюн уклоняющийся, уолюрт грапнлатовиднач. ¡равилат v:-.-.:-: .чин, гравилат речной, тимьян маршалла, полынь серая, лххгарннк обыкновенный и лзугне. Однако, кишечная палочка проявила устойчивость к большинству настоек и только 25гг щ нн\ г.мгчбирозали рост данного тест-м:л:роорганнзма в разведении 1:20-г-;;;0. Более половины (55Г2 > исследуемых настоек проявили :.;,тнвность в отношении протея вульгарного, причем и минимальном

разведении 1:20-1:40. Вместе с тем, и в этой группе можно выделить ряд растений, активность которых проявилась в высоких разведениях настоек: пион уклоняющийся (1:160), лабазник вязолистный (1:640), ко.терия гравилатовидн~ч (1:640), золотарник обыкновенный и другие. Клебсиелла пнсвмонийная и сннегнойная палочка резистентны к водно-спиртовым настойкам в 65% и 73% случаев соответственно. В числе проявивших активность в отношении этих '!ост-культур те же растения: колюрия гравнлатовидная, гравилат речной и гравилат алепский, золотарник обыкновенный.

На основании полученных данных в число перспективных в качест'с возможных антимикробных средств можно отнести водно-спиртовые настойки пиона уклоняющегося, колгарии гравилатовидной, лабазника визолнстного, гравилата алепского и гравилата речного, золотарника" обыкновенного, проявившие активность в различных разведениях в отношении практически всех испытуемых тест-микроорганизмов.

Для дальнейшего химического и фармакологического исследования нами выбран один из предлагаемых видов, а именно, полынь серая Artemisia glauca P;ili. ex Willd. Обоснованием выбора объекта исследования является следующее;

- полынь сер'я - распространенное в Сибири растение, но практически до сих пор не -..сслсдосаны се химический состав и фармакологические -свойства, что несомненно представляет теоретически;'! и практический интерес ;

- полынь ссрхя - систематически близкий и сходный морфологически вид с известной своими npVno-ароматнчсскнми и бактерицидными свойствами полынью эстрагон - Artemisia dracuncaius L., что предполагает сходство их химического состава и биологических свойств. Известны антимикробные свойства и другого пила из того ж™ подрода Dr-cuaculus полыни мсгельчатой Artemisia scoparia, на основе эфирного масла которой разработан и предложен npoT¡;r.crpii6xot;un npciiapai "Оласкар";

- опыт интродукции полыни серой на экспериментальном участке Сибирского ботанического сада дает основание считать возможным создание стабильной и достаточной сырьевой базы этою растения для промышл иного получения эфирного масла и препаратов антимикробного действия на его основе.

Исследование химического состава п динамики накопления эфирного масла полыни серой.

Для исследования химического состава эфирное масло полыни серой, собранной в окрестностях г. Томска в фазу цветения, делили на ряд фракцпй: свободные кислоты, фенолы и терпеноиды. Учитывая, что свободные органические кислоты и фенолы содержатся в эфирном масле в незначительном количестве и практического интереса не представляют, исследовали химический состав терпеноидов, составляющих 90,50-93,95% эфирного масла.

Хроматографпческий газожлдкосгаый анализ эфирного масла показал, что в составе терпеновой фракции содержится 47 компонентов, из которых нами ндентнфшшровано 26 компонентов, что составляет 88,73% от целого эфирного масла Эфирное масло представлено монотерпеноидамн (43,74%), сесквитерпеноидами (9,67%) и ароматическими терпеноидами (35,32 %).

Широко распространенные компоненты мснотерпеновой фракции идентифицировали хроматографически (ГЖХ) по времени удерживания и методом подсадкг заведомо известных веществ. Основными веществами данной фракции являются, % : сС- пинен -3,00; -карен - 5,42; лимонен - 7,09; Jf - терппнен - 6,37 и терпинолен - 13,15.

t Сескв!1терпеноиды выде^лн из эфирдого масла методом препаративной газожндкостной хроматографии и идентифицировали физико-химическими и спектральными методами: но данным ИК - и ПМР- спектроскопии сравнением со сп::<тргми загедомо известных веществ и литерагурными сведениями идентифицировали аг-куркумен, Jjr ир- карнофиллены, каламенсн, калакорен и гермакрен D.

Наибольший интерес представляет фракция ароматических теопскоидоп. составляющая 35% эфирного масла, из когопых 32fi крлхоппгея на диацепигиоБые соединен!!-:. Г/ф^^нее ;.:;:ej:o подвергали . фракционной перегонке. При исследовании высококипящей части эфирного масла выделили угле^дород (I) и его оксипрснзводксе (И).

Вещество I выделили с помощью препаративной газожндкостной хроматографии из фракции эфирного масла, кипящей при t 120-145 С и остаточном давлении 5 им рг. ст.

Вещество состава CGHÍ>(M+154), Т135-136'С (5 мм рт. ст.), п ф 1,5723; djP.9783; О". Это жидкость светло-желтого цвета с характерным приятным запахом, краснеющая при нагревании и хранении на свету. В структуре соединения имеется монозамещенное бензольное кольцо (ИК-спектр шах: 70S, 742,. 149S, 1605, 3032, 3065, 3090 ), которое сохраняется при быстром поглощении четырех молей водорода при гидрировании в кислоте уксусной над окисью пл: гины (по. Адамсу). Последнее обстоятельство позволяет предположить, что данное вещество принадлежит к ацетиленовым углеводородам. Действительно, в ИК-спектре в области 2200-22SO см* наблюдаются две полосы поглощения слабой интенсивности, принадлежащие валентным колебаниям -С=С- связей.

В.ПМР-спектре (3* , мд. СДС1, ГМДС) вещества 3 сигнала: в сильном поле трехпротонныи синглет 1,88 мд., принадлежащий -С-CHj группе; в слабом поле - слаборасщепленный пятипротонныи мультиплет бензольного кольца 7,32 мд. и двухпротопный синглет 3,72 м«д. свидетельствуют о том, что СН^группа находится рядом с бензольным кольцом (рис. 1). Полученные результаты, позволяют сделать вывод, что выделенное соединение имеет наиболее вероятное строение 6-фенил-гексадиин-2,4 (метнлбензилдшш) (I).

ЯМР 13 С-спектр ( , мд. СС1^ ) подтверждает это заключение: 3,5 (I С, кв, СМ); 25,2 (1С, т, С-6); 64,99(1С, с, С-2): 67,S9 (1С, с, С-5); 73,5 (2С, с, С-3,4); 126,40 (1С, д,С-4'); 127,55 (2С6 да, С-З',5'); 128,20 (2С, дд, С-2',б'); 135,45 (1С, с, C-l'> (рве. 2). .

Miicc-спеюр 1 (m/z, J%): 39(14), 50(24), 51(37), . 62(7), 63(1S), 64(8), ¡74(12), 75(13), 76(26), 77(19), 87(5), 91(6), 102(7). 115(21), 119(S), 126(10), 127(12), 12S(19), 139(19), 150(7), 151(24), 152(71), 153(S0), 154(100). 155(13).

На основании физико-химических и спектральных данных основной компонент эфирного масла полыни серой идентифицирован как метнлбензнлдини. Вылсленное соединение идентично по структуре ранее описанному агропнрену из пырея ползучего и капиллену нз полыни волосовидной, полыни эстрагон, а также капиллену нз поаземных органов полыни серой. Из эфирного масла надземной части полыни серой капиллен выделен нами впервые.

7,32 м-g.

CU,-CnC-CziC-Ch/¿

~CHñ

3.72*g-

~CHз

i

м.д. i 7 . 6 S 4 Рис. Í: EiP-cnssip нетмбсиэянятю

«ÍV

3"!

g

-JL_

«1

ñ\j tí -»о»

Риз. 2. ЯИР ^С-спектр мгиявекэидаиина

«м M

«S 4

Кубовой остаток от перегоню! эфирного масла растворяли в эфире, извлекали раствором натрий гидроксида. Извлечение подкисляли, экстрагировали диэтиловыы эфиром и после сушки над безводным натрий сульфатом удаляли растворитель под вакуумом. Вещество II выделяли препаративной ГЖХ в тех же условиях, что и вещество I.

Вещество II состава С^Н^О ( М 170): i£l,5495; [¿]jO° В ИК-спектре интенсивная полоса поглощения 3280 см" (фенольная ОН-группа), расположенная в орто-лоложении по отношению к углеводородному дииновому заместителю. ПМР-спектр вещества II отличается от спектра вещества I присутствием однопротонного синглета в области 9,7 м.д., смещающимся в сильное поле при повышении температуры (ОН-группа) и четырехлротонным мультиплетоы при 7,6 мл., анализ констант спин-спинового взаимодействия которого свидетельствует об ортозамешении в бензольном кольце Полученные результаты позволяют предложить выделенному соединению структуру - (2-оксифенил)-гексадш1н-2,4 (ме гилортогидроксибензилдшш).

Данное вещество выделено нами из эфирного масла полыни серой и идентифицировано впервые. . '

Методом ПГЖХ из эфирного масла полыни серой выделили вещество состава <^HftO¿(M4l78); 1^1,5317; ИК-спектр шах : 915, 1505, 1515,1642, 30S5 см'Í ПМР-спсктр < , м.д., СОО,,ГМДС): 3,35 (2Н, д Н-3), 3,75 (ЗН/с, СН,-3'), 3,80 (ЗН, с, СН3-4'), 5,05 (2Н, д, Н-1), 5,95 (1Н, м, Н-2), 6,70 (ЗН, м, Н-2'5,'^ (III). Поданным ИК-и ПМР-спектроскопии, сравнением со спектрами известных соединении вещество III идентифицировали . как 3-(3,4-дпметоксифенил) пропен-1 или метилэвгенол (III).

Анализ эфирного масла надземной части полыни серой, собранной в разных областях Западной Сибири показал, что несмотря на зна-.ительную удаленность пунктов сбора образцов сырья и различия в условиях местообитания растений, его качественный состав остается постоянным, различия проявляются лишь в количественном содержании отдельных компонентов. Это характерно и для культивируемой в условиях экспериментального участка Сибирскою боганнческлго сада полыни серой.

Анализируя динамику накопления отдельных компонентов эфирного масла необходимо отметить, что различия в их

количественном содержании характерны в основном для монотерпенондов и • ароматических соединений. Так, в эфирном масле дикорастущих растений содержание -глшена составляет от 1, 42% (Курганская область ) до 3,00 % ( Томская область), - карен от 3,40% '(Курганская область ) до 5,42 % ( Томская область ), в то время, как культивируемые растения накаплигают эти вещества в незначительных количествах (0,07 % и 0,042 % соответственно), но при этом содержание сабинена в эфирном масле возрастает до 2,33%. Поскольку данные бициклнческие монотерпеноиды связаны одной эволюционной ветвью, изменение их количественного содержания возможно за счет взаимопревращений. В группе близких по структуре моноцнклическнх монотерпенондов - фелландрена, лимонена, терпинолена, - терпинена отмечена такая же закономерность. И, наконец, более значительные различия можно отметить в колнчесгвенно..1 содержании ароматических терпеноидов. Так, содержание цис-металэвгенола колеблется в . образцах дикорастущей полыни серой в очень широких. пределах от 0,95 % (Курганская область) до 11,65 % (Красноярский кран). Но наибольшее количество этого компонента накапливается в культивируемых растениях (29,13%).

Максимальное содержание основного компонента эфирного масла метилбензнлдшша (капиллена) - 55,78 % отмечено в образце из Курганской области, однако, выращиваемая в условиях Томской области полынь серая не уступает по содержанию этого компонента.

Не менее важкым для эфирномасличных растений яаляется анализ динамики состава эфирных масел в зависимости от фазы развития растения. Данные исследовашы -озволяют заключить, что не только разные классы терпеноидов, но и отдельные компоненты эфирного масла проявляют различные закономерности в характере накопления. Так, если для монотерпенондов . - пннена и лимонена максимальное содержание отмечено в период бутонизации, то фелландрсн, - терпннеи и терпинолен имеют два максимума накопления: в период вегетации и плодоношения рас.<-'нт. Причем, снижение содержания данных компонентов в эфирном масле а период формирования генеративных органов пронехолпт довольно значительное, что можно объяснить либо уменьшением их биосинтеза, либо превращение I в другие структурно-рол'твениые соединения.

Максимальное содержание основных компонентов: метил бснзилдинна и его производного

метилортогидроксибензилдиина в эфирном масле отмечено в фазу цветения растения (22.44%) и совпадает с максимумом накопления эфирного масла в надземной части полыни серой, в связи с чем данный период предложен как наиболее оптимальный для заготовки лекартсвенного сырья (надземной части).

Изучение антимикробных в фармакологических свойств полыни серой

Для исследования антибактериальных и антифунгальных свойств полыни серой использовали эфирное масло, а также суммарные извлечения, полученные из надземной части растения водой, - этанолом различной концентрации и хлороформом. При этом преследовали цель извлечения из растения веществ различных классов природных соединений: терпеноидов, фенолыых соединений, полисахаридов и других. В качестве препарата сравнения использовали эфирное масло эвкалипта.

Установлено, что наиболее эффективным в отношении испытуемых бактерий и грибов является эфирное масло полыни серой. Наибольшую чувствительность к эфирному маслу проявили кокковидные бактерии: стафилококк золотистый и стрептококк гемолитический. Их чувствительность проявилась в срсднеа!" ?ып-г* концентрациях эфирного масла 31,2-62,5 мкг/мл. В более высокой концентрации 125 мкг/мл эфирное масло задерживает рост протея вульгарного. Вместе, с тем, масло не проявило активность в отношении кишечной палочки, клебсиеллы пневмошшной и синегнойной палочки. Активность в отношении поверхностных дерматофитов Trichophyton rubrum, Trychophyton mentagrophytes var. inteldigitale и Microsporum canis эфирное масло проявило в довольно низкой концентрации 7,8 мкг/мл. Но особенно следует обратить внимание на активность эфирного масла в отношении возбудителен аспергидлеза Aspergillus niger и кандидоза Candida albicans. О;..1 проявилась в среднеактивной концентрации 125 мкг/мл.

Анализируя ангимикробные свойства различных экстрактов из надземной части полыни серой следует отметать, что эти суммарные извлечена неактивны в отношении большинства тест-

микроорганизмов и патогенных грибов. Экстракты на 20%-ном и 40%-ном этаноле в концентрации 250 мкг/мл ингибировали лишь рост стрептококка гемолитического. Экстракт хлороформный проявил подобную активность в более низкой концентрации 31,2 мкг/мл. По всей вероятности ингабирующую роль в данном случае -.грают лнпофилыше вещества растения, иттекаемые малополярнымн растворителями, например, эфирное масло или его компоненты. Более высокая концентрация этанола (70%) в водно-сгшртовой настойке,. чем в исследуемых экстрактах существенно влияет на ее антибактериальную активность. Настойка ингпбирует рост кокковидных бактерий и простейших в разведении 1:40-1:321» и неактивна в отношении кишечной палочки, клебсисллы пневмонийной и синегнойной палочки.

Таким образом, из всех исследуемых суммарных комплексов полыни серой эфирное масло выделяется более широким спектром действия, проявляя активность как й отношении ряда бактерий, так и возбудителей грибковых -аболекший. Причем, добавление в питательную среду 10% нормальной лошадиной сыворотки не снижало активные концентрации эфирного масла. Эго даег основание предполагать, что з; опытах in vivo эфирное .масло не потеряет своей активности вследствие возможного блокирования белками сыворотки крови.

Поскольку эфирное «пело полыни серой представляет coúoii многокомпонентную смссь различных классов соединении, представляло интерес выявление основного компонента или фракции, ответственных за проявление антимикробной активности. С этой целью исследовали антибактериальные и антифунгальные свойства терпеновой, фенольнои фракции и основного компонента эфирного масла мгтнлбензилдшша (капиллена) (raú i).

Экспериментальные данные показали, что териеновая фрлкпиь эфирного масла проявила антибактериальную и антифунгальную активность на уровне целого эфирного масла, фенольиая фракция неактивна в отношении всех испытуемых тест - микрооргашпмов. метилбензилднин показа: более высокий \ ревень бактериостатнческой и фунгистатнческой активности, чем эфиг»«« масло и терпеновая фракция, из котогюй он выделен. Учитывая, чгп содержание терпеноной фракции в эфирном масле подшш cepuíi составляет 91.03-93,95%. я т.ч. метилбензиллиина 22.4-55.№. можно

Таблица

АНТИМИКРОБНАЯ АКТИПНОСТЬ ФРАКЦИЙ И ОСНОВНОГО КОМПОНЕНТА ЭФИРНОГО МАС.Ы

ARTEMISIA GLAUCA (нкг/ш)

Tcct - MiiKpoopraiiH.ivH Исследуемый комплекс

Терпеноиая фракция Феиольная фракция Метилбензидциин (капиллен)

Stapliylococ :us aureus 62,5 н/а 31,3

Strcptoeoc-us pyogenes . 31,3 ,п/а 15,6

Escherichia coli л/а и/а н/а

Proteus vulgaiii; 125,0 н/а 62,5

Klebsiella pneumoniae н/а н/п н/а

Pseudomonas aeruginosa н/а н/а н/а

Trichophyton rubrum 7,8 н/а 3,9

Trichophyton 7,8 н/а 7,8

mentagrophytes •

Microsporum canis . 7,8 и/а 1,9

Aspergillus niger 125,0 н/а 125,0

Candida albicans 125,0 н/а 125,0

предположить, что антимикробная активнссть эфирного масла обусловлена данной фракцией и, я частности, be полиацетиленовым компонентом капиллсном.

Изучение противовоспалительных л ранозхжл'мяюпро; свойств полшш серой! Особенно важно для антимикробных препаратов проявление противовоспалительных и ракозххивлягащих свойств, . поскольку использование таких препаратов предусматривается хагс при воспалительных процессах микробной этиологии, так и раневых инфекциях. Все это псслужшо основанием для изучения противовоспалительных к ранозджипляющих свойств эфирного масла и экстракта полыни серой.

Ренаративную способность эфирного масла и водного экстракта полыни серой исследовали яри. згкизлениц. инфицированных стафилококком золотистым ран у крыс. Опыты проводили на 50 белых крысах обоего пола массой 180-220 г.. Данные эксперимента показали, что как эфирное масло, так и, экстракт полыни ccpoii способствуют очтцешпо раны и стимулируют процесс ее заживления, причем значительно (на 11-12 суток) ускоряют рспаративный процесс по сра нению с контрольной группой животных. Однако, уступают по активности препарату сравнения - мази "Лецомнколь". Установлено, что характер основы (вазелнно-ланолиновая, годно-эмульсионная, касторовое пли подсолнечное мпсяо), используемой эксперименте при изготовлении мази, лшг'мскта или раствора эфирного масла, не оказывает существенного влияние на степень его активности. Поэтому в качестве лекарственной формы для исследуемого эфирного масла был предложен раствор а касторовом маслс.

Экспериментально было установлено, что 0,5 fS-нын и lfS-nuii растворы эфирного матга полыни серой касторовом масле ускоряют заживление ран -на 24-2S Го. Повышение концентрации эфирного масла до 3 % усилило стимуляцию рспаратиппых процессе::.

существенно не влияло на скорость заживления ран г,о сравнению с 3?о-ным раствором.

Противовоспалительные свойства оф::;;:;сю .масла и диофилизированного водного экстракта полыни серой изучали па модели острой воспалг ~ельнои реакции, пис заинек введением серотонина. Опыты поставлены на 40 белых крыса»; массой 130-

150 г. Как показали результаты опытов, на фоне острой воспалительной реакции, вызванной серотонином, исследуемые препараты можно считать достаточно активными протнвоотечными средствами, обладающими выраженным антиэкссудативным действием в период энергичного нарастания отека и на пике воспалительной реакции (45 минут). Процент угнетения отека на пике воспалительной реакции для 3%-ного масляного раствора эфирного шеяа л водного экстракта полыни серой составил 32% и 34% соответственно по сравнению с контрольной группы животных (16%).

• Таким образом, экспериментальные данные характеризует эфирное масло и водный экстракт полыни серой как достаточно активные средства для лечения гнойных ран с умеренно^ выраженными противовоспалительным действием.

Оценка безвредности эфирного масла полыни серой. Исследования острой токсичности эфирного масла полыни серой, выполненные в опытах на мыш-\х при внутрижелудочном введении масляного раствора, показали, что дозы, до 5000 мг/ кг не вызыь.иш изменений в поведении и состоянии мышей. Согласно сущсст уюшен классификации (ГОСТ 12007-76) эфирное масло полыни серой может быть отнесено к IV классу: "Вещества малотокенчные". •

Возможность использования эфирного масла полыни серой л стоматологии. Известно широкое применение для лечения хронических. и обострившихся пульпитов, xpoi; :ск.:/

периодантнтов, альзеолитос и заболеваний пародонта гвоздичного масла, эвгенола, тимола, масляных растворов уеннната натрия и хлорофиллипта, сангвирнтрина, применение которых ограничено пс ряду причин. Наиболее близкими к эфирному маслу полыни серой являются гвоздичное масло и эвгенол, которые применяются v стоматологии как противовоспалительные, антисептические н болеутоляющие средства. Однако, отсутствие данных препаратов на фармацевтическом рынке делает их практически недоступными дл<; использования в стоматологии. Поскольку эфирное. масло полип:, серой проявило в эксперименте выраженный антимикробны/; противовоспалительный и ранозаживляющий эффект, представлял: интерес прозсст» его испытание в качестве заменителя, гвоздичного масла.

. Изучение эффективности эфирного масла полыни серой при лечении зубов к заболеваний пародонта проводили па базе лечебно-хирургического отделения областной стоматологической поликлиники г.Томска. Изучена эффективность масла яри следующих заболевания:, обострение хронического пульпита, при острых гнойных пг.родонтитах, хтьвеолитах, пародонтпте в стадии обострения, при пломбировании корнезых каналов по показаниям. Контрольную группу больньч лечили с применением гвоздичного масла. Пролечено 55 пациентов, из которых 60 человек - с воспалительными заболеваниями пульпы и г.ародонтз; 9 человек - с заболеванием пародонта и б человек - с альиеолнтамн.

Исследуемое эфирное мае то полыни серой применялось местно ео всех случаях в виде гурунцы л для пломбирования корневых каналов. Оценку эффективности исследуемого масла осуществляли с учетом уменьшения. ; болей, отека,

отсутствия осложнений (в виде перностатптов) - после пломбирования корневых каналов.'.- Учитывались формы течений патологического процесса (^стрые, хронические). Положительный зффезст получен в 90 случаях или 94,7 у 5 человек отсутствовали какие-либо положггельпыг изменения (интенсивность боли не уменьшалась). ' •.

Представленные клинические данные 'свидетельствуют о положительном лечебном эффекте эфирного масла полыни серой, а, следовательно, о возможности использования данного лекарственного средства для дсченнл хронических и обострившихся пульпитов, хронических перпотй.'лптов, алыколнтоз и заболеваний пародонта.

Лекарственное средство "Эфирное масло полыни серой", предлагаемое для лечения зубов и заболеваний пародонта, защищено патентом РФ.

Разработка НТД на лекарственное сырье и оценка ресурсов полыни серой

3 данной главе приведены результаты изучения признаков, характеризующих подлинность и доброкачественность лекарственного сырья.

Среди микроскопических осаСечностей полипа серой следует ;ы.~ел!лъ: устьица ансмоцитного тпгл; эпидерма с верхней и нижней

стороны листа со слабоизвилистымн стенками; обилие простых одноклеточных звездчатых волосков; секреторные образования представлены в основном эфирномасличными вместилищами, в меньшей степени представлены экзогенные образования-железистые трихомы, строение которых типично д/ш растении семейства астровых. 1

С целью установления доброкачественности лекарствен! >го сырья были определены числовые показатели, включенные в проект НТД: влажность не более 12 %; содержание золы общей не более 9%; золы нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты не более 1%; содержание стеблей, в том числе отделенных при анализе, не более 42%; органической примеси (части других неядовитых растений) не более 2%; количественное содержание эфирного масла не менее 0,5%. Соответствующие показатели установлены и для измельченного сырья. Срок годности сырья рекомендуется установить до 2 лет.

Изучено ра.простр'анение полыни серой на территории Томской, Новосибирской областей, в Хакасии, Туве, Красноярском крае. Определена урожайность данного вида методом закладки учетных площадок. Изучен опыт введения полыни серой в культуру. Установлено, что в условиях Томской области в культуре формируются более продуктивные особи.

На .основании проведенных исследований разработан проект Временной фармакопейной статьи на траву полыни серой.

ВЫВОДЫ

1. Среди эфирномасличных растений флоры Сибири проведен целенаправленный поиск продуцентов антимикробных средств. Одним из перспективных видов, реколгендуемых д..я дальнейшего изучения и пр. ггического использования является полынь серая -Апгтйа ^гиса Ра!!, сх \VilId.

2. Детально изучен химический состав эфирного масла из надземной части полыни серой. Установлено, что в его составе содержится 47 компонентов, представленных моно-, сееквн- и ароматическими тсррснопдамп. Впервые в эфирном масле обнаружены, % : саС.шен 0,17-0,44; - карсн 5,42-11,10; артемнзиакетон 0,20-0,49; -тунон 0,70-1,95 и - туйон 0,20-1,30;

камфора 0,20-0,58; аг-куркумен 0,60-4,90; каламенен 0,30-1,70; калакорен 0,07-0,48. Выделены и установлена структура метилэвгенОла, метилбензиддиина (капиллена) н неописанного в литературе метилортогндросибензнлднииа.

3. Установлено, что качественный и количественный состав эфирного масла не подвержен большой химической изменчивости в зависимости от места произрастания и фазы развития растения. Отмечено, что для накопления эфирного масла в надземной частн полыни серой наиболее благоприятны мезофитные условия ее обитания, максимальное содержание (55,8 %) основного компонента капиллена характерно для растений из ксерофитных мест обитания.

4. Оптимальным сроком заготовки сырья (надземной части) полыни серой является фаза массового цветения растения, так как на этот период приходятся максимумы накопления эфирного масла и капиллена.

5. Показано, что эфирное масло полыни серой обладает широким спектром антимикробного действия. В срсднеактпвных концентрациях 31,2-62,5 мкг/мл эфирное масло ннгибируст рост стафилококка золотистого н стрептококка гемолитического, в концентрации 125 мкг/мл - рост протея вульгарного. Рост возбудителей дерматсфитии эфирное масло задерживает з концентрации 7,8 мкг/ мл, а возбудителей аспергиллеза и кандидоза -в концентрации 125 мкг/ мл. ' Наиболее высокий уровень антимикробной активности проявляет эфирное масло, полученное из растения в фазу бутонизации и цветении.

6. Установлено, что антимикробный эффект эфирного масла обусловлен содержанием полиацешлекоиого соединения мстилбензилдшша (капиллена).

7. В эксперименте установлено, что эфирное масло полыни серой в виде • 3%-ного масляного расгаора проявляет :..,:ра;кеннос антпэкгсудативнос действие на фене острой воспалительной реакции, вызванной серотошшом; способствует очищению гнойной раны и стимулирует псонссс се заживления. Зфнрноо млел х^паи'гетг.и'стс:! низкой токсичностью г. отсутствием местпсраздрхкаюисго действия.

8. На основании клинических испытаний эфирное масло рекомендовано п качестве заменителя гвозлн-нюю масла для лечения зубов и заболеваний пародонта. Средство защищено патентом РФ.

9. На основании данных химического, анатомического и товароведческого анализа разработаны проект временной фармакопейной статьи Трава полыни серой" и технические условия "Эфирное масло полыни серой".

По теме диссертации опубликованы следующие работы:

1. Зарубина JIA., Тихонов В.Н. Антимикробные свойства эфирных масел сибирских видов чабрецов // Фитонциды. Бактериальные болезни растений: Материалы конф.-Киев-Львов, 1990.- Ч. 1.- С. 20.

2. Антибактериальные свойства эфирномасличных растений Сибири / Г.И. Калинкина, Т.П. Березовская, JI.A. Зарубина и др. // Фитонциды. Бактериальные болезни растений: Материалы конф.-Киев-Лььов, 1990,- Ч.1.- С.21.

3. Зарубина Л.А., Калинкина Г.И. Полынь серая - возможный источник лекарственных средств антимикробного действия // Состояние и перспективы развития фармации в. Сибири и на Д.Ботоке: Тез. докл.-1991.- С.133-134.

4. Эфирномасличные растения флоры Сибири - источники антимикробных средств / Г.И. Калинкина, Л.А. Зарубина, Т.П, Березовская и др. // Ресурсоведческое и фотохимическое изучение флоры СССР: Научные труды ВНИИФ.- М., 1991.- Т. 29.- С.89-9'

5. Зарубина Л.А., Калинкина Г.И.Т Сальникова Е.Н. Антнфунгальная активность эфирного масла полыни серой // Актуальные вопросы фармацевтической науки и практики: Тез. докл. научно-практ. конф., посвященной 25-летию фару, ф-та Курского мединститута,- Курск, 1991.-Ч.2.-С.134.

6. Калинкина Г.И., Зарубина Л..А Антимикробные свойстьа эфирного масла золотарника обыкновенного // Третья Украинская конф по мед. ботанике: Тез. докл.-Кнев, 1992,- Ч.1.- С. 66.

7. Зарубина Л.А. Кумарины Artemisia glauca // Химия природ, соедин,- 1992.- N 1.- С. 135.

8. Химический состав эфирного масла пиона уклоняющегося /Г.И. Калинкина, АД. Дембицкий, Л А. Зарубина и др. // Химия природ, соедин.- 1993. - N 6. - С. 905-906.