Автореферат и диссертация по медицине (14.04.02) на тему:Фармакогностическое исследование хвоща лесного как перспективного источника биологически активных соединений

На правах рукописи

БОНДАРЧУК РУСЛАН АНАТОЛЬЕВИЧ

ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ХВОЩА ЛЕСНОГО КАК ПЕРСПЕКТИВНОГО ИСТОЧНИКА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ СОЕДИНЕНИЙ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

14 МАР 2013

Самара-2013

005050650

005050650

Диссертационная работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении Высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, г.Томск

Научный руководитель:

доктор фармацевтических наук, доцент Коломиец Наталья Эдуардовна

Официальные оппоненты:

Аввакумова Надежда Петровна - доктор биологических наук, профессор, государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра общей, бионеорганической и биоорганической химии, заведующий кафедрой

Сапронова Наталья Николаевна — кандидат фармацевтических наук, доцент, Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет им.И.М.Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, кафедра фармакогнозии, доцент кафедры

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Пермская государственная фармацевтическая академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита состоится ^ сТ/^/С.СХ._ 2013 г. в 10.00 часов на заседании

диссертационного совета Д208.085.06 при государственном бюджетном

образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 443079, г. Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения Российской Федерации (443001, г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «Л» г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат фармацевтических наук, доцент

Петрухина Ирина Константиновна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Несмотря на значительные достижения в области создания синтетических лекарственных средств интерес к лекарственным растениям и препаратам растительного происхождения не ослабевает. Растения продолжают оставаться важным источником получения лекарственных препаратов (Киселева T.J1. и др., 2010; Самылина И.А. и др. 2008). В связи с этим изыскание новых объектов и видов лекарственного растительного сырья, их внедрение в медицинскую практику остается важной задачей современной фармакогнозии.

К числу перспективных объектов исследования относится род хвощ Equisetum L. - единственный ныне живущий представитель древнейшего отдела хвощевидные, виды которого очень широко распространены на Земле, произрастая в разнообразных растительных зонах и сообществах. Большинство видов хвоща имеют значительные сырьевые запасы. При этом из всего рода хвощ только один вид - хвощ полевой (Equisetum arvense L.) пользовался повышенным вниманием исследователей из разных стран (Nacamura Н., 1940; Saleh A.M., 1972; Сырчина А.И., 1981; Решетникова М.Д., 1993; M.Veit, 1995). Вероятно, это объясняет и тот факт, что только данный вид хвоща до сих пор является официнальным лекарственным растением как в отечественной, так и зарубежной медицине.

Перспективность некоторых видов рода хвощ была показана в исследованиях, выполненных на кафедре фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета. Предложенная Н.Э.Коломиец методология поиска перспективных видов хвоща, основанная на изучении данных литературы по систематике рода хвощ, их ареалу, сырьевым запасам, оценке фармакологической эффективности биологически активных комплексов по различным тестам, сравнительном исследовании основных групп биологически активных веществ, позволила выделить наиболее перспективные для дальнейшего исследования виды хвоща, к которым относится, прежде всего, хвощ лесной. Результаты сравнительного экспериментального изучения

фармакологической активности по разным тестам водных и водно-спиртовых экстрактов десяти видов хвощей сибирской флоры показали, что хвощ лесной на фоне безвредности обладает антибактериальным, антигрибковым, противовоспалительным действием, выраженной антирадикальной и антимутагенной активностью. При сравнительном исследовании химического состава десяти видов хвощей, основываясь на данных о содержании биологически активных веществ, они были разделены на две группы. Хвощ лесной был отнесен к видам первой группы, для которых характерно преимущественное содержание флавоноидов и фенолокислот, по которым можно проводить их стандартизацию.

Проведенная нами сравнительная оценка гепатопротекторной активности экстрактов трех видов хвоща флоры Сибири подтвердила перспективность выбранного объекта исследования и показала, что хвощ

лесной обладает выраженным гепатопротекторным действием, которое коррелирует с антирадикальной и антимутагенной активностью.

Таким образом, широкий диапазон экологической приспособляемости, обширный ареал и достаточные сырьевые ресурсы, в сочетании с многогранностью фармакологического действия хвоща лесного свидетельствуют о перспективности его применения в медицинской практике и получения на его основе новых лекарственных средств. Вместе с тем, рекомендация нового вида сырья для внедрения в научную медицину требует более детального исследования его химического состава и разработки нормативной документации.

Цель и задачи исследования. Цель данного исследования состояла в том, чтобы на основании детального химического исследования фенольных соединений и изучения анатомо-морфологических признаков растения предложить для медицинской практики новый вид лекарственного растительного сырья - траву хвоща лесного и разработать методики его стандартизации.

Для реализации поставленной цели решались следующие задачи:

1. На основании данных литературы обосновать группу биологически активных веществ для стандартизации сырья хвоща лесного.

2. Провести детальное химическое исследование фенольных соединений и установить их структуру.

3. Изучить динамику накопления флавоноидов и фенолокислот для обоснования сроков заготовки сырья.

4. Оценить экологическую чистоту предлагаемого лекарственного растительного сырья.

5. Разработать проект Фармакопейной статьи «Хвоща лесного трава», «Инструкцию по сбору и сушке травы хвоща лесного».

Научная новизна. Методами структурной химии выделено и идентифицировано 17 веществ фенольной природы, в том числе впервые 2 флавоноидных гликозида (госсипетин-7-глюкозид, кверцетин-3-диглюкозид) и 1 фенольный инданон (онитин). Использование метода ВЭЖХ-МС позволило предположить присутствие в хвоще лесном полигликозилированного флавоноида.

Впервые для хвоща лесного была изучена индивидуальная, сезонная и географическая динамика накопления фенольных соединений (флавоноидов и фенолокислот) в течение всего вегетационного периода. Полученные при этом данные были использованы для обоснования сроков заготовки данного растительного сырья и выбора группы БАВ для стандартизации сырья.

Впервые проведено исследование состава макро- и микроэлементов сырья хвоща лесного, заготовленного в разных географических зонах Российской Федерации. Проведено определение содержания радионуклидов на примере образца хвоща лесного, заготовленного на территории города Северска Томской области, являющегося крупным атомным центром России.

Разработана методика стандартизации сырья хвоща лесного по содержанию флавоноидов спектрофотометрическим методом.

На основании проведенных исследований разработаны: проект Фармакопейной статьи «Хвоща лесного трава», «Инструкция по сбору и сушке травы хвоща лесного».

Практическая значимость. Результаты проведенного фармакогностического исследования позволяют расширить ассортимент отечественного лекарственного растительного сырья за счет вида, систематически близкого к официнальному.

Результаты анатомо-морфологического и химических исследований использованы для разработки методик диагностики и определения качества сырья хвоща лесного. По результатам диссертационной работы разработаны проект Фармакопейной статьи (ФС) «Хвоща лесного трава» и «Инструкция по сбору и сушке травы хвоща лесного».

Результаты анатомо-морфологического исследования хвоща лесного используются для диагностики примесных видов при анализе официнального сырья хвоща полевого и включены в методические пособия, используемые в учебном процессе студентами, интернами. Методики качественного и количественного анализа флавоноидов и фенолокислот в траве хвоща лесного внедрены в научный и учебно-исследовательский процесс кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии, кафедры фармацевтической химии ГБОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет», кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет», кафедры фармакогнозии и ботаники ГБОУ ВПО «Кемеровская государственная медицинская академия».

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии Сибирского государственного медицинского университета в рамках комплексной темы «Разработка инновационных технологий новых фармацевтических продуктов на основе природных биологически активных комплексов» (Регистрационный № 01201152362).

Положения, выдвигаемые на защиту:

1. Результаты анатомо-морфологических и химических исследований, использованных для разработки методик диагностики и определения качества сырья хвоща лесного.

2. Результаты детального химического исследования и установления структуры флавоноидов и фенолокислот хвоща лесного.

3. Результаты исследования индивидуальной, сезонной и географической динамики накопления фенольных соединений в траве хвоща лесного.

4. Методики качественного и количественного анализа ЛРС «Хвоща лесного трава».

Апробация работы. Основные положения диссертации обсуждались на: IX международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» (г.Москва, 2008); научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии и пути их решения» (г. Самара, 2010); межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы фармацевтической науки и образования» (г. Томск, 2011), международной заочной научно-практической конференции «Актуальные проблемы современной медицины» (г. Новосибирск, 2013), VII международной научно-практической конференции «Проблемы современной биологии» (г. Москва, 2013).

Публикации. По результатам исследований опубликовано 15 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендуемых перечнем ВАК.

Работа представляет исследования, выполненные автором в творческом содружестве с сотрудниками кафедры фармакогнозии с курсами ботаники и экологии СибГМУ, кафедры фармацевтической технологии СибГМУ; Института органической химии СО РАН (г. Новосибирск); кафедры химии и технологии материалов современной энергетики Северского государственного технологического института Национального Исследовательского Ядерного Университета «МИФИ» (г. Северск Томской области); Лаборатории получения радиоактивных веществ (Национальный Исследовательский «Томский политехнический университет»); Центральной заводской лаборатории Горно-химического комбината г. Железногорска Красноярского края.

Объем и структура диссертационной работы. Материалы исследования изложены на 141 странице машинописного текста. В тексте приведено 23 таблицы и 21 рисунок. Библиографический указатель включает 134 источника литературы, из них зарубежные - 70.

Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка использованной литературы и приложения.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе дана краткая историческая справка происхождения хвощей, приведены сведения о систематическом, эколого-географическом положении хвоща лесного, сведения о степени изученности биологической активности хвоща лесного и перспективах его применения в медицине.

Во второй главе приведены сведения об объекте исследования, охарактеризованы методы и методики, использованные в работе.

Третья глава посвящена исследованию фенольных соединений хвоща лесного, выделению, идентификации и установлению структуры флавоноидов и фенолокислот данного растения.

В четвертой главе приведена оценка экологической чистоты травы хвоща лесного по результатам изучения элементного состава сырья из различных мест сбора, степени его радиоактивной загрязненности.

Пятая глава посвящена решению вопросов практического использования хвоща лесного: разработке методик определения качества сырья и их валидации, изучению динамики накопления фенольных соединений, разработке товароведческих и микробиологических показателей качества сырья.

В приложении представлены: проект фармакопейной статьи «Хвоща лесного трава», «Инструкция по заготовке и сушке травы хвоща лесного», акты внедрения результатов диссертационного исследования.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования

Объектом исследования являлась надземная часть дикорастущего растения рода Equisetiim L. хвоща лесного Equisetum sylvaticum L., собранная в различных областях России в пределах его естественного ареала. Сбор материала осуществляли в течение всего вегетационного периода (с июня по сентябрь) в 2006, 2008-2011 гг.

Получение экстрактов для химических исследований, разделение на фракции, анализ состава групп БАВ осуществляли с помощью общепринятых методов. Для очистки экстрактов, разделения, выделения, идентификации веществ применяли методы избирательной жидкостной экстракции, спектральные, хроматографические и другие общепринятые методы анализа. Для хроматографического анализа, идентификации и количественного определения фенольных соединений использовали аутентичные вещества производства Fluka, Sigma, Aldrich.

Спектральные исследования проводили на приборах СФ-2000; Specord UR-20; ЯМР-спектры снимали на спектрометре BS-567A (Tesla); Bruker-AM 500.

ВЭЖ-хромато-масс-спектрометрия (метод химической ионизации при атмосферном давлении) проведена в Научно-исследовательском институте органической химии г. Новосибирска. При этом был использован жидкостной хроматограф с диодно-матричным (модель G 1315В) УФ - и масс-селективным детекторами (Agilent Technologies 1100 Series LS/MSD). Условия хроматографирования: колонка Zorbax XDB-C8 Rx-C18 (4,6x150мм) с обращенной фазой, наполнитель (диаметр частиц 5мкм, размер пор 80 А), растворители 2,3% НСООН-МеОН (градиент от 40 до 90% метанола с 5 до 10 минуты), скорость подачи растворителей - 1 мл/мин, температура термостатирования - 30°С, газ- осушитель - азот, скорость подачи газа - 7 л/мин, температура - 340°С, давление на распылителе - 60 psi (фунтов на квадратный дюйм), температура испарителя - 400°С. Возможности диодно-матричного детектора позволили осуществить детектирование и запись спектров поглощения компонентов в диапазоне 230-500 нм. Сканирование для отрицательных и положительных ионов проводилось масс-селективным

детектором, использованным в режиме химической ионизации при атмосферном давлении, в диапазоне m/z от 100 до 1000, что позволило с точностью 0,1а.е. определить молекулярную массу компонентов.

Полученные УФ- и масс-спектры на ВЭЖХ-МС хроматограммах расшифровывали под руководством заведующего кафедрой химии СибГМУ, д-ра хим.наук, профессора М.С.Юсубова и д-ра фарм.наук Н.Э.Коломиец.

Изучение элементного состава образцов проводили методом нейтронно-активационного анализа в НИ ТПУ (г. Томск) и методом рентгенофлуоресцентного анализа в СГТА НИЯУ «МИФИ» (г. Северск).

Исследование внешних и анатомических признаков хвоща лесного проводили в соответствии со статьями «Методы анализа лекарственного растительного сырья», «Техника микроскопического и микрохимического исследования лекарственного растительного сырья» ГФ XI. Для получения ультратонких поперечных срезов стебля и ветвей толщиной 20 мкм использовали микротом «Микротом МЗ-2». Готовые препараты изучали под микроскопом Carl Ziess (увеличения 7x1,5x4,5; 7x1,5x8; 7x1,5x20; 7x1,5x40). Готовые препараты фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата «Sony» Cyber Short 5.1. Полученные снимки обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop CS».

Для оценки качества сырья общепринятыми фармакопейными методиками определяли основные числовые показатели: измельченность сырья, влажность, золу общую и нерастворимую в 10% растворе кислоты хлористоводородной, содержание органической и минеральной примесей.

Химическое исследование фенольных соединений хвоща лесного

Для детального исследования фенольного комплекса хвоща лесного из водно-спиртового извлечения по общепринятой схеме методом избирательной экстракции получали хлороформную, этилацетатную и бутанольную фракции. Из полученных фракций выделяли индивидуальные соединения, которые исследовали методами структурной химии.

Исследование фенольного комплекса хвоща лесного методом колоночной хроматографии позволило выделить 17 веществ фенольной природы, из них - 13 флавоноидов, 3 фенолокислоты, 1 фенольный инданон, структура которых установлена хроматографическими, физико-химическими и спектральными методами. При этом присутствие 3 веществ в хвоще лесном доказано впервые.

Вещество ф-11 выделено в виде бесцветных кристаллов из этилацетатной фракции и водорастворимого остатка этанольного экстракта, Тщ,. 210-212°С. В УФ-спектре вещества присутствуют максимумы

стоп

поглощения X,™» 270, 323 нм (lg е 3,36 и 3,06), указывающие на наличие ацетофенонового хромофора. Положение фенольного гидроксила при С-4 следует из совпадения наблюдаемой полосы поглощения в УФ-спектре (270 нм) с расчетной (272 нм). В ИК-спектре вещества обнаружили полосы поглощения: 3440, 3300 см-1, характерные для валентных колебаний ОН-группы, 1690 см-1, характерные для валентных колебаний С=0, 1600 см",

характерные для валентных колебаний ароматической С=С связи. В ПМР-спектре ТМС-эфира вещества ф-11 снятом в СС14 (м.д., ./, Гц) не регистрировали сигналы ароматических протонов. Также в ПМР-спектре регистрировали сигналы четырех метальных групп: 2,18 и 2,30 (с, по ЗН, СН3- при С-5, С-7), 1,08 (с, 6Н, 2СН3- при С-2); сигналы изолированной метиленовой группы 2,62 (с, -СН2-) и сигналы при 2,84 и 3,54 (м, 8.0 Гц, НОСН2-СН2- при С-6), принадлежащие протонам оксиэтальной цепи. Наличие бензольного кольца следует из наличия в спектре 13С-ЯМР, снятом в ДМСО, 100 МГц шести сигналов в области 127-150 м.д. (127,6; 130,2; 130,6; 136,8; 136,9; 149,9).

он

Таким образом, по совокупности полученных данных и сравнением с данными литературы для вещества ф-11 предложено строение 2,2,5,7-тетраметил-4-оксн-6-(2'-оксиэтил)-инданон или онитин.

Вещество ф-12 выделено из этилацетатной фракции. Вещество ф-12 было элюировано с полиамидной колонки. После перекристаллизации были получены желтые игольчатые кристаллы, Тпл. которых составила 240-242°С. Данное вещество дает красновато-оранжевую окраску с раствором РЬ(СН3СОО)2, оранжево-желтую - с растворами NaOH и Mg(CH3COO)2. При хроматографическом исследовании вещества ф-12 установлено, что оно имеет желтовато-зеленую флюоресценцию, не изменяющуюся после проявления парами аммиака, значения Rf в системе БУВ (4:1:5) - 0,15, в системе СНзСООН - 0,08 соответственно. В Уф-спектре вещества ф-12 наблюдали максимумы: Х^"1"" 263, 280пл., ЗОбпл., 345, 390 нм; к Z!' 269пл.,

Л1С1,-ИЮ ¡СНЪОНа

278, 321пл., 470 нм; А,™» 260пл., 273, 286пл., 316пл.,449 нм; 280,

СН^СООХа

376нм; X "»« 271, 390, 444пл.

Гидролиз вещества ф-12 приводит к образованию агликона госсипетана и глюкозы, идентификацию которых проводили на основании данных хроматографического исследования и УФ-спектров. Агликон

СНгСООХа

госсипетин дает максимумы при X 338, 386 нм; А.™» 370, 625 нм. При добавлении ацетата натрия к раствору агликона синяя окраска исчезает в течение 5-10 минут. Синяя окраска пятна агликона при

хроматографировании на бумаге более устойчивая (около 48 часов), но приобретает характерный синий цвет в течение 30 минут.

Таким образом, на основании полученных данных в сравнении с данными литературы вещество ф-12 было идентифицировано как госсипетин-7-глюкозид или эквиспорозид, госсипетрин.

Темно-желтые кристаллы вещества ф-13 были получены из этилацетатной фракции, Т„,. полученных кристаллов составила 228°С.

При хроматографировании на бумаге вещество ф-13 имеет коричневую флюоресценцию, не изменяющуюся после проявления парами аммиака, значения Rf в системе БУВ (4:1:5) - 0,78, в системе 15% СН3СООН - 0,06 соответственно. В УФ-спектре вещества ф-13 наблюдали максимумы:

337, 388 нм; Х^ 276, 310, 359, 450 нм; X™« 274, 308, 357, 434

СН,СООХа

нм; Х»'-1* 280, 336, 388 нм. При перекисном окислении ф-13 образуется только глюкоза. При кислотном гидролизе вещества образуется углеводный остаток (глюкоза) и агликон, структуру которого устанавливали по результатам хроматографического исследования, данным спектроскопии и сравнением с данными литературы. Структуру углевода устанавливали хроматографически сравнением с аутентичными образцами Сахаров.

Таким образом, на основании полученных данных в сравнении с данными литературы вещество ф-13 было идентифицировано как гербацетин — 3- глюкозид или гербацетрин.

Вещество ф-14 в виде желтых кристаллов выделено из этилацетатной фракции. Тпл. полученных кристаллов составила 181-183°С. Выделенное вещество дает оливково-зеленую окраску с раствором FeCl3, розовую - с металлическим цинком в присутствии HCL (цианидиновая проба). При хроматографировании этого вещества в УФ-свете образуется зона с темно -фиолетовой флюоресценцией. После обработки хроматограммы раствором NH3 эта зона становится темно желтой. Значения Rf 0.68 в системе БУВ 4:1:5; 0.44 в системе 15% СН3СООН; 0.28 в системе 5% СН3СООН. В УФ-спектре

а пои

регистрировали следующие максимумы: 257,266пл., 296пл., 357 нм;

C/i,COO.Va .ис/,

А.»» 273, 325, 398 нм; X»« 273, 433нм; \А™>+"а269, 300, 364, 398 нм;

•¡С7/ 2 О Sa

Л™"са0У°*'пвт 261, 299, 377 нм, 274, 327, 414 нм. Гипсохромный сдвиг на 8 нм I полосы вещества ф - 14 по сравнению с агликоном позволил предположить З-О-гликозилирование.

Кислотный гидролиз исследуемого вещества приводит к образованию кверцетина и D-глюкозы, в соотношении 1:2. Ферментативный гидролиз привел к образованию двух флавоноидов и углеводного остатка. Один из двух флавоноидов был идентифицирован как кверцетин, другой - как кверцетин-3-глюкозид по результатам качественных цветных реакций и кислотного гидролиза. Углеводный остаток был отождествлен с D-глюкозой.

Частичный гидролиз вещества ф-14 приводил к образованию кверцетин-З-О-глюкозида, кверцетина и D-глюкозы, идентификацию

и

которых проводили хроматографическими методами, сравнением с аутентичными веществами.

Флавоноидный гликозид и углеводный остаток, образовавшиеся в результате ферментативного гидролиза вещества ф-14, были идентифицированы как кверцетин-3-глюкозид и D-глюкоза.

Перекисное окисление вещества ф-14 привело к образованию дисахарида, идентифицированного как гентобиоза с помощью хроматографии на бумаге по значениям RfB системах: БУВ 4:1:5 (Rf 0,15); н-бутанол - этиловый спирт-вода 4:1:4 (Rf 0,1) и сравнением с аутентичными образцами.

Таким образом, вещество ф-14 было охарактеризовано как кверцетин-3-0-(6-0-р-0-глюкопиранозил)-р-Б-глюкопиранозил или мератин.

С целью подтверждения и уточнения состава флавоноидов и фенолокислот хвоща лесного использован метод высокоэффективной хромато-масс-спектрометрии (ВЭЖХ-МС). Анализу подвергли обогащенные фенольными соединениями хлороформные, этилацетатные и бутанольные фракции водно-спиртового экстракта.

Структуру соединений устанавливали сравнением главных критериев на ВЭЖХ-МС-хроматограммах (время удерживания на хроматограммах, значения максимумов поглощения в УФ-спектрах и m/z в масс-спектрах) соответствующих фракций с аналогичными данными аутентичных образцов и данными литературы Данным методом в хлороформной, этилацетатной и бутанольной фракциях хвоща лесного подтверждено присутствие 8 веществ фенольной природы, выделенных и идентифицированных хроматографическими и спектральными методами: кемпферол-3-O-ß-D-глюкозида, кемпферол-7-глюкозида, кемпферол-З-О-7-О-диглюкозида, кверцетин-3-диглюкозид, кверцетин-3-рутинозида, гликозида госсипетина, кофейной и и-кумаровой кислот (табл.1).

Таблица 1

Фенольные соединения надземной части хвоща лесного_

Выделено и Структура

№ Название вещества идентифициро- подтверждена

вано методами или предположена

структурной методом

химии ВЭЖХ-МС

1 Кемпферол-З-глюкозид (астрагалин) + +

2 Кверцетин-З-глюкозид (изокверцитрин) +

3 Кемпферол-7-глюкозид + +

4 Кемпферол-З-рутинозид (никотифлорин) +

5 Кемпферол-З-глюкозид-7-рамнозид +

6 Кверцетин-З-рутинозид (рутин) + +

7 Кемпферол-3,7-Диглюкозид + +

8 Кверцетин-З-глюкозид-7-рамнозид +

9 Кверцетин-З-рутинозид-7-рамнозид +

10 Кемпферол-З-О-рутинозид-7-О-глюкозид +

11' Госсипетин-7-глюкозид (госсипетрин, эквиспорозид) + +

12 Гербацетин-З-глкжозид (гербацетрин) +

13* Кверцетин-З-диглюкозид (мератин) + +

14 гс-кумаровая кислота + +

15 Протокатеховая кислота +

16 Кофейная кислота + +

17* Онитин +

18' Полигликозилированный флавоноид +

- вещества, идентифицированные впервые

Необходимо отметить, что методом ВЭЖХ-МС нами получены новые данные о химическом составе хвоща лесного. С максимально возможной для данного метода достоверностью можно говорить о присутствии в хвоще лесном полигликозилированного флавоноида.

Точную информацию о величине молекулярной массы вещества, образующего пик на хроматограмме со временем удерживания 5.025-^5.798мин, дают нам, в первую очередь, масс-спектры, записанные в режимах Neg.Scan. и Pos.Scan. Так, в режиме Pos.Scan, в области молекулярного иона наблюдается пик молекулярного иона М+ с m/z 923,2, интенсивностью 100% (рис.1). Очевидно, что это соединение имеет М.в. основного компонента 922,2. Присутствие в УФ-спектре этого вещества максимумов поглощения при 263 и 363 нм позволяет нам предполагать его флавоноидную природу (рис.2). На то, что агликоном данного вещества является флавонол кверцетин, указывает пик фрагментарного иона с m/z 302,1 и интенсивностью 27%. Расчеты также подтверждают, наше предположение о том, что агликоном этого соединения может быть кверцетин (922-147-147-163-163)=302. Основываясь на данных литературы об известных природных гликозилированных структурах, содержащих более двух углеводных заместителей, можно предполагать что углеводные заместители в данном соединении могут располагаться в кольце А в 3,7-положении, в кольце В в 4'-положении. Известно, что в тригликозидах флавоноидов, выделенных из хвощей, 3-положение молекулы агликона гликозилируется чаще всего биозой, а 7-положение - глюкозой или рамнозой. В единственной публикации, связанной с обнаружением в хвоще болотном пентагликозида кемпферола сообщалось, что глюкоза и рамноза в данном веществе присоединяются к молекуле агликона по 3- и 7-положению молекулы.

Таким образом, на основании совокупности полученных экспериментальных данных (УФ- и масс-спектры, снятые в двух режимах ХИ) и данных литературы мы получили ценную информацию, позволяющую с высокой степенью достоверности предполагать, что данное соединение может являться полигликозилированным кверцетином, имеющим четыре углеводных заместителя, которые могут располагаться в 3-, 7— положении в кольце А. Безусловно, для окончательного подтверждения структуры

необходимо выделение вещества и установление всего набора спектральных и физико-химических характеристик общепринятыми методами.

молекулярного иона полигликозилированного флавоноида (m/z 923,1) и неидентифицированного пика (m/z 622,1) в режиме APCI Pos. Scan.

Таким образом, проведенное нами исследование фенольных соединений надземной части хвоща лесного методами структурной химии и ВЭЖХ-масс-спектрометрии позволило установить наличие 18 веществ (14 флавоноидов, 3 фенолокислоты, 1 фенольный инданон), из них - 4 новых вещества, не известных для хвоща лесного ранее: онитин, госсипетрин, кверцетин-3-диглюкозид, полигликозилированный кверцетин.

Впервые о нахождении онитина (2,2,5,7-тетраметил-4-окси-6-(2'-оксиэтил)-инданон) было сообщено А.И. Сырчиной в 1980-х годах прошлого века в другом виде хвоща - хвоще полевом. В 2004 году присутствие этого вещества также было подтверждено исследованиями корейских ученых, которые выделили онитин и онитин-9-О-глюкозид из метанольного экстракта хвоща полевого в числе прочих веществ фенольной природы. При этом

этими же авторами экспериментально in vitro для онитина была установлена гепатопротекторная и антирадикальная активность.

Обнаружение онитина в хвоще лесном представляет особый интерес в связи с тем, что фенольные инданоны на сегодняшний день - самая малочисленная группа из всех природных инданонов, большинство из которых обнаружены только в папоротниках - филогенетически древних представителях растительного мира. При этом многие инданоны обладают ценными биоактивными свойствами: бактерицидными, цитотоксическими, антикоагулянтными и другими. Хвощи, как и папоротники - представители древнейших растений, поэтому нахождение производных инданона представляется особенно интересным, как с филогенетической точки зрения, так и с точки зрения объяснения гепатопротекторных свойств хвоща лесного и хвоща полевого.

Присутствие гербацитрина в хвоще лесном подтверждено нами после его обнаружения в канадских образцах данного вида Н.Салехом с соавторами в 1972 г.

Нахождение госсипетрина в хвоще лесном представляет, прежде всего, научный интерес, поскольку ранее считалось, что госсипетрин и гербацетин — желтые флавоноловые пигменты - являются таксономическими маркерами только для высших растений семейств Fabaceae, Ericaceae, Papaveraceae и играют роль пигментов цветков. Хвощи же, как известно являются споровыми растениями, которые цветков не образуют.

Использование метода ВЭЖХ-МС позволило нам не только уточнить состав фенольных соединений хвоща лесного, но и с определенной степенью достоверности предположить присутствие полигликозилированного флавонола кверцетина. Присутствие этой редкой разновидности флавоноидов в видах рода хвощ по данным С.Бекмана, Х.Гайгера, Н.Салеха и Д.Харборна является спорным. Однако исследования других авторов позволили не только выделить из наиболее примитивных высших растений, принадлежащих к отделу печеночных мхов, но и установить структуру первого полигликозированного 8-метоксилютеолина, содержащего 18 углеводных остатков в 7 — и 41- положениях. Французскими учеными в 2001 году из Astragalus caprinus выделено несколько полигликозидов кемпферола, кверцетина и их ацилированных и метилированных производных.

Следует отметить, что обнаружение новых фенольных соединений в исследуемом нами хвоще лесном представляет научный интерес не только с точки зрения получения новых сведений о химическом составе данного вида, объяснения связи с фармакологическим действием, решения спорных вопросов таксономии рода хвощ, но и химии природных соединений вообще.

Исследование элементного состава хвоща лесного, как показателя экологической чистоты сырья

Исследование элементного состава лекарственных растений имеет значение, как с научной, так и практической точек зрения. Так, научная составляющая этого вопроса связана с тем, что в настоящее время состав

химических элементов семейств и родов рассматривается как дополнительный хемотаксономический признак в систематике растений. Практический интерес к данному вопросу обусловлен тем, что макро- и микроэлементы, по своей сути являются биологически активными веществами лекарственных растений, и могут определять как самостоятельный фармакологический эффект фитопрепаратов, так и потенцировать их биологические свойства.

Интерес к вопросу о содержании химических элементов специалистов-экологов и фармакогностов обусловлен мировой тенденцией, связанной с пристальным вниманием к вопросам экологической безопасности, и в частности, чистоте заготавливаемого лекарственного сырья. Для рекомендации хвоща лесного в медицинскую практику представляло интерес провести определение содержания химических элементов и радионуклидов в образцах из различных мест его естественного обитания с точки зрения оценки экологической чистоты сырья.

Во всех двадцати анализируемых образцах из разных регионов Российской Федерации, в том числе районов с интенсивной угле-, нефтедобычей и переработкой, установлено наличие 34 макро- и микроэлементов, среди которых - биогенные, токсичные и очень редкие элементы. При этом нами отмечено, что состав и содержание химических элементов в надземной части хвоща лесного сходно и не отличалось в зависимости от места заготовки.

Результаты определения некоторых биогенных и токсичных элементов, полученные рентгено-флуоресцентным методом, и представленные в таблице 2, сравнивали с ПДК СанПиН 2.3.2.560-96 «Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов» (для биологически активных добавок к пище на растительной основе, для фруктов и овощей). Сравнение полученных значений с ПДК для БАД на растительной основе и БАД на овощи и фрукты, показывает, что все 20 исследованных образцов соответствуют данным требованиям.

Таблица 2

Элементный состав хвоща лесного, определенный рентгено-

флуорецентным методом, мг/кг (в пересчете на абс.-сух.сырье)

Образцы Элементы

РЬ Хп № Си Мп Сг БЬ Нд Бг

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

1 1,22 ±0,62 13, 70 ±5, 14 1,90 ±0,81 1,59 ±0,43 30,21 ±12,20 0,52 ±0,31 <0,006 <1,0 3,47± 1,50

1,18 10,22 2,44 1,67 40,33 0,43 <0,006 <1,0 4,04±

±0,43 ±4,11 ±0,92 ±0,39 ±17,30 ±0,21* 0,93

1,78 16,55 3,75± 1,45 27,51 0,83 <0,006 <1,0 2,98±

±0,71 ±10,00 1,01 ±0,62 ±13,02 ±0,33 0,61

1,72 17,50 2,80 1,33 30,1 0,52 <0,006 <1,0 3,91±

±0,70 ±7,0 ±1,1 ±0,5 ±12,0 ±0,20 0,92

0, 59 22,54 0,38 0,29 18,60 0,33 <0,006 < 1,0 4,07±

±0,21 ± 15,4 ±0,13 ±0,10 ±7,93 ±0,11 1,60

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10

6 3,43± 0,82 28,16 ±8,74 4,66 ±1,92 1,67± 0,48 25,82± 8,43 0,22 ±0,08 <0,006 <1,0 5,08± 2,40

7 1,80 ± 0,10 26,72 ±8,04 2,40± 1,03 1,64± 0,50 28,00± 15,1 0,46 ±0,27 <0,006 <1,0 3,32± 0,12

8 1,78 ±0,81 26,20 ±6,23 2,12± 0,74 1,25± 0,43 33,15± 12,2 0,52 ±0,14 <0,006 <1,0 2,00± 0,27

9 1,96± 0,81 18,00 ±6,40 3,49± 1,09 2,07± 0,71 25,30± 12,22 0,47 ±0,13 <0,006 <1,0 2,80± 0,93

10 1,15 ±0,47 20,72 ±8,04 3,35 ±1,33 1,52 ±0,51 25,34 ±12,11 0,72 ±0,20 <0,006 <1,0 3,15± 0,78

И 1,05± 0,63 1,71± 0,48 2,4 8± 1,02 1,90± 0,52 30,47± 10,06 0,39 ±0,12 <0,006 <1,0 3,96± 0,87

12 2,10± 0,63 18,40 ±8,18 2,20± 1,04 1,50± 0,69 3,00± 10,71 0,60± 0,21 0,002 <1,0 2,81± 0,91

13 2,32 ±0,88 18,70 ±6,61 2,84 ±1,16 1,13 ±0,55 36,20 ±12,0 0,72 ±0,26 <0,006 <1,0 2,94± 0,98

14 3,33 ±1,20 15,59 ±6,01 2,76 ±1,07 2,13 ±0,73 26,77 ±10,07 0,42 ±0,2 <0,006 <1,0 3,11± 0,92

15 1,54 ±0,67 18,59 ±7,07 2,80 ±1,1 1,78 ±0,59 33,13 ±13,01 0,58 ±0,22 <0,006 <1,0 3,01± 0,92

16 2,12 ±0,83 19,30 ±7,30 2,36 ±1,04 1,30 ±0,51 40,04 ±14,01 0,50 ±0,20 <0,006 <1,0 3,70± 0,90

17 2,35 ±0,79 17,60 ±7,04 2,36 ±1,05 1,30 ±0,51 28,18 ±11,80 0,48 ±0,20 <0,006 <1,0 3,81± 0,92

18 1,89 ±0,74 18,80 ±7,60 2,80 ±1,11 1,33 ±0,47 31,71 ±12,20 0,49 ±0,21 <0,006 <1,0 3,91± 0,97

19 1,67 ±0,68 19,10 ±7,60 2,89 ±1,23 1,43 ±0,53 35,71 ±14,01 0,50 ±0,22 <0,006 <1,0 4,12± 0,98

20 1,70 ±0,71 17,70 ±7,04 3,00 ±1,51 1,40 ±0,45 28,17 ±11,02 0,52 ±0,20 <0,006 <1,0 3,96± 0,90

ПДК СанПиН 2.3.2.560-96

БАД на раст.основе 6,0 - - -

БАД овощи 5,0 100,0 5,0 50,0

БАД фрукты 4,0 100,0 5,0 50,0

Определение радиоактивных нуклидов. Определение радиоактивных нуклидов проводили на примере образца хвоща лесного, заготовленного в окрестностях г. Северска Томской области, в котором расположена вторая в мире по мощности промышленная атомная станция. Результаты показали, что содержание искусственных радиоактивных нуклидов в траве хвоща лесного не превышает допустимые уровни (согласно ОФС 42-001-03 для лекарственного сырья и не представляет опасности для потребителей).

Разработка методик стандартизации травы хвоща лесного

Внедрение нового лекарственного растительного сырья в медицинскую практику невозможно без стандартизации этого сырья и разработки на основе полученных результатов проектов нормативной документации. К ним

относятся инструкции по заготовке и сушке сырья, фармакопейные статьи и т.п.

В качестве доминирующих компонентов для стандартизации травы хвоща лесного нами выбраны флавоноиды и фенолокислоты. Для данных групп БАВ разработаны методики качественного и количественного анализа, проведена их валидация, изучена динамика накопления флавоноидов и фенолокислот в траве хвоща лесного. Кроме того, были определены товароведческие показатели сырья; выявлены его диагностические внешние и анатомические признаки.

Для определения подлинности сырья использовали метод тонкослойной хроматографии со стандартными образцами кофейной кислоты и рутина, присутствие которых доказано нами хроматографически.

При выборе методики количественного определения флавоноидов в исследуемом объекте руководствовались требованиями, предъявляемыми к современной нормативной документации. Прежде всего, методики определения качества лекарственного сырья и фитопрепаратов должны быть гармонизированы с международными фармакопеями.

Для количественного определения суммы фенолокислот в траве хвоща лесного использовали общепринятый для данной группы БАВ метод прямого спектрофотометрического анализа (при длине волны 322±5нм в пересчете на кофейную кислоту).

Оптимальными параметрами экстракции фенолокислот из сырья являются: измельченность сырья — 1-3 мм; экстрагент - 40%-ый этиловый спирт, температура экстракции — 80°С, время экстракции - 45 минут; двукратная экстракция.

При разработке методики количественного определения флавоноидов в траве хвоща лесного за основу нами выбрана методика количественного определения флавоноидов в филогенетически и химически близком виде хвоща - траве хвоща полевого в Европейской и Британской фармакопеях. Данная методика предполагает использование при пробоподготовке кислотного гидролиза флавоноидов в присутствии ацетона, гексаметилентетрамина и последующее извлечение агликонов этилацетатом. Далее для количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на кверцетин нами использован метод дифференциальной спектроскопии, основанный на комплексообразующей реакции с алюминия хлоридом. Зарубежные фармакопеи предполагают на этом заключительном этапе методики количественного определения использовать метод ВЭЖХ.

Нами установлено, что оптимальными параметрами экстракции флавоноидов из травы хвоща лесного являются: измельченность — 1-3 мм; трехкратная экстракция, время ступенчатой экстракции - 50 минут; объем кислоты хлористоводородной - 2 мл; время реакции - 30 минут.

Для подтверждения степени пригодности предлагаемых методик спектрофотометрического определения флавоноидов и фенолокислот нами была проведена их валидация по прецизионности (повторяемость и

воспроизводимость (лабораторная и межлабораторная), правильности и линейности, которая подтвердила, что предлагаемые методики количественного определения флавоноидов и фенолокислот в траве хвоща лесного являются правильными, воспроизводимыми и линейными.

Изучение динамики накопления фенольных соединений

Для обоснования оптимальных сроков заготовки травы хвоща лесного нами изучена индивидуальная, сезонная и географическая изменчивость накопления флавоноидов и фенолокислот в образцах надземной части хвоща лесного, собранных в двух наиболее характерных для этого вида местообитаниях (мелколиственный лес, заросли кустарников). Образцы для исследования заготавливали в течение всего срока вегетации растения в разных регионах РФ.

Для оценки полученных данных и выяснения возможной вариабельности признаков рассчитывали коэффициент вариации, и определяли диапазон варьирования полученных данных. А для оценки отклонения минимальной и максимальной величины выборки от среднего арифметического в вариационном ряду был проведен расчет нормированного отклонения Л

Индивидуальную изменчивость изучали на примере 25 образцов хвоща лесного, заготовленных в июле 2008 г. в Томской области в пределах одной ценопопуляции.

Изменчивость содержания флавоноидов в индивидуальных растениях хвоща лесного составила СУ= 15,34%, с диапазоном варьирования 0,1890,336% и 5=0,2656, изменчивость содержания фенолокислот составила СУ=13,49%, с диапазоном варьирования 0,170-0,260% и о=0,206, что в соответствии со шкалой изменчивости признаков является средним. Полученные результаты позволяют говорить о стабильности данных признаков внутри ценопопуляции хвоща лесного.

Кроме того, нами проведен расчет нормированного отклонения (I). Расчеты показали, что данная выборка согласуется с «правилом трех сигм» или «правилом трех б», укладываясь в пределы -2 до +2: для флавоноидов — 11=-1,87,12=1,8; для фенолокислот- 11=-1,31, \2=\,97.

Анализ полученных результатов по индивидуальной изменчивости содержания флавоноидов и фенолокислот в траве хвоща лесного показывает, что их достоверность составляет не менее 95,4 %.

Изучение географической (межпопуляционной) изменчивости позволяет объяснить различия в химическом составе вида и наличия хемотипов, существование которых связывают с географическим фактором. Наличие химической неоднородности в пределах ареала может иметь большое практическое значение, поскольку содержание и качественный состав биологически активных веществ определяют качество лекарственного сырья.

Нами проанализированы результаты определения содержания флавоноидов и фенолокислот на 6 образцах хвоща лесного, собранного приблизительно в одни сроки в разных областях Российской Федерации.

Как показали результаты, содержание флавоноидов в образцах хвоща лесного из различных регионов характеризуется низкой вариабельностью СУ=5,22%, с диапазоном варьирования 0,361-0,399, а содержание фенолокислот - средней вариабельностью СУ= 13,42%, с диапазоном варьирования 0,120-0,165.

Расчет нормированного отклонения /, показало, что минимальная и максимальная величина выборки отличается от среднего арифметического в вариационном ряду и укладывается в пределы -2 до +2: для флавоноидов -11=-0,61,12=1,33; для фенолокислот- 11=-0,87,12=1,58.

Таким образом, в нашем случае можно говорить о том, что полученные результаты по географической изменчивости содержания флавоноидов и фенолокислот соответствует не менее чем 95,4% достоверности.

Изучение сезонной (хронографической) изменчивости проведено в образцах надземной части хвоща лесного, заготовленных в разных регионах Российской Федерации в течение всего вегетационного периода.

При изучении сезонной динамики нами было установлено, что максимальное содержание фенолокислот в траве хвоща лесного наблюдается только в начальный период вегетации растения (в начале июня) и в конце вегетации (приблизительно в начале сентября). Начиная с середины июня и до середины августа содержание фенолокислот снижается, в то время как содержание флавоноидов в этот временной интервал находится на максимальных значениях.

На основании полученной информации о сезонных особенностях накопления флавоноидов и фенолокислот необходимо было решить вопрос о сроках заготовки травы хвоща лесного и выборе группы БАВ для стандартизации сырья. На наш взгляд, для увеличения срока заготовки сырья, а, именно, в течение всего вегетационного периода растения, целесообразно проводить стандартизацию сырья по содержанию флавоноидов. Обоснованным данным решение можно считать и с точки зрения биологической роли флавоноидов в фармакологическом действии данного вида.

Кроме содержания действующих веществ показателями качества сырья являются микробиологическая чистота, влажность, содержание золы и примесей, пределы которых нами также установлены экспериментально.

Для диагностики цельного и измельченного сырья хвоща лесного, кроме хроматографического анализа, проведено анатомо-морфологическое исследование надземной части растения.

Диагностически значимыми внешними признаками травы хвоща лесного являются наличие нежесткого стебля с вторично ветвящимися, отклоненными вниз, тонкими ветвями; наличие на ребрах стеблей (рис.3а,б,в) и веточек (рис.3г,д) двух рядов роговидных выростов (или шипиков); и

наличие в бороздках хорошо заметных не упорядоченно расположенных устьиц с характерной лучистой складчатостью (рис.Зв).

Рис. 3. Хвощ лесной. Фрагменты морфологического и микроморфологического строения травы хвоща лесного

Обозначения: фрагмент стебля (1,2,3) и веточки (4,5) с роговидными выростами на гребнях и устьицами в бороздках (стереомикроскоп, отраженный свет, увеличение 15x8, 15x8x4)

К диагностически значимым анатомическим особенностям травы хвоща лесного (рис.4) можно отнести наличие: в бороздках длинных вытянутых клеток с прямыми или слегка извилистыми пористыми стенками (2,3,7,8); устьиц с характерной лучистой складчатостью кутикулы, которые

локализуются в основании ребер и сопровождают бороздку, располагаясь в один, два, три, реже четыре неупорядоченных ряда (6-8); по краям ребер больших сосочковидных выступов (выростов); слабоволнистого контура на ребрах ветвей (1-4).

Рис.4. Фрагменты анатомического строения травы хвоща лесного

Обозначения: эпидермис стебля: ребра с выступами (1,4); бороздки с устьицами (2,5) (ув.120х). Сосочковидные выросты на ребрах (6) (ув.240х). Эпидермис веточки: с трех (8) и однорядным (7) расположением устьиц (ув.240х; 120х). Фрагмент эпидермиса со слабоволнистым контуром по краю (3) (ув.240х)

На основании проведенных исследований разработан проект ФС «Хвоща лесного трава» и «Инструкция по сбору и сушке хвоща лесного».

ВЫВОДЫ

1. Из надземной части хвоща лесного выделено и идентифицировано 17 веществ фенольной природы: кемпферол-З-О-Р-Б-глюкозид, кверцетин-3-глюкозид, кемпферол-7-глюкозид, кемпферол-3-рутинозид, кемпферол-3-глюкозид-7-рамнозид, кемпферол-3,7-диглюкозид, кверцетин-З-глюкозид-7-рамнозид, кемпферол-З-О-рутинозид-7-О-глюкозид, кверцетин-3-рутинозид-7-рамнозид, онитин, кемпферол-З-О-рутинозид-7-О-глюкозид, гербацетин-3-глюкозид, госсипетин-7-глюкозид, кверцетин-3-диглюкозид, и-кумаровая кислота, кофейная кислота, протокатеховая кислота.

Впервые из хвоща лесного выделены фенольный инданон - онитин, флавоноиды - госсипетин-7-глюкозид и кверцетин-3-диглюкозид.

2. Установлено наличие 34 макро- и микроэлементов, среди которых биогенные, токсичные и очень редкие элементы, содержание которых не зависит от места заготовки сырья.

3. Разработаны методики количественного определения флавоноидов и фенолокислот хвоща лесного. На основании результатов изучения динамики накопления фенольных соединений для стандартизации травы хвоща лесного предложены флавоноиды.

4. Установлено, что заготовку травы хвоща лесного целесообразно проводить в течение всего срока вегетации растения в пределах его естественного ареала.

5. К диагностическим признакам сырья относятся: наличие устьиц в бороздках с характерной лучистой складчатостью кутикулы и их расположение нечетко выраженными продольными рядами; наличие характерных сосочковидных выростов на ребрах стеблей.

6. Установлено, что числовые показатели сырья для цельной и измельченной травы хвоща лесного характеризуются следующими значениями: флавоноидов в пересчете на кверцетин не менее 0,2%; влажность не более 13%; золы общей не более 20%; золы, нерастворимой в 10% растворе хлористоводородной кислоты, не более 10%; частиц, не проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 3 мм, не более 10%; других частей растения (корневищ, корней), не более 1 %; частиц, не проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 7 мм, не более 10%; частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 0,25 мм не более 15%; органической примеси (в том числе других видов хвощей), не более 4%; минеральной примеси не более 1%.

7. На основании выполненных исследований разработан проект Фармакопейной статьи «Хвоща лесного трава», «Инструкция по сбору и сушке травы хвоща лесного».

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Коломиец, Н.Э. Экологические аспекты заготовки и использования лекарственного растительного сырья / Н.Э. Коломиец, Г.И.Калинкина A.A. Марьин, P.A. Бондарчук // Известия Самарского научного центра. - 2010. - Том 12 (33). - №1 (8). -С.2051-2055.

2. Бондарчук, P.A. Исследование фенольных соединений хвоща лесного Equisetum sylvaticum L. / P.A. Бондарчук, Н.Э.Коломиец // Бюллетень сибирской медицины. - 2011. - №5. - С.25-29.

3. Коломиец, Н.Э. Гепатопротекторные свойства хвощей / Н.Э.Коломиец, В.В. Шейкин, A.B. Ратькин, P.A. Бондарчук // Фармация. -2011.- №7.- С. 15-16.

4. Коломиец, Н.Э. Растения рода хвощ (Equisetum L.) - перспективные источники новых лекарственных препаратов / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, P.A. Бондарчук // Сборник научных трудов IX международного конгресса «Здоровье и образование в XXI веке» «Влияние космической погоды на биологические системы в свете учения А.Л.Чижевского». -Москва, 2008. - С.260-261.

5. Бондарчук, P.A. Количественное определение флавоноидов в траве хвоща лесного / Р.А.Бондарчук, Н.Э.Коломиец // Сборник трудов межрегиональной научно-практической конференции с международным участием «Актуальные вопросы фармацевтической науки и образования». -Томск: Изд-во «Печатная мануфактура», 2011. - С.34-36.

6. Калинкина, Г.И. Подходы к рациональному использованию лекарственного растительного сырья / Г.И. Калинкина, Н.Э. Коломиец, Р.А.Бондарчук // «Актуальные вопросы современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (14 января 2013 г.). - Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013. - С. 138-141.

7. Коломиец, Н.Э. Исследование структуры нового вещества, выделенного из хвоща лесного методом рентгеноструктурного анализа / Н.Э.Коломиец, P.A. Бондарчук // «Актуальные вопросы современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (14 января 2013 г.). — Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013. - С. 146-149.

8. Коломиец, Н.Э. Проблемы унификации требований к оценке качества растительного сырья / Н.Э. Коломиец, Г.И. Калинкина, Р.А.Бондарчук // «Актуальные вопросы современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (14 января 2013 г.). - Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013. - С. 142-146.

9. Полуэктова, T.B. Исследование утеротропной активности некоторых дикорастущих и культивируемых растений флоры Сибири / Т.В.Полуэктова, Н.Э. Коломиец, P.A. Бондарчук // «Актуальные вопросы современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (14 января 2013 г.). - Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013.-С. 154-157.

10. Бондарчук, P.A. К выбору метода количественного определения флавоноидов в траве хвоща лесного / P.A. Бондарчук, Н.Э. Коломиец, И.М. Смолякова, A.A. Марьин // «Актуальные вопросы современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (14 января 2013 г.). - Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013. - С. 120-123.

11. Бондарчук, P.A. Количественное определение фенолокислот в траве хвоща лесного / P.A. Бондарчук, Н.Э. Коломиец, И.М. Смолякова, A.A. Марьин // «Актуальные вопросы современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции. (14 января 2013 г.). - Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013. -С.124-127.

12. Бондарчук, P.A. Валидация методики спектрофотометрического определения суммы фенолокислот в траве хвоща лесного / P.A. Бондарчук, Н.Э. Коломиец, И.М. Смолякова, A.A. Марьин // «Актуальные вопросы современной медицины»: материалы международной заочной научно-практической конференции (14 января 2013 г.). - Новосибирск: Изд. «СибАК», 2013. - С.128-133.

13. Бондарчук, P.A. Оценка элементного состава хвоща лесного, произрастающего в Кемеровской области / P.A. Бондарчук, Н.Э. Коломиец, A.A. Марьин, Н.Ю. Абрамец // «Проблемы современной биологии»: материалы VII международной научно-практической конференции (15.01.2013). - Москва, 2013. - С.94-97.

14. Бондарчук, P.A. К вопросу о радиоактивной чистоте некоторых видов, произрастающих в районе ОАО «Сибирский химический комбинат» / Р.А.Бондарчук, Н.Э. Коломиец, A.A. Марьин, Н.Ю. Абрамец // «Проблемы современной биологии»: материалы VII международной научно-практической конференции (15.01.2013). - Москва, 2013. - С. 50-54.

15. Бондарчук, P.A. Разработка показателей качества травы хвоща лесного / P.A. Бондарчук, Н.Э. Коломиец // «Проблемы современной биологии»: материалы VII международной научно-практической конференции (15.01.2013). -Москва, 2013. -С.55-57.

Заказ 160. Тираж 100.

Томский государственный университет систем управления и радиоэлектроники

634050, г. Томск, пр. Ленина, 40. Тел. 533018.