Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Биофармацевтическое исследование гемцитабина-противоопухолевого лекарственного средства группы антиметаболитов

003488154 На правах рукописи

ПАРШИНА Наталья Анатольевна

БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕМЦИТАБИНА -ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ГРУППЫ

АНТИМЕТАБОЛИТОВ

15.00.02 — фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ДЕК 2009

Москва—2009

003488154

Работа выполнена в экспресс-лаборатории централизованного клинико-диагностического отдела РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН и на кафедре фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета ГОУ ВПО Российский Университет дружбы народов

Научные руководители:

доктор биологических наук профессор Байкова Валентина Николаевна доктор химических наук профессор Плетенева Татьяна Вадимовна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук профессор Берлянд Александр Семенович доктор биологических наук профессор Горбачева Лора Борисовна

Ведущая организация: Российский Государственный Медицинский Университет

Защита диссертации состоится «25» декабря 2009 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д.212.203.13 при Российском университете дружбы народов (117198 г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РУДН (117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6).

Автореферат разослан « » ноября 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор биологических наук профессор

Е. В. Лукашева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность темы. Гемцитабин (2',2'-дифтородезоксицитидин, торговое название «Гемзар») - лекарственное средство из группы антиметаболитов пиримидина -применяется в терапии злокачественных новообразований (А. Veitkamp - 2008; P. Shmidt -2002). Гемцитабин является препаратом выбора в терапии нсрсзсктабельного рака поджелудочной железы (С. Louvet - 2003; J. Abbruzzese - 2002). Уникальный механизм действия, выраженная эффективность гемцитабина в терапии различных типов опухолей у взрослых, а также умеренная токсичность создали предпосылки для внедрения препарата в детскую практику (J. Reid - 2004).

Оптимизация режимов введения гемцитабина путем модификации дозы и длительности инфузии - актуальная задача противоопухолевой терапии (М. Zwitter -2005). Достижение максимальной эффективности терапии эскалацией дозы препарата нецелесообразно, так как влечет за собой развитие тяжёлых токсических реакций. В связи с этим важной задачей является поиск новых режимов дозирования, заключающихся в увеличении продолжительности инфузии по сравнению со стандартным режимом с одновременным снижением дозы гемцитабина. При стандартной 30-минутной инфузии 1000-1500 мг/м2 (J. Clark - 2002, M. Crul - 2005) не учитывают особенности метаболизма и биотрансформации гемцитбина. Вследствие этого большую часть времени его концентрация в плазме крови превышает концентрацию насыщения

дезоксицитидинкиназы - фермента, обеспечивающего образование активных внутриклеточных форм пролекарства, что приводит к неполной субоптимальной активации гемцитабина.

Исследования последних лет показали, что с изменением скорости введения гемцитабина меняется его противоопухолевая активность и переносимость (L. Cattel — 2006, M. Saif- 2006).

Исходя из представлений о возможности оптимального использования особенностей метаболизма гемцитабина разработан режим фиксированной дозовой интенсивности (Fixed Dóse Rate - FDR), когда гемцитабин инфузируется длительно (до 120 мин) с постоянной скоростью 10 мг/м2 в минуту (М. Tempero — 2003)..

В условиях пролонгированного введения для оценки скорости накопления внутриклеточных метаболитов, ответственных за реализацию цитотоксического эффекта гемцитабина, необходимо исследовать его фармакокинетику. Кроме того, особое значение

приобретает оценка эффективности и безопасности режима длительных инфузий препарата на основе контроля общих клинических и биохимических показателей крови.

Химиотерапия гемцитабином в сочетании с другими цитостатиками успешно применяется в лечении различных гистологических подтипов лимфомы Ходжкина у взрослых. Но недостаточная и противоречивая информация о безопасности режимов химиотерапии, включающих гемцитабин, ограничивает его применение для лечения гемобластозов и солидных опухолей у детей (Р. 81е1гЛегг - 2002). Для эффективного дозирования гемцитабина в схемах химиотерапии в детской практике требуется детальное исследование особенностей его метаболизма.

Цель и задачи исследования

Цель работы - разработка системы терапевтического лекарственного мониторинга

гемцитабина у больных раком поджелудочной железы и лимфомой Ходжкина на основе методик количественного определения в лекарственном препарате и плазме крови методом ВЭЖХ и кинетического контроля общеклинических и биохимических

Задачи исследования:

1. Разработать методики контроля качества лекарственного препарата и

количественного определения гемцитабина в плазме крови методом ВЭЖХ.

2. Провести терапевтический мониторинг гемцитабина с оценкой его фармакокинетики у больных раком поджелудочной железы при режиме модифицированной инфузии с фиксированной скоростью введения для оптимизации химиотерапии.

3. Осуществить систематический контроль биохимических и общеклинических показателей крови у больных раком поджелудочной железы, получающих препарат в режиме модифицированной инфузии с фиксированной скоростью введения.

4. Провести терапевтический мониторинг гемцитабина у детей с лимфомой Ходжкина при его ведении в состав комплексной химиотерапии для оценки эффективности и безопасности применения.

5. Оценить степень выраженности гематологической токсичности г гепатотоксичности при различных схемах терапии гемцитабином по кинетически» параметрам биохимических и общеклинических показателей крови.

Научная новизна исследования

Разработана и валидирована экспресс-методика определения гемцитабина гидрохлорида в лекарственной форме методом ВЭЖХ, которая позволила охарактеризовать различные серии препарата по показателям качества: «подлинность», «испытания на чистоту», «количественное определение».

Разработана и валидирована экспресс-методика определения гемцитабина в плазме крови методом ВЭЖХ. Методика позволила проводить терапевтический лекарственный мониторинг гемцитабина и продемонстрировать преимущественную эффективность не применявшегося ранее режима пролонгированных инфузий гемцитабина по сравнению со стандартным введением.

Впервые проведена оценка безопасности не применявшегося ранее режима пролонгированных инфузий гемцитабина в терапии рака поджелудочной железы по кинетическим параметрам биохимических и общеклинических показателей.

Практическое значение диссертационной работы Разработанная методика определения гемцитабина в плазме крови позволяет мониторировать его содержание при назначении инфузий препарата в различных режимах и схемах моно- и полихимиотерапии для контроля и коррекции дозы.

На основании результатов терапевтического лекарственного мониторинга гемцитабина и оценки показателей биохимического и общеклинического анализа крови модифицированный режим с фиксированной скоростью введения рекомендован для терапии неоперабельного рака поджелудочной железы взамен действующему стандартному протоколу.

Выявленные изменения биохимических и гематологических показателей крови — маркеров гепатотоксичности, нефротоксичности, миелосупрессии позволяют рекомендовать сопутствующую гепатопротекгорную терапию и назначение стимуляторов лейкопоэза при применении гемцитабина в составе схем химиотерапии лимфомы Ходжкина и солидных; опухолей у детей.

Внедрение в практику Экспресс-метод количественного определения гемцитабина гидрохлорида реализуется в экспресс-лаборатории РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

Рекомендации по применению модифицированного режима инфузий гемцитабина взамен стандартного режима введения, биокинетическая оценка показателей

составе полихимиотерапии, внедрены в лечебную практику в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН (отделение клинической фармакологии и отделение химиотерапии гемобластозов).

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН (специальность «Фармация», дисциплина «фармацевтическая химия» - раздел «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств», дисциплина «токсикологическая химия» -раздел «Аналитическая токсикология»).

Апробация диссертации. Основные положения работы доложены и обсуждены на Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке», «Концепции болезней цивилизации» (Москва, 2007 г.), на совместных научных семинарах кафедр фармацевтической и токсикологической химии, биологии и общей генетики, экспресс-лаборатории, отделения клинической фармакологии и химиотерапии гемобластозов РОНЦ РАМН.

Результаты работы представлены в периодической печати: 4 статьи опубликованы в журналах списка ВАК.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 156 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, результатов исследования и их обсуждения, выводов и библиографического указателя, включающего 140 источников. Работа иллюстрирована 45 рисунками и 32 таблицами.

Положения, выносимые на защиту:

• Валидация методики качественного и количественного определения гемцитабина в лекарственном препарате (метод ВЭЖХ)

• Валидация методики качественного и количественного определения гемцитабина плазме крови (метод ВЭЖХ).

• Оценка безопасности режима пролонгированных инфузий с фиксированно" скоростью введения на основе контроля изменений биохимических 1 гематологических показателей крови у больных при пролонгированных инфузиях фиксированной скоростью введения.

• Оценка эффективности модифицированного режима введения гемцитабина пр| монотерапии рака поджелудочной железы.

• Оценка безопасности режима комплексной химиотерапии лимфомы Ходжкина : солидных опухолей у детей на основе контроля изменений биохимических ] гематологических показателей крови.

€

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследования

Для проведения оценки качества лекарственного препарата (ЛП) "Гемзар" использовали: лиофилизированный порошок для приготовления раствора для инъекций фл. 200 мг и 1 г «Eli Lilly» (Франция).

В работе были использованы следующие реактивы: стандарты гемцитабина гидрохлорида (USP, США) и дезоксицитидина (Sigma-Aldrich); компоненты подвижной фазы - ацетонитрил (HPLC grade, Sigma-Aldrich), метанол (HPLC grade, Merck), натрия дигидрофосфат «хч», ледяная уксусная кислота (Sigma-Aldrich), аммония ацетат (for molecular biology, Sigma-Aldrich), о-фосфорная кислота (85%, «чда»).

В исследование было включено 17 пациентов с цитологически подтвержденным диагнозом диссеминированного и местнораспространенного рака головки и тела поджелудочной железы, не подвергавшихся ранее химио- и радиотерапии. Возраст больных — от 47 до 64 лет (57,1 ± 4,7 лет). Их состояние характеризовалось удовлетворительными показателями функционирования костного мозга (число лейкоцитов >3*109/л, число тромбоцитов > 100*109/л, уровень гемоглобина > 90г/л).

Основными критериями исключения из исследования были метастазы в ЦНС; неадекватное функционирование почек (уровень креатинина в сыворотке > 120 мкмоль/л) и печени (билирубин > 1,5 мг/дл, уровни AJIT и ACT >3 N). Данная группа пациентов получала гемцитабин в рамках протокола «Исследование дозозависимого режима длительных инфузий гемцитабина у больных местнораспространенным и диссеминированным раком поджелудочной железы», разработанного в отделении Клинической фармакологии НИИ Клинической онкологии РОНЦ РАМН. Препарат вводили внутривенно, капельно в виде 120—минутной инфузии (10 мг/м2 в мин) в 1-ый, 8-ой и 15-ый дни курса. Затем следовал двухнедельный перерыв. Число курсов составило 1-4.

Для сравнительной оценки содержания гемцитабина в плазме крови при внутривенных инфузиях была подобрана группа пациентов (N=15) с солидными опухолями (рак поджелудочной железы — 2, рак почки — 5, рак легкого — 6, рак яичника — 2). Больные получали гемцитабин в качестве монотерапии по стандартной схеме 1500 мг/м2 в/в в течение 30 мин.

Исследование влияния полихимиотерапии по схеме винорельбин, гемцитабин, прокарбазин, преднизолон (ViGePP) на показатели периферической крови проводили у шести пациентов с рефрактерными и рецидивными формами лимфогранулематоза. Противорецидивная программа включала винорельбин (30 мг/м2сут) в 1 и 8 дни, гемцитабин (1000 мг/м2 сут) в 1 и 8 дни, прокарбазин (100 мг/м'сут) в 7 день внутрь и преднизолон (30 мг/м2) внутрь в 1—14 дни цикла. Возраст пациентов — от 13 до 16 лет (средний возраст 14,2±1,2 лет). Число курсов химиотерапии составило 2—5.

Оценку безопасности применения химиотерапии по схеме: гемцитабин (700—800 мг/м2) в 1 и 8 дни и оксалиплатин (30—50 мг/м2) в 1 и 8 дни четырехнедельного цикла у детей. Число курсов - 4—6. Возраст пяти пациентов от 3 до 6 лет, основной диагноз -солидные опухоли различной локализации.

До начала терапии состояние детей в обеих группах характеризовалось удовлетворительными показателями функционирования костного мозга (число нейтрофилов >1,5»109/л, число тромбоцитов > 90*109/л). У пациентов отсутствовали признаки нарушения функционирования почек и печени (уровень креатинина

<110мкмоль/мл, трансаминазы не превышали верхнюю границу нормы более, чем в 2 раза).

Определение показателей общеклинического и биохимического анализа проводили перед каждым курсом химиотерапии и в 1, 3, 5, 15 дни после каждого введения в течение курса.

Для идентификации и количественного определения гемцитабина в ЛП и плазме крови использовали жидкостной хроматограф Metrohm (Швейцария) модель 844UV/VIS с диодно-матричным УФ-детектором, позволяющим проводить измерения на трех длинах волн. Компьютерную обработку результатов анализа проводили с помощью программы «1С Net 2.3». В работе использовали аналитическую колонку Prontosil С18 (150 х 4,6 мм, размер частиц 5 мкм); в качестве подвижной фазы - смесь ацетатный буфер (рН 5,0): ацетонитрил в объемном соотношении 97,5:2,5. Водный ацетатный буфер фильтровали через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм, а затем смешивали с ацетонитрилом (марки «для ВЭЖХ»). Температура колонки - 25°С; объемная скорость подвижной фазы - 0,7 мл/мин. При скорости потока >1 мл/мин наблюдали смещение пиков в область мертвого пространства. Объем вводимой пробы - 20 мкл. Продолжительность анализа не превышала 12 мин. При анализе плазмы интервал между введениями проб составлял не менее 15 мин, что обеспечивало полное элюирование длительно удерживаемых эндогенных примесей. УФ-детектирование гемцитабина и дезоксицитидина проводили при 282 и 269 нм, соответственно.

Биохимические показатели определяли на автоматическом биохимическом анализаторе АкуопЗОО (Abbott, США). Мониторинг показателей общего анализа крови проводили на гематологическом анализаторе Cell-Dyn 3700 (Abbott, США).

Определение кинетических параметров восстановления показателей гематологической токсичности и гепатотоксичности осуществляли в компьютерной программе «Origin 6.1». Для определения константы скорости реакций первого порядка использовали полулогарифмические координаты lnC(t). Уравнение прямой вида у=а-Ьх (lnC=lnCo-kt) сопровождалось указанием значений коэффициентов а и Ь. Это не требовало дополнительных расчетов константы скорости (k=-b). Периоды полу восстановления tin исследуемых показателей вычисляли по формуле: ti/2=ln2/k. Начальную концентрацию биохимического показателя С0 (а=1пС0 при t=0) определяли графически.

Статистическую обработку результатов исследования и корреляционный анали проводили с помощью программ «Origin 6.1», «Statistica 6» и программ пакета Microsol Office XP-Excel. Метрологическую характеристику методик количественног определения гемцитабина в препарате и сыворотке крови проводили по ФС: «Статистическая обработка результатов химического эксперимента и биологически испытаний» (ГФ XI).

Результаты исследований

1. Разработка методики количественного определения гемцитабина гидрохлорида в лекарственном препарате «Гемзар»

Метод ВЭЖХ, предлагаемый Фармакопеей США (USP) для идентификации : количественного определения гемцитабина, характеризуется особенностями, н позволяющими использовать его в экспресс-анализе непосредственно перед применение! препарата в клинике. Время выполнения анализа составляет 30 мин. Для проведени

градиентного элюирования требуется дополнительное дорогостоящее устройство, обеспечивающее формирование градиента концентраций и снабженное системой клапанов, а также второй насос (для градиента низкого давления). При смешивании даже предварительно дегазированных растворителей возможно выделение пузырьков воздуха, так как растворимость газа в смеси растворителей отличается от растворимости в чистых растворителях. Попадание пузырьков воздуха в проточную кювету отрицательно влияет на измерение абсорбции элюата. Как правило, к градиентному элюированию прибегают в случаях анализа многокомпонентных смесей, содержащих вещества, сильно различающиеся по своим сорбционным свойствам.

Для качественного и количественного определения гемцитабина гидрохлорида в его лекарственной форме (ЛФ) нами был разработан более быстрый (12 мин по сравнению с 30-минутным выполнением по USP) и простой в исполнении метод изократической ВЭЖХ с использованием обращенно-фазовой колонки, заполненной модифицированным силикагелем с привитым сорбентом—октадецилсиланом Prontosil С18 (150x4,6 мм, размер частиц 5 мкм).

При подборе оптимальных условий хроматографического анализа были исследованы двухкомпонентные подвижные фазы (ПФ) разного состава.

Хроматограммы, полученные при использовании различных ПФ, оценивали по показателям: время удерживания (tR), коэффициент емкости (к), селективность (а), разделение (R), асимметрия пика (As). В качестве вещества для проверки пригодности системы использовали дезоксицитидин. При использовании ПФ состава метанол-вода (20:80) гемцитабин эшоировался слишком быстро, пики выходили слишком рано, попадая в область «мертвого пространства». При уменьшении содержания органического модификатора на 10 % (метанол-вода 10:90 %, об) удалось достичь улучшения удерживания на неподвижной фазе, однако разделение компонентов было неудовлетворительным.

Принимая во внимание, что ацетонитрил обладает несколько большей полярностью, чем метанол (индексы полярности Снайдера - 5,8 и 5,1 соответсвенно), при следующих испытаниях этот растворитель был выбран в качестве модификатора ПФ. Использование ПФ состава ацетонитрил-вода (10:90 и 5:95, % об) привело к увеличению коэффициента емкости до 1,4—2. Однако хроматограммы, полученные с использованием этих ПФ, характеризовались низкой селективностью. Кроме того, происходило «размывание» концов пиков.

Известно, что в случае одновременного существования в системе молекулярного иона, молекулы, димера или более сложных ассоциатов целевого аналита (адсорбата) на поверхности адсорбента, его хроматографический пик уширяется (Sadek Р, 2002).

Поэтому для оптимизации хроматографической методики было предложено заменить деионизированную воду на ацетатный буфер, что могло способствовать смещению равновесия в сторону ионизированных (протонированных) форм. Действительно, реализация такого подхода позволила добиться удовлетворительной селективности и эффективности хроматографического разделения (рис.1).

Пара- Гемцитабин Дезокси-

метр цитидин

к 6,35 3,89

к' 3,6 1,7

N 796 860

Аз 1,47 1,2

а 2,1

Я 3,5

Рис. 1. Хроматограмма гемцитабина и внутреннего стандарта дезоксицитидина для подвижной фазы ацетатный буфер (рН 5,0):ацетонитрил (97,5 : 2,5, % об.) и параметры их разделения

Таким образом, в результате исследований была подобрана изократическая система ацетатный буфер (рН 5,0):ацетонитрил в объемном соотношении 97,5:2,5, которая явилась оптимальной для определения гемцитабина на колонке с силикагелем, модифицированным окгадецилсиланом.

Нижний предел обнаружения гемцитабина (сигнал, превышающий тройной уровень флуктуации линии фона) составил 0,2 мкг/мл. Нижний предел количественного определения — 0,4 мкг/мл.

Содержание гемцитабина и дезоксицитидина определяли методом абсолютной калибровки по градуировочным графикам (рис.2). Для их построения использовали серию разведений стандартных образцов.

/

С(гсмцнтабина), мкг/мл

45000-,

и

Й 40000-

а

* 35000

$ 30000

я

Л 25000-

20000-

с

15000 -

10000

5000 -

0-

С(гемцнта6инй), мкг/мл

Рис.2. Калибровочные графики для определения гемцитабина гидрохлорида в ЛП для различных интервалов концентраций.

Учитывая линейное изменение площади под пиком на хроматограммах в зависимости от содержания аналита в пробе, был рассчитан поправочный коэффициент, характеризующий различие в степени молярного поглощения определяемого вещества -гемцитабина и внутреннего стандарта - дезоксицитидина, который составил 1,28 .

По результатам серии определений (проведенных в разные дни) стандартных

образцов гемцитабина гидрохлорида были рассчитаны метрологические характеристики разработанной методики (табл. 1).

Таблица 1. Метрологические характеристики методики определения гемцитабина

Теоретическая концентрация Найдено, мкг/мл X S to,9S;6 Л х , мг/л Е, % t рассч.

50 мг/л 50,4 1,58 2,45 1,46 2,9 0,67

Таким образом, разработанная методика характеризуется приемлемой относительной ошибкой среднего и не содержит систематической ошибки. Параметры количественного определения свидетельствуют о возможности применения методики для контроля качества ЛП «Гемзар».

2. Определение подлинности и содержания гемцитабина гидрохлорида в

препарате «Гемзар»

С целью повышения безопасности применения цитотоксического препарата «Гемзар» для контроля качества ЛП в клшшке может быть использована разработанная методика хроматографического определения. На рис. 3 показан пример хроматограммы, полученной при анализе препарата. Подлинность действующего вещества была подтверждена по совпадению времен удерживания анализируемого и стандартного образцов. Относительное содержание гемцитабина и родственных примесей было определено по соотношению площадей хроматографических пиков. Численную оценку содержания примесей проводили относительно площади пика стандарта гемцитабина.

ль.;

м

Вещество tR AUC, mAU*sec AUC, %

Родственные 2,19и 40,22 0,11

примеси 2,29

Дезокси- 3,91 1547,56 43,46

цитидин

Гемцитабин 6,55 1969,57 44,53

Рис.3 Хроматограмма, полученная при анализе лиофилизированного порошка «Гемзар»

Для расчета количества гемцитабина гидрохлорида применяли метод внутреннего стандарта, что позволяло компенсировать небольшие отклонения параметров разделения на размер пиков. Содержание гемцитабина гидрохлорида в лекарственной форме вычисляли по формуле:

263,20 х AUC, х Сst х V xlOO%

С(%)= -

299,66 X AUCj X m X к

где Ся - концентрация стандартного раствора дезоксицитидина, мг/мл; А1ГС1 - площадь пика гемцитабина в анализируемой пробе; АиСг - площадь пика внутреннего стандарта—дезоксицитидина; V - общий объём растворителей с учетом разведений, мл; ш - масса препарата, мг; К - коэффициент, учитывающий различие в УФ — поглощении внутреннего стандарта и анализируемого вещества (к = 1, 28); 263,20 и 299,66 —молекулярные массы гемцитабина и гемцитабина гидрохлорида. Результаты количественного определения представлены в таблице 2.

Таблица 2. Содержание гемцитабина гидрохлорида и родственных примесей в лиофилизированном порошке для приготовления инъекционного раствора «Гемзар» (Eli Lilly, Франция) (N=5, Р=95%)__

Содержание гемцитабина гидрожлорида,% Суммарное содержание примесей, %

USPXXIX/НД Фактическое ( % ± ^ 3 ) USP ХХ1Х/НД Фактическое ( х ± А * )

95—105 98,54 ± 1,03 <2,3 1,62 ±0,44

Таким образом, препарат «Гемзар» соответствовал требованиям Фармакопеи США и НД производителя.

3. Разработка методики количественного определения гемцитабина в плазме крови

Для определения концентрации гемцитабина в плазме крови осуществляли пробоподготовку, оптимизируя известные методики. Было обнаружено, что при использовании комбинации изопропанола и этилацетата значительно возрастает время выпаривания (от 20 до 60 мин). Применение в качестве экстрагента ацетонитрила без добавления метанола не позволяет достичь нужной степени очистки от примесных соединений в плазме, интерферирующих с определяемыми веществами. При таком варианте пробоподготовки надосадочная жидкость была непрозрачной и опалесцировала.

Оказалось, что смесь ацетонитрил—метанол (9:1) наиболее эффективно преципитирует белки и позволяет значительно сократить время упаривания образца. Для повышения эффективности извлечения активных веществ нами была успешно апробирована двукратная экстракция. Кроме того, было установлено, что на стадии пробоподготовки до введения экстрагента необходимо добавление в анализируемую пробу ледяной уксусной кислоты. Снижение рН и концентрации полярного растворителя приводит к ингибированию активности цитидиндеаминазы, что блокирует биотрансформацию 2',2'—дифтородезоксицитидина до дифтордезоксиуридина, т.е. обеспечивает стабильность определяемого вещества в пробе. Центрифугирование образца при пониженной температуре (4°С) привело к снижению растворимости примесей и обеспечило чистоту пробы, вносимой в хроматограф. В процессе эксперимента нами была установлена необходимость замены природы инертной среды. Вместо жидкого азота в системе был обеспечен вакуум (остаточное давление 10 мм рт. ст.), создаваемый роторно—вакуумным испарителем. Это существенно упростило процедуру высушивания пробы за счет понижения температур кипения летучих растворителей.

Специфичность метода была подтверждена при анализе трех образцов плазмы, взятых у здоровых доноров (рис.4).

«о-40-

:о-10-

-к_I

I

I

3 4 5 6 7 8 9 10 И 1} 13 14 1,МИН

Параметр Гемцитабин Дезоксицитидин

8,79 4,66

к' 3,2 1,3

N 2310 1400

а 2,47

Я 3,9 2,8

Рис.4. Образцы хроматограмм : а— плазма без определяемых веществ; б— плазма, полученная при добавлении гемцитабина и дезоксицитидина (модельная система) и параметры разделения.

Из сравниваемых хроматограмм образцов плазмы без и с добавлением определяемых веществ следует, что эндогенные вещества не мешают идентификации основных компонентов. Состав подвижной фазы не отличался от выбранного нами при контроле качества ЛП, условия хроматографирования также совпадали, за исключением скорости потока элюэнта (0,7 мл/мин).

Установленная линейная зависимость (г=0,9975) площади под пиком на хроматограмме от содержания гемцитабина в модельных смесях сохранялась в интервале (1^15) мкг/мл (рис. 5).

Л

у

0,004 0,006 0,008 С, мг/мл

Рис. 5. Калибровочный график для определения гемцитабина в плазме крови.

Уравнение регрессии имело вид: у=8,51+51,59*х. Нижний предел количественного определения составил 1 мкг/мл (отношение сигнал/шум>3,1^0=8,9%).

Таблица 3. Результаты определения гемцитабина в плазме крови (N=5, Р-95%).

№ Введено, мкг/мл Найдено, мкг/мл 5! Еср1 % ( рассч.

1 1,00 1,05±0,12 3,13 11,4 3,86

2 5,00 4,96±0,34 2,78 В,17 5,9 3,53

3 10,0 9,86±0,48 3,52 4,8 3,61

Разработанная методика определения гемцитабина в плазме крови может быть использована для контроля его содержания в крови с целью выбора оптимального режима дозирования препарата.

4. Терапевтический лекарственный мониторинг гемцитабина в плазме крови и оценка безопасности применения пролонгированной инфузии в терапии рака поджелудочной железы

Доклинические исследования (КХ}гипе\уаЫ - 1990) показали, что оптимальная концентрация гемцитабина в плазме, достаточная для образования активного метаболита гемцитабина трифосфата в мононуклеарных и лейкозных клетках, должна составлять в среднем 10—20 мкмоль/л (6—9 мкг/мл). Нами было установлено, что такая концентрация достигается в среднем через 30 мин от начала 120-минутного введения и остается на данном уровне во время инфузии и в течение 30 мин после её завершения. Через 80 мин после окончания введения гемцитабин не детектируется в плазме крови (рис.6).

На основании полученных данных были рассчитаны основные фармакокинетические параметры для модифицированной инфузии: Стах=10,71±1,79мкг/мл, период полувыведения 11/2=16,9 мин, константа элиминации к= (0,041 ±0,007)мин-'.

1В 1в 14

Рис. 6. Содержание гемцитабина в плазме крови при 120-минутиой инфузии со скоростью введения 10 мг/ м2 в мин (N=17) и 30-минутной инфузии в дозе 1200-1500мг/мг. Заштрихованная область — интервал концентраций, соответствующих проявлению терапевтического эффекта.

При определении содержания гемцитабина в плазме пациентов, получавших препарат в виде 30-минутной инфузии в дозе 1500 мг/м2, была обнаружена значительная вариабельность результатов. Так, через 5 мин после окончания инфузии концентрация варьировала от 5,1 до 17,2 мкг/мл. Однако через 30 мин после завершения введения она составила 2,32±1,13 мкг/мл.

В нашем исследовании было показано, что длительная, 120-минутная инфузия при скорости введения 10 мг/м2 в мин позволяет избежать избыточного накопления токсичного лекарственного вещества и обеспечивает его оптимальное терапевтическое содержание в плазме крови в течение более длительного временного интервала по сравнению со стандартным режимом введения.

Переносимость и токсичность режима модифицированных инфузий гемцитабина.

Оценку безопасности пролонгированных инфузий гемцитабина осуществляли путем определения биохимических и общеклинических показателей крови у пациентов перед началом каждого курса, между введениями в пределах цикла и по завершению терапии.

В преобладающем большинстве случаев серьезные проявления токсичности режима лечения были связаны с поражением системы кроветворения. Уменьшение абсолютных количеств лейкоцитов, нейтрофилов, тромбоцитов, эритроцитов и гемоглобина по окончанию каждого курса было статистически достоверным (р<0,05) (табл. 4).

Таблица 4. Изменения общеклинических показателей крови в течение двух курсов

Гематологический показатель Значение показателя 7

Норма До 1 курса После 1 курса Цо 2 курса После 2 курса

Лейкоциты, х109/л 4,5-11 6,57±2,15 3,82±1,97 8,31±2,77 4,21±2,24

Нейтрофилы, х10'/л 1,8-7,7 4,07±2,61 2,61±1,18 4,36±1,13 3,44±2,11

Тромбоциты, хЮ'/л 180-320 230,55±74,22 174,63±61,86 214,64±71,43 171,87±55,62

Гемоглобин, г/л 125-160 124,32±15,25 103,71±10,89 129,48±19,22 107,24±12,07

За изменениями картины периферической крови (табл. 5) следили также по показателю а — степени снижения числа лейкоцитов, нейтрофилов, тромбоцитов и уровня гемоглобина: М0-Н

*100%

где N0 — значение показателя до лечения, N — значение показателя по окончанию курса.

Таблица 5. Изменения гематологических показателей при инфузии гемцитабина (р<0,05, N=23)_

Показатель Относительное уменьшение а, %

Лейкоциты 41,2±8,8

Нейтрофилы 36,1±12,7

Тромбоциты 31,7±5,9

Гемоглобин 10,3±4,1

Эритроциты 22,5±3,4

У 39% пациентов после применения гемцитабина в виде БОЯ-инфузий возникла тромбоцитопения II ст по ВОЗ, а у 13% отмечалось угнетение тромбоцитопоэза III ст, но кровотечений не наблюдалось. Анемия I ст наблюдалась у 10% пациентов. Лейкопения относится к дозолимитирующим осложнениям применения гемцитабина, при использовании режима длительных инфузий лейкопения I ст была выявлена у 48% пациентов, II ст зарегистрирована в одном случае. Нейтропения I ст была отмечена у 26% больных, II ст — у 21%, однако III ст была отмечена лишь у 8,7% пациентов. У двух пациентов с нейтропенией III степени следующая доза гемцитабина была редуцирована на 25%. КСФ в ходе терапии не назначали. Фебрильная нейтропения не была отмечена ни в одном случае.

Таблица 6. Сравнение гематологической токсичности режимов монотерапии гемцитабином ___

Вид токсичности Доля больных в группе FDR—инфузий (N=23) Доля больных в группе стандартной терапии (N=15) Доля больных в группе стандартной терапии (N=20) по данным РОНЦ(2001)

Нейтропения I—II ст 47,8% 16,7% 25%

Нейтропения III—IV ст 8,7% 8,3% 15%

Тромбоцитопения 1—Ист 39% 25% 10%

Тромбоцитопения III—IV ст 13% 16,7% 15%

Анемия I—II ст 10% 8,3% 20%

При сравнении показателей гематологической токсичности (табл. 6) несмотря на неоднородность выборки (присутствие в группе сравнения пациентов с различными солидными опухолями) наблюдали очевидную тенденцию к усилению проявлений токсичности при применении модифицированного режима введений. Вследствие назначения гемцитабина с учетом его фармакокинетических особенностей, происходит более активное проникновение не только в клетки—мишени, но и в клетки костного мозга, что вызывает более выраженные гематологические осложнения. Абсолютные количества лейкоцитов, тромбоцитов, эритроцитов по завершению первого курса химиотерапии в группе модифицированного режима введения гемцитабина были достоверно ниже по сравнению с группой стандартного режима (р<0,05). Однако, как следует из полученных данных (табл. 6) и в случае пролонгированных инфузий, и в случае 30—минутного введения не было отмечено тяжелых случаев гематологической токсичности, которые привели бы к отказу от продолжения терапии.

В течение всего курса введения контролировали показатели функционирования печени и почек. Лишь у двух пациентов (10%) отмечены проявления гепатотоксичности II ст, выражавшиеся в повышении уровней трансаминаз и щелочной фосфатазы в 3—4 раза выше верхней границы нормы для данных показателей. В процессе терапии не было выявлено ни одного случая проявления нефротоксичности гемцитабина.

Для комплексной оценки воздействия пролонгированных инфузий на состояние антиоксидантной системы у 12 пациентов из стандартной и исследуемой групп

определяли показатели общего антиоксидантного статуса (ОАОС), глутатионредуктазы (ГР), гамма-глутамилтрансферазы (у-ГТ), малонового диальдегида (табл. 7) .

Таблица 7. Изменение показателей антиоксидантного статуса при стандартной и

модифицированной иш >узии

Показатель Значение через 30 мин после завершения инфузии

Стандартная 30-минутная инфузия Модифицированная 120-минутная инфузия

ОАОС 1,66±0,32 1,61±0,14

Глутатионредуктаза 105,8±21 83,3±26

У-ГТ 44±8 51±12

Малоновый диальдегид 1,02±0,41 Э,86±0,56

Различия средних в обеих группах не достигали уровня статистической значимости (Р>0,1).

Таким образом, модифицированный режим введения характеризуется умеренным профилем токсичности, несмотря на более длительную экспозицию клеток действию гемцитабина по сравнению с 30-минутными инфузиями.

5. Мониторинг гемцитабина в плазме крови у детей при комплексной терапии на основе гемцитабина для оценки ее безопасности

При определении гемцитабина в плазме крови у детей, получающих препарат в составе химиотерапии лимфомы Ходжкина (лХ) по протоколу винорельбин-гемцитабин-прокарбазин-преднизолон (\ЧОеРР), было обнаружено быстрое снижение его содержания (табл.8, рис.8). Мониторирование концентрации препарата в плазме крови после завершения инфузии позволило косвенно оценить содержание активных форм пролекарства в клетках-мишенях. Так, при определении концентрации гемцитабина в плазме крови у детей, получающих препарат в составе химиотерапии по протоколу \^ОеРР, использовал разработанную ранее методику. На хроматограммах (рис.7) четко прослеживается быстрое уменьшение концентрации гемцитабина во времени.

V б

Ь ш

Рис. 7. Хроматограммы плазмы крови больной К. а— до инфузии гемцитабина, б—5 мин после завершения инфузии, в—13 мин после завершения инфузии (время выхода пика препарата— 8,71±0,5мин).

Кинетика выведения гемцитабина характеризуется низким периодом полувыведения (табл. 8).

Таблица 8. Результаты определения гемцитабина в плазме крови у fleTeü(N=6)

Время после завершения инфузии, мин Концентрация, мкг/мл

5 5,5±0,69

10 3,1±0,44

15 1,85±0,34

На основании полученных результатов были рассчитаны фармакокинетические параметры гемцитабина: Стм=(6,12±1,82) мкг/мл, константа элиминации к = (0,103±0,032) мин-1, ti/2=6,71 мин. При анализе крови на разных курсах введения у трех пациентов не наблюдалось кумуляции препарата. Хроматограммы свидетельствуют об отсутствии перекрестной реакции определяемого препарата с эндогенными компонентами плазмы и с винорельбином, назначаемым до введения гемцитабина.

Таким образом, было показано, что во время инфузии и в течение 10 мин после ее завершения концентрация гемцитабина достигает оптимальных значений (6 мкг/мл) для реализации его цкготоксического эффекта. Сопутствующая химиотерапия не влияет на скорость выведения гемцитабина.

Переносимость и токсичность химиотерапии по протоколу ViGePP у детей с лимфомой Ходжкина.

При анализе результатов, отражающих тяжесть миелосупрессии, было установлено, что степень угнетения лейкопоэза была пропорциональна числу курсов химиотерапии (ХТ). Так, лейкопения II ст (по классификации ВОЗ) была выявлена в течение 1 курса терапии, III ст — наблюдалась как реакция на первое введение препаратов во 2 и 3 курсах. Лейкопения IV ст отмечена после проведения четырех курсов ХТ. Длительность лейкопении IV ст в среднем составила 3 сут (от 2 до 7 дней). Ожидаемый минимум (надир) лейкоцитов составлял 0,7-109/л в первый день после второго введения в 3 курсе ХТ. Обращает на себя внимание положительная тенденция более активного увеличения числа лейкоцитов после проведения третьего и четвертого курсов (рис.8).

3 2вв 1 з

I. сутки

Рис. 8 Динамика изменения числа лейкоцитов и тромбоцитов на разных курса! химиотерапии по протоколу УЮеРР. Горизонтальная линия - нижняя граница нормы.

Тромбоцитопения, отмечаемая рядом исследователей как наиболее выраженное проявление токсичности гемцитабина (Ф. Мамедов - 2000), в данном протоколе былг

умеренной. Необходимо отметить, что в среднем на момент начала ХТ, количества тромбоцитов находились на нижней границе нормы. Реакцией на введение препаратов была тромбоцитопения I ст (1 курс) и II ст (2—4 курсы), т. е. степень угнетения тромбоцитопоэза так же, как и лейкопоэза, пропорциональна длительности терапии (см. рис. 8). Низший уровень тромбоцитов составлял 45000, который пришелся на 5день после второго введения в 3 курсе. При проведении терапии кровотечений у больных отмечено не было.

Анемии как осложнения химиотерапии менее значимы по сравнению с нейтропенией (Гарин, 2002). Анемии зависят от кумуляции доз гемцитабина, что ярко демонстрируют полученные результаты: анемия была отсроченным проявлением токсичности, — в течение 1 курса ХТ она отмечена только после второго введения. Затем уровень гемоглобина последовательно снижался, достигая I ст анемии на 2 курсе ХТ, II ст после первого введения 3 курса и III ст после второго ведения 3 курса с дальнейшим сохранением токсического эффекта в течение 4 курса (рис.9). Ни у одного из пациентов не была зафиксирована IV ст анемии.

Рис. 9. Динамика изменения гемоглобина на разиых курсах химиотерапии по протоколу ViGePP. Горизонтальная линия-нижняя граница нормы

Гемцитабин относится к слабо гепатотоксическим препаратам. Однако его применение в ХТ приводит к более выраженным токсическим эффектам. В данном исследовании наблюдали постепенное нарастание уровня ACT в течение 1 курса ПХТ, максимум для данного показателя был достигнут после второго введения в 1 курсе (II ст по классификации Национального института рака США). В ходе дальнейшей терапии повышения уровня фермента были более сглаженными, возможно вследствие реализации адаптивных возможностей организма. Для показателя поражения гепатоцитов —AJIT, напротив, были получены результаты по отсроченной токсичности — умеренное повышение наблюдали после второго введения 1 курса (I ст), а затем более выраженный цитолиз после первого введения 2 курса (рис. 10). Повышение уровней трансаминаз было реверсируемым, и период их восстановления до нормы не превышал двух недель.

■ 1курс • 2курс

1ав

3 2т

t, сутки

3

5 15

Рис.10 Динамика изменения показателей гепатотоксичности на разных курсах химиотерапии по протоколу УЮеРР. Горизонтальная линия-верхняя граница нормы

При анализе данных по динамике показателей мочевины и креатинина значимых проявлений нефротоксичности выявлено не было.

Состояние антиоксидантной системы как характеристика токсичности химиотерапевтической схемы УЮеРР на основе гемцитабина.

При изучении показателей АОС у детей с лимфомой Ходжкина было обнаружено, что при проведении ХТ перед началом лечения наблюдается повышенное напряжение антиоксидантной системы:ОАОС выше нормальных значений. Затем достоверное увеличение ОАОС прослеживается от введения к введению (N=5, р<0,05). Максимальные значения данного интегрального показателя отмечены как непосредственная реакция на введение гемцитабина и винорельбина (табл. 9). Отсутствует достоверное различие между ОАОС до начала и по окончанию курса ХТ.

Активность ГР так же значительно возрастает после каждого введения, истощения данной ферментной системы в рамках одного курса не наблюдали, напротив, реакция на каждое введение была достоверно выше (N=5, р<0,05), чем на предыдущее.

Для супероксиддисмутазы (СОД) выявлены несколько другие закономерности — нарастание этого звена антиоксидантной системы отсрочено по времени от введения препаратов. Максимальные значения зафиксированы к 3 дню после инфузий гемцитабина и винорельбина.

Таблица 9. Динамика изменения показателей АОС при химиотерапии по протоколу УЮеРР__

День ХТ ОАОС, ммоль/л ГР, Е/л СОД, Е/мл

до 1 введения 1,88±0,02 69,9± 7,5 129,2± 41,4

после 1 введения 1,87± 0,07 82,9± 7,3 201,4±51,3

3 день после введения 1,82±0,06 62,3± 9,2 258,3±74,6

до 2 введения 1,88±0,05 81,6± 15,3 105,4±19,8

после 2 введения 1,93±0,03 116± 14,2 154,2±24,3

11день 1,63±0,03 82,3±11,7 188,3± 49,5

17день 1,81± 0,08 87,6±12,6 205,5±41,3

Таким образом, режим УЮеРР характеризуется приемлемым токсическим

профилем. В ходе исследования установлено, что проведение химиотерапии по схеме винорельбин, гемцитабин, прокарбазин, преднизолон возможно у детей с рецидивами лимфомы Ходжкина.

Переносимость н токсичность химиотерапии по протоколу гемцитабин-оксалиплатин у детей с солидными опухолями

В рамках данного исследования также были проанализированы полученные лабораторные данные, характеризующие токсичность комбинированного режима по схеме гемцитабин 700—800мг/м: в 1 и 8 дни и оксалиплатин в дозе 30—50мг/м2 в 1 и 8 дни (схема GemOx).

Миелосупрессия, проявлявшаяся в выраженном снижении числа лейкоцитов периферической крови, не была кумулятивной. Так, к началу каждого курса число лейкоцитов восстанавливалось до нормы. У 4 больных лейкопоэз стимулировали применением колониестимулирующих факторов. Снижение числа лейкоцитов не было немедленной реакцией на введение химиопрепаратов: минимальные количества лейкоцитов регистрировались на 3 сутки после введения. Так, лейкопения II ст (по ВОЗ) наблюдалась на 3 сутки после 1 введения и на 3 сутки после 2 введения во всех четырех курсах. При дальнейшем мониторировании наблюдалась тенденция к их восстановлению. Минимальное количество лейкоцитов - 1,03*109/л (III ст) наблюдали на 3 сут после 2 введения во время второго курса химиотерапии. Степень угнетения лейкопоэза не была пропорциональна номеру курса, как в случае протокола ViGePP, напротив к 4 курсу отмечалась более слабая реакция костного мозга на введение цитотоксических препаратов, которая не выходила за рамки I ст миелосупресссии (рис.11).

t. сутки t, сутки

Рис. 11. Динамика изменения числа лейкоцитов и тромбоцитов на разных курсах химиотерапии GemOx. Горизонтальная линия-нижняя граница нормы

Тромбоцитопения является одним из выраженных проявлений токсичности препаратов платины, комплексное применение с гемцитабином усиливает этот негативный эффект. В отличие от показателей лейкопоэза, когда число лейкоцитов изменялось синусоидально с минимумом на втором курсе и постепенным возвращением к норме, для тромбоцитов наблюдали снижение их числа от курса к курсу. Следует отметить, что к моменту первого введения в любом из курсов, их число было в пределах нормы. В течение всего периода лечения тромбоцитопения III ст была зафиксирована однократно — на 5 сутки после второго введения в третьем курсе химиотерапии. Надир тромбоцитов составил 48000, что потребовало переливания тромбоконцентрата. После первого введения на любом из курсов наблюдалась тробоцитопения I ст, а после второго введения в среднем к 5 дню каждого из курсов тяжесть ее усиливалась, достигая II ст.

Однако уже к 15 дню количества тромбоцитов приближались к нижней границе нормы.

Анемия I—II ст была отсроченным проявлением токсичности — после первого введения препаратов в каждом из курсов она возникала только к 3 дню, в то время, как после второго введения, она регистрировалась на следующий же день после инфузий. Восстановление уровня гемоглобина до нормы после второго введения происходило медленно во втором и третьем курсах (по сравнению с первым) и более активно в четвертом курсе. Анемия III ст зафиксирована однократно у двух пациентов на 5 день после второго введения в третьем курсе ХТ (рис.12).

2еа 1 3 t, сутки

• Рис.12 Динамика изменения гемоглобина на разных курсах химиотерапии GemOx.

Горизонтальная линия-нижняя граница нормы

Метаболизм обоих препаратов протекает в печени, поэтому в ходе исследования наблюдали значительные колебания уровней АЛТ и ACT. Резкий подъем концентрации ACT был зафиксирован в первый день как после первого, так и после второго введения. Максимальные значения (III ст гепатотоксичности) отмечены на 2 и 3 курсах в первый день после первого или второго введения. В течение четвертого курса проявления гепатотоксичности оставались в пределах I ст выраженности (рис. 13).

—* - 1курс -■— 1курс

2курс - 2курс

-А- Зкурс 360 Т -А- Зкурс

4курс : 4 курс

3 2вв 1 t, сутки

3 2вв 1 3 t, сутки

Рис. 13. Динамика изменения показателей гепатотоксичности на разных курсах химиотерапии СетОх. Горизонтальная линия-верхняя граница нормы

При анализе данных по динамике изменения различных биохимических и общеклинических показателей крови были выявлены биокннетические индикаторы токсичности схем терапии на основе гемцитабина. Так оказалось, что для показателей миелотоксичностн: числа лейкоцитов, тромбоцитов, гемоглобина и показателен гепатотоксичности кинетика восстановления до значений нормы соответствовала первому порядку. Были рассчитаны основные кинетические параметры биохимических и общеклинических показателей крови - k, t|/2, С0. Их вычисляли, используя однокамерную модель и допуская, что исследуемые маркеры распределены в камере равномерно. В таблице 10 представлены результаты определения биокинетических параметров для показателей лейкоцитов, тромбоцитов, AJIT и ACT для второго введения 1 курса для обоих протоколов.

Таблица 10. Кинетические характеристики показателей гематологической и гепатотоксичности для протоколов на основе гемцитабина, применяемых в дсгской онкогематологии.

Определяемый показатель Кинетические параметры в протоколе ViGePP, N=6

к, сут"1 t|/2, сут С„ Норма

Лейкоциты (4,5±1,01)*10-! 15.3 1,64±0,17 >4,1 *107л

Тромбоциты (4,9±1,6)*10"J 14,1 101±12,4 140-380* 107л

АЛТ (8,4±1,9)*10"2 8.2 141±15,7 <40 Е/л

ACT (7,3±1,5)*10"J 9,7 91± 10,5 1 <38 Е/л

Определяемый показатель Кинетические параметры в протоколе GeOx, N=5

к, сут"1 tin, сут с, Норма

Лейкоциты ^2,7±0,7)*10"2 124,3 1,86±0,21 >4,1 *10ч/л

Тромбоциты (1,05±0.2)*10"2 6,7 117±8,3 140-380* 107л

АЛТ (7,8±1,1)*10^ 8,9 192±13,5 <40 Е/л

ACT (6.5±l,9)*10_i 10,1 118±11,7 <38 Е/л

Полученные результаты показывают, что скорость восстановления показателей гематологической токсичности значительно ниже по сравнению с маркерами поражения печени. Для минимизации токсичности можно рекомендовать своевременное назначение стимуляторов лейкопоэза, которые ослабляют степень миелосупрессии.

выводы

1. Разработаны методики количественного определения гемцитабина в ЛП «Гемзар» и плазме крови. В результате экспериментальных исследований был подобран оптимальный вариант пробоподготовки и условия хроматографирования: изократическая система для реализации разделения в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. Нижний предел количественного определения для плазмы крови составил 1 мкг/мл, линейная зависимость сохранялась в интервале (1-И5) мкг/мл (г=0,9975). Нижний предел метода количественного определения для ЛП составил 0,4 мкг/мл, линейная зависимость сохранялась в интервале (0,4-^-40) мкг/мл (г=0,9994).Проведена оценка качества двух серий препарата, выявлено соответствие НД по показателям «подлинность», «испытания на чистоту» и «количественное определение» методами ВЭЖХ и ИК-спектроскопии.

2. Установлено, что у больных РПЖ, получающих препарат в форме инфузий с фиксированной скоростью введения, оптимальная концентрация гемцитабина в плазме для проявления его терапевтического эффекта (6—9 мкг/мл) достигается через 30 мин от начала 120-минутного введения и остается на данном уровне во время инфузии и в течение 30 мин после её завершения. Фармакокинетические характеристики гемцитабина для пролонгированных инфузий: Стах=10,7±1,8 мкг/мл, период полувыведения ti/2=0,28±0,064, константа элиминации ке|=(2,46±0,42)ч—1.

3. Установлено, что модифицированный режим введения гемцитабина в терапии РПЖ характеризуется умеренным профилем токсичности, основным проявлением которой явилась миелосупрессия: 40% пациентов после применения гемцитабина возникла тромбоцитопения, анемия наблюдалась у 10% пациентов, а лейкоыння -у 48% пациентов.

4. В результате ТЛМ гемцитабина у детей с лимфомой Ходжкина, получавших препарат в составе комплексной химиотерапии, было показано, что во время инфузии и в течение 10 мин после ее завершения концентрация пролекарства достигает оптимальных значений (6 мкг/мл). На основании полученных результатов были рассчитаны фармакокинетические параметры для данного типа инфузий гемцитабина: Стах= (6,12±1,82) мкг/мл, константа элиминации kd = (6,18±1,92) ч_|, t|/2=0,12±0,044.

5. На основании биокинетического моделирования показано, что скорость восстановления показателей гематологической токсичности до нормы значительно ниже по сравнению с маркерами поражения печени (к скорости восстановления для лейкоцитов составила (3,46±1,43)*10"2 сут-1, а для АЛТ и ACT (7,91±1,96) *10" 2сут~' и(6,44±1,72)*10' "сут соответственно).

Список сокращений

AJ1T - ачанинаминотрансфераза ACT - аспартатаминотрансфераза ВЭ)КХ- высокоэффективная жидкостная хроматография у-ГТ - у-глутамилтрансфераза ЛДГ - лактатдегидрогеназа ЛВ - лекарственное вещество ЛС - лекарственное средство ЛП - лекарственный препарат ЛФ - лекарственная форма

лХ-лимфома Ходжкини

ПФ-подвижная фаза

РПЖ-рак поджелудочной железы

ТЛМ-терапевтический лекарственный мониторинг

ЩФ - щелочная фосфатаза

ХТ-химиотерапия

ViGePP - протокол винорельбин-гемцитабин-

прокарбазин-предпизолоп

GemOx — протокол гемцитабин-оксалиплатин

USP-Фармакопея США

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аитноксидаптпые препараты - их место и роль в детской онкологии / В. Н. Байкова, К. Э. Банков, А. В. Иванов, А. В. Калипкина, Н. А. Паршина, А. П. Арзамасцев, Л. А. Дурнов // Практикующий врач сегодня - 2005. - №1.- С. 2932.

2. Особенности количественного определения гемцитабина в плазме крови методом ВЭЖХ / Н. А. Паршина, Т. В. Плетенева, В. Н. Байкова, М. Н. Нариманов // IX Международный конгресс «Здоровье и образование в XXI веке» «Концепция болезней цивилизации»: Тезисы докладов. - М., 2007. -С.423.

3. Количественное определение гемцитабина в плазме крови методом ВЭЖХ / Н. А. Паршина, Т. В. Плетенева, В. Н. Байкова, М. Н. Нариманов // Химико-фармацевтический журнал. - 2008. - №5 (т. 42). - С.38-41.

4. Определение содержания гемцитабина в плазме крови больных раком поджелудочной железы при пролонгированных инфузиях / Н. А. Паршина // Вестник РУДН, серия "Медицина". - 2008,-№6. - С. 508-511.

5. Мониторинг гемцитабина в плазме крови у детей, получающих химиотерапию по протоколу винорельбин, гемцитабин, прокарбазин, преднизолон / Н. А. Паршина, В. Н. Байкова // Детская онкология-2009. -№2. - С. 37-39.

6. Особенности токсикологического профиля гемцитабина - противоопухолевого препарата группы антиметаболитов / Н. А. Паршина, В. Н. Байкова, Т. В. Плетенева // Судебно-медицинская экспертиза (в печати).

7. Применение хроматографических методов в химико-токсикологическом анализе - глава в кн. «Токсикологическая химия. Практикум». - под ред. Т. В. Плетеневой // Н. А. Паршина, Е. В. Успенская. - М.: «Эксмо», 2008. - С. 181-201.

Резюме

Паршина Наталья Анатольевна

Биофармацевтическое исследование гемцитабина — противоопухолевого лекарственного средства группы антиметаболитов.

В работе проведена разработка системы терапевтического лекарственного мониторинга гемцитабина у больных раком поджелудочной железы и педиатрических пациентов с лимфомой Ходжкнна на основе методик количественного определения в лекарственном препарате и плазме крови и кинетического контроля лабораторных показателей крови.

Разработана унифицированная методика ВЭЖХ для контроля качества лекарственного препарата в условиях лаборатории онкологической клиники. По результатам ТЛМ было установлено, что применение модифицированного режима инфузий гемцитабина (120-минутное введение со скоростью 10мг/м" в мин) приводит к его длительному нахождению в кровеносном русле в концентрации, оптимальной для реализации цитотоксического эффекта. Охарактеризован профиль токсичности не применявшегося ранее режима и показана его удовлетворительная переносимость. Для оценки безопасности схем химиотерапии на основе гемцитабина в педиатрической онкогематологии проведены биокинетические исследования. Было установлено, что скорость восстановления показателей гематологической токсичности до нормы значительно ниже по сравнению с маркерами поражения печени.

Natalia A. Parsliina "Biopharmaceutical research of gemcitabine - anticancer drug-antimetabolite".

The research represents developing of system of therapeutic drug monitOLing of gemcitabine for patients with pancreatic cancer and children with Hodgkin's disease. The TDM system is based on HPLC-determination of gemcitabine in medicinal preparation and plasma. Also kinetic control of wide spectrum of laboratory tests was performed for these groups of patients.

Unified HPLC method was developed for qualitative and quantitative determination of gemcitabine. According to TDM it was found that using of modified regimen of infusion(120 min with a fixed dose rate of 10mg/m2 per minute) allows to achieve prolonged disposition of gemcitabine in blood to obtain its optimal concentration for realization of cytotoxic effect. Toxity profile of two types of therapy were characterized and it was shown that toxic effects are satisfactory and tolerable. To estimate safety of schemes of chemotherapy with gemcitabine in pediatric oncology the biokinetic research was performed. It was shown that recovery constants for haematological parameters are lower than for ALT and AST so supportive therapy may be useful.

Подписано в печать i2.ii.Q9 Формат60x84/16 Бумага офисная «5уе1оСору». Тираж 100 экз. Заказ № 912 Отпечатано на УМТ РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН 115478, Москва, Каширское ш., 24

Цель и задачи исследования.7

Научная новизна исследования.8

Научно-практическая значимость исследования.8

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.10

1.1 Роль гемцитабина в современной онкологии.10

1.2.1 Рак поджелудочной железы: эпидемиология, статистика, патогенез. 12

1.2.2. Терапия рака поджелудочной железы.14

1.3. Химическое строение, фармакокинетические и фармакодинамические особенности гемцитабина.17

1.3.1. Фармакопейные характеристики гемцитабина.17

1.3.2 Фармакодинамика гемцитабина.18

1.3.3 Фармакокинетика гемцитабина.22

1.3.4 Стандартный режим дозирования гемцитабина.24

1.4.Клинические исследования по изучению длительных инфузий гемцитабина с постоянной скоростью введения.25

1.5.Особенности токсикологического профиля гемцитабина.31

1.6.Фармацевтический анализ гемцитабина. Обзор фармакопейных статей.40

1.7. Алгоритм выбора условий хроматографического определения гемцитабина.42

1.7.1 ВЭЖХ-определение гемцитабина в плазме крови.48

1.8. Клинико-диагностическое значение определения гематологических и биохимических показателей при терапии гемцитабином.50

1.8.1.Общеклиническое исследование крови.50

1.8.2.Биохимические методы оценки функции печени и почек.52

1.9. Роль процессов свободнорадикального окисления и активности антиоксидантной системы при проведении химиотерапии.53

1.10. Математическое моделирование биокинетики.57

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Методы определения гемцитабина в лекарственном препарате и плазме крови.61

2.1.1. Оборудование и реактивы.61

2.1.2. Стандартные образцы.62

2.1.3. Объекты анализа.63

2.1.4. Оценка параметров хроматографической системы.64

2.1.5. Расчет количественного содержания гемцитабина в лекарственной форме.66

2. 2. Валидация хроматографического метода исследования.66

2.3 Характеристика групп пациентов.69

2.3.1. Пациенты, получавшие монотерапию гемцитабином в форме пролонгированных инфузий.70

2.3.2. Пациенты, получавшие полихимиотерапию, включающую гемцитабин.72

2.4. Методики определения биохимических показателей крови.73

2.5. Определение показателей состояния антиоксидантной системы.75

2.6 Определение подлинности гемцитабина гидрохлорида методом ИК-спектрофотометрии.81

ГЛАВА 3. Результаты исследований.82

3.1. Разработка экспресс-методики количественного определения гемцитабина гидрохлорида в лекарственном препарате «Гемзар».83

3.1.1 Подготовка стандартных растворов.84

3.1.2. Выбор оптимальных условий хроматографического определения.85

3.1.3. Выбор условий детектирования.91

3.1.4. Параметры разделения и метрологическая характеристика методики.92

3.2 Определение подлинности лекарственного препарата «Гемзар»и оценка содержания гемцитабина гидрохлорида в нем.95

3.2.1 Подготовка проб для хроматографического анализа.95

3.2.2 Анализ лекарственного препарата «Гемзар» в условиях онкологической клиники.95

3.3. Идентификация гемцитабина гидрохлорида в лекарственном препарате «Гемзар» методом ИК—спектрометрии.97

3.4. Разработка и валидация методики количественного определения гемцитабина в плазме крови.102

3.5. Терапевтический лекарственный мониторинг гемцитабина в плазме крови и оценка безопасности применения пролонгированной инфузии в терапии рака поджелудочной железы.108

3.5.1 Эффективность модифицированного режима введения гемцитабина.108

3.5.2 Оценка переносимости и токсичности пролонгированных инфузий гемцитабина в терапии рака поджелудочной железы.110

3.6. Мониторинг гемцитабина в плазме крови у детей, получающих комплексную терапию, включающую гемцитабин, и оценка безопасности режимов.123

3.6.1. Мониторинг гемцитабина у детей, получающих препарат в составе химиотерапии лимфомы Ходжкина.124

3.6.2. Токсичность схем терапии на основе гемцитабина у детей с лимфомой Ходжкина.126

3.6.3. Токсичность химиотерапии на основе гемцитабина у детей с солидными опухолями.139

3.7. Биокинетический анализ показателей гепатотоксичности и гематологической токсичности схем химиотерапии на основе гемцитабина.144

ВЫВОДЫ.146

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.148

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ECOG - Восточная Кооперативная Группа Исследования Рака FDR - инфузии с фиксированной скоростью введения Gem (Гем) - гемцитабин GeOx - протокол гемцитабин-оксалиплатин

ViGePP - протокол винорельбин-гемцитабин-прокарбазин-преднизолон

USP - фармакопея США

AJ1T - аланинаминотрансфераза

АОК - антиоксидантный комплекс

АОС - антиоксидантная система

ACT - аспартатаминотрансфераза в/в - внутривенно

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГПО - глутатионпероксидаза

ГР - глутатионредуктаза

ДЛТ - дозолимитирующая токсичность

JIB - лекарственное вещество

ЛДГ - лактатдегидрогеназа

ЛИ - лекарственный препарат

JIC - лекарственное средство

ЛФ - лекарственная форма

ЛХ - лимфома Ходжкина

ЛУК - ледяная уксусная кислота

МДА - малоновый диальдегид

НМРЛ -немелкоклеточный рак легкого

ОАОС - общий антиоксидантный статус

ОБ - общий билирубин

ОФ — обращенная фаза

ПОЛ - пероксидное окисление липидов

ПФ - подвижная фаза

ПХТ - полихимиотерапия

РПЖ - рак поджелудочной железы

СОД - супероксиддисмутаза

СПОЛ - свободнорадикальное пероксидное окисление липидов

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТЛМ - терапевтический лекарственный мониторинг

XT- химиотерапия

ЩФ - щелочная фосфатаза у-ГТ - у -глутамилтрансфераза

Введение

Актуальность темы

Гемцитабин (торговое название «Гемзар») — 2',2-дифтородезоксицитидин-сравнительно новый противоопухолевый препарат из группы антиметаболитов - применяется в терапии злокачественных новообразований у взрослых [115, 123]. Гемцитабин является препаратом выбора в терапии нерезектабельного рака поджелудочной железы [112, 120]. Уникальный механизм действия, выраженная эффективность в терапии различных типов опухолей у взрослых, а также умеренная токсичность создали предпосылки для внедрения препарата в детскую онкологию [107].

Оптимизация режимов введения гемцитабина путем модификации дозы и длительности инфузии - актуальная задача противоопухолевой терапии [127]. Достижение максимальной эффективности терапии эскалацией дозы препарата нецелесообразно, так как влечет за собой развитие тяжёлых токсических реакций. В связи с этим важной задачей является поиск новых режимов дозирования, заключающихся в увеличении времени инфузии по сравнению со стандартным режимом с одновременным снижением дозы гемцитабина.

Применяемая до настоящего времени 30-минутная инфузия в дозе 10001500 мг/м2 [37, 55] приводит к тому, что большую часть времени концентрация гемцитабина в плазме крови превышает концентрацию насыщения дезоксицитидинкиназы — фермента, обеспечивающего образование активных внутриклеточных форм гемцитабина как пролекарства. Это вызывает неполную активацию гемцитабина.

Исследования последних лет показали, что с изменением темпа внутривенного введения гемцитабина меняется его противоопухолевая активность и переносимость [55, 78]. Исходя из представлений о возможности оптимального использования особенностей метаболизма гемцитабина разработан режим фиксированной дозовой интенсивности (Fixed Dose Rate -FDR), когда гемцитабин инфузируется длительно (до 120 мин) с постоянной скоростью 10 мг/м2 в минуту [130].

В условиях пролонгированного введения для оценки скорости накопления внутриклеточных метаболитов, ответственных за реализацию цитотоксического эффекта гемцитабина, необходимо исследовать его фармакокинетику. Кроме того, особое значение приобретает оценка эффективности и безопасности режима длительных инфузий препарата на основе контроля общих клинических и биохимических показателей крови.

Химиотерапия гемцитабином в сочетании с другими цитостатиками успешно применяется в лечении различных гистологических подтипов лимфомы Ходжкина у взрослых. Но недостаточная и противоречивая информация о безопасности режимов химиотерапии, включающих гемцитабин, ограничивает его применение для лечения гемобластозов и солидных опухолей у детей [117, 127]. Для эффективного дозирования гемцитабина в схемах химиотерапии в детской практике требуется детальное исследование особенностей его метаболизма.

Цель исследования - разработка системы терапевтического лекарственного мониторинга гемцитабина у больных раком поджелудочной железы и лимфомой Ходжкина на основе методик количественного определения в лекарственном препарате и плазме крови методом ВЭЖХ и кинетического контроля общеклинических и биохимических Задачи исследования:

1. Разработать методики контроля качества лекарственного препарата и количественного определения гемцитабина в плазме крови методом ВЭЖХ.

2. Провести терапевтический мониторинг гемцитабина с оценкой его фармакокинетики у больных раком поджелудочной железы при режиме модифицированной инфузии с фиксированной скоростью введения для оптимизации химиотерапии.

3. Осуществить систематический контроль биохимических и общеклинических показателей крови у больных раком поджелудочной железы, получающих препарат в режиме модифицированной инфузии с фиксированной скоростью введения.

4. Провести терапевтический мониторинг гемцитабина у детей с лимфомой Ходжкина при его ведении в состав комплексной химиотерапии для оценки эффективности и безопасности применения.

5. Оценить степень выраженности гематологической токсичности и гепатотоксичности при различных схемах терапии гемцитабином по кинетическим параметрам биохимических и общеклинических показателей крови.

Научная новизна. Разработана и валидирована экспресс-методика определения гемцитабина гидрохлорида в лекарственной форме методом ВЭЖХ, которая позволила охарактеризовать различные серии препарата по показателям качества: «подлинность», «испытания на чистоту», «количественное определение».

Разработана и валидирована экспресс-методика определения гемцитабина в плазме крови методом ВЭЖХ. Методика позволила проводить терапевтический мониторинг гемцитабина и продемонстрировать преимущественную эффективность не применявшегося ранее режима пролонгированных инфузий гемцитабина в рамках протокола «Исследование дозозависимого режима длительных инфузий гемцитабина у больных местнораспространенным и диссеминированным раком поджелудочной железы», разработанного в отделении Клинической фармакологии НИИ Клинической онкологии РОНЦ РАМН по сравнению со стандартным введением.

Практическая значимость. Разработанная методика определения гемцитабина в плазме крови позволяет мониторировать его содержание при назначении инфузий препарата в различных режимах и схемах моно- и полихимиотерапии для контроля и коррекции дозы.

На основании результатов терапевтического лекарственного мониторинга гемцитабина и оценки показателей биохимического и гематологического анализа крови модифицированный режим с фиксированной скоростью введения рекомендован для терапии рака поджелудочной железы взамен действующему стандартному протоколу.

Внедрение в практику. Экспресс-метод количественного определения гемцитабина гидрохлорида реализуется в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

Рекомендации по применению модифицированного режима инфузий гемцитабина взамен стандартного режима введения, биокинетическая оценка показателей гематологической токсичности и гепатотоксичности у детей, получающих гемцитабин в составе полихимиотерапии, внедрены в лечебную практику в РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН.

Результаты исследования внедрены в учебный процесс кафедры фармацевтической и токсикологической химии медицинского факультета РУДН (специальность «Фармация», дисциплина фармацевтическая химия, раздел «Современные методы стандартизации и контроля качества лекарственных средств»)

выводы

1. Разработана методика количественного определения гемцитабина в ЛП и плазме крови. В результате экспериментальных исследований был подобран оптимальный вариант пробоподготовки и условия хроматографирования: изократическая система для реализации разделения в обращенно-фазовом варианте ВЭЖХ. Нижний предел количественного определения для плазмы крови составил 1 мкг/мл, линейная зависимость сохранялась в интервале (1-^15) мкг/мл (г=0,9975). Проведена оценка качества двух серий препарата, выявлено соответствие НД по показателям «подлинность», «количественное определение» и «испытания на чистоту» методами ВЭЖХ и ИК-спектроскопии.

2. На основании результатов ТЛМ гемцитабина у больных РПЖ, получающих препарат в форме инфузий с фиксированной скоростью введения, было установлено, что оптимальная концентрация гемцитабина в плазме для проявления его терапевтического эффекта (6—9 мкг/мл) достигается в среднем через 30 мин от начала 120-минутного введения и остается на данном уровне во время инфузии и в течение 30 мин после её завершения. Для группы пациентов, получавших гемцитабин в форме стандартной инфузии, такой закономерности не выявлено. Определены фармакокинетические характеристики гемцитабина для пролонгированных инфузий: Стах=Т0,7±1,8 мкг/мл, период полувыведения 11/2=16,9 мин, константа элиминации к=(0,041±0,007)мин~1.

3. Установлено, что модифицированный режим введения гемцитабина в терапии РПЖ характеризуется умеренным профилем токсичности, основным проявлением которой явилась миелосупрессия: 40% пациентов после применения гемцитабина возникла тромбоцитопения, анемия наблюдалась у 10% пациентов, а лейкопения - у 48% пациентов.

4. В результате ТЛМ гемцитабина у детей с лимф омой Ходжкина, получавших препарат в составе комплексной химиотерапии, было показано, что во время инфузии и в течение 10 мин после ее завершения концентрация пролекарства достигает оптимальных значений (6 мкг/мл). На основании полученных результатов были рассчитаны фармакокинетические параметры для данного типа инфузий гемцитабина: Стах= (6,12±1,82) мкг/мл, константа элиминации к = (0,103±0,032) мин-1, ti/2=6,71 мин.

5. На основании биокинетического моделирования показано, что скорость восстановления показателей гематологической токсичности до нормы значительно ниже по сравнению с маркерами поражения печени (к восстановления лейкоцитов составила 0,03-0,045, а для AJIT и ACT (0,070,08) сут-1 и (0,06-0,07) сут-1 соответственно).