Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Анализ и стандартизация азидотимидина с использованием комплекса физико-химических методов

п>9 3 У ^ - ч

ВСЕСОЮЗНОЕ ОБЪЕДИНЕНИЕ «СОЮЗФАРМАЦИЯ» ПРИ МИНИСТЕРСТВЕ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ СССР

ВСЕСОЮЗНЫЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФАРМАЦИИ

На правах рукописи

НЕСТЕРОВ Виктор Валерьевич

АНАЛИЗ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ АЗИДОТИМИДИНА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КОМПЛЕКСА ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИХ МЕТОДОВ

Специальность 15.00.02 — фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

МОСКВА - 1991

Работа выполнена в Государственном научно-исследова-тсльском институте по стандартизации и контролю лекарственных средств Минздрава СССР.

Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор Н. С. Евтушенко Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор А. 3. Книжник кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник Т. А. Завражная

Ведущая организация —

Всесоюзный научно-исследовательский институт химии и технологии лекарственных средств (Харьков)

Защита состоится « 6 » 1991 г. в /0_ча-

сов на заседании специализированного совета Д-074.28.01 при Всесоюзном научно-исследовательском институте фармации (по адресу: 117418, Москва, ул. Красикова, 34).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всесоюзного научно-исследовательского института фармации.

Автореферат разослан « ^^ » _199 Г г.

Ученый секретарь специализированного совета Д-074.28.01 кандидат фармацевтических наук, старший научный сотрудник

Л. М. Боброва

: г ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'., .¡^ [Актуальность темы. Начало 80-х годов возвестило человечество о появлении нового заболевания, явившегося воистину "чумой XX века" н получившего название синдром приобретенного иммунодефицита (спид).

В основе этого заболевания лежит поражение иммуной системы организма. Возбудителем является вирус, относящийся к семейству ретро-вирусов. Сам по себе иммунодефицит не вызывает каких-либо признаков заболевания, юс вызывают многочисленные, наслаивающиеся друг на друга патологические процессы, перед которыми организм оказывается беззащитным.

Поиск и разработка новых лекарственных препаратов для лечения этого заболевания на сегодняшний день является весьма актуальной проблемой.

Наиболее перспективными синтетическими лекарственными средствами, применяемыми для лечения СГВД являются производные деэоксинуклеотидов. В настоящее время З-дезокси-З-азидотимидин (азидотимидин) можно рассматривать как единственное лекарственное средство для лечения С1ВД.

Рост числа заболеваний С1ВД в СССР (к концу 1992 г. ожидается до 24 тыс., а к 2000 г. около 1,Ь млн.человек), а также высокая цена препарата за рубежом (стоимость годичного курса (100-200 грамм) составляет свыше 15 тыс.долларов), диктует необходимость промышленного производства азид от ими дина в нашей стране.

Синтез азидотимидина (АЗТ) в Советском Союзе осуществлен в Институте молекулярной биологии АН СССР, совместно с Московским институтом тонкой химической технологии и НЮ"Витамины".

Одной из проблем, которая требовала незамедлительного решения при осуществлении промышленного выпуска нового лекарственного средства, является контроль качества готового продукта.

Известно, что качество препарата находится в прямой зависимости от уровня технологического процесса, используемых методов анализа, стандартизации основных продуктов его синтеза, а также уровня требований включенных в НТД.

Поэтому для обоснования нормативных показателей качества азидотимидина и разработки методов контроля необходимо было провести исследование по изучению физико-химических свойств как самого АЗТ, так и веществ, представлкхаих собой его возможные примеси.

Для реавния перечисленных задач наиболее перспективный является применение комплекса физических и физико-химических методов анализа. Такой подход позволяет всесторонне, с высокой чувствительностью и надежностью исследовать физико-химические свойства вещества, определить возможные причины юс изменений, и на основе полученных результатов разработать методики анализа доя оценки качества препарата.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлось изучение физико-химических свойств нового противовирусного лекарственного средства азидотимидина на основе использования комплекса современных методов и обоснование параметров нормативно-технических показателей качества препарата.

Для достижения указанной цели необходимо было решение следующих основных задач исследования:

- изучить хроматографические характеристики исследуемого соединения азидотимидина и возможных примесей для разработки методик определения его чистоты и количественного содержания;

- изучить спектральные характеристики в видимой УФ- и ИК-области спектра, показать возможность их использования для оценки степени идентичности и качества препарата;

- исследовать возможность применения методов поляриметрии, термического анализа,рентгенографии и ШР при определении структурных особенностей азидотимидина;

- на основании выявленных физико-химических свойств азидотимидина обосновать комплекс методов анализа и установить параметры, позволяющие всесторонне оценить качество и стандартизировать готовый продукт.

Научная новизна. Изучено влияние основных компонентов хроматографической системы на поведение азидотимидина (АЗТ) и сопутствующих ему примесей в условиях обращенно-фазной ВЭЖХ. Показано, что они являются полупродуктами, побочными продуктами синтеза и продуктами разложения препарата. Разработаны условия их хроматографичес-кого разделения.

Установлена ТСХ - селективная система для определения чистоты АЗТ - (метанол:хлороформ, 1:9).

Разработана унифицированная газохроиато графическая методика, позволяющая одновременно идентифицировать и количественно оценить примеси Ь органических растворителей в лекарственном веществ АЗТ и остаточных растворителей, используемых в производстве стандартного образца препарата.

С использованиемпроизводноК УФ-спактрофотометряи исследованы /Ф-спектрьГ АЗТ и его вероятных примесей в различных растворителях (вода, метанол, растворы соляной кислоты и натрия гидроксида), в результате установлено, что рН ерэды влияет ка характер спектра АЗТ: в кислой среда наблюдается смещение перлов полосы поглощения в высокочастотную область, а в полочной в низкочастотную область.

Методом Ж-спеггрофотокетрия исследовано строение АЗТ и выявлены наиболее характерные полосы поглощения (при ЗЗЬО-ЗЗОО, 3180-3120, 900-820, 1070-990, 1625-1500 и 2130-2080 см"1) для группировок, определяющих фармакологическое действие препарат^..

При изучении термических характеристик АЗТ установлена возможность образования его полиморфных форм с различными текпературзгет плавления. Исследовано влияние примесей на термические эффекты препарата, показано, что с увеличением концентрации примесей наблюдается понижение температуры плавления вещества.

Для идентификации и контроля качества АЗТ разработан комплекс методов (хроматографических, спектральных и термических), позволяющий определить показатели качества АЗТ (подлинность, содержание специфических примесей, количественное содержание, а также допустимые нормы их отклонений).

Практическая значимость. На основании проведенных исследований разработаны и внедрены:

методики контроля качества и стандартизация АЗТ, которые включены в проект ЮС на лекарственное вещество и стандартный образец АЗТ. Проекты представлены в Фармакологический Комитет МЗ СССР для получения разрешения на клинические испытания препарата (Акт № 94/9Ь от 7.06.1991 г., Акт № 95/95 от 7.06.I99I г.);

- методики постадийного контроля лабораторного синтеза АЗТ (Акт от 10.01.1989 г. НПО "Витамины);

- методики определения органических остаточных растворителей и определения цветности АЗТ (Акт 0.6-6216-92.3 от 2.10.90 ИБХ АН СССР);

- методики ТСХ и ВЭ1Х для определения специфических примесей и чистоты АЗТ (Акт от 19.03.1991 г. ЗП МБК ВКЩ АМН СССР);

- методики контроля качества стандартного образца АЗТ с использованием ТСХ, ВйНХ, и Ш (Акт от 22.04.91 ИБХ АН СССР).

На защиту выносятся следующие положения:

- результаты исследования хроматографического поведет»* азидоти-мидина и его специфических примесей, полученные с использованием методов ТСХ, ЬЫХ и. Ш;' ■

- & -

- данные исследования спектральных характеристик аэидотимидина с использованием методов ОСФИ, УФ-, ИК-спектрофотометрии, ЯМР%-спектро-сколии, рентгеновской дифрактбграфии и поляриметрии;

- результаты изучения термических характеристик аэидотимидина, полученные истодом дериватографии;

- методики контроля качества и стандартизации лекарственного вещества аэидотимидина, и его стандартного образца.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на конференции молодчх ученых Гос.НИИС^ИС ИЗ СССР (Москва 1988,1989, 1990 гг), на Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых в г.Куйбышеве - 1988 г., на Всесоюзной научной конференции молодых ученых г.Москва-1990 г., на научно-практической конференции в г.Владимире - 1991 г.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научных исследований Гос.НИИСКЛС МЗ СССР (номер государственной регистрации 01.6Ь,0 0823Ы) и соответствует тематике научного направления "Фармацевтическая химия" союзкой проблемы "Фармация, Научного Совета N 48 АМН СССР.

Публикации. По теме диссертации опубликовано & печатных работ.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 159 страницах машинописного текста, содержит 25 таблиц и 29 рисунков.

Работа состоит из введения, обзора литературы (I глава), 4 глав экспериментальных исследований, выводов и списка литературы. Список литературы включает 83 источника отечественной и 10Ь зарубежной литературы.

Во введении сформулированы актуальность, цель и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе критически рассмотрены литературные данные,касающиеся физико-химических свойств, фармакологического действия препарата и показаны основные тенденции применения современных методов для анализа аэидотимидина.

Вторая глава посвящена применению хроматографических методов (ТСХ, ЬЭЖХ и Г1Х) для оценки чистоты и контроля качества аэидотимидина,

В третьей главе представлены результаты исследований спектральных характеристик аэидотимидина с использованием методов ООШ, У4-, ИК-

спектрофотометрил, ЯМР%-спектроскопии, рентгеновской дифрактографии и поляриметрии. Погазана возможность использования указанных методов для контроля качества и стандартизации азидотимидина.

В четвертой главе изложены результаты экспериментальных исследований по изучению термических характеристик; установлена целесообразность использования термического анализа для оценки качества азидоти-мидина. ■

Пятая глава посвящена вопросу контроля качества стандартного образца азидотимидина. .

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. Использование хроматографичесхих методов для контроля качества и стандартизации азидотимидина.'

Азидотидадин (АЗТ) является достаточно сложным аналитическим объектом, вследствие наличия в нем большого числа примесей, имеющих близкую с основным веществом химическую структуру, что делает применение хроматографичесига методов для его анализа вполне обоснованным.

Для оценки качества лекарственного вещества АЗТ была применены методы ТСХ и ВЭЖХ, нами такяч рассмотрена возможность использования метода ГЖХ для определения остаточных органических растворителей п АЗТ.

Для определения специфических примесей нами предлагается метод ТСХ. В результате проведенных исследований по выбору условий хроматог-рафического разделения было показано, что оптимальное разделение АЗТ и его возможных примесей достигается на силикагельных пластинках (Кизильгель 60-УФ-254), в системе растворителей метанол¡хлороформ (1:9). В ходе исследований установлено, что при детектировании в УФ-254 нм достигается наибольшая чувствительность обнаружения анализируемых соединений.

Чувствительность обнаружения на хроматограыме АЗТ, тимина, тиыи-дина и б енэ оилан гидрог ими дина (БАнйГмд) практически одинакова, около О,С© мкг. Учитывая это, содержание указанных примесей предложено оценивать по сравнению с АЗТ. Чувствительность обнаружения бензоилазидотимидина (БАЗГ) и дибензоилтимидина (ДБГмд) приблизительно в 4 раза ниже (около 0,2 мкг), поэтому для оценки содержания этих примесей в качестве свидетеля предлагается использование раствора АЗТ с концентрацией в 4 раза ниже, чем в случав тимина, тимидина и БАнЛцц .

Разработанная методика позволяет проводить полуколичественную оценку содержания специфических примесей в лекарственном веществе АЗТ.

Применение ВЭЖХ ддя исследований АЗТ предусматривало разработку методик определения содержания "УФ-поглощасцих" примесей и количественного содержания действующеговещества.

Для решения данной задачи нами был использован СФ вариант ВЭЖХ. Исследования по оптимизации хроматографических условий разделения показали, что, как АЗТ, так и его возможные примеси имеет различную степень удерживания на 0$ сорбенте. Так тинин, тимидин и АЗТ имеют удовлетворительное разделение на ОФ сорбенте при использовании подвижных фаз, содержащих до 20 % метанола (рисЛ)|. В тоже время, БАнгТыд, БАЗТ и ДОГмд практически не элюируются с колонки в данных условиях. Вымывание этих соединений достигается применением высоких концентраций метанола в подвижной фазе (рис.2). Однако с увеличением концентрации органического модификатора практически отсутствует деление тимина и тимидина.

Для решения данной задачи нами предлагается использование двух Хроматографических циклов с концентрацией метанола в подвижной фазе (А) - 20 % при определении тимина и тимидина, и (Б) - 60 % при определении БАнгТвд, БАЗТ, и ДБГмд.

Хроматографические условия, разработанные для определения специфических примесей позволяют получить вполне удовлетворительное разделение АЗТ, тимина и тимидина на сорбенте "jn Ibondapak. ™ Cjq"-I0 мкм (колонка 300x3.9 мм), при'злюировании смесью метанол-вода (20:80) со скоростью подвижной фазы I мл/мин. Детектирование проводили при 26Ь им,(что соответствует максимуму поглощения анализируешь соединений, растворенных в подвижной фазе).

Для определения БАЗТ, БАнгТыд и ДБТмд нами предлагается использование. аналогичных условий, но при содержании метанола в подвижной фазе 60 % и детектировании при 230 нм (что соответствует максимумупог-лещения данных соединений в подвижной фазе).

Расчет количественного содержания проводили методом внутренней нормализации площадей пиков. Анализ 9 опытных партий показал, что содержание примесей в них колеблется в системе (А) от 0,15 % до 4,77 % и в системе (В) от 0,45 % до 2,41 % (табл.1).

Определение количественного содержания АЗТ проводилось при тех же хроматографических условиях (система А), С использованием метода внешнего стандарта, в качестве которого использовался опытный стандартный образец АЗТ. Относительная ошибка определения не превышает +2 %. С помощью разработанной методики была проведена оценка качества ,9 опытных партий лекарственного вещества АЗТ. Установлено, что содер-

Хроматограмма модельной смзси АЗТ, тимин, тимидин при элвироЕании подвижной фазой метанол:вода, 20:80

1

■ . I» _

I I I-1-1-1-1-1-1-I-1-1-1-1—

О 2 4 6 6 10 12 мин

I - тимин, 2 - тимидин, 3 - АЗТ Риа.1.

Хроматограмма модельной смеси при элюировании смесью метанол:вода (60:40)

2

3

/

/

■ I I

10

20 мин

I- неразделенный пик тимин-тимидин, 2 - АЗТ, 3 - БАнгТмд, 4 - БАЗТ, 5 - ДБТмд

Рис .2

О

Таблица I

Результаты количественного определения УФ поглощающих примесей в лекарственном веществе АЗТ методом ВЭ1Х

№ партии

1 тимин и тимидин

Содержание в %

{БАнгТмд, БАЗ, ДЕГмд

пр,ЧС$Р

1

2

3

4 . 5

б 7 , 8

0,20 0,33 4,77 0,29 0,15 0,38 0,36 0,25 0,45

1,70 2,21 0,45 2,25 ■ 2,78 1,35 2,41 1,40 1,62

жание действующего вещества в них колеблется от 96,12 % до 99,35 %. Разработанные методики были использованы в процессе оптимизации синтеза препарата в НГО"Витамины".

Методики контроля содержания "УФ-поглощащих" примесей включены в проект ВФС на лекарственное вещество й стандартный образец АЗТ. Методика определения действующего вещества включена в проект ВФС на лекарственное вещество АЗТ.

Одним из важных вопросов качества лекарственных препаратор является определение в' них остаточных ' органических растворителей. Исходя из технологической схемы синтеза было установлено, что наиболее вероятными примесями в АЗТ возможны: метанол, диэтиламин, хлороформ, диметилформамид (ДМШ и толуол. Для их определения нами использован метод РЖХ.

Методика газохроыатографического разделения разрабатывалась на модельных смесях. Предложенные хроматографические условия позволяют получить удовлетворительное разделение исследуемых соединений на полярном носителе (рис.3). Условия хроматографического разделения: газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором, стеклянная колонка 300x0,3 см, заполненная сорбентом "Хроиосор(Г P-I0I", с размером частиц 60-80 меш. Температура термостата колонки - 140 °С, испарителя и детектора - 200 t, скорость газа-носителя (гелий) и водорода -30 мл/мин, воздуха - 300 мл/мин.

/ Идентификацию примесей проводили сопоставлением времен удерживания .остаточных орагкических растворителей с временами удерживания

стандартов этих пригасей. Количественное определение проводили методом внешнего стандарта. Розработшшая методика апробирована на опытных про!,каленных партиях АЗТ (табл.2). Показано, что сумкарное содержание примеси остаточных органических растворителей находится в интервале от 0,02 % до 0,15 %.

Таблица 2

Определение остаточных органических растворителей в опытно-промышленных партиях АЗТ методом ГЖХ.

№ партии!__Найдено п %

¡метанол} диэтиламш [ хлороформ ! ДМФА ! толуол ! сумма

I следы - 0,03 следа 0,02 0,08

2 0,02 • - следы 0,03 0,05 0,10

3 0,05 - - 0,07 0,02 0,15

4 - 0,12 - - следы, 0,12

5 ■ следы - 0,02 - - 0,02

6 0,03 - - 0,02 - 0,05

7 0,02 • 0,06 - 0,04 - 0,12

8 следы 0,08 следы следы 0,06 0,14

пр.ЧСФР следы следы - - следы -

Наряду с контролем остаточных растворителей в готовом продукта, в процессе производства препарата возникала необходимость определения остаточных растворителей диоксана и пиридина в полупродуктах синтеза, т.е. в БАнхТмд. Для их определения нами были использованы ранее описанные хроматографические условия. Хроматограмма разделения приведена на рис.4. Количественное определение проводили методом внешнего стандарта. Методика апробирована на полупродуктах синтеза, который в свою очередь были использованы для производства АЗТ. Исследование указанных партий лекарственного вещества на содержание в них примеси диоксана и пиридина дали отрицательный результат.

Результаты определения остаточных органических растворителей использованы при составлении пояснительной записки к проекту &ЬС на лекарственное вещество АЗТ.

Предложенные методики используются на ОПУ ИБХ АН СССР для контроля производства препарата.

2. Спектральные характеристики АЗТ

Для разработки методов контроля качества и стандартизации АЗТ нами исследованы спектральные характеристики препарата,с использовани-

Хромат о грамма разделения модельной смеси в изоамиловом спирте

О 2 4 6 8 10 12 мин

I - метанол, 2 - диэтиламин, 3 - хлороформ, 4 - толуол, 5 - ДММ, б - изоамиловый спирт Рио.З

Хроматограмма разделения модельной смеси в ацетоне

■ I I I I I I it I »11

0 2 '4 6 8 10 мин

I - диоксан, 2 - пиридин, 3 - ацетон Рис.4

ем методов: ОСФМ, У$-, ИК-спектрофотомвтрии, ШР^Н-спектроскопии, рентгеновской дифрактографин и поляриметрии.

Учитывая, что изменения в структуре молекулы, а также наличие примесей, может быть причиной изменения цвета препарата, контролирование лекарственного вещества по показателю "Цветность" является черъэ-вычайно важным. Нами исследованы цветовые характеристики АЗТ методом 0С$М по методике ГО-XI и в системе СИЕЛАБ. Полученные результаты свидетельствуют о неоднородности цветовых характеристик для анализируемых партий (табл.3). Исследования, выполненные в системе СИЕЛАБ дозволяют заключить, что образцы ни одной партии-нэ ыогут быть определены как белые. Различия между партиями проявляются как- в насыщенности тона ( $ ), так и в характере цветового тона (Н°).

Таблица 3

Цветовые характеристики АЗТ

)> партии! Визуальное! Характеристика цветового тона в система (Степень !определе- 1СИЕЯАБ ________(белизны

1нив цвета 1 I ! 14 А 1 в 1 О } Н° } У/ 1по 1ГФ XI

I кремовый 83,00 0,03 8,08 8;08 90,20 81,20 0,84

2. белый 79,20 0,023 0,60 0,60 92,12 79,18 0,97

3 кремовый 83,57 0,34 6,90 6,90 87,15 82,18 0,66

4 желтоватый 75,80 2,70 12,90 13,20 78,20 72,40 0,70

5 белый 88,20 0,09 1,70 1,70 86,98 88,10 0,96

6 желтоватый 78,70 2,40 12,70 12,90 79,30 75,05 0,71

7 белый 78,60 2,30 15,80 15,90 81,80 73,30 0,68

8 белый 69,20 1,66 5,13 5,40 72,02 68,70 0,86

пр ЧСФР кремовый 71,89 2,92 II,58 11,95 75,81 69,45 0,72

Исходя из полученных экспериментальных данных,лекарственное вещество АЗТ характеризуется как белый порошок с отчетливым желтым оттенком. Результаты, полученные в систоле СИЕЛАБ,являются более достоверными, чем по Г&-Х1 и несут обширную информацию о цветовых характеристиках АЗТ.

УФ-спектры сняты э различных растворителях: в воде, метаноле, в 0,1 М растворах гидроксида натрия и соляной кислоты. Спектры 0,002 % раствора АЗТ в метаноле и воде имеют два максимума поглощения при 210 нм и 266 км, а также минимум поглощения при 233 км (рис.Ь).

Показано, что рН среды не влияет на втору» полосу поглощения я изменявт первую, в кислой среде наблюдается смещение максимума поглоще-

УФ-йпектры поглощения АЗТ

УФ-спектри поглощения АЗТ и его возможных примесей в метаноле

0,1 М раствор соляной кислоты С----) тимидин (— х—

Рис.5 Рис.6

кия в высокочастотную область (208 ни), а в щелочной в низкочастотную область (219 нм) (рис.5).

В результате исследований УФ-спектров примесей установлено, что тимин и тимидкн имеют практически одинаковый с АЗТ характер спектра поглощения, обусловленный наличием группы 5-метилурацила в этих соединениях (рис.6).

Наличие азидной группы в АЗТ не удалось идентифицировать Даже с использованием четвертой производной от спектров поглощения.

Идентичность спектров АЗТ и примесей делает проблематичным использование УФ-спектрофотометрии для количественного, определения АЗТ.

Нами рассмотрена возможность использования УФ-спектрофотометрии для оценки чистоты препарата. В проведенных исследованиях,изучено влияние примесей на характер спектра АЗТ, для чего определены отношения оптических плотностей в минимуме для АЗТ и имеющихся в нашем распоряжении примесей.

Наличие примесей может оказывать влияние на эти соотношения поскольку указанные соединения характеризуются более высокими отношениями по сравнению с АЗТ. Полученные экспериментальные данные позволяют сделать вывод, что отношения плотностей А д 234^ А 210 и *Д234/А Я 266 равное 0,23 и 0,22 соответственно, является характерным для АЗТ.

Таким образом, установлено, что УФ-спектрофггсметрия может быть использована для определения подлинности АЗТ (подтверждение группы 5-метилурацила), однако не может бьггь использована для подтверждения в нем азидной группы. Показана возможность использования УФ-спектрофотометрии для определения чистоты АЗТ по отношению оптических плотностей.

Изучены ИК-спектры АЗТ в дисках с КВг. Использование ИК-спектро-фотометрии позволяет идентифицировать в АЗТ азидо-группу (при 21302080 ), определяющую фармакологическое действие препарата.

При сравнительной оценке образцов различных партий, нами были выявлены отличия в строении образцов некоторых партий, которые могут быть объяснены изменениями связей в гетероцикле молекулы.

Для более полного изучения структурных особенностей АЗТ было продолжено исследование его строения^ использованием методом. ЩР^Н-спек-троскопии и рентгеновской дифрактоскопии.'

В результате проведенных методом ЯМР исследований,удалось установить характерные для АЗТ сигналы в млн.долях протона при: 6 1,92, 2,36-2,55, 3,67-4,11, 4,48,6,05, 4,39, 9,8. Было показано, что спектры АЗТ различных партий практически идентичны и отличаются лишь интен-

сивностью сигнала при 6-2,7 ил.д., что может быть объяснено различным содержанием влаги в данных образцах.

Используя в работе метод рентгеновской дифрактоскопии7кы не ставили перед собой задачу расчета параметров кристаллической решетки. Целью наших исследований было изучение однородности рентгенографических характеристик лекарственного вещества АЗТ различных партий и рассмотрение возможности применения данного метода для идентичности препарата.

Установлено, что образцы практически всех партий идентичны и дают аналогичные дифракционные картины (рис.7А). Однако в процессе исследований выявлены существенные различия в характере дифракционных кривых для образцов партии Р 3 (рис.7Б). Наблюдаемые отличия могут быть объяснены малой степенью кристалличности в образцах этой партии, или их принадлежностью к другой кристаллической модификации.

Для определения подлинности АЗТ предложено использовать метод по-ляриметрии. Определено удельное вращение оптической плотности для 0,8 % растворов лекарственного вещества АЗТ в метаноле (ГФ-XI). Доказано что [dj siqjf для АЗТ должно находиться в интервале (+58°)-(+61°).

3. Термические характеристики АЗТ

Одной из констант, характеризующих структурные особенности, а также гомогенность твердых веществ, являются его термические характеристики. Этим было обусловлено исследование термических характеристик лекарственного вещества АЗТ с использованием метода дериватографии.

Исследования проводились на приборе "Дериеатограф-Ю&О", фирмы "КОМ" Венгрия. Весы аналитические с воздушным демпфером и устройством для накладки гирь. Основная чувствительность 100 мг. Предел измерений 0-10 г. Точность измерения при чувствительности: 20 мг ± I %> ЬО -100 мг ±0,5 200-2000 мг ±0,2 %. Гальванометр зеркальный,с натянутой подвеской типа Kenn Зоннее, чувствительность 1,10 а/мм/м. Внутренне сопротивление ЗЬ0-400 ом. Длительность колебаний 10-11 сек. Термопары Р* -Pi -К^ (ллатино-плагино-родиевые) 0,35, точность по стандарту МСЗ II29I.

Лекарственное вещество АЗТ имеет два термических эффекта в интервале температуры I19—121 °С и 180-230 °С (рис.8). Первый эффект-эндотермический, связан с плавлением, о чем свидетельствует постоян-. ство массы образца. Отсутствие термической деструкции доказывалось методом ТСХ, после прогревания при данной температуре. Критерием оценки являлось отсутствие дополнительных пятен на хроматограмме. Второй эффект - экзотермический, характеризует собой процесс термического

Рентгеновские дифрактограыш

А) типичная для АЗТ Б) опытная партия 9 3

Рис.7

*JU

I tl-w. A—

o> I

разложения, о чем свидетельствует постоянное изменение массы и обугливание образца.

Наличие в некоторых партиях третьего термического эффекта (табл.4) объясняется содержанием остаточных органических растворителей.После прогревания образца при данной температуре, наблюдаемый эффект исчезал.

Нами установлено, что в процессе синтеза препарата возможно образование полиморфных модификаций с различными температурами плавления I17-119 °С и 157-1Ь9 °С (партия Я 3).

С целью рассмотрения возможных причин.наблюдаемых.изменений исследовано влияние некоторых примесей на термические характеристики ЛЗТ,

Типичная дериватограмма АЗТ

Рис.8

Таблица 4

Термические характеристики АЗТ различных партий

№ партии! температурный 1 интервал. оС 1 природа эффекта!температура.плавления ! !по ГФ-Х1, с

I I. 119-121 пл. 119-121

2. 180-230 т.р.

2 I. 35-55 Д- 119-121

2. 119-121 пл.

3. 180-230 ' т.р.

3 I. 25-30 д. 157-159

2. 117-И9 пл.

3. 157-159 пл.

4. 159-280 т.р.

4 I. 55-82 . . д- 118-121 ,

2. 118-121 пл.

3. 160-230 т.р.

5 I. 119-121 пл. . 119-121

2. 180-230 т.р.

6 I. 118-121 пл. 118-121)

2. 180-230 т.р.

7 I. 70-80' д. 118-121

2. 118-121 пл.

3. 180-230 т.р.

8 I. 30-50 д. 119-121

2. 119-121 пл.

3. 180-230 т.р.

пр ЧСФР I. 25-30 д. - 119-121

2. 119-121 пл. _

3. 180-230

д, - дегидратация

пл. - плавление

т.р. - термическое разложение

Модельные смеси готовили добавлением к стандартному образцу АЗТ точно установленных количеств стандартов примесей: тимина фирмы "¿лука" и тимидина -"Мери". Анализ полученных результатов показал, что содержание в модельных образцах примесей приводит к заметному понижению температуры плавления. Так,в образцах с содержание«примесей 3 %,наблюдает с я понижение температуры плавления на 1-2 °С, с увеличениенкон-, центрации примесей до б %, наблюдается снижение на 4-5 °С.

Таким образом, наличие примесей не может быть причиной наблюдаемо« го полиморфизма. Полученные экспериментальные данные в определенной степени подтверждаются результатами ИК-спектрофотометрии, рентгеновской дифрактографии и поляриметрии.

Вместе с тем следует отметить, что большое содержание примеси, б % и более, может быть причиной изменения температуры плавления, исходя из чего представляется целесообразным использовать метод термического анализа для определения подлинности и контроля качества лекарственного вещества АЗТ.

4. Разработка стандартного образца АЗТ

При разработке методов контроля качества стандартного образца АЗТ мы основывались на химической структуре и физико-химических свойствах АЗТ и его примесей.

Учитывая высокие требования, предъявляемые в качеству стандартного образца, его контролирование по показателю "примеси" имеет особое значение. Для оценки чистоты стандарта наш предлагается использование методов ТСХ и ВЭЖХ. Условия проведения анализа те же, что и для лекарственного вещества АЗТ.

Анализ, полученных экспериментальных данных показал, что очистка стандартного образца позволяет снизить содержание "УФ-поглощающих"при-месей,по сравнению с исходными партиями лекарственного вещества .приблизительно в два раза.

Наряду с контролем содержания "УФ-поглощаюцих" примесей,нами осуществлялось определение примесей остаточных органических растворителей, применяемых в производстве стандарта. Ими являются этанол и хлороформ. Для этих целей нами предлагается использование метода ГКХ. Определение проводили при тех же условиях, что и в лекарственном веществ. . Хрома-то грамма разделения модельной смеси представлена на рисунке 9. Расчет количественного содержания проводили методом внешнего стандарта. Методика разрабатывалась на модельных смесях и затем была апробирована на опытных образцах стандарта. Проведенные исследования опытных партий стандарта.показали наличие незначительного количества примеси остаточных растворителей в пределах 0,05 %.

Нами,с использованием метода ОСФМ,определены цветовые характеристики стандартных образцов различных партий, а также партий лекарственного вещества из которого они были получены.

Результаты исследований показали, что очистка почти не изменяет цветовые характеристики АЗТ. Так степень белизны для стандартных образцов и лекарственного вещества из которого они были получены, находится в интервале 78,17-87,18 и 76,14-87,70, соответственно.

Хроматографа, разделения модельной смеси в диоксане

О

10

12 мин

I - этанол, 2 - хлороформ, 3 - дноксан Рис.9

Проведенные исследования позволят заключить, что все партии стандарта имеют отчетливый желтый оттенок цвета. Полученные экспериментальные данные использованы при составлении пояснительной записки на стандартный образец АЗТ.

Для определения подлинности и оценки качества стандарта нами также предлагается использование УФ- и Ш-спектрофотометрии, ЯМР^Н-спек-троскопии, поляриметрии и термического анализа.

Проведенные исследования о использованием УФ-,ИН-спектрофотометрии и ЯМР^Н-спектроскопии показали, что анализируемые партии практически идентичны. В процессе работы не выявлено каких-либо существенных различий в строении наученных образцов различных партий.

Экспериментальные данные, полученные при использовании- метода поляриметрии свидетельствуют, что для всех изученных опытных партий стандарта значения удельного вращения составляет (+61°)+1 Проведенная очистка позволяет повысить указанные значения,по сравнению с исходными партиями лекарственного вещества,в среднем на 3°.

Изучение термических характеристик стандарта АЗТ и опытных партий лекарственного вещества, из которого они получены, показало, что для стандарта АЗТ характерно наличие двух термических эффектов при

с

119-121 °С и 180-230 °С, характеризующих собой процесс плавления и термического разложения соответственно!

Для установления подлинности стандарта АЗТ наг.ш предлагается измерение температуры плавления (ГФ-Х1). . • •

Для оценки чистоты и контроля качества стандарта нами также предлагается проводить измерение молярной экстинции (ГФ-Х1), значение которой находится в интервале Е=»9900±300).

ВЫВОДЫ

1. Проведены исследования на основе которых разработаны ТСХ-ме-тодики оценки чистоты АЗТ. В лекарственном веществе обнаружены и полуколичественно оценены Ь примесей, представляющие собой, как полупродукты и побочные продукты синтеза, так и продукты разложения препарата.

2. Подобраны хроматографические условия, позволяющие в обращенно-фазном варианте ВЭЖХ разделить АЗТ и сопутствующие ему "УФ-логлощаю-щие" примеси. Эти условия были положены в основу методик контроля качества лекарственного вещества и стандартного образца АЗГ по показателям: "Определение количественного содержания действующего вещества (лекарственное вещество) и "УФ-поглощающие примеси" (лекарственное вещество и стандарт). Относительная ошибка при определении количественного содержания действующего вещества не превышает +2 %.

3. Разработана унифицированная ГЖХ-методика определения остаточных органических растворителей в лекарственном веществ и стандарте АЗТ. Установлено, что суммарное содержанке остаточных растворителей в лекарственном веществе и стандарте не превышает 0,15 % и 0,05 /^соответственно.

4. Изучены спектральные характеристики АЗТ с использованием методов ОСФМ, УФ- и ИК-спектрофотометрии, ЯМР*Н-спектроскопии, рентгеновской дифрактографии и поляриметрии. С помощью метода ОСФМ установлено, что лекарственное вещество й стандарт АЗТ имеют желтый оттенок, наличие которого объясняется содержанием примесей.' Полученные экспериментальные данные использованы при составлении соответствующих проектов КС.

Изучены Уф-спектры АЗТ. Установлено, что УФ-спектрофотометрия может быть использована лишь для определения группировки Ь-метилураци-ла. Показано, что для обнаружения группы, определяющей фармакологическое действие препарата, необходимо использование более специфичного метода.

Установлено, что АЗТ имеет характерную полосу поглощения ИК-слек-тра при 2130-2080 см'^/азидо группа. Предложено,для подтверждения

азидной группы в препарате .использовать его ИК-спвктр в дисках с КВг.

С помощью метода ЯЫРАН установлены характерные для АЗТ сигналы дар-спектра. Показана возможность применения метода для определения подлинности АЗТ,

Для определения подлинности АЗТ рекомендован комплекс методов, включающий в себя 0С8М, УФ- и ИК- спектрофотометркю, ЯЫР*Н - спектроскопию, рентгеновскую дифрактографию и поляриметрию.

Ь. С использованием метода Дериватографки изучены термические характеристики АЗТ. Установлено, что в процессе синтеза препарата возможно образование двух полиморфных форм с различными температурами плавления. Показано влияние примесей на термические характеристики, при этом увеличение содержания примесей до б % снижает температуру плавления АЗТ на 4-6°С. Предложено использовать метод термического анализа для определения подлинности АЗТ.

6. Разработан метод получения стандартного образца АЗТ путем очистки лекарственного вещества на силикагелв, с последующей перекристаллизацией из деионизированной воды. Исследованы физико-химические свойства стандартного образца АЗТ. Показано, что очистка позволяет снизить содержание примесей приблизительно в два раза. Предложен комплекс методов контроля качества стандартного образца АЗТ.

7. Методики контроля качества и стандартизации АЗТ включены в пректы ВФС на лекарственное вещество и стандартный образец АЗТ и направлены в Фармакологический Комитет ИЗ СССР.

Основное содержание работы изложено в следующих публикациях:

1. Нестеров В.В. Применение высокоэффективной жидкостной хроматографии для контроля чистоты азидотимидина.//В кн. :Тез.докл.Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых, посвященной 70-летию декрета о национализации аптек. - Куйбышев, - 1988.-с. 128-129.

2. Нестеров В.В. Совершенствование методов контроля азидоти-•мидина в процессе его производства.//Рукопись депонирована в ВНИИМИ МЗ СССР/-М.:1989.-Д.-162Ь6.-Реферат в МРК-1989,-Ж.Раздел XXII.

3. Нестеров В.В. Оценка качества азидотимидина методом высокоэффективной жидкостной хроматографии.//В кн. :Тез.докл. Всесоюзной научно-практической конференции молодых ученых "Молодежь практическому здравоохранению".-Москва.-1990. -С.ЬЬ.

4. Евтушенко H.С., Нестеров В.В. Применение физико-химических методов для анализа подлинности лекарственного вещества азидотшдк-дина.//В кн.:Тез.докл.научно-практической конференции "Резервы совершенствования лекарственного обеспечения населения РСФСР" и пленума Всероссийского научного общества фармацевтов. Секция III.-Вла^ димир.-1991. -С.26.

5. Нестеров В.В., Титова А.И., Евтушенко Н.С., Решетняк B.D.// Изучение возможности использования УФ-спектро фотометрии в контроле качество азидотииццина.//Фармация.-1991.-Р 3. - С. 30 - 32.