Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Анализ диагностических радиофармацевтических препаратов с технецием-99М

На правах рукописи

ЭПШТЕЙН Наталья Борисовна

АНАЛИЗ ДИАГНОСТИЧЕСКИХ РАДИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКИХ ПРЕПАРАТОВ С ТЕХНЕЦИЕМ-99М

15 00 02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора фармацевтических наук

0/

ООЗ172881

Москва-2008

003172881

Работа выполнена в Государственном учреждении - Медицинский радиологический научный центр Российской академии медицинских наук и

в ГОУ ВПО - Московская медицинская академия имени И М Сеченова Росздрава

Научный консультант:

доктор химических наук, профессор Харитонов Юрий Яковлевич

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук,

профессор Берлянд Александр Семенович

доктор фармацевтических наук Белобородое Владимир Леонидович

доктор фармацевтических наук,

профессор Пятин Борис Михайлович

Ведущая организация:

Институт стандартизации и контроля лекарственных средств ФГУ НЦ ЭСМП

Защита состоится «/-5" » 09 2008 г в iЧ часов на заседании Диссертационного совета Д 208 040 09 при Московской медицинской академии имени И М Сеченова по адресу 119019, Москва, Никитский бульвар, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА имени И М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д 49)

Автореферат разослан « 3 » 2008 г

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д 208 040 09, доктор фармацевтических наук, профессор

Наталья Петровна Садчнкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Проблема своевременного и точного диагноза остается одной из основных проблем клинической медицины XXI века. В комплексе клинико-инструментальных средств диагностики различных органов и тканей одно из ведущих мест принадлежит радионуклидным (радиоизотопным) методам исследования

Благодаря разнообразию радионуклидов и большому количеству «транспортных средств», доставляющих изотоп к органу-мишени, сегодня можно изучать любую систему организма

Диагностика с использованием радиофармацевтического препарата (РФП) позволяет обнаружить нарушения деятельности органов намного раньше анатомических изменений, выявляемых другими диагностическими тестами (рентген, компьютерная и ЯМР-томография, ультразвуковое исследование) Такая ранняя диагностика позволяет осуществить раннее лечение, когда оно наиболее эффективно и возможен благоприятный прогноз, что особенно важно при онкологических, кардиологических и неврологических заболеваниях

К важным преимуществам радионуклидного метода по сравнению с рентгеновским относятся его безопасность, низкие лучевые нагрузки на органы и организм исследуемого, более высокая разрешающая способность, возможность его использования у пациентов с индивидуальной непереносимостью рентгеноконтрастных препаратов

Простота, скорость, безболезненность, надежность диагностики с помощью радиофармпрепаратов заслужили всеобщее признание

Однако до настоящего времени российские клиники не имеют современных отечественных препаратов для радионуклидной диагностики заболеваний легких, костной системы, исследования гемодинамики. Так, например, применяемые в настоящее время РФП для диагностики легких «Макроагрегаты альбумина, 1311», «Макроагрегаты альбумина, "иТс» (Россия) имеют ряд существенных недостатков

• это препараты с нестабильными количеством частиц и их размерами, в то время как одним из основных требований, предъявляемых к диагностическому средству, предназначенному для сцинтиграфии легких, является стабильность размера и количества частиц;

• макроагрегаты с mI создают высокую лучевую нагрузку на пациента за счет использования «жесткого» у-излучателя иода-131 (Е =364 кэВ, Т1П=8,05 дня)

Лишенный этих недостатков препарат «ТСК-5» (CIS, Франция) практически недоступен для радиологических клиник России из-за высокой стоимости

Аналогичная ситуация сложилась с РФП для диагностики костей и исследования гемодинамики Так, в настоящее время российские клиники используют два отечественных препарата с технецием-99м для исследования костной системы - это «Пирфотех» и «Технефор» («Диамед») Однако накопление этих препаратов в костях - невысокое (около 30-40%) За рубежом имеются РФП, позволяющие осуществлять качественную диагностику костной патологии «TCK-I4», «ТСК-21» (CIS, Франция), «Techebon» (Hoechst, Германия), MDP (Amersham, Великобритания), Phosphon (Венгрия), «Osteoscan» (Proctor & Gamble, США) и другие Однако они также являются малодоступными

Для исследования гемодинамики в России используют препарат «Альбумин, ш1» (ФГУП «НИФХИ им JI Я Карпова», Россия). Однако довольно большой период полураспада, «жесткое» у-излучение Ш1 и медленное выведение радионуклида из крови затрудняют его применение при повторных диагностичег"""

процедурах, а также обуславливают повышенные лучевые нагрузки на организм Этих трудностей удастся избежать, если в качестве метки для приготовления РФП использовать короткоживущие изотопы, например, "мТс Такие препараты за рубежом производят, один из самых известных - эта «ТСК-2» (CIS, Франция), но и он малодоступен для российских клиник.

В Медицинском радиологическом научном центре РАМН (ГУ - МРНЦ РАМН) разработаны отечественные радиофармпрепараты и реагенты для их приготовления «Микросферы альбумина, 99мТс», «ОЭДФ, "мТс» (ОЭДФ оксиэтилидендифосфоновая кислота) и «Альбумин, "мТс» для диагностики заболеваний легких, костной системы и изучения гемодинамики, соответственно.

Современное производство препаратов медицинского назначения в значительной мере определяется состоянием аналитического контроля на всех его стадиях Выход и качество конечных продуктов зависят не только от строгого соблюдения технологического регламента, от качества сырья, но и от применения надежных аналитических методик постадийного контроля и оценки качества сырья и готовой продукции Аналитический контроль должен проводиться в полном соответствии с нормативной документацией

На новые диагностические препараты «Микросферы альбумина, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и «Альбумин, 99"Тс» такая нормативная документация отсутствовала Отсутствовали также и основные принципы и критерии фармакопейной оценки качества реагентов и получаемых из них радиофармпрепаратов Это связано с тем, что за рубежом РФП получают на радиофармацевтическом предприятии, минуя стадию нерадиоактивного реагента («kit»), и затем доставляют в радиологические клиники («ready-for-use radiopharmaceuticals»), а в России РФП готовят непосредственно в клинике из нерадиоактивного реагента и пертехнетата натрия,"мТс из генератора («kits or in-house radiopharmaceuticals») Поэтому анализ реагентов для приготовления РФП с 99мТс не описан в зарубежных фармакопеях

Цель и задачи работы. Исследование посвящено теоретическому и экпериментальному обоснованию разработки основных принципов и критериев анализа радиофармпрепаратов с технецием-99м на примере новых отечественных препаратов «Микросферы альбумина, 99мТс», «Альбумин, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и реагентов для их получения, которые позволили бы проводить контроль их качества и создать нормативную документацию

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи

- обосновать и сформулировать основные принципы и критерии оценки качества нерадиоактивных реагентов и получаемых из них радифармпрепаратов;

- разработать схемы химико-фармацевтического и радиохимического анализа 1) микросфер альбумина (МСА), микросфер альбумина, модифицированных оловом(И) (MCA(Sn)); реагента (смесь MCA(Sn), твина-80 и NaCl), радиофармпрепарата «Микросферы альбумина, "мТс», 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин, 99мТс», 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ, Тс»,

- изучить физико-химические и радиохимические свойства 1) MCA; MCA(Sn), реагента, радиофармпрепарата «Микросферы, МмТс», 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин, 99мТс», 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ, 99мТс»,

- разработать методики качественного и количественного анализа для- 1) МСА; MCA(Sn), реагента, радиофармпрепарата «Микросферы, 99мТс», 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин, мТс», 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата

«ОЭДФ,"мТс»,

- разработать унифицированные методики анализа реагентов и радиофармпрепаратов с технецием-99м,

- исследовать стабильность свойств субстанций, реагентов и радиофармпрепаратов в процессе хранения,

установить корреляцию результатов химико-фармацевтического и радиохимического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов,

- разработать Стандарты предприятия ГУ-МРНЦ РАМН «Микросферы альбумина», «ОЭДФ, субстанция»,

- разработать ФСП на препараты «Микросферы альбумина, 99мТс», «Альбумин,"мТс», «ОЭДФ,99мТс» и реагенты для их получения

Научная новизна. Разработаны способы и методики полного фармацевтического анализа и оценки качества новых отечественных препаратов для радионуклидной диагностики «Микросферы альбумина, "мТс», «Альбумин, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и реагентов для их получения.

Разработаны экспрессные тест-методы анализа с использованием индикаторных трубок для определения 8п(Н) в реагентах для приготовления РФП

Разработаны унифицированные методики анализа субстанций, реагентов и РФП с технецием-99м

Разработаны методики количественного определения компонентов в постадийном контроле синтеза МСЛ(8п)

Установлена корреляция результатов химико-фармацевтического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов

В результате проведенных исследований обоснованы принципы и критерии оценки качества нерадиоактивных реагентов и получаемых из них диагностических радиофармацевтических препаратов, что составляет основу методологии создания новых диагностических радиофармпрепаратов и их аналитического сопровождения

Практическая значимость работы Разработаны ФСП на препараты «Микросферы альбумина, 99мТс» (ФСП 42-01670477-00), «Альбумин, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и реагенты для их получения Разработаны Стандарты предприятия (ГУ-МРНЦ РАМН) «Микросферы альбумина» (СТП 19-01, от 08 0501 г), «ОЭДФ, субстанция» (СТП-32-05 от 14 04 05 г)

Материалы работы вошли в документацию, на основании которой издан Приказ МЗ РФ № 128 от 30 04 97 г. о разрешении клинического применения препарата «Микросферы альбумина, МмТс» (регистрационное удостоверение 97/128/7).

Результаты работы по определению олова(И) методом индикаторных трубок вошли в документацию при получении свидетельства о государственной метрологической аттестации УНИИМ Госстандарта РФ ТС-224 09/009-2004 на индикаторные трубки для фирмы ООО «МедЭкоТест» (Москва)

Методики оценки качества препаратов «Микросферы альбумина, 99мТс», «Альбумин, "мТс», «ОЭДФ, 99мТс», реагентов для их приготовления, МСА, МСА(8п), ОЭДФ внедрены в лабораторию технологии и методов контроля радиофармпрепарагов ФГУП ГНЦ РФ-Институт биофизики и в лабораторию экспериментальной ядерной медицины ГУ- МРНЦ РАМН

Апробация работы. Результаты работы представлены на II, VIII, IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1995, 2001, 2002), Российской национальной конференции «Формирование приоритетов лекарственной

политики» (Москва, 1995), Всеросийской конференции «Опухоли висцеральных локализаций ранняя диагностика, профилактика, лечение» (Томск, 1995), Международном конгрессе «Euroanalysis X» (Базель, Швейцария, 1998), Международных конференциях «Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики» (Обнинск, 2000, 2002), I Евразийском конгрессе «Медицинская физика 2001» (Москва, 2001), III Российско-японском семинаре по технецию (Дубна,

2002), III Международном конгрессе «Энергетика-3000» (Обнинск, 2002), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), X Международной конференции «Separations of ionic solutes» (Братислава, Словакия,

2003), Международных конференциях «Ломоносов 2004», «Ломоносов 2006» (Москва, 2004, 2006), Всероссийских конференциях «Аналитика России» (Москва, 2004, Краснодар, 2007), II Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2005), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), Международном конгрессе по аналитической химии «ICAS-2006» (Москва, 2006), XXXI годичной сессии научного совета РАН по аналитической химии (Звенигород, 2006), Международной научной сессии «Ядерная медицина и радиофармацевтика» (Обнинск, 2006)

Публикации. Основные результаты диссертации изложены в 41 печатной работе

Связь исследования с плановыми исследованиями ГУ-МРНЦ РАМН. Работа выполнена в рамках проблемно-тематических планов научных исследований ГУ-МРНЦ РАМН «Разработка и биологические испытания радиофармпрепаратов на основе альбумина, комплексонов и боросодержащих соединений для диагностики и терапии» (номер гос регистрации 01 20 0003061), «Разработка радиофармпрепаратов для диагностики и терапии» (номер гос регистрации 01.9.40002470), «Разработка и биологические испытания наборов реагентов к генераторам "мТс и 188Re на основе ксидифона и микросфер альбумина для радионуклидной диагностики и терапии» (номер гос. регистрации 01 20.0407146).

Основные положения, выносимые на защиту:

- схемы полного фармацевтического анализа новых отечественных препаратов для радионуклидной диагностики и реагентов для их получения- «Микросферы, 99мТс», «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,"мТс» ;

- результаты комплексного физико-химического исследования химических и радиохимических свойств реагентов и препаратов;

- схемы анализа и контроля качества MCA, MCA(Sn) и ОЭДФ, являющихся промежуточными и основными компонентами реагентов для приготовления РФП «Микросферы альбумина, 99мТс» и «ОЭДФ,99мТс», соответственно,

- унифицированные методики определения олова(И), общего олова, альбумина, ОЭДФ в субстанциях и в реагентах для приготовления РФП;

- результаты изучения стабильности свойств субстанций, реагентов и радиофармпрепаратов в процессе хранения,

- корреляцию результатов химико-фармацевтического и радиохимического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов,

- Стандарты предприятия ГУ-МРНЦ РАМН «Микросферы альбумина», «ОЭДФ, субстанция» ФСП на радиофармпрепарат «Микросферы альбумина, 99мТс», проекты ФСП на радиофармпрепараты «Альбумин,"мТс», «ОЭДФ,99мТс» и реагенты для их получения

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 258 страницах компьютерного текста, состоит из списка сокращений, введения, обзора литературы, четырех глав, отражающих результаты собственных исследований, общих выводов, списка литературы, включающего 261 источник, и приложения, в котором представлены документы, подтверждающие практическую значимость полученных результатов Работа содержит 60 таблиц и 25 рисунков

Во введении сформулирована актуальность темы, определены цели и задачи исследования, научная новизна и практическая значимость работы

В первой главе на основе анализа литературных данных обобщены сведения о радиофармпрепаратах, использующихся в настоящее время в медицинской практике для диагностики легких, исследования гемодинамики и изучения костной системы Рассмотрены методы синтеза и анализа радиофармпрепарагов с технецием-99м. Рассмотрена взаимосвязь аналитических показателей качества и клинических требований для РФП

Вторая глава посвящена разработке методов анализа микросфер альбумина, микросфер альбумина, модифицированных оловом(Н), реагента и РФП на основе микросфер альбумина.

Третья глава посвящена разработке методов анализа реагента и РФП на основе альбумина

В четвертой главе приведены результаты исследований по разработке методов анализа субстанции ОЭДФ, реагента и РФП на основе ОЭДФ В пятой главе изложено краткое обсуждение итогов работы

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ 1. Исходные вещества и методы исследования

Объектами исследования являлись- 1) микросферы альбумина (МСА) сыворотки крови человека, микросферы альбумина, модифицированные оловом(П) (MCA(Sn)), реагент на основе MCA(Sn), радиофармпрепарат «Микросферы альбумина, 99мТс», 2) реагент на основе альбумина сыворотки крови человека, радиофармпрепарат «Альбумин,99мТс», 3) субстанция ОЭДФ, реагент на основе ОЭДФ, радиофармпрепарат «ОЭДФ,99мТс»

MCA, MCA(Sn), реагент на основе MCA(Sn), реагент на основе альбумина, реагент на основе ОЭДФ были получены в лаборатории экспериментальной ядерной медицины ГУ-МРНЦ РАМН (г Обнинск) РФП «Микросферы альбумина, "мТс», «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,"мТс» получали из соответствующих реагентов добавлением к ним элюата "мТс из генератора "Мо/"мТс производства ФГУП ГНЦ РФ. Физико-энергетический институт, г Обнинск, Россия.

В качестве препаратов сравнения использовали «Альбумин,1311» (ФГУП «НИФХИ им ЛЯ Карпова», Россия), ТСК-2, ТСК-5 («Cis Bio», Франция), «Технефор, 99мТс» («Диамед», Россия), разрешенные к клиническому применению

В работе использованы реактивы, которые описаны в ГФ XI, вып 2, квалификации хч и оси (для стандартизации исходных растворов олова(П), для разбавления элюатов 99мТс с объемной активностью 200-1600 Мбк (5-40 мКи/мл) до активности ~ 40 Мбк (~ 1 мКи/мл) 0,9% раствором хлорида натрия)

Для приготовления растворов использовали дистиллированную воду, полученную в системе Milli-IIQ (Япония)

Исходные растворы олова(П) с концентрацией 0,8 Ю"2 - 4,2 10'2 М (1-5 мг/мл) готовили растворением навески безводного хлорида олова(П) с содержанием олова(П)

не менее 95% в 0,1 М растворе соляной кислоты в атмосфере аргона Содержание олова(Н) в исходных растворах определяли титрованием йодатом калия, а в разбавленных растворах - спектрофотометрически с перренатом калия Растворы олова(П) меньших концентраций готовили разбавлением исходных и использовали свежеприготовленными.

Биуретовый реактив готовили по методике, описанной в ГФ XI [вып. 2, С 34] Для фильтрования суспензии при определении РХП использовали мембранные фильтры «Millipore» с размером пор не более 1 мкм, а также бумажные фильтры «синяя лента» фирмы «Filtrak» (Германия)

Использовали хроматографическую бумагу FN 17 фирмы «Filtrak» (Германия), Whatman 1, Whatman 31ЕТ (Англия), хроматографические пластинки фирмы «Мегск» (Германия) и «Sorbfil» (Россия)

Для определения олова(П) были использованы индикаторные трубки производства ООО «МедЭкоТест» (Россия) (свидетельство о государственной метрологической аттестации УНИИМ Госстандарта РФ ТС-224 09/009-2004)

Определение диаметров и количества частиц проводили с помощью оптического микроскопа МБИ-6, снабженного окулярным микрометром МОВ-1 Для определения количества частиц в реагенте использовали камеру Горяева для счета форменных элементов крови, модель 851 (ТУ 64-1-816-88)

Взвешивание осуществляли на аналитических весах фирмы «Sartorius» (Германия), модель А 200 S, с точностью ±0,1 мг.

Регистрацию УВИ спектров поглощения и измерение оптической плотности растворов проводили на спектрофотометрах СФ-26 (Россия) и «Philips Scientific UV-VIS» модель PU 8745 (Англия)

РЖ-спектры регистрировали на приборе «Philips», модель PU 9512 (Англия) Спектры ПМР регистрировали на приборе «Bruker АМ-300» на частоте 300 МГц, спектры ЯМР 31Р - на «Bruker АС-200» на частоте 81 МГц

Спектральный анализ проводили с использованием спектрографа ИСП-30 Для определения остаточных органических растворителей в субстанции ОЭДФ использовали газовый хроматограф фирмы «Perkin Elmer».

Значения рН растворов измеряли на ионометре «Эксперт-001» (Россия) со стеклянным комбинированным электродом «ЭСК-10601/7» ГОСТ 22261 и ТУ 4215004-35918409-97 Потенциал асимметрии устанавливали по оксалатному (рН 1,68) и боратному (рН 9,18) буферным растворам Потенциометрическое титрование проводили с помощью автоматической установки RTC822 фирмы «Radiometer» (Дания)

Температуру плавления определяли на «Приборе для определения температуры плавления с диапазоном измерений в пределах от 20 до 360°С» (ПТП) (Россия)

Измерение радиоактивности проводили на сцинтилляционном счетчике фирмы «Messelectronic Dresden GMBH» (Германия)

Функциональную пригодность РФП «Микросферы альбумина, 99мТс» изучали на 620 здоровых беспородных крысах-самцах, массой 180-200 грамм, 13 кроликах породы Шиншилла массой 2,5-3,0 кг На крысах изучали распределение РФП по органам и тканям в различные сроки (от 3 мин до 24 ч) после внутривенной инъекции в объеме 0,2 мл (10-15 Мбк) препарата. За 100%-ный эталон принимали тушку животного, а накопление радиоактивности в органах и тканях считали по отношению к тушке Биопробы органов и тканей радиометрировали в колодезном счетчике с

пересчетным устройством NK-350 (Венгрия) Результаты подвергали статистической обработке

Статические сцинтиграммы легких кроликов регистрировали на гамма-камере DSX фирмы «Sopha Medical» (Франция) в двух прямых проекциях (передней и задней) через 2-5 мин после введения 25-30 МБк РФП в краевую вену уха под внутривенным нембуталовым наркозом (40 мг/кг)

2. Разработка методов анализа микросфер альбумина; микросфер альбумина, модифицированных оловом(И); реагента и РФП на основе микросфер альбумина

Разработана схема химико-фармацевтического анализа МСА, выбраны параметры МСА, позволяющие наиболее полно осуществлять их характеристику описание, размер частиц (диаметр), растворимость, подлинность, количественное определение, потеря массы при высушивании, прозрачность и цветность раствора МСА, рН 1%-ной водной вытяжки, набухание, удельный объем (насыпная плотность) Разработаны методики определения указанных параметров

МСА представляют собой сыпучий порошок светло-желтого цвета. Отбор проб МСА для проведения анализа осуществляли методом квартования

Микроскопическое исследование МСА показало, что они имеют сферическую форму При исследовании образцов МСА установлено, что в каждом из них не менее 95% частиц имеют диаметр от 10 до 30 мкм Средний диаметр микросфер составляет 18,1 ± 1,2 мкм (п=20, Р=0,95)

МСА практически нерастворимы в воде, 95%-ном этаноле, хлороформе и эфире, умеренно растворимы в 2 М растворе NaOH при нагревании на кипящей водяной бане Получаемый при этом раствор прозрачен, имеет желтую окраску, находящуюся между окраской 3 и 4 эталонов шкалы «б» эталонов желтых оттенков

Показана возможность применения для МСА известных спектрофотометрических методик, используемых для определения белка в нативном альбумине Одна из них основана на светопоглощении водных растворов белка в области 260-300 нм с максимумом при 278 нм Другая методика основана на образовании в щелочной среде фиолетового комплекса Cu(II) с пептидными связями молекулы белка с максимумом поглощения при 540 нм

Изучены УФ спектры поглощения щелочных растворов (в 2 М растворе NaOH) более 60 серий альбумина сыворотки крови человека и МСА Спектры поглощения растворов альбумина и МСА в 2 М растворе NaOH практически совпадают и имеют максимум при 29tt нм Эти наблюдения хорошо согласуются с литературными данными, описывающими батохромный сдвиг на 12 нм (от 278 до 290 нм) максимума поглощения белка в сильно щелочной среде Такое явление объясняется ионизацией фенольных групп тирозиновых остатков белка, известно, что в случае триптофана такой сдвиг не имеет места, а вкладом фенилаланина в поглощение белков в области 270-300 нм можно пренебречь Линейная зависимость оптической плотности растворов альбумина и МСА в 2 М NaOH от их концентрации при 290 нм наблюдается в диапазоне 0,1-1,0 мг/мл Вычислены удельные показатели экстинкции для 1% щелочных растворов альбумина и МСА при 290 нм, равные 10,2 ± 0,4 (п=5, Р=0,95) и 10Д ± 0,4 (п=5, Р=0,95), соответственно. Относительная погрешность определения не превышает ± 5,0%

Изучены спектры поглощения щелочных растворов альбумина и МСА с биуретовым реактивом В спектрах наблюдается широкая полоса поглощения с

максимумом при 540 нм Спектры биуретовых комплексов альбумина и МСА практически совпадают между собой и со спектрами, описанными в литературе Соблюдение закона Бугера-Ламберта-Беера наблюдается как для биуретовых комплексов альбумина, так и для растворов МСА при содержании от 0,25 до 2,5 мг основного вещества в 1 мл измеряемого раствора при 540 нм Вычислены удельные показатели экстинкции 1% щелочных растворов альбумина и МСА с биуретовым реактивом. 2,75 ± 0,10 (п=5, Р=0,95) и 2,81 ± 0,13 (п=5, Р=0,95), соответственно Они практически совпадают друг с другом и с известным из литературы для комплекса нативного белка с биуретовым реактивом Относительная погрешность определения не превышает ± 7,2%

Потерю массы при высушивании определяли при нагревании образцов микросфер до 100-105 °С, она не превышает 3,0%

Удельный объем МСА изменялся в пределах от 1,1 до 1,4 см3/г Набухание МСА происходит практически мгновенно Размер их увеличивается в среднем на 15%, но при этом не менее 95% набухших МСА имеют диаметры от 10 до 35 мкм Средний диаметр набухших МСА составляет 20,9 ± 1,4 мкм (п=20, Р=0,95) рН фильтратов 1%-ной водной вытяжки изменяется от 4,8 до 5,2 Исследована стабильность МСА МСА могут храниться в течение 12 месяцев при температуре +2 - 8 °С в условиях холодильника без изменения их свойств Характеристики и нормы показателей качества МСА приведены в табл 1

Таблица 1

Характеристики и нормы показателей качества МСА

Наименование показателей Характеристика показателей и норм

Описание Сыпучий порошок светло-желтого цвета, без запаха

Растворимость Практически нерастворим в воде, 95% этиловом спирте, хлороформе, эфире (1 10 000)

Реакции подлинности Е1%1СМ при ^4= 290 нм от 9,7 до 10,5, Е1%1см при Хтах - 540 нм от 2,7 до 2,9

Прозрачность и цветность 1% раствора МСА в 2 Н NaOH Прозрачный раствор, цветность между 3 и 4 эталонами шкалы «б» эталонов желтых оттенков

рН 1% водной вытяжки 4,8 - 5,2

Диаметр 95% МСА, мкм 10-30

Средний диаметр МСА, мкм 18,1 + 1,2

Потеря массы при высушивании, % Не более 3,0

Диаметр 95% МСА набухших в 0,9% NaCl, мкм 10-35

Средний диаметр набухших МСА в 0,9% NaCl, мкм 20,9 ±1,4

Удельный объем, см3/г 1,1-1,4

Срок годности 12 месяцев

При разработке методик анализа MCA(Sn) целесообразно осуществлять их контроль по схеме, разработанной для МСА, включающей параметры, выбранные ранее для МСА Определение показателей проводили по методикам, аналогичным описанным для МСА В связи с тем, что MCA(Sn) содержат олово, возникла

необходимость в разработке методики его определения в модифицированных микросферах.

Микросферы альбумина, модифицированные Sn(II), представляют собой сыпучий порошок светло-желтого цвета.

Исследование под микроскопом показало, что MCA(Sn) представляют собой частицы сферической формы При исследовании образцов MCA(Sn) установлено, что в каждом из них не менее 95% частиц имеют диаметры от 10 до 30 мкм Средний диаметр модифицированных микросфер составляет 19,2 ± 1,3 мкм (п=15, Р=0,95)

MCA(Sn) практически нерастворимы в воде, 95%-ном этаноле, хлороформе и диэтиловом эфире, умеренно растворимы в 2 М растворе гидроксида натрия при нагревании на кипящей водяной бане. Получаемый при этом раствор прозрачен, имеет желтую окраску, находящуюся между окраской 3 и 4 эталонов шкалы «б» эталонов желтых оттенков

Показана возможность применения спектрофотометрических методик для определения белка в MCA(Sn) и выбраны экспериментальные условия для их проведения.

Изучены УФ спектры поглощения растворов более 30 образцов MCA(Sn) в 2 М NaOH в сравнении со спектрами щелочных растворов альбумина и МСА Спектры поглощения растворов альбумина, МСА и MCA(Sn) в 2 М NaOH практически совпадают между собой и имеют максимум при 290 нм Линейная зависимоть оптической плотности растворов альбумина, МСА и MCA(Sn) в 2 М NaOH от их концентрации при 290 нм наблюдается в диапазоне 0,1-1,0 мг/мл Определены удельные показатели экстинкции для 1% щелочных растворов альбумина, МСА и MCA(Sn) при 290 нм, которые составляют 10,2 ± 0,4 (п=5, Р=0,95), 10,1±0,4 (п=5, Р=0,95) и 10,3 ± 0,5 (п=5, Р=0,95), соответственно Относительная погрешность определения не превышает ± 5,0%

Изучены спектры поглощения щелочных растворов альбумина, МСА и MCA(Sn) с биуретовым реактивом Во всех спектрах обнаружены широкие полосы поглощения с максимумом при 540 нм Спектры биуретовых комплексов альбумина, МСА и MCA(Sn) практически совпадают между собой и с литературными спектрами для биуретового комплекса нативного альбумина Соблюдение закона Бугера-Ламберта-Беера для комплексов альбумина, МСА и MCA(Sn) наблюдается в интервале концентраций от 0,25 до 2,5 мг/мл основного вещества при 540 нм Вычислены удельные показатели экстинкции 1% щелочных растворов с биуретовым реактивом-2,75 ± 0,10 (п=5, Р=0,95), 2,81 ± 0,13 (п=5, Р=0,95) и 2,79 ± 0,12 _(п=5, Р=0,95) для альбумина, МСА и MCA(Sn), соответственно Они практически совпадают между собой и с литературными данными для биуретового комплекса нативного альбумина Относительная погрешность определения не превышала ± 7,2%

Потерю массы при высушивании определяли при нагревании образцов MCA(Sn) до 100-105 °С Этот показатель не превышает 4,0%

Набухание MCA(Sn), как и в случае МСА, происходит практически мгновенно Диаметр MCA(Sn) увеличивается при этом в среднем на 22%, но не менее 95% частиц имеют диаметры от 10 до 35 мкм, что является одним из главных требований к препарату. Средний диаметр набухших MCA(Sn) составляет 23,4 ± 1,3 мкм (п=20, Р=0,95)

рН фильтратов 1% водной вытяжки образцов MCA(Sn) изменяются в пределах ог 2,5 до 3,0

Содержание Sn(II) в MCA(Sn) является одним из важнейших показателей качества MCA(Sn), которое, в свою очередь, определяет качество РФП 99мТс-MCA(Sn), а именно эффективность мечения и, соответственно, относительную активность РХП

Согласно технологии MCA(Sn) олово осаждается (в основном, по-видимому, на поверхность микросфер) в двухвалентном состоянии Проведенные исследования методом мессбауэровской спектроскопии показали, что оно содержится в MCA(Sn) как в виде Sn(II), так и в виде Sn(IV)

Определение Sn(II) в альбуминовых микросферах является сложной задачей, поскольку: 1) содержание Sn(II) в MCA(Sn) очень мало (около 3-7 мкг/мг микросфер),

2) для одного анализа имеется возможность использовать всего 10-20 мг микросфер,

3) имеет место совместное присутствие Sn(II) и большого количества по сравнению с ним белка, 4) Sn(II) легко окисляется кислородом воздуха и гидролизуется в присутствии влаги Кроме того используемые в анализе методы предполагают предварительное переведение анализируемой пробы в раствор, что в случае MCA(Sn) влечет за собой окисление Sn(II) до Sn(IV) Если провести предварительное отделение олова(Н) от микросфер, то возможна потеря определяемого элемента, принимая во внимание указанные выше концентрации Sn(II) в микросферах и количество пробы для анализа Поэтому необходимо было разработать способ определения Sn(II) при его совместном с микросферами присутствии

Разработанный способ включает «смывание» олова(П) с микросфер (без их отделения) 2 М раствором HCl, в котором растворена соль Fe(III) Оказавшееся в растворе Sn(II) восстанавливает Fe(III) до Fe(II), эквивалентное количество которого определяют спектрофотометрически в присутствии о-фенантролина, дающего с Fe(II) окрашенный комплекс с широкой полосой поглощения, имеющей максимум при 510 нм Линейная зависимость оптической плотности растворов комплекса Fe(II) с о-фенантролином от концентрации Sn(II) наблюдается в интервале 0,5-7,0 мкг/мл Рассчитан молярный коэффициент погашения, равный 19 800 ± 594 л/моль см (п=5, Р=0,95) Относительная погрешность определения не превышает ± 5,0% Результаты определения Sn(II) в растворах представлены в табл 2

Таблица 2

Результаты определения олова(П) по реакции с Fe(III) в присутствии о-фенантролина (п=5, Р=0,95); s-стандартное отклонение, Е-полуширина доверительного интервала, Е%-процентная погрешность

Введено Sn(II), Найдено -

мкг среднее для Sn(II), мкг s Е Е, %

10,0 10,5 0,1 0,3 3,0

15,0 15,0 0,2 0,4 2,6

20,5 20,9 0,3 0,6 3,0

24,5 24,5 0,2 0,5 2,0

28,5 28,8 0,4 1,0 3,5

37,0 36,6 0,2 0,5 1,3

Приведенные данные показывают, что методика позволяет получать правильные и хорошо воспроизводимые результаты

Круг методов, которые можно использовать для определения общего олова (8п(П)+8п(1У)) в таком специфическом объекте, как МСА(Бп), ограничен Это связано с тем, что- 1) большая часть олова в МСА(Бп) находится в виде БпЩ) (около 90%) и,

следовательно, содержание общего олова также мало (на уровне десятков микрограммов), 2) предварительное отделение олова от микросфер с целью последующего его определения, как и в случае со Sn(II), трудновыполнимо из-за малого содержания олова, 3) при определении общего олова в растворе без его отделения от микросфер неминуемо влияние белковой матрицы на результаты определения

Мы сочли необходимым действовать следующим образом- 1) устранить влияние белковой матрицы без предварительного выделения олова, 2) окислить имеющееся в MCA(Sn) Sn(II) до Sn(IV) и затем 3) найти подходящий способ определения общего олова.

Разработана методика определения общего олова в виде Sn(IV), заключающаяся в предварительном «мокром» озолении навески MCA(Sn) концентрированной серной кислотой в присутствии хлорной кислоты в качестве окислителя с последующим спектрофотометрическим определением олова с пирокатехиновым фиолетовым при рН 3-4 Максимум в спектре поглощения образовавшегося комплекса наблюдается при 555 нм, коэффициент молярного погашения составляет 65 400 ± 1140 л/моль см (п=5, Р=0,95) Закон Бугера-Ламберта-Беера выполняется в интервале от 0,2 до 1,6 мкг/мг Sn(IV) Относительная погрешность определения не превышает ± 5,0%

Для подтверждения правильности разработанных методик определения Sn(II) и общего олова в MCA(Sn) содержание олова оценивали следующими способами

1 Исходя из количества олова(П), взятого в реакцию модификации определенной навески МСА; количества общего олова, найденного в фильтрате после завершения осаждения Sn(II) на МСА (те непрореагировавшего олова с МСА), и количества общего олова, найденного в готовых МСА (табл 3)

Таблица 3

Результаты определения Sn(Il) и общего олова на различных стадиях получения MCA(Sn) (п=5, Р=0,95)

Образцы МСА(8п) 16 от 24 03 92 17 от 27 03 92 18 от 31 03 92

Исходное Зп(П) в р-ре, % 95,7 ± 2,9 103,3 ±3,1 100,2 + 2,5

В фильтрате общее олово, % 27,0 ± 1,4 13,7+0,7 18,3 ± 0,5

В МСА(8п) общее олово, % 63,7 + 3,2 87,0 + 4,4 78,0 ±3,1

Сумма общее олово, % 90,7 ± 3,2 100,7 ± 4,4 96,3 ±3,1

Данные табл 3 подтверждает правильность контроля Sn(II) и общего олова по разработанным нами методикам

2 Подтверждением правильности результатов, полученных с помощью разработанных методик определения Sn(II) по реакции восстановления им Fe(III) в присутствии о-фенантролина (метод А) и общего олова в виде Sn(IV), основанной на разрушении MCA(Sn) «мокрым» сжиганием в присутствии окислителя с последующим определением с пирокатехиновым фиолетовым (метод В), являются также данные эмиссионного спектрального анализа (метод Б), ГФ XI [вып 1,С 322332] Результаты представлены в табл 4 Спектральному анализу подвергали микросферы, оставшиеся на фильтре после определения Sn(II), и микросферы без предварительного определения Sn(II) (образецы 7 и 8)

Из табл 4 видно, что общее олово, определенное методом В в MCA(Sn), близко к сумме Sn(II)+Sn(IV), найденной с помощью методов А и Б, а также к расчетному содержанию Sn(II), вычисленному из навески МСА и SnCl2, взятых в реакцию. В табл 4 приведены также значения общего содержания олова в образцах 7 и 8,

полученные спектральным методом без предварительного определения 8п(П), что практически совпадает с полученным суммарным значением

3 Подтверждением правильности разработанных методик определения 8п(П) и общего олова в МСА(8п) являются также результаты определения соотношения содержания 8п(И) и 8п(1У) в МСА(Бп) методом мессбауэровской спектроскопии Так, в 5-м образце МСА(Бп) (табл 4) 88% олова было найдено в виде олова(П) и 12% - в виде олова(1У), в 6-м образце - 70% олова(П) и 30% олова(1У) Полученные результаты хорошо согласуются с данными физико-химического анализа (табл 4)

Таблица 4

Результаты определения 8п(П) и 8п(1У) в экспериментальных образцах МСА(8п) различными методами (п=5, Р=0,95)

N Введено Найдено олова, мкг/мг Связывание

MCA(Sn) с

Sn(II), Sn(II) Sn(IV) Общее Sn 99мТс, %

мкг/мг А Б В

1 6,0 0,5 + 0,1 3,4 ± 0,4 3,9 ± 0,5 35,5 ± 2,6

2 7,0 0,8 ± 0,1 не более 1,0 не более 1,7 33,1 ±3,4

3 12,0 3,3 ± 0,3 8,8 ± 1,3 11,9+1,0 99,0 ±0,1

4 12,0 2,5 ±0,2 8,6 ±1,3 11,3 + 1,2 99,0 ± 0,1

5 25,0 19,8 ± 0,5 4,4 ± 2,0 24,0 ±2,1 75,3 ± 0,2

6 25,0 16,8 ± 0,5 5,6 ± 0,9 22,7 ±0,9 94,8 ± 0,7

7 25,0 - 24,1 ± 1,2 - -

8 25,0 - 23,4 ± 1,2 23,4 ± 1,2 -

Разработанные методики определения содержания Sn(II) и общего олова в MCA(Sn) позволили определеить то оптимальное количество Sn(II), осаждаемое на МСА, которое обеспечивало бы максимальное связывание 99мТс с MCA(Sn) и максимальное накопление в легких В табл 5 представлены результаты анализа образцов MCA(Sn) с различным содержанием Sn(II) (от 10 до 50 мкг/мг МСА) и накопления в легких крыс радиофармпрепаратов, полученных из этих образцов.

Таблица 5

Результаты химического анализа образцов МСА(8п) и накопления в легких крыс РФП, полученных на их основе (п=3, Р=0,95)

NN MCA(Sn) Содержание олова, мкг/мг МСА Относительная активность "м Тс, не связанного с MCA(Sn), % Накопление в легких 99м Tc-MCA(Sn) через 3 мин после инъекции, %

Введено Sn(II) в реакцию с МСА Найдено

Sn(II) Общее олово

1 10 2,5 ±0,1 2,9 ±0,1 0,2 94,6 ±1,2

2 15 6,2 ±0,2 7,2 ± 0,3 0,7 96,6 ±0,4

3 20 8,6 ± 0,3 8,7 + 0,3 0,8 93,7 ±0,5

4 25 10,2 ± 0,3 12,3 ± 0,5 3,5 93,6 ±1,4

5 30 13,2 ± 0,4 - 5,9 -

6 35 18,2 ± 0,6 20,1 ± 0,8 7,8 86,3 ± 0,8

7 40 18,5 ± 0,6 21,9 ±0,9 8,2 86,8 ± 1,5

8 50 23,0 ± 0,7 28,3 ± 1,1 12,4 3,6 ± 0,7

Как видно из табл 5, содержание Sn(II) в MCA(Sn) в значительной степени определяет и относительную активность радиохимической примеси Наименьшая (не более 4,0%) относительная активность радиохимической примеси найдена в препаратах 1-4, содержащих олово(Н) от 3 до 10 мкг/мг МСА Накопление 99мТс-MCA(Sn) в легких крыс при введении указанных образцов препарата составило не менее 93%, в печени - не более 1% (данные не приведены в таблице) При этом в течение 1 часа после введения препарата выводится из легких крыс от 10 до 18% от введенной активности 99мТс В образцах, приготовленных из MCA(Sn) и содержащих олова(П) более 10-15 мкг/мг МСА, относительная активность радиохимической примеси увеличивается до 13%, накопление препарата в легких не превышает 90%, а в печени - увеличивается до 14%

Таким образом, содержание Sn(II) в MCA(Sn) более 10 мкг/мг не приводит к улучшению качества препарата Из табл 5 видно, что оптимальное количество Sn(II), необходимое для проведения процесса модификации и получения качественного РФП, составляет 15 мкг Sn(II) на 1 мг микросфер

Исследование образцов MCA(Sn), полученных при использовании указанного расчетного количества Sn(II), показало, что содержание Sn(II) в MCA(Sn) составляет от 3 до 7 мкг/мг или от 17 до 35 мкг/флакон (табл б)

Таблица 6

Результаты определения 8п(П) в МСА(8п), в реагентах и накопление ""Тс-МСА^п), полученных на их основе, в легких крыс

NN Содержание Sn(II) в MCA(Sn), мкг/мг (п=3,Р=0,95) Содержание Sn(II) в реагенте, мкг/флакон Относительная активность РХП, 99мТс, % Накопление в легких ""Tc-MCA(Sn) через 3 мин после инъекции, % (п=3, Р=0,95)

27-1 7,1 ±0,1 32,0,34,0, 34,8 0,8, 1,2, 1,0 95,5 ±0,5

27-2 6,9 ±0,1 33,0,32,8, 31,7 0,7,0,9, 0,8 95,5 ±0,9

27-5 5,3 + 0,2 24,0, 23,8, 20,9 0,1,0,7,2,0 97,1 ± 1,0

28-1 5,9 ±0,2 28,1,27,6,28,0 0,8,0,5, 0,1 96,8 ± 1,7

28-2 4,8 ±0,1 21,0,21,7, 22,4 0,3,0,1,0,6 95,9 ±0,4

28-3 4,1 ± 0,2 24,3,24,0,23,5 0,6,0,2,0,1 97,5+0,8

28-4 3,4 ±0,2 19,0, 17,8, 17,5 0,6,1,0, 0,3 96,2+1,5

Примечание к табл 6 Каждая цифра в 3 и 4 колонках таблицы соответствует результату анализа одного флакона с реагентом

Характеристики и нормы показателей качества стандартных образцов МСА(Бп) сведены в табл 7

Реагент представляет собой апирогенную, стерильную лиофшшзированную смесь, состоящую из МСА(5п), твина-80 и хлорида натрия.

Помимо контроля качества реагента по таким параметрам, как внешний вид, растворимость, подлинность, рН, определение диаметра МСА(8п), числа МСА(8п) во флаконе, стояла задача по разработке методик определения 8п(И), белка, твина-80 и хлорида натрия По внешнему виду реагент представляет собой лиофилизат белого или слегка желтоватого цвета.

Для испытания на растворимость использовали 0,9% раствор ЫаС1, поскольку такой же раствор, содержащий 99мТс без носителя, применяется для приготовления препарата из реагента. Реагент неполностью растворим в этом растворителе и образует суспензию желтоватого цвета, при хранении которой выпадает осадок, легко

Таблица 7

Характеристики и нормы показателей качества МСА(8п)

Наименование показателей Характеристика показателей и норм

Описание Сыпучий порошок светло-желтого цвета

Растворимость Практически нерастворим в воде, 95% этаноле, хлороформе, эфире (1 10 000)

Подлинность Е1%1ем при 290 им от 9,8 до 10,8, Е1%1Ш при 540 нм от 2,7 до 2,9

Прозрачность и цветность 1% раствора МСА(8п) в 2 М ЫаОН Прозрачный раствор, цветность между 3 и 4 эталонами шкалы «6« эталонов желтых оттенков

рН 1% водной вытяжки 2,5 - 3,0

Диаметр 95% МСА(Зп), мкм 10-30

Средний диаметр МСА(Зп), мкм 19,2 ±1,3

Потеря массы при высушивании Не более 4,0 %

Диаметр 95% набухших МСА(8п), мкм 10-35

Средний диаметр набухших МСА(8п) в 0,9% №С1, мкм 23,4 ± 1,3

Содержание БпШ) в МСА(Зп), мкг/мг от 3 до 7

Содержание БпЦУ) в МСА(5п), % не более 10 % от содержания 8п(П)

переходящий в равномерную взвесь при встряхивании Жидкость над осадком -бесцветная

Для разработки теста на подлинность реагента были проведены несколько испытаний Микроскопическое исследование суспензии реагента дает возможность идентифицировать сферичесую форму частиц Подлинность альбумина устанавливали по методу Лоури, основанном на образовании окрашенных продуктов реакции ароматических аминокислот и цистеина (компонентов молекулы белка) с реактивом Фолина, при этом развивается темно-синяя окраска раствора Наличие двухвалентного олова устанавливали по методике с использованием комплекса двухвалентного железа с о-фенантролином

Для определения рН суспензии реагента в 0,9% изотоническом растворе №С1 использовали потенциометрический метод (ГФ XI) Наличие микросфер в суспензии не мешает определению рН, величина которого не зависит также и от объема суспензии реагента в интервале 1-4 мл Величина рН суспензии реагента изменялась в пределах от 3,9 до 4,3

Для измерения диаметра модифицированных микросфер в реагенте отбирали пробу суспензии реагента в 0,9% растворе ЫаС1, поскольку измерению диаметра частиц в сухом реагенте мешает наличие в нем большого количества кристаллов ЫаС1 Вследствие некоторого набухания модифицированных микросфер в водном растворе диаметр их увеличивается и находится в интервале от 10 до 35 мкм, тогда как соответствующий интервал для МСА(8п) в сухом виде, используемых для приготовления реагента, составляет 10-30 мкм. Не менее 95% частиц в реагенте имеют диаметр от 10 до 35 мкм (п=5, Р=0,95) Средний диаметр МСА(8п) в реагенте составляет 21,9 ± 0,6 мкм (п=5, Р=0,95)

При определении числа микросфер в камере Горяева пользовались правилами, принятыми для подсчета лейкоцитов из-за схожести их размеров Число частиц во флаконе находилось в интервале от 800 000 до 1 500 000 штук Относительная погрешность определения не превышала ± 11,0%

Определение олова(Н) в реагенте проводили с помощью разработанной спектрофотометрической методики, основанной на образовании окрашенного комплекса о-фенантролина с Ее(П), образующимся в результате реакции восстановления Ре(Ш) двухвалентным оловом Содержание 8п(П) в реагенте изменялось от 0,017 до 0,035 мг (т е. от 3 до 7 мкг/мг микросфер) Содержание 8п(П) в реагентах близко к его содержанию в соответствующих образцах МСА(Зп) при пересчете на 1 мг белка. Наличие в реагенте твина-80 и хлорида натрия не влияют на результаты определения 8п(П)

Определение белка в реагенте проводили по биуретовой реакции с использованием рассчитанного удельного показателя экстинкции для биуретового комплекса 1%-ного щелочного раствора МСА(8п)- 2,79 ± 0,12 (п=5, Р=0,95) Наличие в реагенте твина-80 и хлорида натрия не влияет на результаты определения белка. Относительная погрешность определения не превышает ± 7,2% Содержание белка в реагенте в виде микросфер составляет от 4,0 до 5,5 мг

Хлорид натрия определяли потенциометрически титрованием раствором нитрата серебра (ГФ XI) Наличие микросфер альбумина и твина-80 не влияет на результаты анализа Относительная погрешность определения не превышает ± 2,0% Содержание хлорида натрия в реагенте изменяется от 8,7 до 9,3 мг

Определение содержания твина-80 в реагенте проводили спектрофотометрически по методике, основанной на взаимодействии твина-80 с амилозной фракцией крахмала. В реакцию вводили избыточное количество крахмала по отношению к твину Не вступивший в реакцию с твином избыток крахмала взаимодействует с вводимым в раствор иодом, образуя окрашенный в синий цвет комплекс, полоса поглощения в спектре которого имеет максимум при 680 нм Оптическая плотность раствора окрашенного комплекса зависит от содержания твина в растворе (чем выше концентрация твина, тем меньше оптическая плотность испытуемого раствора) Пропорциональная зависимость оптической плотности испытуемого раствора от содержания твина наблюдается в интервале концентраций 1-5 мкг/мл. Относительная погрешность определения не превышает ± 10,0% Наличие микросфер и хлорида натрия не влияет на определение твина-80 Содержание твина в реагенте изменяется от 0,17 до 0,25 мг.

Стерильность реагента контролировали в соответствии с Инструкцией по стерилизации и контролю стерильности радиофармацевтических препаратов для инъекций, радиоизотопных генераторов и нерадиоактивных реагентов для получения радиофармацевтических препаратов, утвержденной Минздравом СССР 01 03.90 г

Определение пирогенности реагента проводили в соответствии с ГФ XI на кроликах Тест-доза составляла I мл суспензии, полученной после растворения реагента в 4 мл 0,9% изотонического раствора ЫаС1 для инъекций, на 1 кг массы кролика

Реагенты являются стерильными и апирогенными в течение всего срока годности. Проведено изучение стабильности при хранении реагента при температуре +28 °С Хранение реагента в течение 12 месяцев при температуре +2-8 °С в условиях холодильника не изменяет его свойств Проведено изучение хранения реагента в течение 14 суток при комнатной температуре Установлено, что хранение реагента при указанных условиях не влияет на его свойства.

Характеристики и нормы показателей качества реагента и препарата «Микросферы альбумина, 99мТс» представлены в табл 8

Таблица 8

Характеристики и нормы показателей качества реагента и препарата «Микросферы альбумина, 99мТс»

Наименование показателей качества Характеристика показателей

РЕАГЕНТ

Описание Лиофилизат белого или слегка желтоватого цвета

Растворимость При смешивании с 1-4 мл 0,9% раствора ЫаС1 образуется суспензия

Подлинность По микросферам, альбумину, олову(И)

рН суспензии 3,9-4,3

Диаметр 95% МСА(Зп), мкм 10-35

Средний диаметр МСА(Зп), набухших в 0,9% ЫаС1, мкм 21,9 ±0,6

Количество микросфер 800 000 - 1 500 000

Содержание альбумина, мг 4,0 - 5,5

Содержание 5п(И), мг 0,017 - 0,035

Содержание ЫаС1, мг 8,7 - 9,3

Содержание твина-80, мг 0,17 - 0,25

Срок годности 12 месяцев

ПРЕПАРАТ

Описание Суспензия желтоватого цвета

РН 3,9 - 4,3

Радиохимическая примесь, % не более 4,0%

Срок годности 5 часов

Для приготовления РФП «Микросферы альбумина, 99мТс» во флакон с реагентом вводят шприцем 1-4 мл раствора пертехнетата натрия, 99мТс из генератора путем прокола иглой через резиновую пробку Флакон с содержимым помещают в свинцовый контейнер, энергично встряхивают и продолжают перемешивание в течение 20 мин Препарат готов к применению по истечении указанного времени

Препарат представляет собой суспензию желтоватого цвета, при стоянии которой выпадает осадок микросфер, переходящий в равномерную взвесь при встряхивании, жидкость над осадком бесцветная При взаимодействии пертехнетата натрия, 99мТс с 8п(П) происходит восстановление технеция до более низкой степени окисления и его присоединение к микросферам

При выборе аналитических параметров, которые-необходимо контролировать в готовом препарате, мы руководствовались тем, что препарат получают растворением реагента, качество которого определяется требованиями ФСП, в растворе натрия пертехнетата, 99мТс, удовлетворяющего требованиям ФСП 42-02254528-03, поэтому отпадает необходимость проведения полного контроля качества РФП, тем более, что срок его годности относительно мал (~ 5 часов) По этим причинам при контроле качества целесообразно определять те параметры, которые могут изменяться при его приготовлении, а именно- рН и РХП - относительную активность "мТс, не связанного с МСА(8п)

Определение подлинности по радионуклиду и объемной активности не проводили, поскольку эти параметры препарата соответствуют ФСП 42-02254528-03, так как приготовление радиофармацевтического препарата по существу сводится к растворению реагента в растворе натрия пертехнетата, 99мТс, качество которого отвечает требованиям упомянутой выше ФСП При растворении реагента в элюате

практически не происходит реакций, приводящих к изменению присутствующих в растворе веществ Объемная активность 99мТс в препарате равна объемной активности 9мТс в растворе натрия пертехнетата, используемого для приготовления РФП, так как изменения объема при этом не происходит

Основным показателем качества любого РФП является его радиохимическая чистота - РХЧ. Однако в случае соединений технеция, когда отсутствуют доказательства химической индивидуальности основной доли радионуклида в составе препарата, употребление понятия РХЧ неправомочно В этом случае определяют «относительную активность радиохимической примеси» - РХП В препарате 99мТс-MCA(Sn) радиохимической примесью могут быть растворимые химические соединения 99мТс, не вступившие во взаимодействие с микросферами. Традиционные хроматографические или электрофоретические методы, используемые для контроля РХЧ и РХП в радиофармпрепаратах с 99мТс, представляющих собой истинные растворы, непригодны для контроля рассматриваемого препарата.

Разработана методика определения 99мТс, несвязанного с МСА, путем предварительного фильтрования препарата через мембранный или бумажный фильтр с последующим сопоставлением скорости счета от пробы фильтрата и пробы раствора натрия пертехнетата, "мТс, используемого для приготовления препарата. Относительная активность радиохимической примеси в препарате не превышает 4,0%

Исследования радиохимического состава фильтратов образцов препарата 99мТс-MCA(Sn), в которых и содержится РХП, не связанный с микросферами 99мТс, показали, что наибольшая его часть (до 60%) находится не в виде пертехнетата натрия, а в виде коллоида - восстановленного гидролизованного технеция Тс02 пН20, который при введении препарата животным накапливается в печени Результаты определения РХП хорошо согласуются с данными по его накоплению в печени чем больше РХП, тем больше накопление коллоида в печени и меньше - в легких

Поскольку РХЧ (в нашем случае РХП) - это основной показатель качества радиофармпрепарата, определяющий в клинике фармакокинетику препарата, необходимо сравнить полученные данные по содержанию РХП в препарате 9 Тс-MCA(Sn) с результатами функциональной пригодности препарата.

Результаты изучения распределения "MTc-MCA(Sn) в организме крыс в различные сроки после внутривенного введения показали, что через 3 мин после инъекции в критическом органе - легких содержалось около 97% радиоактивности от введенного количества. Незначительное присутствие радионуклида в других органах (крови, печени, почках) говорит о том, что вводимые частицы сразу же блокируют капиллярную сеть легких, распределяясь в легочной ткани Начиная с 30 минуты, заметно уменьшение содержания препарата в легких - около 91%, к 5-му часу - 71%, через 24 часа в этом органе оставалось 35% от введенного количества радиоактивности, при этом в печени было не более 5%

Период полувыведения препарата из легких крыс составляет 17 часов Выведение "MTc-MCA(Sn) из организма происходит в основном через почки Так, через 3 мин после инъекции в почках регистрировалось 0,13 ± 0,01%, через 5 часов -5,09 ± 0,33%, через сутки -11,0 ± 1,1% от введенной активности

Выведение через гепатобилиарный тракт незначительно Через 5 часов в печени и кишечнике содержание радиоактивности составляло 1,77 ± 0,09% и 2,16 ± 0,16%, соответственно Незначительное накопление в этих органах свидетельствует о том, что в результате разрушения частиц в легких не происходит образование меченых

частиц белка такого размера, которые захватывались бы клетками РЭС и выводились в кишечник По-видимому, в данном случае поисходит отщепление радиоактивной метки от модифицированных микросфер и выведении через мочевыделительную систему, что подтверждается динамикой экскреции РФП из организма во все сроки наблюдения, а также увеличением накопления в желудке от 0,21% через 1 час до 1,3% через 5 часов после инъекции Незначительное накопление РФП в печени и кишечнике в процессе его выведения из организма, по нашему мнению, может являться косвенным доказательством того, что в процессе получения МСА(Бп) в основном происходит поверхностное распределение 8п(И) на микросферах и, соответственно, технеция-99м при приготовлении препарата

Получены сцинтиграммы легких кроликов через 5 мин после введения отечественного 99мТс-МСА(8п) и французского ТСК-5 препаратов Во всех случаях изображения были хорошего качества с четкими, ровными контурами легких, с диффузноравномерным распределением в них препарата. Другие органы на сцинтиграммах не регистрировались Различия между 99мТс-МСА(8п) и ТСК-5 при визуальной оценке не были выявлены

Проведено сравнительное изучение распределения по органам и тканям крыс 99мТс-МСА(8п) и ТСК-5. Фармакокинетика отечественного и французского препаратов аналогична Однако наблюдается более медленное выведение ТСК-5 из легких по сравнению с 99мТс-МСА(8п), что может, по-видимому, также являться косвенным доказательством того, что олово(П) и 99мТс распределяются по всему объему микросфер в случае ТСК-5 и по поверхности - в случае 99мТс-МСА(8п)

Величину рН суспензии препарата устанавливали потенциометрически Значение рН изменяется от 3,9 до 4,3

Изучено влияние следующих факторов

1) Содержания 8п(П) в реагенте на качество радиофармпрепарата 99мТс-МСА(8п), те на содержание РХП Относительная активность РХП в препарате зависит от содержания 8п(П) в реагенте Оптимальное содержание БпЩ) в реагенте составляет 17-35 мкг/флакон (3-7 мкг/мг микросфер)

2) Объема элюата, применяемого для получения РФП, а также возможного разбавления уже готового радиофармпрепарата 0,9%-ным раствором ЫаС1 на содержание РХП, поскольку согласно медико-техническим требованиям на препарат его готовят растворением реагента в 1-4 мл раствора пертехнетата натрия, 99мТс Растворение реагента как в 1 мл элюата, так и в 4 мл, позволяет получить препарат с содержанием РХП не более 4,0% При необходимости готовый препарат может быть разбавлен 0,9% раствором №С1 (например, при получении препарата с необходимой объемной активностью или с определенной концентрацией микросфер)

Полученные результаты хорошо согласуются с данными лабораторных испытаний на животных

3) Времени хранения препарата на содержание РХП Препарат хранили при комнатной температуре в соответствии с правилами ОСПОРБ Относительная активность РХП практически не изменяется в течение 5 часов после приготовления препарата Результаты биологического изучения хранения готового препарата в течение 5 часов при комнатной температуре показали, что он устойчив в течение 5 часов, не меняются его биологические свойства

4) Объемной активности 99мТс на содержание РХП в радиофармпрепарате 99мТс-МСА(8п) При объемной активности "мТс в препарате от 18,5 до 296,0 МБк/мл (при

общей активности от 74,0 до 1184,0 МБк) не наблюдается значимого изменения относительной активности РХП в препарате

5) Стерилизации реагента ионизирующим излучением на показатели качества реагента и препарата Стерилизация реагента облучением дозой 1 106 рад несколько снижает содержание Sn(II) и твина-80 по сравнению с нестерильными реагентами, но относительная активность РХП в препарате, приготовленном из стерильного реагента, становится ниже

6) Способа перемешивания раствора при приготовлении препарата Перемешивание вручную или с помощью прибора для перемешивания не оказывает влияния на показатели качества препарата.

Проведено изучение стабильности реагента при хранении в течение 12 месяцев при температуре +2-8 °С на качество РФП «Микросферы альбумина, 99мТс» Хранение реагента в течение 12 месяцев при температуре +2-8 "С в условиях холодильника не изменяет качество готового РФП Фармакокинетика его в выбранные сроки 3 мин и 1 час не отличается от результатов, полученных с РФП, приготовленных из свежих реагентов

Проведено изучение стабильности реагента при хранении в течение 14 суток при комнатной температуре на качество РФП Хранение реагента при указанных условиях не изменяет радиохимических и биологических свойств полученного из него радиофармпрепарата.

Срок годности РФП установлен, исходя из периода полураспада радионуклида (6,01 часа), радиохимического и биологического поведения препарата, испытанного в различные сроки после его приготовления Было установлено, что срок годности препарата составляет 5 часов.

Экспериментальная оценка безвредности препарата «Микросферы альбумина,99мТс» проведена в лаборатории технологии и методов контроля радиофармпрепаратов ФГУП ГНЦ РФ - Институт биофизики На основании токсикологических исследований препарата "MTc-MCA(Sn), проведенных в соответствии с «Общими методическими указаниями по экспериментальным исследованиям новых радиофармацевтических препаратов» (1990 г), установлено, что при введении белым крысам в клинической дозе он является безвредным Препарат стерилен, апирогенен, не вызывает местных реакций на введение При введении белым беспородным мышам в дозе, в 1 300 раз превышающей клиническую, препарат не вызывал гибели животных

Клинические испытания РФП «Микросферы альбумина,""Тс» были проведены в 10 клинических базах Результаты клинических испытаний позволяют утверждать, что препарат соответствует требованиям, предъявляемым к РФП, предназначенным для перфузионной сцинтиграфии легких По физико-химическим параметрам и получаемой информации препарат не уступает зарубежному аналогу ТСК-5 (CIS, Франция).

3. Разработка методов анализа реагента и РФП на основе альбумина

Реагент представляет собой стерильный, апирогенный лиофилизат, состоящий из 10 мг альбумина и 15 мкг олова(И), хранящийся в укупоренных и завальцованных флаконах

На основании ОСТ «Стандарты качества лекарственных средств. Основные положения» № 91500 05 001-00 разработана схема химико-фармацевтического анализа реагента «Альбумин,99мТс», которая включает в себя определение следующих показателей описание, растворимость, подлинность, прозрачность и цветность

раствора, рН, стерильность, пирогенность, количественное определение олова(Н) и альбумина, упаковка, маркировка, транспортирование, хранение, срок годности

Внешний вид реагента определяли визуально, он представляет собой лиофилизат белого или слегка желтоватого цвета

Для испытания на растворимость использовали 0,9% раствор хлорида натрия, поскольку такой же раствор, содержащий 99мТс без носителя, применяется для приготовления препарата из реагента Реагент полностью растворим в течение 10-ти секунд в этом растворителе и образует бесцветный или слегка желтоватый прозрачный раствор

Для установления подлинности реагента были разработаны методики, позволяющие надежно идентифицировать его. подлинность альбумина устанавливали по методу Лоури, основанном на образовании окрашенных продуктов реакции ароматических аминокислот и цистеина (компонентов молекулы белка) с реактивом Фолина (ГФ XI), при этом развивается темно-синяя окраска раствора, наличие двухвалентного олова устанавливали по окрашиванию в светло-желтый цвет раствора комплекса восстановленного оловом(П) двухвалентного железа с о-фенантролином, приготовленного для количественного определения олова(Н)

Для определения величины рН раствора реагента в 5 мл изотонического раствора хлорида натрия использовали потенциометрический метод Величина рН раствора экспериментальных образцов реагента изменялась от 2,5 до 3,5

Для определения белка обычно используют две известные из литературы методики Одна из них основана на светопоглощении водных растворов белка в области 260-300 нм с максимумом при 278 нм Другая методика основана на образовании в щелочной среде окрашенного в фиолетовый цвет комплекса двухвалентной меди с пептидными связями молекулы белка с максимумом поглощения при 540 нм.

Разработку методик определения альбумина в реагенте предварительно проводили на стандартных растворах, на модельных смесях, а затем на экспериментальных сериях реагента.

При определении альбумина по биуретовой реакции было установлено, что соблюдение закона Бугера-Ламберта-Беера наблюдается для биуретового комплекса щелочного раствора альбумина при содержании от 0,2 до 1,8 мг альбумина в 1 мл измеряемого раствора при 540 нм Вычислен удельный показатель поглощения 1% щелочного раствора альбумина с биуретовым реактивом, который составил 2,75±0,10 (п=12, Р=0,95) и практически совпадает с удельным показателем, известным из литературы

Было установлено, что содержание олова(П) в реагенте от 10 до 60 мкг/флакон не влияет на определение альбумина с помощью биуретового реактива

Также для разработки методики количественного определения альбумина в реагенте была использована способность белков к поглощению излучения в УФ-области спектра Поскольку нашей задачей было разработать методику определения альбумина в реагенте, который кроме 10 мг альбумина содержит 15 мкг олова(Н), причем рН раствора реагента около 2,5-3,5, то предварительно требовалось установить зависимость спектра поглощения растворов альбумина от рН Установлено, что изменение рН от 2,12 до 6,15 не влияет на положение максимума в УФ-спектре поглощения водных растворов альбумина Оызкс~ 278 ± 2 нм) и на величину оптической плотности при X макс

Поскольку технология приготовления альбуминового реагента предполагает высушивание раствора реагента в лиофильной сушке, были проведены эксперименты на модельных смесях с целью выяснения влияния градиента низких температур на последующее определение альбумина Установлено, что градиент низких температур, используемых при лиофилизации реагента, не влияет на определение альбумина (не изменяет положения максимума в спектре поглощения (он остается при 278±2 нм) и величину оптической плотности).

При определении альбумина по собственному поглощению в УФ-области было установлено, что соблюдение закона Бугера-Ламберта-Беера наблюдается для водного раствора альбумина при содержании от 0,4 до 1,6 мг альбумина в 1 мл измеряемого раствора при 278 нм Вычислен удельный показатель поглощения 1% водного раствора альбумина в максимуме поглощения при 278 нм, который составил 5,45±0,25 (п=5, Р=0,95) Погрешность спектрофотометрического определения не превышала ±5,0% Установлено, что содержание олова(П) в реагенте от 10 до 60 мкг/фл не влияет на определение альбумина по собственному поглощению в УФ-области

Результаты определения альбумина в реагенте с помощью биуретового реактива и по собственному поглощению белка в УФ области представлены в табл 9.

Таблица 9

Результаты определения альбумина в реагенте с помощью биуретового реактива и по собственному поглощению белка в УФ области

Найдено альбумина, Найдено альбумина,

мг/фл, мг/фл,

N серии с биуретовым по собственному

реактивом поглощению

23290296 10,5 9,9

10,3 9,9

10,3 9,9

24210498 10,5 10,3

10,3 9,8

10,3 9,9

25190398 10,3 10,9

11,2 10,7

_ 10,3 10,7-

27090498 10,2 9,9

9,9 9,7

10,4 9,9

30140598 10,4 11,2

10,3 11,6

10,4 11,0

35211298 10,7 9,9

10,7 10,8

10,4 10,8

36170399 10,5 10,6

10,5 9,9

9,8 10,6

Из таблицы видно, что результаты определения альбумина в реагенте с помощью разработанных спектрофотометричееких методик достаточно хорошо согласуются друг с другом и с истинным значением 10 мг (введенным количеством альбумина при изготовлении реагента)

Содержание олова(П) в реагенте является одним из важнейших показателей качества Для определения олова(Н) в реагенте наиболее оптимальным, с нашей точки зрения, является спектрофотометрический метод Для разработки спектрофотометрической методики определения олова(П) в реагенте использовали реакцию, основанную на измерении светопоглощения окрашенного 11е(ГУ)-тиоцианатного комплекса при 353 нм, образующегося в результате восстановления рения(УИ) оловом(Н) до Яе(1У) с последующим взаимодействием последнего с тиоцианат-ионами с образованием окрашенного комплекса Работа была проведена предварительно на стандартных растворах олова(Н) Выполнение закона Бугера-Ламберта-Беера наблюдается в интервале концентраций олова(П) от 1,6-6,4 мкг/мл в измеряемом растворе Предел обнаружения олова(И) по данной методике составляет 0,2 мкг/мл. Относительная ошибка определения составляет ±5,2% Рассчитанный условный молярный коэффициент погашения (е) для 11е(1У)-тиоцианатного комплекса оказался равным 15731±815 л/моль см (п=9, Р=0,99)

Разработана методика определения олова(П) на модельных смесях Установлено, что положение максимума поглощения в спектрах растворов рений(1У)-тиоцианатных комплексов (для стандартных растворов Бп(И) и модельных смесей) совпадает, молярные коэффициенты погашения составляют 15731±815 л/моль см (растворы олова(Н)), 15324 ± 636 л/моль см (модельная смесь) Графики зависимости оптической плотности от концентрации олова(Н) в стандартном растворе (у = 0,12х + 0,01, г = 0,9974) и оптической плотности от концентрации олова(Н) в модельных смесях (у = 0,12х + 0,01, г = 0,9947) с учетом относительных ошибок линейны и накладываются друг на друга Присутствие альбумина в количестве 10 мг не влияет на определение олова(П) Результаты валидации методики представлены в табл 10

Таблица 10

Валидация методики определения олова(П) в модельных смесях

Валидируемые параметры Результаты

Точность Введено олова(И), мкг Найдено олова(Н), мкг Эг

0,8 0,8 ±0,1 0,08

2,0 2,1 ±0,2 0,09

4Д 3,9 ± 0,3 0,03

6,1 6,3 ±0,3 0,05

8,1 7,6 ±0,5 0,02

10,0 10,2 ±0,3 0,03

20,0 19,9 ±0,2 0,01

30,0 29,9 ± 0,7 0,02

40,0 39,5 ±0,6 0,02

50,0 49,8 ± 0,6 0,01

Воспроизводимость Стандартное отклонение я = 0,18 (п = 9, Р = 0,99)

Линейность у = 0,12х + 0,01 (г = 0,9974)

Диапазон линейности 1,6 - 6,4 мкг/мл

Предел обнаружения 0,2 мкг/мл

Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанная методика обладает приемлемыми точностью, воспроизводимостью, поэтому мы ее использовали для количественного определения двухвалентного олова в реагенте Результаты определения олова(П) в реагенте представлены в табл 11

Таблица 11

Результаты определения содержания 8п(П) в экспериментальных сериях реагента

N серии Содержание Sn(II), мкг

Введено 8п(Н), мкг Найдено Sn(II), мкг

3 10,0 8,6, 9,8, 9,2

4 15,0 15,3,15,5, 15,6

5 15,0 13,3, 13,6,15,5

,6 20,0 18,8, 19,8, 17,3

7 20,0 20,0, 20,4,21,5

8 20,0 21,5, 19,8, 20,7

Таким образом, разработана простая, точная и воспроизводимая методика спектрофотометрического определения олова(П) в реагенте для приготовления радиофармпрепарата «Альбумин,99мТс»

Вторая реакция, используемая для количественного определения 8п(П), основана на восстановлении Ре(Ш) стандартным раствором 5п(И) в солянокислом растворе с последующим образованием окрашенного комплекса Ре(Н) с о-фенантролином Она легла в основу разработанной нами спектрофотометрической методики определения олова(Н) в реагенте Линейная зависимость оптической плотности растворов комплекса Ре(Н) с о-фенантролином от концентрации олова(И) наблюдается в интервале 0,5-7,0 мкг/мл в измеряемом растворе. Рассчитан условный молярный коэффициент погашения, который составляет 19 800±594 л моль"1 см"1 (п=5, Р=0,95)

Разработана методика определения олова(И) при переводе его в олово(ГУ), заключающаяся в предварительном «мокром» озолении реагента концентрированной серной кислотой в присутствии хлорной кислоты в качестве окислителя с последующим спектрофотометрическим определением олова с пирокатехиновым фиолетовым Правильность разработанной методики оценивали методом «введено» -«найдено» (табл 12)

Таблица 12

Результаты определения олова(П) по олову(1У)

Введено олова(П), мг Найдено олова(1У), мг

10,00 10,22

10,00 9,71

10,00 9,41

10,00 10,19

10,00 9,89

10,00 9,38

10,00 10,65

10,00 10,31

Для доказательства правильности разработанных спектрофотометрических методик определения олова(Н) в реагенте мы использовали метод индикаторных трубок (ИТ) В методе индикаторных трубок аналитическим сигналом является длина окрашенной зоны (Ьо, см), возникающая в индикаторной трубке после контакта определяемого вещества с индикаторным порошком и зависящая от концентрации определяемого вещества Индикаторные трубки представляют собой полые стеклянные трубки различного диаметра ((1, см) и различной длины (Ь, см), заполненные индикаторным порошком

В качестве индикаторных порошков использовали ксерогели кремниевой кислоты, модифицированные фосфорномолибденовой гетерополикислотой (ГПС) Нз[Р(Мо3Ою)4], ее аммонийной солью (МН4)3[Р(Мо30]0)4] и реактивом Вавеле (смесь фосфорномолибденовых кислот 12 и 18 рядов Н3[РМоп04о] и Н3[РМо18Обо]) Для выполнения поставленной задачи определяли.

1) оптимальное ГПС в качестве аналитического реагента,

2) условия восстановления ГПС (кислотность среды, количество молибдена(У1) в ксерогеле, наличие катализатора);

3) способ ввода пробы в индикаторную трубку (за счет капиллярных сил или с помощью перистальтического насоса);

4) скорость потока пробы;

5) геометрические размеры индикаторной трубки (диаметр и длину);

6) условия стабилизации олова(Н) в измеряемом растворе, учитывая его низкое содержание в реагенте

Установлено, что для определения олова(Н) в реагенте с помощью метода индикаторных трубок следует использовать ксерогель, модифицированный реактивом Вавеле , с содержанием молибдена 60 мг/г Оптимальные условия анализа-внутренний диаметр индикаторных трубок - 1 мм, длина 10 см, ввод пробы - с помощью перистальтического насоса, скорость ввода пробы не выше 100 мкл/мин в течение 4-5 минут объемом 0,5 мд, в среде 1М НС1

Разработаны методики определения олова(П) в реагенте с помощью индикаторных трубок по градуировочному графику и методу добавок Результаты представлены в табл. 13

Таблица 13

Результаты определения олова(П) в реагентах методом ИТ по градуировочному графику

№ серии Введено БпЩ), мкг Найдено 8п(11), мкг - Бг

4 15,0 14,0 ± 3,5 0,09

5 15,0 15,7 ±4,0 0,10

6 20,0 23,6 ±3,4 0,06

7 20,0 21,6 ±2,7 0,05

8 20,0 21,4 ±2,0 0,04

Данные, полученные методом индикаторных трубок, хорошо согласуются с результатами спектрофотометрических методик тех же серий реагента, что подтверждает правильность и хорошую воспроизводимость разработанной методики (табл. 14).

* Индикаторные порошки разработаны на кафедре аналитической химии МГУ им М В Ломоносова под руководством д х н, профессора Е И Моросановой

Таблица 14

Результаты определении 8п(П) в реагенте для приготовления РФП «Альбумин,"мТс>> различными методами

N серии Введено олова(П), мкг Найдено 5п(П), мкг/фл

ИТ «рениевая» методика «железная» методика в виде 8п(1У) с пирокатехи- новым фиолетовым

1 2 3 4 5 6

4 15,0 14,8,12,8,17,1 15,1,15,3, 15,5 12,8,14,9, 17,1 12,8,17,1,16,1

5 15,0 12,8,14,8,14,0 13,3, 13,6, 15,5 17,1, 13,3, 13,5 14,2,17,1,15,4

6 20,0 17,8,19,0,21,6 18,8,19,8, 17,3 20,2,22,7,21,9 17,6,19,2,21,7

7 20,0 22,8,20,5,21,5 20,0, 20,4, 21,5 17,6,18,2,19,3 19,2,21,4,22,0

8 20,0 22,3,20,8, 21,2 21,5, 19,8, 20,7 17,6,18,3,18,6 20,0,16,9,18,9

Примечание к табл 14 Каждая цифра в колонках 3,4,5,6 таблицы соответствует результату анализа одного флакона с реагентом

Определение стерильности и пирогенности реагента проводили в лаборатории технологии и методов контроля радиофармпрепаратов ФГУП ГНЦ РФ - Институт биофизики. Проведенными исследованиями было установлено, что реагенты являются стерильными и апирогенными в течение всего срока годности Установлен срок годности реагента — 12 месяцев

Изучена стабильность при хранении реагента при температуре +2-8°С Хранение реагента в течение 12 месяцев при температуре +2-8°С в условиях холодильника не изменяет его свойств

Изучена стабильность при хранении реагента в течение 14 суток при комнатной температуре от +18 до +20°С Установлено, что хранение реагента при указанных условиях не влияет на его свойства

Характеристики и нормы показателей качества реагента для приготовления препарата «Альбумин,99мТс» представлены в табл. 15.

Для приготовления РФП «Альбумин, 99мТс» во флакон с реагентом, содержащим модифицированный двухвалентным оловом альбумин, вводят шприцем 1-5 мл раствора пертехнетата натрия, "мТс, из генератора путем прокола иглой через резиновую пробку Флакон с содержимым помещают в свинцовый контейнер, перемешивают, не взбалтывая, при комнатной температуре в течение 30 минут Препарат готов к применению по истечении указанного времени Препарат представляет собой прозрачный бесцветный или слегка желтоватый раствор

При контроле качества РФП определяли те параметры, которые могут изменяться при его приготовлении, а именно рН и РХП - относительную активность 99мТс, не связанного с альбумином. В препарате «Альбумин,99мТс» радиохимическими примесями могут быть растворимые химические соединения 99мТс, не вступившие во взаимодействие с альбумином - свободный пертехнетат натрия,"мТс

Таблица 15

Характеристики и нормы показателей качества реагента

Тест Норма по ФСП

Описание Лиофилизат белого или слегка желтоватого цвета

Растворимость Содержимое флакона должно растворяться в 5,0 мл раствора 0,9 % №С1 в течение 10 секунд

РН 2,5 - 3,5

Подлинность А Наличие двухвалентного олова устанавливали по окрашиванию в светло-желтый цвет раствора комплекса восстановленного оловом(П) железа(П) с о-фенангролином Б Наличие альбумина по образованию синего комплекса при взаимодействии реагента с биуретовым реактивом

Содержание альбумина во флаконе, мг 9,0-11,0

Содержание 5п(Н) во флаконе, мкг 12,0-18,0

Стерильность Стерильный

Пирогенность Апирогенный

Хранение В защищенном от света месте при температуре от +2 до +8 °С

Срок годности 1 год

Для разработки методики определения свободного Na"MTc04 использовали методы бумажной хроматографии (БХ) и тонкослойной хроматографии (ТСХ). В качестве неподвижных фаз применяли хроматографические пластинки со слоем силикагеля 0,22 мм фирмы «Мегск», хроматографическую бумагу FN 17 фирмы «Filtrak», Whatman 1, Whatman 31ЕТ В качестве подвижных фаз использовали 85%-ный метанол, метилэтилкетон, ацетон - метанол (1 1), ацетон - вода (95 5), 0,9 % раствор хлорида натрия Было установлено, что оптимальной системой для определения свободного Na"MTc04, является система ацетон-вода (95 5) В данной системе пятно Na"MTc04 идет с фронтом растворителя компактно, присутствие «хвостов» минимально, в то время как РФП остается на старте Величина Rf для "мТс04 составляет 0,94±0,07, для РФП 0-0,1 (п=5, Р=0,95)

Относительная активность радиохимической примеси в препарате не превышала 5% Характеристики и нормы показателей качества препарата представлены в табл 16.

Таблица 16

Характеристики и нормы показателей качества РФП «Альбумин,1"иТс»

Наименование показателей качества Норма по ФСП

Описание Прозрачный бесцветный раствор

РН 2,5-3,5

Радиохимическая примесь,% Не более 5%

Срок годности 4 часа

Испытание препарата на стерильность и пирогенность проводили в лаборатории технологии и методов контроля радиофармпрепаратов ФГУП ГНЦ РФ - Институт биофизики и испытательном лабораторном центре ЦНИИ эпидемиологии. Все серии препарата были стерильными и апирогенными Одновременно на кроликах оценивали реакцию на внутривенное введение препарата (срок наблюдения - 48

часов) Экспериментальная оценка функциональной пригодности и безвредности препарата «Альбумин,99мТс» была проведена в той же лаборатории на крысах Были сделаны следующие выводы

1 Препарат «Альбумин, 99мТс» достаточное время находится в сосудистом русле в количестве, которое позволяет адекватно оценить объем циркулирующей крови и плазмы.

2 По своим фармакокинетическим характеристикам РФП «Альбумин, 99мТс» не отличается от других препаратов альбумина, разрешенных к клиническому применению

3. Препарат рекомендуется хранить не более 4 часов.

4 Радиофармпрепарат «Альбумин, 99мТс» не вызывают у животных нежелательных реакций при внутривенном введении и является безвредным

5. Реагент и РФП «Альбумин, 99мТс» могут быть рекомендованы для клинического изучения

4. Разработка методов анализа субстанции ОЭДФ, реагента и РФП на основе ОЭДФ

Разработана схема химико-фармацевтического анализа субстанции ОЭДФ, включающая определение следующих показателей описание, растворимость, подлинность, температура плавления, прозрачность и цветность раствора, рН 1%-ного раствора, посторонние примеси, сульфатная зола, тяжелые металлы, остаточные органические растворители, количественное определение, микробиологическая чистота, упаковка, маркировка, хранение, срок годности

ОЭДФ представляет собой порошок белого или почти белого цвета Субстанция ОЭДФ очень легко растворима в воде; легко растворима в метиловом и этиловом спиртах, очень мало растворима в ацетоне и эфире

Для доказательства подлинности субстанции разработаны методики ПМР, ЯМР 31Р, ПК-спектроскопии* В спектре ПМР субстанции ОЭДФ присутствует четкий симметричный триплет в области 8 = 1,6 ± 0,02 м д, в спектре ЯМР 31Р - синглет в области 5 = 20,38 ± 0,02 м д

В ИК-спектре ОЭДФ наблюдаются интенсивные полосы поглощения в области 1190 - 1120 см"1, относящиеся к колебаниям фосфорильного кислорода (ир=о ), в области 930 см"' (и5 РЮИ ) и 1030 - 1020 см" (иа5 Р.0н ). а также при 960 см ответственные за колебание связей в группах Р-ОН и Р-(ОН)2

Разработана методика определения подлинности ОЭДФ с-помощью бумажной хроматографии по совпадению величин Яг в сравнении со стандартом Хро-матографирование проводили на бумаге КЫ 17 размером 10х 12 см в системе н-бутанол - пиридин - этанол - вода, взятых по объему в соотношении 1 0,5 1 . 4, восходящим способом После проявления хроматограммы обнаружились пятна ОЭДФ - белые на розово-коричневом фоне с = 0,77 ± 0,02 (п = 9, Р = 0,95)

Был проведен элементный анализ для субстанции ОЭДФ (две параллельные пробы) Найдено, % С - 11,31; 11,46, Н - 3,92; 4,17, Р - 30,04, 29,96 Вычислено, %

* Методики ПМР и ЯМР 31Р разработаны нами совместно с к х н Стручковой МИ и к х н Игнатенко А В, Институт органической химии РАН им НД Зелинского Методика ИК-спекгроскопии разработана нами совместно с к х н Сенявиным В М , Московский государственный университет им МВ Ломоносова

** Элементный анализ выполнен к х н Анисимовой Г Ф, Институт органической химии РАН им НД Зелинского

С-11,65, Н-3,88, Р-30,06

Температура плавления ОЭДФ составила 198-199 °С 1%-ный водный раствор ОЭДФ - прозрачный и бесцветный Значение рН 1%-ного водного раствора ОЭДФ изменяется от 1,5 до 2,0 Потерю массы при высушивании определяли при нагревании навески ОЭДФ массой около 1,0 г (точная навеска) до 100-105 °С в сушильном шкафу Потеря массы при высушивании не превышала 0,5%

Содержание сульфатной золы из 1 г (точная навеска) субстанции ОЭДФ не превышала 0,01% и выдерживала испытание на содержание тяжелых металлов в зольном остатке - не более 0,001%

Поскольку на последней стадии очистки субстанции ОЭДФ используют ацетон, то была разработана методика определения остаточного органического растворителя (ацетона) методом ГЖХ с использованием внешнего стандарта (ацетонитрила) Содержание ацетона в препарате - не более 0,5%

Разработана методика определения ОЭДФ в субстанции. Методика заключается в «мокром» озолении субстанции смесью концентрированных серной и хлорной кислот до фосфат-ионов с последующим спектрофотометрическим определением в виде «желтого» фосфорнованадиевомолибденового комплекса (ФВМК) Для доказательства того, что разложение органической матрицы идет до фосфат-ионов, в качестве стандарта использовали КН2РО4 В процессе работы установлены оптимальное время разложения (30-35 мин), температура разложения (250-350 °С) Подобраны необходимые для разложения количества прибавляемых кислот (концентрированной серной кислоты - 2 мл, концентрированной хлорной кислоты -0,35 мл) После разложения фосфат-ионы переводили в «желтую» форму ФВМК прибавлением ванадомолибденовой смеси

Установлено, что положение максимумов в спектрах поглощения стандарта (КН2Р04) и ОЭДФ после разложения совпадает - при 350±2 нм. Графики зависимости оптической плотности от концентрации фосфора в растворе, с учетом относительных ошибок, линейны и накладываются друг на друга- у = 0,2х + 0,03, г = 0,9971 (КН2Р04), у = 0,2х + 0,04, г = 0,9971 (ОЭДФ) Следовательно, разложение субстанции происходит полностью до фосфат-ионов Выполнение закона Бугера-Ламберта-Беера наблюдается в интервале концентраций фосфора от 1,0 до 3,8 мкг/мл Молярные коэффициенты погашения КН2РО4 и ОЭДФ практически совпадают 6720±156 л/моль.см (КН2Р04), 6707±92 л/моль.см (ОЭДФ). Предел обнаружения фосфора по данной методике составляет 0,1 мкг/мл Относительная ошибка определения не превышает ± 3,6% Содержание ОЭДФ в субстанции - не менее 98,0% и не более 100,5% в пересчете на сухое вещество

Исследована стабильность ОЭДФ в процессе хранения Субстанция ОЭДФ хранится в течение 1 года при температуре не выше 25 °С без изменения ее свойств (исследования продолжаются)

Характеристики и нормы показателей качества субстанции ОЭДФ представлены втабл 17

Реагент представляет собой стерильный, апирогенный лиофилизат, состоящий из 10 мг ОЭДФ и 20 мкг олова(Н), хранящийся в укупоренных и завальцованных флаконах.

♦

Методика определения остаточных органических растворителей методом ГЖХ была разработана нами совместно с к х н Хомушку Г М, НПО «Тайфун» (г Обнинск)

С учетом ОСТ «Стандарты качества лекарственных средств Основные положения» разработана схема химико-фармацевтического анализа реагента для приготовления РФП «ОЭДФ,99шТс» Она включает определение следующих показателей- описание, растворимость, подлинность, прозрачность и цветность раствора, рН, стерильность, пирогенность, количественное определение олова(П) и ОЭДФ, упаковка, маркировка, транспортирование, хранение, срок годности

Таблица 17

Характеристики и нормы показателей качества субстанции ОЭДФ

Показатели Методы анализа Норма по Стандарту предприятия

Описание Визуальный Белый или почти белый порошок

Растворимость ГФ XI Очень легко растворим в воде, легко растворим в СНэОН, 96%С2Н,0Н

Подлинность ПМР ЯМР3'Р Спектры испытуемого и стандартного растворов должны совпадать по положению химических сдвигов и их относительным интенсивностям

ИК-спектроскопия ИК-спектры испытуемого и стандартного образцов должны совпадать по положению полос и их относительным интенсивностям

Элементный анализ С - 11,31%, Н - 3,92%, Р - 30,04%

Цветные реакции а) по образованию синего комплекса при взаимодействии ОЭДФ с СоСЬ в щелочной среде, б) по образованию желтого соединения при взаимодействии ОЭДФ с Н202 и молибдатом аммония в кислой среде

Прозрачность и цветность 1%-ного раствора ГФ XI Прозрачный, бесцветный

рН 1%-ного раствора ГФ XI, потснциометрический 1,5-2,0

Температура плавления, °С ГФ XI 198-199

Потеря массы при высушивании ГФ XI не более 0,5%

Содержание сульфатной золы ГФ XI не более 0,01%

Содержание тяжелых металлов ГФХ1 не более 0,001%

Посторонние примеси Бумажная хроматография Единичной примеси не более 0,5%, сумма примесей - не более 2%

Количественное определение Спекгрофотомегрический От 98,0% до 100,5%

Микробиологическая чистота ГФ XI Изм 3, категория 1 2

Остаточные органические растворители (ацетон) ГЖХ не более 0,5%

Условия хранения Стандарт предприятия При! <25 "С, в сухом, защищенном от света месте

Упаковка Стандарт предприятия По 10 г во флакон из темного стекла.

Маркировка Стандарт предприятия На этикетке указывают предприятие- изготовитель и его товарный знак, название препарата на русском языке, количество, условия хранения, номер серии, срок годности

Срок годности Стандарт предприятия 1 год

По внешнему виду реагент представляет собой лиофилизат белого или почти белого цвета Реагент полностью растворим в 0,9% растворе хлорида натрия в течение 10 секунд и образует бесцветный и прозрачный раствор.

Для установления подлинности реагента разработаны методики, позволяющие надежно идентифицировать его. 1) ИК-спектр испытуемого образца в таблетке с КВг в области от 4000 до 400 см'1 должен совпадать с прилагаемым рисунком спектра по положению полос и их относительным интенсивностям. 2) Цветные реакции-

а) по образованию синего комплекса при взаимодействии раствора реагента (в 0,9% хлориде натрия) с СоСЬ в щелочной среде,

б) раствор, приготовленный для количественного определения олова(И), должен быть окрашен в светло-желтый цвет

Для определения величины рН раствора реагента в 5 мл 0,9% изотонического раствора хлорида натрия использовали потенциометрический метод Величина рН раствора экспериментальных образцов реагента изменялась от 2,0 до 3,5.

Разработку методики определения ОЭДФ в реагенте предварительно проводили на модельных смесях, а затем на экспериментальных сериях реагента При определении ОЭДФ в модельных смесях, реагенте, как и в субстанции, на стадии пробоподготовки было проведено разложение органической матрицы концентрированными серной и хлорной кислотами до фосфат-ионов. Подобраны оптимальное время разложения, температура разложения, количество прибавляемых кислот. После разложения фосфат-ионы переводили в «желтую» форму ФВМК прибавлением ванадомолибденовой смеси Максимумы поглощения в спектрах растворов ФВМК (для КН2РО4, ОЭДФ, модельных смесей) совпадают (при 350±2 нм), молярные коэффициенты погашения также практически совпадают- 6720±156 л/моль см (КН2Р04), 6707±92 л/моль см (ОЭДФ), 6667±613 л/моль см (модельная смесь) Присутствие 8п(Н) в количестве 20 мкг не влияет на определение ОЭДФ.

Результаты валидации методики определения ОЭДФ в модельных смесях приведены в табл. 18

Таблица 18

Валидация методики определения ОЭДФ (в пересчете на фосфор) в модельных смесях

Валидируемые параметры Результаты

Правильность Введено фосфора, Найдено фосфора, мкг/мл

0,6 0,5 ±0,1

1,3 1,3 ±0,0

1,9 2,0 ±0,1

2,6 2,7 ±0,1

3,2 3,2 ±0,1

3,8 3,8 ± 0,0

Воспроизводимость Стандартное отклонение б = 0,2 (и = 9, Р = 0,99)

Устойчивость растворов Свежеприготовленный раствор сравнения Свежеприготовленный измеряемый раствор

Линейность у = 0,2х + 0,04, г = 0,9973

Диапазон линейности 1,2 - 3,8 мкг/мл

Предел обнаружения 0,1 мкг/мл

Таким образом, разработана унифицированная спектрофотометрическая методика определения ОЭДФ, которая может быть использована для определения ОЭДФ как в субстанции, так и в реагенте

Содержание олова(Н) в реагенте является одним из важнейших показателей качества, которое в свою очередь, определяет качество радиофармпрепарата «ОЭДФ,99тТс», а именно эффективность мечения и, соответственно, относительную активность радиохимической примеси

Для разработки спектрофотометрической методики определения олова(Н) в реагенте использовали реакцию, основанную на измерении светопоглощения окрашенного Ке(1У)-роданидного комплекса при 353 нм, образующегося в результате восстановления рения(УИ) оловом(Н) до рения(1У) с последующим взаимодействием последнего с роданид-ионами с образованием окрашенного комплекса Работа была проведена предварительно на стандартных растворах олова(П)

Выполнение закона Бугера-Ламберта-Беера наблюдается в интервале концентраций олова(П) от 1,6 до 6,4 мкг/мл в измеряемом растворе Предел обнаружения олова(П) по данной методике составляет 0,2 мкг/мл Относительная ошибка определения составляет ± 5,2% Рассчитанный условный молярный коэффициент погашения (е) для Яе(1У)-роданидного комплекса оказался равным 15731±815 л/моль см (п = 9, Р = 0,99)

Разработана методика определения олова(П) на модельных смесях Установлено, что положение максимума поглощения в спектрах растворов рений(1У)-роданидных комплексов (для стандартных растворов 8п(И) и модельных смесей) совпадает, молярные коэффициенты погашения составляют 15731±815 л/моль см (растворы олова(П)), 15324±636 л/моль см (модельная смесь) Графики зависимости оптической плотности от концентрации олова(П) в стандартном растворе (у =0,12х + 0,01, г = 0,9974) и оптической плотности от концентрации олова(П) в модельных смесях (у = 0,12х + 0,01, г = 0,9947), с учетом относительных ошибок, линейны и накладываются друг на друга Присутствие ОЭДФ в количестве 10 мг не влияет на определение олова(П). Результаты валидации методики представлены в табл 19

Таблица 19

Валидация методики определения олова(П) в модельных смесях

Валидируемые параметры Результаты

Правильность Введено олова(П), мкг Найдено олова(П), мкг

0,8 0,8 ±0,1

2,0 2,1 ±0,2

4,1 3,9 ±0,3

6,1 6,3 ± 0,3

8,1 7,6 ± 0,5

10,0 10,2 ± 0,3

20,0 19,9 ±0,2

30,0 29,9 ± 0,7

40,0 39,5 ±0,6

50,0 49,8 ±0,6

Воспроизводимость Стандартное отклонение в = 0,18 (п = 9, Р = 0,99)

Линейность у = 0,12+ 0,01 (г = 0,9974)

Диапазон линейности 1,6-6,4 мкг/мл

Предел обнаружения 0,2 мкг/мл

Полученные данные свидетельствуют о том, что разработанная методика обладает приемлемыми правильностью, воспроизводимостью, поэтому она использована для количественного определения олова(И) в реагенте

Результаты определения олова(Н) в реагенте представлены в табл 20

Таблица 20

Результаты определения содержания 8п(П) в экспериментальных сериях реагента

№ серии Содержание ЭпСП), мкг

Введено 8п(П), мкг Найдено 8п(П), мкг

1 2,5 2,8, 2,1,2,3,2,6

2 6,0 6,8,5,8, 7,9, 8,3, 5,3

3 10,0 13,6,9,8,15,5,9,2,12,1

4 15,0 15,1, 15,3,15,5,15,6,13,6

5 15,0 13,3,13,6,15,5

6 20,0 18,8, 19,8, 14,9, 17,3

7 20,0 20,0, 20,4, 21,5

8 20,0 21,5,19,8,20,7

Таким образом, разработана простая, точная и воспроизводимая методика спектрофотометрического определения олова(И) в реагенте для приготовления радиофармпрепарата «ОЭДФ,99гаТс»

Для доказательства правильности разработанной спектрофотометрической методики определения олова(Н) в реагенте мы использовали метод ИТ.

Разработаны методики определения олова(П) в реагенте с помощью метода индикаторных трубок по градуировочному графику и методу добавок Обобщенные результаты определения олова(Н) в реагенте, полученные различными методами представлены в табл 21

Таблица 21

Результаты определения 8п(П) в реагенте для приготовления РФП «ОЭДФ,"тТс» различными методами

№ серии Введено ЭпСП), мкг Найдено БпШ), мкг/фл

Индикаторные трубки Спектрофотометрическая «рениевая» методика

градуировоч ный график метод добавок

1 2 3 4 5

4 15,0 14,0 ±3,5 14,7, 14,5, 17,5 15,1,15,3,15,5

5 15,0 15,7 ±4,0 12,3, 17,5, 12,8 13,3,13,6,15,5

6 20,0 23,6 ±3,4 20,0, 21,0, 18,3 18,8,19,8,17,3

7 20,0 21,6 ±2,7 20,0, 19,6,20,8 20,0,20,4,21,5

8 20,0 21,4 ±2,0 21,7, 20,4, 19,6 21,5,19,8,20,7

Примечание к табл 21 Каждая цифра в колонках 4, 5 в таблице соответствует результату анализа одного флакона с реагентом

Данные, полученные методом индикаторных трубок хорошо согласуются с результатами спектрофотометрической методики тех же серий реагента, что подтверждает правильность и хорошую воспроизводимость разработанной методики

Испытания стерильности и пирогенности реагента проводили в лаборатории клинической иммунологии ГУ-МРНЦ РАМН. Установлено, что реагенты являются стерильными и апирогенными в течение всего срока годности

Проведено изучение стабильности реагента при хранении при температуре +2-8 °С Хранение реагента в течение 12 месяцев при +2-8 °С в условиях холодильника не изменяет его химических свойств Проведено изучение хранения реагента в течение 14 суток при температуре от +18 до +20 °С. Хранение реагента в указанных условиях не изменяет его свойств.

Характеристики и нормы показателей качества реагента для приготовления препарата «ОЭДФ,99тТс» представлены в табл 22.

Таблица 22

Характеристики и нормы показателен качества реагента для приготовления препарата «ОЭДФ,9'тТс»

Наименование Норма по ФСП

показателей качества

Описание Лиофилизат белого или почти белого цвета

Растворимость Содержимое флакона должно растворяться в 5,0 мл раствора 0,9% №С1 в течение 10 секунд

РН 2,0-3,5

Подлинность А ИК-спектр испытуемого образца в таблетке КВг в области от 4000 до 400 см"1 должен совпадать с прилагаемым рисунком спектра по положению полос и их относительным интенсивностям Б Раствор, приготовленный для количественного определения олова(11), должен быть окрашен в светло-желтый цвет В Образование синего комплекса при взаимодействии реагента с СоСЬ в щелочной среде

Содержание ОЭДФ во флаконе, мг 9,0-11,0

Содержание 8п(П) во флаконе, мкг 17,0-23,0

Стерильность Стерильный

Пирогенность Апирогенный

Хранение В защищенном от света месте при температуре от +2 до +8 °С

Срок годности 12 месяцев

Для приготовления РФП «ОЭДФ,99шТс» во флакон с реагентом вводят шприцем 5 мл раствора пертехнетата натрия,99"1^ из генератора Флакон с содержимым энергично встряхивают в течение 30 минут до полного растворения реагента Препарат готов к применению по истечении указанного времени

При контроле качества РФП определяли те параметры, которые могут изменяться при его приготовлении, а именно. рН и РХП - относительную активность 99шТс, не связанного с ОЭДФ

Препарат представляет собой прозрачный бесцветный раствор Разработаны методики тонкослойной и бумажной хроматографии определения относительной активности РХП - не связанного №9 тТс04 в РФП В работе использованы следующие хроматографические системы. 85%-ный метанол, метилэтилкетон, ацетон - метанол (1 1), ацетон - вода (95 5) В качестве неподвижной фазы использованы бумага «Рйгак» Ш 17 и пластины для ТСХ «БоЛА!»

Оптимальной системой для определения свободного Ыа"тТс04 является система ацетон - вода (95 5) В данной системе пятно свободного На"шТс04 идет с фронтом растворителя компактно, присутствие «хвостов» минимально, в то время как РФП остается на старте Величина для №99тТс04 составляет 0,94 ± 0,07, для РФП 0-0,1 Относительная активность радиохимической примеси в препарате не превышала 5%

Характеристики и нормы показателей качества препарата «0ЭДФ,99шТс» представлены в табл. 23.

Таблица 23

Характеристики и нормы показателей качества препарата «ОЭДФ,55тТс»

Наименование Норма по ФСП

показателей качества

Описание прозрачный бесцветный раствор

РН 2,0-3,5

Радиохимическая примесь, % 59тТсОГ не более 5,0%

Срок годности 5 часов

Функциональную пригодность исследовали в лаборатории экспериментальной ядерной медицины ГУ - МРНЦ РАМН При изучении функциональной пригодности препарата «ОЭДФ,99тТс» в качестве препарата сравнения брали его функциональный аналог «Технефор, 99гаТс», получаемый из реагента путем введения элюата 99шТс во флакон с реагентом Содержимое флакона перемешивали в течение 15-20 минут

Радиофармпрепараты «Технефор, 99тТс» и «ОЭДФ,99шТс» вводили крысам в хвостовые вены по 1,7 МБк в объеме 0,1 мл Через определенные интервалы времени (5 мин, 1, 3, 6, 12 и 24 часа) животных забивали декапитацией, брали кровь, органы и ткани, взвешивали и радиометрировали Данные радиометрии использовали для расчетов содержания меченых препаратов в органах и тканях крыс (в процентах от введенного количества препарата) (табл 24)

Таблица 24

Соотношение уровней «ОЭДФ,Ип1Тс» и «Технефор, "тТс» кость/мышца, кость/кровь в организме интактных крыс после их однократного внутривенного введения (в % от введенного количества)

Время после инъекции ОЭДФ®тТс Технефор, 99тТс

кость/мышца кость/кровь кость/мышца кость/кровь

5 мин 0,32 0,45 0,22 - 0,38

1ч 2,33 4,16 2Г,47 3,46

Зч 9,76 20,68 9,71 8,84

6ч 10,08 20,82 11,68 16,60

12 ч 23,96 59,91 26,72 18,50

24 ч 20,54 35,68 22,30 17,15

Поглощение костной тканью радиофармпрепаратов «ОЭДФ,99тТс» и «Технефор,99тТс» было высоким уже через 1 час после их введения и оставалось таковым в течение 24 часов Величина соотношения кость/мышца возрастала через 1 час после введения для обоих меченых препаратов и достигала максимума к 12 часам. Аналогичная тенденция наблюдалась и для соотношения кость/кровь, однако абсолютные величины содержания «ОЭДФ,"тТс» были выше, чем у «Технефор, тТс» во все сроки исследования Почечный клиренс препарата «ОЭДФ,99тТс» оказался очень высоким, что подтвердилось большим содержанием РФП в моче уже в

ранние сроки- к 4 ч выводилось около 50-55%, а к 24 ч - более 60% РФП

Положительными характеристиками исследованных препаратов является их чрезвычайно низкие (следовые) количества как в щитовидной железе, так и в головном мозге Таким образом, препарат «ОЭДФ,99гаТс» обладает высокой степенью тропности к костной ткани и может быть рекомендован к использованию для радио-нуклидного исследования костной патологии

Проведено изучение стабильности реагента при хранении в течение 12 месяцев при температуре +2-8 °С Проведено изучение стабильности реагента при хранении в течение 14 суток при комнатной температуре Хранение реагента при указанных условиях не изменяет радиохимических и биологических свойств полученного радиофармпрепарата

Срок годности РФП установлен исходя из периода полураспада радионуклида (6,01 часа), радиохимического и биологического поведения препарата, испытанного в различные сроки после его приготовления. Срок годности препарата составляет 5 часов

На основании токсикологических исследований препарата «ОЭДФ,99шТс», проведенных в соответствии с «Общими методическими указаниями по экспериментальным исследованиям новых радиофармацевтических препаратов» (1990 г), установлено, что при введении крысам в клинической дозе он является безвредным Препарат стерилен, апирогенен, не вызывает местных реакций на введение

5. Краткое обсуждение итогов работы

За рубежом РФП получают на радиофармацевтическом предприятии, минуя стадию нерадиоактивного реагента, и затем доставляют в радиологические клиники («ready-for-use radiopharmaceuticals»), а в России РФП готовят непосредственно в клинике из нерадиоактивного реагента и пертехнетата натрия, Тс из генератора («kits or in-house radiopharmaceuticals») Основное отличие «ready-for-use radiopharmaceuticals» от «in-house radiopharmaceuticals» заключается в том, что первые проходят контроль качества после их изготовления в ОТК завода-изготовителя, а качество вторых - не контролируют после их приготовления в клинике, кроме определения объемной активности Поэтому должна быть велика степень ответственности у производителелей генераторов 99мТс и производителей реагентов за качество производимой продукции

Проведенные исследования реагентов и приготавливаемых из них радиофармпрепаратов свидетельствуют о том, что для получения высокого и воспроизводимого качества и эффективности РФП необходимо выполнение правил GMP при получении субстанций и реагентов, GRP - при приготовлении препаратов в клинике и GLP - для обеспечения качества результатов аналитического контроля субстанций, реагентов и РФП

Поскольку российской особенностью радиофармпрепаратов, получаемых из генераторных радионуклидов (в том числе и РФП с "мТс), является трехстадийность их приготовления субстанция -»реагент -»РФП, то и анализ проходит по тем же этапам

При производстве реагентов для РФП крайне важно, чтобы используемые субстанции были очень высокого качества. Если в субстанции присутствуют примеси неорганического или органического характера, то это приводит к получению препарата, содержащего значительное количество невосстановленного Тс или к изменению соотношений между образующимися в растворе комплексными соединениями радионуклида и в обоих случаях к изменению биологического

поведения препарата, следовательно, к получению неверной диагностической информации.

Были определены показатели в субстанциях, которые необходимо контролировать, чтобы получить качественный РФП, приготовленный на их основе. Разработанные методики легли в основу Стандартов предприятия ГУ- МРНЦ РАМН «Микросферы альбумина(МСА)», «Оксиэтилидендифосфоновая кислота (ОЭДФ)».

Анализ реагентов для приготовления РФП с Тс не описан в зарубежных фармакопеях Поэтому необходимо было обосновать и сформулировать основные принципы и критерии оценки качества нерациоактивных реагентов и получаемых из них радифармпрепаратов

Важной особенностью реагента является малое содержание компонентов во флаконе (от нескольких микрограммов до десятков миллиграммов) В связи с этим требовалость разработать высокочувствительные методики определения компонентов, входящих в состав реагента. Другой особенностью реагента является то, что при количественном определении любого компонента реагента мы фактически определяем показатель «однородность дозирования», так как анализу подвергается содержимое одного флакона. Еще одной важной российской особенностью получения РФП через реагент является то, что анализу подвергается нерадиоактивный реагент и поэтому облучение персонала не происходит За рубежом же анализируют радиоактивный препарат.

Были разработаны схемы химико-фармацевтического анализа реагентов Одним из важнейших показателей качества реагента является содержание олова(Н) в реагенте, которое, определяет качество радиофармпрепарата, а именно эффективность мечения и, соответственно, относительную активность радиохимической примеси Еще одной особенностью реагента является то, что определение олова(П) в нем является сложной задачей, поскольку содержание Sn(II) в реагенте очень мало (-10-20 мкг), олово(Н) легко окисляется кислородом воздуха и гидролизуетея в присутсвии влаги Были разработаны унифицированные методики определения олова(И) для всех трех исследованных реагентов для приготовления РФП- «Микросферы альбумина, 99мТс», «Альбумин, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс».

В России РФП с "мТс готовят в клинических условиях из реагентов, а элюат 99мТс, получаемый из генератора 99Мо/"мТс, является одновременно растворителем для реагента и исходным раствором радионуклида

В клинике получение элюата 99мТс из генератора и приготовление РФП должно проходить при соблюдении правил GRP, которые во многом сходны с правилами GMP, но существует и много различий, связанных с радиоактивной природой веществ, с которыми приходится работать. Одной из главных отличительных черт работы по правилам GRP является то, что в «чистом» помещении должно быть «отрицательное» давление по отношению к окружающему пространству, чтобы ни при каких обстоятельствах не произошло его радиоактивное загрязнение (производство по правилам GMP требует в данных помещениях «положительного» давления)

Важной особенностью РФП с ""Тс является то, что они не оказывают фармакологического действия на организм, который можно было бы оценить существующими, методами, поскольку 1) в реагенте находится малое содержание компонентов (от нескольких микрограммов до десятков миллиграммов), 2) обычно препарат вводится пациенту однократно

Сроки годности РФП с 99мТс малы - несколько часов, поэтому при контроле качества препаратов должны преимущественно использоваться экспресс-методы, а

также методы, позволяющие надежно контролировать показатели качества при минимальных объемах проб

Основными показателями качества РФП является объемная активность, относительная активность радиохимических примесей, которые не являются постоянными величинами и изменяются в течение срока годности препарата Поэтому количественное значение этих показателей должно быть жестко связано со временем изготовления РФП и элюирования 99шТс из генератора. Разработана унифицированная ТСХ методика определения РХП - «относительной активности радиохимической примеси» несвязанного Ыа99гаТс04 в РФП

При разработке маркировки следует придерживаться правила маркировка первичной упаковки РФП (как правило, флакон для лекарственных средств) должна содержать минимум информации в целях обеспечения минимальной лучевой нагруки на глаза медперсонала Полная информация о любом РФП содержится в паспорте на препарат и в инструкции по медицинскому применению

Поскольку в клинике анализ приготовленных РФП с "тТс перед их введением пациенту не проводится, то при разработке методов контроля качества субстанций, реагентов и РФП мы стремились найти корреляцию результатов физико-химического и радиохимического анализа с данными биологических испытаний на животных Полученные данные позволяют сделать вывод о том, что именно от содержания 8п(И) в реагенте зависит относительное количество РХП в препарате и его накопление в органе - мишени Установлена зависимость между аналитическими и биологическими показателями качества для препарата «Микросферы альбумина, 99мТс»

В заключение несколько слов об обеспечении качества результатов аналнза Все исследования по разработке методик анализа субстанций, реагентов и РФП были проведены с учетом правил вЬР А именно разработанные методики были провалидированы, чтобы удостовериться в том, что они дают результаты, достаточно надежные и воспроизводимые для предлагаемой области определения Валидацию методик осуществляли по следующим показателям правильность, воспроизводимость, устойчивость растворов, специфичность, линейность, диапазон линейности, предел обнаружения

Внутрилабораторный контроль качества результатов осуществляли путем анализа стандартных растворов, модельных смесей, холостых проб, реальных проб, аттестованных стандартных образцов Каждую пробу анализировали не менее 3 раз. Обработку результатов осуществляли с помощью методов математической статистики

Для проверки достоверности результатов физико-химического анализа, полученных при использовании разработанных методик по определению олова(И), проводили межлабораторные испытания в 5 учреждениях Было установлено, что разработанные методики определения олова(П) являются правильными и воспроизводимыми

ВЫВОДЫ

1 На основании проведенных систематических экспериментальных исследований обоснованы и сформулированы основные принципы и критерии оценки качества нерадиоактивных реагентов и получаемых из них радифармпрепаратов Полученные результаты можно рассматривать как общее методологическое направление при создании новых радиофармпрепаратов на основе генераторных радионуклидов

2 Разработаны схемы полного фармацевтического анализа новых отечественных препаратов для радионуклидной диагностики и реагентов для их получения «Микросферы, 99мТс», «Альбумин,"мТс», «ОЭДФ,?9мТс» Проведено комплексное изучение физико-химических и радиохимических свойств реагентов и препаратов

Разработаны схемы анализа субстанций MCA, MCA(Sn) и ОЭДФ, являющихся промежуточными и основными компонентами реагентов для приготовления РФП «Микросферы альбумина, "мТс» и «ОЭДФ,99мТс», соответственно Обоснован выбор показателей качества субстанций, которые необходимо контролировать, и разработаны аналитические методики их определения. Установлены нормы показателей качества субстанций MCA, MCA(Sn) и ОЭДФ.

3 Разработаны методики качественного и количественного анализа для субстанций, реагентов и получаемых из них радиофармпрепаратов «Микросферы, 99мТс», «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,"мТс».

4 Разработана унифицированная спектрофотометрическая методика определения олова(И) в следующих объектах, в реагентах для приготовления РФП «Альбумин,""Тс», «ОЭДФ,""Тс», в хлориде олова(И), в постадийном контроле технологии получения MCA(Sn) Методика основана на восстановлении рения(УИ) оловом(Н) до рения(1У) с последующим взаимодействием последнего с роданид-ионами с образованием окрашенного комплекса

Разработана унифицированная спектрофотометрическая методика количественного определения Sn(II) в MCA(Sn), в реагентах для приготовления РФП «Микросферы альбумина, 99мТс» и «Альбумин, 9 мТс» по реакции восстановления оловом(П) железа(Ш) в присутствии о-фенантролина

5 Разработана унифицированная, экспрессная, хорошо воспроизводимая, дешевая, простая в исполнении, не требующая дорогостоящего оборудования, лабораторных условий и профессионально подготовленных пользователей методика определения олова(Н) с помощью индикаторных трубок в реагентах для приготовления РФП «Альбумин,99"^», «ОЭДФ,"мТс» Методика может быть использована в радиологических клиниках для проверки качества реагента перед приготовлением РФП или для проверки качества РФП

6 Разработана унифицированная методика количественного определения общего олова в MCA(Sn) и в реагенте для приготовления РФП «Альбумин, 99мТс», основанная на разрушении MCA(Sn) или альбумина, соответственно, «мокрым» сжиганием в присутствии окислителя с последующим определением с пирокатехиновым фиолетовым

7 Исследована стабильность свойств субстанций, реагентов и радиофармпрепаратов в процессе хранения

8 Установлена корреляция результатов химико-фармацевтического и радиохимического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов

9 Разработаны Стандарты предприятия ГУ МРНЦ РАМН «Микросферы альбумина» (СТП 19-01, от 08 05 2001 г), «ОЭДФ, субстанция» (СТП-32-05 от 14 04.2005 г) Разработаны ФСП на препараты «Микросферы альбумина, "мТс» (ФСП 42-01670477-00), «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,"мТс» и реагенты для их получения

Список основных работ по теме диссертации

1. Epstein N В , Potapova Z.M, Kharitonov Yu Ya, Kharlamov V.T, Khleskov VI, Petriev V M, Skvortsov V G Protein determination m human serum albumin microspheres with and without attached stannous ions // Pharmaceutical and Pharmacological Letters - 1995 - V. 5, N. 3-P. 98-100

2 Potapova Z M, Epstein N В , Starovoytova L P , Kharitonov Yu Ya, Khleskov VI, Kharlamov V T, Skvortsov V G Quality control of 99m-Tc-labelled microspheres for studies of the pulmonary blood circulation II Pharmaceutical and Pharmacological Letters.- 1995 -V 5,N 4 - P 135-138

3 Цыб А Ф, Эпштейн H Б, Скворцов В Г, Харитонов 10 Я, Потапова 3 М, Петриев В М, Старовойтова Л П., Дешевой Ю Б., Павлов Е П, Хлесков В И, Корсунский В Н Новый отечественный препарат для перфузионной сцинтиграфии легких - микросферы альбумина, меченные технецием-99м // II Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М, 1995 - С 270

4. Потапова 3 М, Харитонов Ю Я, Эпштейн Н Б , Петриев В М, Скворцов В Г , Хлесков В И Контроль качества микросфер альбумина, меченных технецием-99м, для радиоизотопной диагностики легких // Российская национальная конференция «Формирование приоритетов лекарственной политики» - М, 1995 -С 136-138

5 Цыб А Ф., Петриев В М, Эпштейн Н Б, Потапова 3 М, Старовойтова Л П, Мартьянов Б М, Скворцов В Г, Харитонов Ю Я, Хлесков В И Микросферы альбумина, меченные технецием-99м, для диагностики рака легких II Всероссийская конференция «Опухоли висцеральных локализаций, ранняя диагностика, профилактика, лечение». - Томск, 1995 - С 256-257

6 Старовойтова Л П, Эпштейн Н Б., Потапова 3 М, Мартьянов Б М, Паша С П и др Новый отечественный препарат для перфузионной сцинтиграфии легких // Вестник рентгенологии и радиологии,- 1996 - № 4, с 47-48

7 Старовойтова Л П, Потапова 3 М, Эпштейн Н Б, Мартьянов Б М, Паша С.П, и др. Экспериментальное изучение микросфер альбумина, модифицированных двухлористым оловом -99мТс, МСА, предназначенных для сцинтиграфии легких // Медицинская радиология и радиационная безопасность - 1997 - т 42, № 3 - с 23-26

8 Potapova Z.M, Epstein N В , Kharitonov YuYa, Starovoytova L P , Khleskov VI et all Stannous ions determination in human serum albumin microspheres with attached stannous ions // Pharmaceutical and Pharmacological Letters - 1998.- V. 8, № 3 - P 103 -105.

9 Потапова 3 M , Эпштейн H Б , Харитонов Ю Я , Старовойтова Л П, Хлесков В И и др Спектрофотометрическое определение Sn(II) в микросферах альбумина, модифицированных двухлористым оловом, предназначенных для сцинтиграфии легких // Медицинская радиология и радиационная безопасность - 1998 т 43, № 5- с. 52-56

10 Morosanova Е., Vehkorodny A, Marchenko D, and Epstem N Length-of-Stam Indicator Tubes for Pharmaceutical and Clinical Analysis // Chimia.- 1998.- V 52, № 7/8 - P. 361

11 Эпштейн Н Б, Потапова 3 М„ Скворцов В Г, Побережная О Н. Разработка методов контроля качества реагента и приготовляемого на его основе препарата 99мТс-альбумин // Международная конференция «Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики» - Обнинск, 2000.- С. 57.

12 Эпштейн Н Б, Скворцов В.Г, Цыб А Ф. Экспресс-определение олова(И) в реагентах для приготовления РФП // VIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». - М, 2001 - С 701

13 Эпштейн Н Б, Потапова 3 М, Халитова А.И Определение радиохимических примесей в РФП 99мТс-альбумин // Медицинская физика.- 2001, №11 -С. 34.

14 Эпштейн НБ, Янкова В Г, Скворцов В Г, Томчани OB., Харитонов ЮЯ Контроль качества реагента и РФП <<"мТс-альбумин» // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство».- М,, 2002. - С 728

15 Эпштейн Н Б, Терехова Т В, Скворцов В Г, Харитонов Ю Я, Хорохорина В.А Контроль качества реагентов и радиофармпрепарата "тТс-ОЭДФ // IX Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» - М, 2002. - С 728.

16 Эпштейн Н Б , Янкова В Г, Скворцов В Г, Харитонов Ю Я Анализ реагента и РФП «99мТс-альбумин» // Ядерная медицина в XXI веке: клинические и методические аспекты использования радиофармацевтических препаратов на основе 99мТс Тез докл Дубна, 2002 - С 74.

17 Моросанова ЕИ, Эпштейн НБ Индикаторные трубки для экспрессного определения олова(П) в радиофармпрепаратах // Ядерная медицина в XXI веке клинические и методические аспекты использования радиофармацевтических препаратов на основе 99мТс. Тез докл Дубна, 2002 - С 69-70

18 Epstein N В, Yankova V.G, Skvortsov V G, Kharitonov Yu Ya. Quality Control of 99mTc-Labeled Human Serum Albumin for Studies of the Haemodynamics // The Third Russian-Japanese Seminar on Technetium - Dubna, 2002 - P 156-157

19 Morosanova E, Epstein N. Indicator Tubes for Control of Radiopharmaceuticals II The Third Russian-Japanese Seminar on Technetium - Dubna, 2002 - P 158

20 Эпштейн H Б, Терехова T В , Харитонов Ю.Я, Скворцов В Г., Перевезенцева А А Контроль качества субстанции оксиэтилидендифосфоновой кислоты, используемой при приготовлении радиофармпрепарата для исследования костной патологии // Третий международный конгресс «Энергетика-3000». --Обнинск, 2002 -С 132-133.

21 Эпштейн Н Б, Янкова В Г, Моросанова Е И., Скворцов В Г., Харитонов Ю Я., Магомедова 3 У. Определение олова(П) в реагенте для приготовления РФП, применяемого для исследования гемодинамики // Третий международный конгресс «Энергетика-3000» - Обнинск, 2002. - С 128-130

22. Эпштейн Н Б, Терехова Т В , Харитонов Ю Я, Скворцов В Г, Перевезенцева A.A. Разработка методик определения и контроля качества субстанции, реагента и радиофармпрепарата «99тТс-ОЭДФ» И Всероссийская научно-техническая конференция «Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики» - Обнинск, 2002 - С 82-83

23 Моросанова Е И, Эпштейн Н Б, Янкова В Г, Магомедова 3 У, Харитонов 10 Я , Скворцов В Г Использование индикаторных трубок для определения олова(П) в реагенте для приготовления радиофармпрепарата «99мТс-альбумин» // Всероссийская научно-техническая конференция «Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики» - Обнинск, 2002 - С. 100-101

24 Эпштейн Н Б , Моросанова Е И, Терехова Т В , Магомедова 3 У, Харитонов Ю Я , Скворцов В Г Анализ радиофармацевтических препаратов с технецием-99м // Международный форум «Аналитика и аналитики» - Воронеж, 2003. - т 2 - С 383

25 Моросанова Е И, Эпштейн Н Б, Магомедова 3 У, Логинова К.А Индикаторные трубки для определения олова(И) в реагентах для генератора технеция-99м // Международный форум «Аналитика и аналитики» - Воронеж, 2003. - т 1 - С 136

26 Эпштейн Н Б , Терехова Т В , Харитонов Ю Я, Скворцов В Г Определение оксиэтилидендифосфоновой кислоты (ОЭДФ) в субстанции и реагенте, используемом для приготовления радиофармпрепарата «99шТс-ОЭДФ(8п)» // Химико-фармацевтический журнал -2003 -т 37 -№5.-С 39-41

27 Morosanova Е I, Epstein N В , Loginova К A. Determination of tin(II) in reagents for radiopharmaceuticals // 10th International Conference «Separations of ionic solutes» -Slovakia, 2003 - P 149

28. Эпштейн H Б , Терехова T В , Харитонов Ю Я, Скворцов В Г. Определение двухвалентного олова в реагенте для получения радиофармпрепарата «99тТс-ОЭДФ»//Химико-фармацевтический журнал -2004 -т 38 -№5 - С 55-56

29. Терехова Т В , Эпштейн Н Б , Харитонов Ю Я, Скворцов В Г Анализ субстанции, реагента и радиофармпрепарата «99тТс-ОЭДФ» // Материалы Международной конференции «Ломоносов-2004». - М, 2004 - т. 1 - С 35

30 Эпштейн Н Б , Моросанова Е.И, Терехова Т В , Харитонов Ю Я, Скворцов В Г Унифицированные методики анализа диагностических радиофармпрепаратов с технецием-99м // Всероссийская конференция «Аналитика России» - М, 2004 -С. 219-220

31 Эпштейн Н Б,Терехова ТВ, Харитонов ЮЯ, Скворцов В Г Методы анализа субстанции оксиэтилидендифосфоновой кислоты (ОЭДФ), используемой для . приготовления РФП для исследования костной патологии П 2 Всероссийская конференция «Аналитические приборы» - Санкт-Петербург, 2005 - С. 143-144.

32 Эпштейн Н Б, Янкова В Г, Терехова Т В, Харитонов Ю,Я , Скворцов В Г Определение радиохимических примесей в диагностических препаратах с "мТс // II Международный симпозиум «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии». - Краснодар, 2005 - С 449

33. Шилина АС, Давыдов ДЮ, Эпштейн НБ., Харитонов ЮЯ Определение олова(П) в радиофармпрепаратах методом потенциометрического титрования // Материалы Международной конференции «Ломоносов-2006» - М, 2006 - т 1 -С. 23.

34. Шилина А С, Гусенков С В., Эпштейн Н Б. Хомушку Г М., Жлоба А А. Определение аскорбиновой кислоты в радиофармпрепаратах методом

потенциометрического титрования // Материалы Международной конференции «Ломоносов-2006» -М,2006 -т 1 -С 21.

35 Epstein NB, Khomushku GM, Shilina AS, Zhloba A A, Kharitonov YuYa, Skvortsov V G Determination of ascorbic acid in radiopharmaceuticals by high performance liquid chromatography // International Congress on Analytical Sciences -Moscow, 2006 - V 2 - P 562-563.

36 Эпштейн H Б., Янкова В Г., Моросанова Е И, Магомедова 3 У, Терехова Т В , Харитонов Ю Я Определение олова в реагентах для приготовления радиофармацевтических препаратов с технецием-99м // Фармация - 2007 - № 1. -С 8-10

37. Маленкина А А, Шилина А С., Эпштейн Н Б Определение констант диссоциации оксиэтилидендифосфоковой кислоты // IV региональная научная конференция «Техногенные системы и экологический риск» - Обнинск, 2007 - С 126-129

38 Эпштейн НБ, Шилина АС, Хомушку ГМ, Харитонов ЮЯ Анализ лиофилизата и радиофармпрепарата на основе ОЭДФ для лечения костных метастазов // II Всероссийская конференция «Аналитика России» (с международным участием).- Краснодар, 2007 - С 458

39. Эпштейн Н Б , Янкова В Г, Харитонов Ю Я Анализ и контроль качества радиофармпрепарата «Альбумин, 9мТс» и реагента для его получения //

Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии - 2008 - №1 С 3-7

40 Эпштейн Н Б, Моросанова Е И, Харитонов Ю Я, Терехова Т В , Скворцов В Г Аналитический

контроль качества радиофармпрепарата «99тТс -ОЭДФ» для радионуклидной диагностики костной патологии // Химико-фармацевтический журнал - 2008. - т 42 -№5.-С 50-56

44 Эпштейн НБ Контроль качества диагностических радиофармацевтических препаратов с технецием-99м//Фармация -2008 - №4 - С 48-51

Эпштейн Наталья Борисовна АВТОРЕФЕРАТ

Компьютерная верстка и выпуск оригинал-макета - Г Б Пильнов Подписано в печать 25 05 2008 г Формат 60х 84/16 Печать - офсетная Печ л 2 8, уч год л 1 Тираж 100 экз № Отпечатано в типографии НПО «Тайфун» Адрес 249038, г Обнинск, пр Ленина, 82

Актуальность работы. Проблема своевременного и точного диагноза остается одной из основных проблем клинической медицины XXI века. В комплексе клинико-инструментальных средств диагностики различных органов и тканей одно из ведущих мест принадлежит радионуклидным (радиоизотопным) методам исследования [1].

Благодаря разнообразию радионуклидов и большому количеству «транспортных средств», доставляющих изотоп к органу-мишени, сегодня можно изучать любую систему организма.

Диагностика с использованием РФП позволяет обнаружить нарушения деятельности органов намного раньше анатомических изменений, выявляемых другими диагностическими тестами (рентген, компьютерная и ЯМР-томография, УЗИ). Такая ранняя диагностика позволяет осуществить раннее лечение, когда оно наиболее эффективно и возможен благоприятный прогноз, что особенно важно при онкологических, кардиологических и неврологических заболеваниях.

К важным преимуществам радионуклидного метода по сравнению с рентгеновским относятся его безопасность, низкие лучевые нагрузки на органы и организм исследуемого, более высокая разрешающая способность, возможность его использования у пациентов с индивидуальной непереносимостью рентгеноконтрастных препаратов [2].

Простота, скорость, безболезненность, надежность диагностики с помощью радиофармпрепаратов заслужили всеобщее признание.

Однако до настоящего времени российские клиники не имеют современных отечественных препаратов для радионуклидной диагностики заболеваний легких, костной системы, исследования гемодинамики. Так, например, применяемые в настоящее время РФП для диагностики легких «Макроагрегаты альбумина, I», «Макроагрегаты альбумина, 99чТс» (Россия) имеют ряд существенных недостатков: • это препараты с нестабильным количеством частиц и их размерами, в то время как одним из основных требований, предъявляемых к диагностическому средству, предназначенному для сцинтиграфии легких, является стабильность размера и количества частиц; • макроагрегаты с 1311 создают высокую лучевую нагрузку на пациента за счет использования "жесткого" у-излучателя иода-131 (Е =364 кэВ, Т1/2=8;05 дня). Лишенный этих недостатков препарат «ТСК-5» (CIS, Франция) практически недоступен для радиологических клиник России из-за высокой стоимости.

Аналогичная ситуация сложилась с РФП для диагностики костей и исследования гемодинамики. Так, в настоящее время российские клиники используют два отечественных препарата с технецием-99м для исследования костной системы - это «Пирфотех» и «Технефор» («Диамед»). Однако накопление этих препаратов в костях - невысокое (около 30-40%). За рубежом имеются РФП, позволяющие осуществлять качественную диагностику костной патологии: «ТСК-14», «ТСК-21» (CIS, Франция); «Techebon» (Hoechst, Германия); MDP (Amersham, Великобритания); Phosphon (Венгрия), «Osteoscan» (Proctor & Gamble, США) и другие. Однако они также являются малодоступными.

Для исследования гемодинамики в России используют препарат «Альбумин,

1 Л |

I» (ФГУП «НИФХИ им. Л.Я. Карпова», Россия). Однако довольно большой период полураспада, "жесткое" у-излучение 1311 и медленное выведение радионуклида из крови затрудняют его применение при повторных диагностических процедурах, а также обуславливают повышенные лучевые нагрузки на организм. Этих трудностей удастся избежать, если в качестве метки для приготовления РФП использовать короткоживущие изотопы, например, 99мТс. Такие препараты за рубежом производят, один из самых известных — это «ТСК-2» (CIS, Франция), но и он малодоступен для российских клиник по указанной ранее причине.

В Медицинском радиологическом научном центре РАМН (ГУ МРНЦ РАМН) разработаны отечественные радиофармпрепараты и реагенты для их приготовления: «Микросферы альбумина, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и «Альбумин, 99мТс» для диагностики заболеваний легких, костной системы и изучения гемодинамики, соответственно.

Современное производство препаратов медицинского назначения в значительной мере определяется состоянием аналитического контроля на всех его стадиях. Выход и качество конечных продуктов зависят не только от строгого соблюдения технологического регламента, от качества сырья, но и от применения надежных аналитических методик постадийного контроля и оценки качества сырья и готовой продукции. Аналитический контроль должен проводиться в полном соответствии с нормативной документацией.

На новые диагностические препараты: «Микросферы альбумина, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и «Альбумин, ""Тс» такая нормативная документация отсутствовала. Отсутствовали также и основные принципы и критерии фармакопейной оценки качества реагентов и получаемых из них радиофармпрепаратов. Это связано с тем, что за рубежом РФП получают на радиофармацевтическом предприятии, минуя стадию нерадиоактивного реагента («kit»), и затем доставляют в радиологические клиники («ready-for-use radiopharmaceuticals»), а в России РФП готовят непосредственно в клинике из нерадиоактивного реагента и пертехнетата натрия,99мТс из генератора («kits or in-house radiopharmaceuticals»). Поэтому анализ реагентов для приготовления РФП с 99мТс не описан в зарубежных фармакопеях.

Работа проводилась в рамках проблемно-тематических планов НИР ГУ МРНЦ РАМН: "Разработка и биологические испытания радиофармпрепаратов на основе альбумина, комплексонов и боросодержащих соединений для диагностики и терапии" (номер государственной регистрации 01.20.0003061), "Разработка радиофар\шрепаратов для диагностики и терапии" (номер государственной регистрации 01.9.40002470), «Разработка и биологические испытания наборов реагентов к генераторам 99мТс и 188Re на основе ксидифона и микросфер альбумина для радионуклидной диагностики и терапии" (номер государственной регистрации 01.20.0407146).

Цель и задачи работы. Исследование посвящено теоретическому и экпериментальному обоснованию разработки основных принципов и критериев анализа радиофармпрепаратов с технецием-99м на примере новых отечественных препаратов «Микросферы альбумина, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс» и «Альбумин, 99мТс» и реагентов для их получения, которые позволили бы проводить контроль их качества и создать нормативную документацию.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Обосновать и сформулировать основные принципы и критерии оценки качества нерадиоактивных реагентов и получаемых из них радифармпрепаратов.

2. Разработать схемы химико-фармацевтического и радиохимического анализа: 1) MCA; MCA(Sn); реагента (смесь MCA(Sn), твина-80 и NaCl); и радиофармпрепарата «Микросферы альбумина, 99мТс»; 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин, 99мТс»; 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ, 99мТс».

3. Изучить физико-химические и радиохимические свойства: 1) MCA; MCA(Sn); реагента; радиофармпрепарата «Микросферы, 99мТс»; 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин, 99мТс»; 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ, 99мТс». ;

4. Разработать методики качественного и количественного анализа для: 1) МСА; MCA(Sn); реагента; радиофармпрепарата «Микросферы, 99мТс»; 2) реагента и радиофармпрепарата «Альбумин-"мТс»; 3) ОЭДФ, реагента и радиофармпрепарата «ОЭДФ-99мТс».

5. Разработать унифицированные методики анализа реагентов и радиофармпрепаратов с технецием-99м.

6. Исследовать стабильность свойств субстанций, реагентов и радиофармпрепаратов в процессе хранения.

7. Установить корреляцию результатов химико-фармацевтического и радиохимического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов.

8. Разработать Стандарты предприятия ГУ МРНЦ РАМН "Микросферы альбумина", «ОЭДФ, субстанция».

9. Разработать ФСП на препараты "Микросферы альбумина, 99мТс", «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,99мТс» и реагенты для их получения.

Научная новизна. Впервые разработаны способы и методики полного фармацевтического анализа и оценки качества новых отечественных препаратов 4 1 для радионуклидной диагностики: "Микросферы альбумина, мТс», «Альбумин, 99мТс»; «ОЭДФ, 99мТс» и реагентов для их получения.

Впервые разработаны экспрессные тест-методы, анализа, с использованием индикаторных трубок для определения Sn(II) в реагентах для приготовления РФП.

Разработаны унифицированные методы анализа субстанций, реагентов и РФП с технецием-99м.

Разработаны методики количественного определения компонентов в постадийном контроле синтеза MCA(Sn).

Установлена корреляция результатов химико-фармацевтического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов.

Практическая значимость работы. Разработаны ФСП на препараты "Микросферы альбумина, 99мТс» (ФСП 42-01670477-00), «Альбумин, 99мТс»; «ОЭДФ, 99мТс» и реагенты для их получения. Разработаны Стандарты предприятия (ГУ МРНЦ РАМН) "Микросферы альбумина" (СТП 19-01, от 08.05.01 г.), «ОЭДФ, субстанция» (СТП-32-05 от 14.04.05 г.).

Материалы работы вошли в документацию, на основании которой издан Приказ МЗ РФ № 128 от 30.04.97 г. о разрешении клинического применения препарата "Микросферы альбумина, 99мТс» (регистрационное удостоверение 97/128/7).

Результаты работы по определению олова(П) методом индикаторных трубок вошли в документацию при получении свидетельства о государственной метрологической аттестации УНИИМ Госстандарта РФ ТС-224.09/009-2004 на индикаторные трубки для фирмы ООО «МедЭкоТест» (Москва).

Методики оценки качества препаратов "Микросферы альбумина, 99мТс», «Альбумин, 99мТс», «ОЭДФ, 99мТс», реагентов для их приготовления; МСА, MCA(Sn), ОЭДФ внедрены в лабораторию технологии и методов контроля радиофармпрепаратов ГНЦ РФ-Институт биофизики и в лабораторию экспериментальной ядерной медицины ГУ МРНЦ РАМН.

Апробация работы. Результаты, работы представлены на II, VIII, IX Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (Москва, 1995, 2001, 2002), Российской национальной конференции "Формирование приоритетов лекарственной политики" (Москва, 1995), Всеросийской конференции "Опухоли висцеральных локализаций: ранняя диагностика, профилактика, лечение" (Томск, 1995), Международном конгрессе «Euroanalysis X» (Базель, Швейцария, 1998), Международных конференциях «Современные проблемы ядерной медицины и радиофармацевтики» (Обнинск, 2000, 2002), I Евразийском конгрессе «Медицинская физика 2001" (Москва, 2001), III Российско-японском семинаре по технецию (Дубна, 2002), III Международном конгрессе «Энергетика-3000» (Обнинск, 2002), Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003), X Международной конференции «Separations of ionic solutes» (Братислава, Словакия, 2003), Международных конференциях «Ломоносов 2004», «Ломоносов 2006» (Москва, 2004, 2006), Всероссийской конференции «Аналитика России» (Москва, 2004), II Всероссийской конференции «Аналитические приборы» (Санкт-Петербург, 2005), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005), Международном конгрессе по аналитической химии «ICAS-2006» (Москва, 2006), XXXI годичной сессии научного совета РАН по аналитической химии (Звенигород, 2006), Международной научной сессии "Ядерная медицина и радиофармацевтика" (Обнинск, 2006)

Публикации. Основные результаты работы изложены в печатных работах.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ

1. На основании проведенных систематических экспериментальных исследований обоснованы и сформулированы основные принципы и критерии оценки качества нерадиоактивных реагентов и получаемых из них радифармпрепаратов.

Полученные результаты можно рассматривать как общее методологическое направление при создании новых радиофармпрепаратов на основе генераторных радионуклидов.

2. Разработаны схемы полного фармацевтического анализа новых отечественных препаратов для радионуклидной диагностики и реагентов для их получения: «Микросферы, 99мТс», «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,99мТс». Проведено комплексное изучение физико-химических и радиохимических свойств реагентов и препаратов.

Разработаны схемы анализа субстанций: MCA, MCA(Sn) и ОЭДФ, являющихся промежуточными и основными компонентами реагентов для приготовления РФП «Микросферы альбумина, 99мТс» и «ОЭДФ,99мТс», соответственно. Обоснован выбор показателей качества субстанций, которые необходимо контролировать, и разработаны аналитические методики их определения. Установлены нормы показателей качества субстанций MCA, MCA(Sn) и ОЭДФ.

3. Разработаны методики качественного и количественного анализа для субстанций, реагентов и получаемых из них радиофармпрепаратов: «Микросферы, 99мТс», «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,99мТс».

4. Разработана унифицированная спектрофотометрическая методика определения олова(П) в следующих объектах: в реагентах для приготовления РФП «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,99мТс», в хлориде олова(Н), в постадийном контроле технологии получения MCA(Sn). Методика основана на восстановлении рения(УИ) оловом(Н) до рения(1У) с последующим взаимодействием последнего с роданид-ионами с образованием окрашенного комплекса.

Разработана унифицированная спектрофотометрическая методика количественного определения Sn(II) в MCA(Sn), в реагентах для приготовления РФП "Микросферы альбумина, 99мТс" и "Альбумин, 99мТс" по реакции восстановления оловом(И) железа(Ш) в присутствии о-фенантролина.

5. Разработана унифицированная, экспрессная, хорошо воспроизводимая, дешевая, простая в исполнении, не требующая дорогостоящего оборудования, лабораторных условий и профессионально подготовленных пользователей методика определения олова(П) с помощью индикаторных трубок в реагентах для приготовления РФП: «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,99мТс». Методика может быть использована в радиологических клиниках для проверки качества реагента перед приготовлением РФП или для проверки качества РФП.

6. Разработана унифицированная методика количественного определения общего олова в МСА(8п) и в реагенте для приготовления РФП "Альбумин, 99мТс", основанная на разрушении МСА(8п) или альбумина, соответственно, "мокрым" сжиганием в присутствии окислителя с последующим определением с пирокатехиновым фиолетовым.

7. Исследована стабильность свойств субстанций, реагентов и радиофармпрепаратов в процессе хранения.

8. Установлена корреляция результатов химико-фармацевтического и радиохимического анализа с данными биологических испытаний радиофармпрепаратов.

9. Разработаны Стандарты предприятия ГУ МРНЦ РАМН «Микросферы альбумина» (СТП 19-01, от 08.05.2001 г), «ОЭДФ, субстанция» (СТП-32-05 от 14.04.2005 г). Разработаны ФСП на препараты «Микросферы альбумина, 99мТс» (ФСП 42-01670477-00), «Альбумин,99мТс», «ОЭДФ,99мТс» и реагенты для их получения.