Автореферат и диссертация по фармакологии (15.00.02) на тему:Аналитическая химия нового отечественного препарата для радионуклидной диагностики заболеваний легких

РГ б од

На правах рукописи УДК 615.074:543+615.015+616.024

ЭПШТЕЙН Наталья Борисовна

АНАЛИТИЧЕСКАЯ ХИМИЯ НОВОГО ОТЕЧЕСТВЕННОГО ПРЕПАРАТА ДЛЯ РАДИОНУКЛИДНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЗАБОЛЕВАНИЙ ЛЕГКИХ

15.00.02 - фармацевтическая химия и фармакогнозия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук

Москва - 1996

Работа выполнена в Медицинском радиологическом научном цен Российской Академии медицинских наук

Научные руководители:

доктор химических наук, профессор Ю.Я. Харитонов кандидат биологических наук В.Г. Скворцов

Научный консультант:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор А.Ф. Цыб

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, профессор A.C. Берлянд кандидат химических наук Е.И. Моросанова

Ведущее учреждение:

Всероссийский научный центр по безопасности биологически активных веществ, Купавна

Защита диссертации состоится ". " сиоил 1996 [

в часов на заседании диссертационного совета Д.074.05.0

Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: г. Москва, Суворовский бульвар, д. 13

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ММА им. И.М. Сеченова (г. Москва, Зубовская площадь, д. 1)

Автореферат разослан 74* " хЛСОЛ_1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д.074.05.06 кандидат фармацевтических наук, доцент Н.П. Садчь

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В комплексе клинико-инструментальных ¡дств диагностики различных патологических процессов одно из веду-х мест принадлежит радионуклидным (радиоизотопным) методам. Ос-¡ное достоинство методов ядерной медицины состоит в способности ¡давать (на качественном и количественном уровнях) изображения, «ктеризующие динамику физиологических процессов в организме. 1 методы относительно просты и точны, практически безопасны для 1ьного. Методики радионуклидной диагностики сопровождаются вве-нием пациенту радиофармацевтических препаратов (РФП), что обу-звливает лучевые нагрузки, не превышающие допустимых величин и жые (или даже ниже) дозе облучения больного при выполнении одно-рентгеновского снимка.

Комплекс радионуклидных исследований при заболеваниях легких 1ючает определение одного из важнейших показателей их функцио-1ьной способности - артериального кровотока (перфузии).

До настоящего времени отечественные клиники не имеют надежного своим характеристикам отечественного препарата для перфузионной 1нтиграфии легких. Данный метод получения изображения основан на зменной блокаде артериокапиллярного русла легких частицами, ченными радиоактивными изотопами, с последующей регистрацией эбражения на гамма-камере. На сцинтиграмме легких практически эрового человека отмечается равномерное распределение радиоак-зного препарата, полученное изображение имеет одинаковую интен-зность. При заболеваниях легких сцинтиграфическая картина зависит с от локализации и размеров основного патологического очага, так и от иенений в остальных участках легкого.

Сканирование легких применяется для исследования больных с эм-пией легочной артерии, инфарктом легкого, новообразованиями в лег-

воспалением легких, бронхиальной астмой и другими заболевания-

Диагностическое средство, предназначенное для сцинтиграфии лег-<, должно отвечать определенным требованиям.

Размер и число частиц должны быть стабильными. Известно, что здний диаметр легочного капилляра составляет 8,2 мкм, поэтому для окирования капиллярной сети необходимо вводить частицы, размер горых превышает диаметр просвета капилляра. Оптимальными для ви-злизации легких являются частицы с диаметром 10-35 мкм, которых лжно быть не менее 95% среди частиц всех других размеров. Для по-^ния отчетливой сцинтиграммы легких достаточно заблокировать 0,1% общего числа капилляров легких, т.е. ввести 200-300 тысяч частиц.

Препарат должен:

- обладать высокой специфичностью к поглощению и фиксации в гких (не менее 95% от введенной активности РФП) настолько, чтобы ружающие органы и ткани не влияли на изображение исследуемого ана и не облучались;

-2- поглощаться из крови легкими, чтобы получалось максимал! отношение орган/фон по радиоактивности;

- содержать радионуклид, не связанный с препаратом, не более I радиохимическая примесь (РХП);

- подвергаться биологическому разложению и выведению из с низма за определенное (воспроизводимое) время;

- обеспечивать создание минимальных лучевых нагрузок на пац

та;

- характеризоваться безвредностью, стерильностью и апироге стью;

- быть недорогим и доступным.

В Медицинском радиологическом научном центре РАМН (г. Обне совместно с Федеральным научным центром "Институт биофизики" МП РФ (г. Москва) разработан новый отечественный препарат для фузионной сцинтиграфии легких - "Микросферы альбумина, 99м (99м-Тс-МСА(Бп)).

Современное производство препаратов медицинского назначен значительной мере определяется состоянием аналитического конт| на всех его стадиях. Выход и качество конечных продуктов завися только от строгого соблюдения технологического регламента, от каче сырья, но и от применения надежных аналитических методик постади го контроля и оценки качества сырья и готовой продукции. Ан тический контроль должен проводиться в полном соответствии с но| тивно-технической документацией. На указанный новый диагностиче препарат "Микросферы альбумина, 99м-Тс", требования к кото| кратко охарактеризованы выше, такая нормативная документация oi ствовала и для ее создания требовалось проведение комплекса иссл ваний.

Работа выполнена в рамках плана научных исследований М РАМН по проблеме "Разработка новых радиофармпрепаратов для t ностики и терапии, их физико-химическое и радиобиологическое со вождение" (N гос. регистрации 01.9.10008411) и "Разработка ра фармпрепаратов для диагностики и терапии" (N гос. регистр; 01.9.40002470).

Цель и задачи работы. Исследование посвящено разработке собов и методик анализа препарата "Микросферы альбумина, 99м-1 реагента для его получения, которые позволили бы проводить конт их качества и создать нормативно-техническую документацию.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить дующие задачи:

- изучить физико-химические свойства микросфер альбумина (IV а также микросфер альбумина, модифицированных оловом(И) (МСА( реагента, препарата 99M-Tc-MCA(Sn);

- разработать способы и методики качественного и количествеь анализа MCA, MCA(Sn), реагента к генератору 99-Мо/99м-Тс (с MCA(Sn), твина-80 и хлорида натрия), препарата "Микросферы аль£ на, 99м-Тс";

- разработать методики количественного определения олова общего олова для поэтапного контроля технологии получения MCA(S

- установить оптимальное количество олова(М), которое требуется вязать с МСА в технологии получения MCA(Sn), чтобы обеспечить мак-имальное связывание с технецием-99м;

- исследовать стабильность МСА, реагента и препарата при хране-

ии;

- установить корреляцию результатов химико-фармацевтического нализа с данными биологических и клинических испытаний препарата i9M-Tc-MCA(Sn);

- разработать проект Стандарта предприятия "Микросферы альбу-1ина (МСА)";

- разработать проект Временной фармакопейной статьи на препарат Микросферы альбумина, 99м-Тс" и реагент для его получения.

Научная новизна. Разработаны методики полного анализа и оценки ачества нового отечественного препарата для радионуклидной диагностики заболеваний легких "Микросферы альбумина, 99м-Тс" и реагента 1ля его получения в результате проведенного комплекса исследований эизико-химических свойств МСА, MCA(Sn), реагента и препарата.

Разработаны методика количественного определения олова(И) в /lCA(Sn), методики количественного определения олова(Н) и общего 1Лова в постадийном контроле синтеза MCA(Sn).

Установлено оптимальное содержание олова(И) в MCA(Sn), необхо-;имое для получения максимального связывания технеция-99м с /ICA(Sn).

Выявлена корреляция результатов химико-фармацевтического ана-¡иза с данными биологических испытаний препарата 99м-Тс-МСА(Бп).

Практическая значимость работы. Разработан Стандарт предпри-1тия (МРНЦ РАМН) "Микросферы альбумина (МСА)", утвержденный и веденный в действие 10.01.94 г.

Материалы работы вошли в документацию, на основании которой юлучено разрешение Фармакологического комитета МЗМП РФ от 3.05.94 г. (протокол N9) на клинические испытания препарата Микросферы альбумина, 99м-Тс". Клинические испытания препарата спешно проведены в десяти клиниках России. Препарат рекомендован Фармакологическим комитетом МЗМП РФ к медицинскому применению протокол N14 от 06.07.95 г.).

Разработан проект ВФС на препарат "Микросферы альбумина, 99м-с" и реагент для его получения.

Методики оценки качества препарата 99M-Tc-MCA(Sn), реагента, ICA(Sn) и МСА внедрены в радиоаналитической лаборатории Федераль-ого научного центра МЗМП РФ "Институт биофизики" и в лаборатории кспериментальной ядерной медицины МРНЦ РАМН.

Апробация работы. Результаты исследования представлены на аучной конференции отдела радиоактивных препаратов МРНЦ РАМН Эбнинск, май 1994 г.), на II Российском национальном конгрессе Человек и лекарство" (Москва, апрель 1995 г.), на XXXI Научной конфе-енции факультета физико-математических и естественных наук, посвя-;енной 35-летию Российского университета дружбы народов (Москва, ай 1995 г.), на конференции "Проблемы качества радиофармацев-лческих препаратов" Координационного научно-технического совета по

проблемам лучевой диагностики, терапии, радиофармацевтики и воп| сам их радиационной безопасности (Москва, май 1995 г.), на Bcepocci ской конференции "Опухоли висцеральных локализаций. Ранняя диап стика, профилактика, лечение" (Томск, июнь 1995 г.), на Российской i циональной конференции "Формирование приоритетов лекарствен политики" (Москва, июнь 1995 г.).

Публикации. Основные результаты работы изложены в 6 публи циях.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа h3j жена на 137 страницах машинописного текста, состоит из введения, < зора литературы, четырех глав, отражающих результаты собственных i следований, общих выводов, списка литературы, включающего 170 i точников, и приложения. Работа содержит 27 таблиц и 14 рисунков, введении сформулирована актуальность темы, определены цели и зад: исследования, научная новизна и практическая значимость работы.

В первой главе на основе анализа литературных данных рассмот| ны и критически оценены методы анализа французского аналога pearei и радиофармпрепарата на основе MCA - ТСК-5. Рассмотрены мете синтеза отечественного и зарубежного реагентов и зависимость свой получаемых из них РФП от особенностей синтеза. Проведен хроно. гический анализ свойств РФП для перфузионной сцинтиграфии легких.

Вторая глава посвящена изучению физико-химических свойств разработке методик определения показателей качества МСА.

В третьей главе приведены результаты исследований физи химических свойств, результаты количественного анализа и метро, гические характеристики методик определения MCA(Sn). Показана п вильность разработанных методик определения Sn(ll) и общего олов MCA(Sn). Определено оптимальное количество Sn(ll) в MCA(Sn) для i лучения качественного РФП.

Четвертая глава посвящена изучению физико-химических свойств разработке аналитических методик контроля качества реагента на осн MCA(Sn).

В пятой главе приведены результаты исследований по разрабо методик анализа РФП 99M-Tc-MCA(Sn) и его биологического поведеь Приведены данные сравнительного биологического изучения 99м-MCA(Sn) и ТСК-5.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Материалы и методы исследования.

Объектами исследования являлись: MCA, MCA(Sn), реагент на ос ве MCA(Sn), которые были получены в лаборатории экспериментапь ядерной медицины МРНЦ РАМН и РФП 99M-Tc-MCA(Sn), который готе ли из реагента добавлением к нему элюата технеция-99м из генерат 99-Мо/99м-Тс.

В работе использованы реактивы квалификации х.ч. и о.с.ч., кото| готовили согласно ГФ XI, вып. 2.

Исходные растворы Sn(ll) с концентрацией 0,8-10"2 - 4,2-10"2 М гс вили растворением навески безводного SnCl2 с содержанием Sn(il)

енее 95% в 0,1 M растворе HCI в атмосфере аргона. Содержание Sn(ll) исходных растворах определяли иодатометрически, а в разбавленных астворах - спектрофотометрически с перренатом калия.

Функциональную пригодность 99M-Tc-MCA(Sn) изучали на 620 здо-овых беспородных крысах, массой 180-200 грамм, 13 кроликах породы .Ыншилла, массой 2,5-3,0 кг. На крысах изучали распределение РФП по рганам и тканям в различные сроки после внутривенной инъекции (от 3 1ин до 24 ч) 0,2 мл (10-15 Мбк) препарата. За 100%-ный эталон принижи тушку животного, накопление радиоактивности в органах и тканях читали по отношению к тушке. Радиометрии подвергали 1 мл крови, егкие, печень, почки, желудок, мочевой пузырь, кишечник крыс. Резуль-аты подвергали статистической обработке. *

Статические сцинтиграммы легких кроликов регистрировали на гам-ia-кэмере DSX фирмы "Sopha MedicaJ" (Франция) в двух прямых проек-,иях (передней и задней) через 2-5 мин после введения 25-30 МБк РФП в раевую вену уха под внутривенным нембуталовым наркозом (40 мг/кг).

Определение диаметра и числа частиц проводили с помощью оп-ического микроскопа МБИ-6, снабженного окулярным микрометром ЮВ-1 при увеличении окуляра 15х и объектива Юх. Для определения исла частиц в реагенте использовали камеру Горяева для счета фор-юнных элементов крови, модель 851 (ТУ 64-1-816-88).

Набухание микросфер определяли под микроскопом в 0,9%-ном рас-воре NaCI, поскольку такой же раствор, содержащий технеций-99м без осителя (элюат из генератора 99-Мо/99м-Тс), применяют для приготов-ения РФП 99M-Tc-MCA(Sn) из реагента.

Взвешивание осуществляли на аналитических весах фирмы Sartorius" (Германия), модель А 200 S, с точностью ± 0,0001 г.

Регистрацию УФ-ВИД спектров поглощения и измерение оптической 1Лотности растворов проводили на спектрофотометре фирмы "Philips identifie" (Англия), модель PU 8745.

Спектральный анализ проводили с помощью спектрографа средней 1исперии ИСП-30.

Для измерения рН растворов использовали рН-метр фирмы Radiometer" (Дания), модель M 84. Потенциометрическое титрование ыполняли с помощью автоматической микробюретки ABU-80 "Radiometer") с точностью дозирования 0,001 мл.

Измерение радиоактивности проводили на сцинтилляционном четчике фирмы "Messelectronic Dresden GMBH" (Германия).

2. Анализ микросфер альбумина.

Разработана схема химико-фармацевтического анализа МСА, выбра-1Ы параметры МСА, позволяющие наиболее полно осуществлять их ха-(актеристику: описание, размер частиц (диаметр), растворимость, под-1Инность, количественное определение, потеря массы при высушивании, |розрачность и цветность раствора МСА, рН 1%-ной водной вытяжки, ¡абухание, удельный объем (насыпная плотность). Разработаны методики пределения указанных параметров.

МСА представляют собой сыпучий порошок светло-желтого цвета. >тбор проб МСА для проведения анализа осуществляли методом кварто-ания.

Микроскопическое исследование MCA показало, что они имеют сс рическую форму.

При исследовании 20 образцов МСА установлено, что в каждом них не менее 95% частиц имеют диаметр от 10 до 30 мкм (п=3, P=0,i Средний диаметр микросфер составляет 18,1 ±1,2 мкм.

МСА практически нерастворимы в воде, 95%-ном этаноле, хло| форме и эфире; умеренно растворимы в 2 М растворе NaOH при наг зании на кипящей водяной бане. Получаемый при этом раствор п| зрачен, имеет желтую окраску, находящуюся между окраской 3 и 4 эта нов шка^ы "б" эталонов .желтых оттенков.

Показана возможность применения для МСА известных спектрос тометрических методик, используемых для определения белка в нат ном альбумине. Одна из них основана на светопоглощении водных р творов белка в области 260-300 нм с максимумом при 278 нм. Дру методика основана на образовании в щелочной среде фиолетового к< плекса Cu(ll) с пептидными связями молекулы белка с максимумом глощения при 540 нм.'

Изучены УФ сАектры поглощения щелочных растворов (в 2 М р творе NaOH) более 60 партий альбумина сыворотки крови человек; МСА. Спектры поглощения .растворов альбумина и МСА в 2 М раствс NaOH практически совпадают и имеют максимум при 290 нм. Эти Ha6j дения хорошо согласуются с литературными данными, описывающих тохромный сдвиг на 12 нм (от 278 до 290 нм) максимума поглощв! белка в сильно щелочной среде. Такое явление объясняется ионизац! фенольных групп тирозиновых остатков белка; известно, что в слу триптофана такой сдвиг не имеет места, а вкладом фенилаланина в глощение белков в области 270-300 нм можно пренебречь. Линейная висимость оптической плотности растворов альбумина и МСА в 2 NaOH от их концентрации при 290 нм наблюдается в диапазоне 0,1-мг/мл. Вычислены удельные показатели экстинкции для 1% щелоч! растворов альбумина и МСА при 290 нм, равные 10,2 ± 0,4 (п=5, Р=0, и 10,1 ± 0,4 (п=5, Р-0,95), соответственно. Относительная погрешно определения не превышает ± 5,0%.

Изучены спектры поглощения щелочных растворов альбумина и N с биуретовым реактивом. В спектрах наблюдается широкая полоса глощения с максимумом при 540 нм. Спектры биуретовых комллек альбумина и МСА практически совпадают между собой и со спектра описанными в литературе. Соблюдение закона Бугера-Ламберта-Бе! наблюдается как для биуретовых комплексов альбумина, так и для р творов МСА при содержании от 0,25 до 2,5 мг основного вещества в 1 измеряемого раствора при 540 нм. Вычислены удельные показатели q тинкции 1% щелочных растворов альбумина и МСА с биуретовым реан вом: 2,75 ± 0,10 (п=5, Р=0,95) и 2,81 ± 0,13 (п=5, Р=0,95), соответств но. Они практически совпадают друг с другом и с известным из лите туры для комплекса нативного белка с биуретовым реактивом. Отно тельная погрешность определения не превышает ± 7,2%.

Потерю массы при высушивании определяли при нагревании обр цов микросфер до 100-105 °С; она не превышает 3,0%.

Удельный объем MCA изменялся в пределах от 1,1 до 1,4 см3/г.

Набухание МСА происходит практически мгновенно. Размер их увенчивается в среднем на 15%, но при этом не менее 95% набухших МСА чмеют диаметры от 10 до 35 мкм. Средний диаметр набухших МСА составляет 20,9 ± 1,4 мкм (п=3, Р=0,95).

рН фильтратов 1%-ной водной вытяжки изменяется от 4,8 до 5,2.

Исследована стабильность МСА. МСА могут храниться в течение 12 иесяцев ри температуре +2-10 °С в условиях холодильника без изменения их свойств.

Характеристики и нормы показателей качества МСА приведены в габл. 1.

Таблица 1. Характеристики и нормы показателей качества

Наименование показателей Характеристика показателей и норм

□писание Сыпучий порошок светло-желтого цвета, без запаха

Растворимость Практически нерастворим в воде, 95% этаноле, хлороформе, эфире (1:10 000)

Подлинность Е'*м при 290 нм от 9,7 до 10,5; Е\*м при 540 нм от 2,7 до 2,9

Прозрачность и цветность 1% раствора МСА в 2 М NaOH Прозрачный раствор, цветность между 3 и 4 эталонами шкалы "б" эталонов желтых оттенков

рН 1% водной вытяжки 4,8-5,2

Циаметр 95% МСА, ммл 10 - 30

Средний диаметр МСА, мкм 18,1 ± 1,2

1отеря массы при высушивании Не более 3,0 %

Диаметр 95% МСА (набухших) в ),9% NaCI, мкм 10 - 35

Средний диаметр набухших МСА в ),9% NaCI, мкм 20,9 ± 1,4

/дельный объем, см3/г 1,1 - 1,4

^рок годности 12 месяцев

3. Анализ микросфер альбумина, модифицированных оло-юм(И). При разработке методик анализа MCA(Sn) целесообразно осуществить их контроль по схеме, разработанной для МСА, включающей параметры, выбранные ранее для МСА. Определение показателей проводили ю методикам, аналогичным описанным для МСА. В связи с тем, что /ICA(Sn) содержат олово, возникла необходимость в разработке методи-и его определения в модифицированных микросферах. Микросферы альбумина, модифицированные Sn(ll), представляют обой сыпучий порошок светло-желтого цвета.

Исследование под микроскопом показало, что MCA(Sn) представ/ ют собой частицы сферической формы. При исследовании 15 образц MCA(Sn) установлено, что в каждом из них не менее 95% частиц име диаметры от 10 до 30 мкм. Средний диаметр модифицированных микр сфер составляет 19,2 ± 1,3 мкм (п=3, Р=0,95).

MCA(Sn) практически нерастворимы в воде, 95%-ном этаноле, хт роформе и диэтиловом эфире; умеренно растворимы в 2 М раство гидроксида натрия при нагревании на кипящей водяной бане. Г лучаемый при этом раствор прозрачен, имеет желтую окраску, нахо; щуюся между окраской 3 и 4 эталонов шкалы "б" эталонов желтых отте ков.

Показана возможность применения спектрофотометрических меп дик для определения белка в MCA(Sn) и выбраны экспериментальн, условия для их проведения.

Изучены УФ спектры ' поглощения растворов более 30 образц MCA(Sn) в 2 М NaOH в сравнении со спектрами щелочных раствор альбумина и МСА. Спектры поглощения растворов альбумина, МСА MCA(Sn) в 2 М NaOH практически совпадают между собой и имеют мг симум при 290 нм. Линейная зависимоть оптической плотности растЕ ров альбумина, МСА и MCA(Sn) в 2 М NaOH от их концентрации при 2 нм наблюдается в диапазоне 0,1-1,0 мг/мл. Определены удельные по» затели экстинкции для 1% щелочных растворов альбумина, МСА MCA(Sn) при 290 нм, которые составляют: 10,2 ± 0,4 (п=5, Р=0,9 10,1±0,4 (п=5, Р=0,95) и 10,3 ± 0,5 (п=5, Р=0,95), соответственно. Отк сительная погрешность определения не превышает ± 5,0%.

Изучены спектры поглощения щелочных растворов альбумина, М и MCA(Sn) с биуретовым реактивом. Во всех спектрах обнаружены шщ кие полосы поглощения с максимумом при 540 нм. Спектры биуретое комплексов альбумина, МСА и MCA(Sn) практически совпадают мех собой и с литературными спектрами для биуретового комплекса натив> го альбумина. Соблюдение закона Бугера-Ламберта-Беера для компл сов альбумина, МСА и MCA(Sn) наблюдается в интервале концентра!, от 0,25 до 2,5 мг/мл основного вещества при 540 нм. Вычислены уде. ные показатели экстинкции 1% щелочных растворов с биуретовым ре тивом: 2,75 ± 0,10 (п=5, Р=0,95), 2,81 ± 0,13 (п=5, Р=0,95) и 2,79 ± 0 (п=5, Р=0,95) для альбумина, МСА и MCA(Sn), соответственно. Они пр тически совпадают между собой и с литературными данными для биу| тового комплекса нативного альбумина. Относительная погрешность ределения не превышала ± 7,2%.

Потерю массы при высушивании определяли при нагревании обр цов MCA(Sn) до 100-105 °С. Этот показатель не превышает 4,0%.

Набухание MCA(Sn), как и в случае МСА, происходит практиче мгновенно. Диаметр MCA(Sn) увеличивается при этом в среднем на 2'. но не менее 95% частиц имеют диаметры от 10 до 35 мкм, что являе одним из главных требований к препарату. Средний диаметр набухь MCA(Sn) составляет 23,4 ± 1,3 мкм (п=3, Р=0,95).

рН фильтратов 1% водной вытяжки образцов MCA(Sn) изменяютс пределах от 2,5 до 3,0.

Содержание Sn(ll) в MCA(Sn) является одним из важнейших показа-злей качества MCA(Sn), которое, в свою очередь, определяет качество ФП 99M-Tc-MCA(Sn), а именно: эффективность мечения и, соответст-внно, относительную активность РХП.

Согласно технологии MCA(Sn) олово осаждается (в основном, по-идимому, на поверхность микросфер} в двухвалентном состоянии. Проеденные исследования методом мессбауэровской спектроскопии покапли, что оно содержится в MCA(Sn) как в виде Sn(ll), так и в виде Sn(IV).

Определение Sn(ll) в альбуминовых микросферах является сложной адачей, поскольку: 1) содержание Sn(ll) в MCA(Sn) очень мало (около 3-мкг/мг микросфер); 2) для одного анализа имеется возможность ис-ользовать всего 10-20 мг микросфер; 3) имеет место совместное при-/тствие Sn(ll) и большого количества по сравнению с ним белка; 4) n(ll) легко окисляется кислородом воздуха и гидролизуется в присутст-ии влаги. Кроме того используемые в анализе методы предполагают редварительное переведение анализируемой пробы в раствор, что в пучае MCA(Sn) влечет за собой окисление Sn(ll) до Sn(IV). Если провес-л предварительное отделение олова(М) от микросфер, то возможна по-зря определяемого элемента, принимая во внимание указанные выше энцентрации Sn(ll) в микросферах и количество пробы для анализа. Потому необходимо было разработать способ определения Sn(ll) при его овместном с микросферами присутствии.

Разработанный способ включает "смывание" олова(М) с микросфер >ез их отделения) 2 М раствором HCl, в котором растворена соль Fe(lll). казавшееся в растворе Sn(ll) восстанавливает Fe(lll) до Fe(ll), эквива-знтное количество которого определяют спектрофотометрически в при-/тствии о-фенантролина, дающего с Fe(ll) окрашенный комплекс с ши-жой полосой поглощения, имеющей максимум при 510 нм. Линейная 1Висимость оптической плотности растворов комплекса Fe(ll) с о-енантролином от концентрации Sn(ll) наблюдается в интервале 0,5-7,0 кг/мл. Рассчитан молярный коэффициент погашения равный 19 800±594 'моль см (п=5, Р=0,95). Относительная погрешность определения не эевышает ± 5,0%. Результаты определения Sn(ll) в растворах представ-5ны в табл. 2.

аблица 2. Результаты определения олова(И) по реакции с Fe(lll) в присутствии о-фенантролина (п=3, Р=0,95); S-стандартное отклонение, Е-

полуширина доверительного интервала, Е%-процентная погрешность

Введено Sn(ll), мкг Найдено среднее для Sn(ll), мкг S Е Е, %

10,0 10,5 0,1 0,3 3,0

15,0 15,0 0,2 0,4 2,6

20,5 20,9 0,3 0,6 3,0

24,5 24,5 0,2 0,5 2,0

28,5 28,8 0,4 1,0 3,5

37,0 36,6 0,2 0,5 1,3

Приведенные данные показывают, что методика позволяет получать »авильные и хорошо воспроизводимые результаты.

Круг методов, которые можно использовать для определения общ олова (Sn(ll)+Sn(IV)) в таком специфическом объекте, как MCA(Sn), or ничен. Это связано с тем, что: 1) большая часть олова в MCA(Sn) на дится в виде Sn(ll) (около 90%) и, следовательно, содержание общ олова также мало (на уровне десятков микрограмм); 2) предварителы отделение олова от микросфер с целью последующего его определен как и в случае со Sn(ll), трудновыполнимо из-за малого содержания о ва; 3) при определении общего олова в растворе без его отделения микросфер неминуемо влияние белковой матрицы на результаты оп деления.

Мы сочли необходимым действовать следующим образом: 1) уст нить влияние белковой матрицы без предварительного выделения олс 2) окислить имеющееся в MCA(Sn) Sn(ll) до Sn(IV) и затем 3) найти п ходящий способ определения общего олова.

Разработана методика определения общего олова в виде Sn(IV), ключающаяся в предварительном "мокром" озолении навески МСА( концентрированной серной кислотой в присутствии хлорной кислот! качестве окислителя с последующим спектрофотометрическим опре лением олова с пирокатехиновым фиолетовым при рН 3-4. Максиму! спектре поглощения образовавшегося комплекса наблюдается при : нм, коэффициент молярного погашения составляет 65 400 ± 1 140 л/м< см (п=5, Р=0,95). Закон Бугера-Ламберта-Беера выполняется в интер ле от 0,2 до 1,6 мкг/мг Sn(IV). Относительная погрешность определе не превышает ± 5,0%.

Для подтверждения правильности разработанных методик опреде ния Sn(ll) и общего олова в MCA(Sn) содержание олова оценивали с дующими способами.

1. Исходя из количества олова(П), взятого в реакцию модифика определенной навески МСА; количества общего олова, найденног фильтрате после завершения осаждения Sn(ll) на МСА (т.е. непроре; ровавшего олова с МСА); и количества общего олова, найденного в гс вых МСА (табл. 3).

Таблица 3. Результаты определения Sn(ll) и общего олова на различ

стадиях получения MCA(Sn) (п=3, Р=0,95)

Образцы МСА(вп) 16 от 24.03.92 17 от 27.03.92 18 от 31.03.9

Исходное Вп(1)) в р-ре , % 95,7 ±2,9 103,3 ±3,1 100,2 ±2,1

В фильтрате общее олово, % 27,0 ± 1,4 13,7 ±0,7 18,3 + 0,5

В МСА(Зп) общее олово,% 63,7 ± 3,2 87,0 ± 4,4 78,0 ±3,1

Сумма: общее олово, % 90,7 ± 3,2 100,7 ±4,4 96,3 ±3,1

Данные табл. 3 подтверждает правильность контроля Зп(И) и 061. олова по разработанным нами методикам.

2. Подтверждением правильности результатов, полученных с помо-дью разработанных методик определения Зп(11) мо реакции восстановления им Ре(Ш) в присутствии о-фенантролина (метод А) и общего олова в виде Бп(1\/), основанной на разрушении МСА(вп) "мокрым" сжиганием в присутствии окислителя с последующим определением с пирокатехино-вым фиолетовым (метод В), являются также данные эмиссионного спектрального анализа (метод Б), ГФ XI [вып. 1, С. 322-332]. Результаты представлены в табл. 4. Спектральному анализу подвергали микросферы, эставшиеся на фильтре после определения Бп(11), и микросферы без предварительного определения Зп(И) (образецы 7 и 8).

Таблица 4. Результаты определения Эп(И) и Бп(1\/) в экспериментальных образцах МСА(Бп) различными методами (п=3, Р=0,95)_

Дата Введено Найдено олова, мкг/мг Связывание

NN пригото- MCA(Sn) с

вления Sn(ll), Sn(ll) Sn(IV) Общее Sn 99м-Тс, %

мкг/мг А Б В

1 20.06.90 6,0 0,5 ± 0,1 3,4 ± 0,4 3,9 + 0,5 , 35,5 ± 2,6

2 27.04.90 7,0 0,8 ±0,1 не более не более 33,1 ±3,4

- 1,0 1,7 -

3 25.04.90 12,0 3,3 ±0,3 8,8 ± 1,3 11,9 ± 1,0 99,0 ±0,1

4 05.06.90 12,0 2,5 ±0,2 8,6 ± 1,3 11.3 ± 1,2 99,0 ±0,1

5 08.12.89 25,0 19,8 ±0,5 4,4 ±2,0 24,0 + 2,1 75,3 ± 0,2

6 02.02.90 25,0 16,8 ±0,5 5,6 ±0,9 22,7 ± 0,9 94,8 ± 0,7

7 02.02.90 25,0 - 24,1 ± 1,2 - -

8 02.02.90 25,0 - 23,4 ± 1,2 23,4 ± 1,2 -

Из табл. 4 видно, что общее олово, определенное методом В в yiCA(Sn), близко к сумме Sn(ll)+Sn(IV), найденной с помощью методов А I Б, а также к расчетному содержанию Sn(ll), вычисленному из навески /1СА и SnCI2, взятых в реакцию. В табл. 4 приведены также значения общего содержания олова в образцах 7 и 8, полученные спектральным ме-одом без предварительного определения Sn(li), что практически совпадет с полученным суммарным значением.

3. Подтверждением правильности разработанных методик определена Sn(ll) и общего олова в MCA(Sn) являются также результаты опреде-ения соотношения содержания Sn(ll) и Sn(IV) в MCA(Sn) методом мес-бауэровской спектроскопии. Так, в 5-м образце MCA(Sn) (табл. 4) 88% лова было найдено в виде олова(П) и 12% - в виде олова(1\/); в 6-м об-азце - 70% олова(И) и 30% олова(1\/). Полученные результаты хорошо огласуются с данными физико-химического анализа (табл. 4).

Разработанные методики определения содержания Sn(ll) и общего лова в MCA(Sn) позволили определеить то оптимальное количество n(ll), осаждаемое на МСА, которое обеспечивало бы максимальное свя-ывание технеция-99м с MCA(Sn) и максимальное накопление в легких. В абл. 5 представлены результаты анализа образцов MCA(Sn) с раз-

личным содержанием 8п(И) (от 10 до 50 мкг/мг МСА) и накопления в ких крыс радиофармпрепаратов, полученных из этих образцов.

Таблица 5. Результаты химического анализа образцов МСА(Зп) и накопления в легких крыс РФП, полученных на их основе (п=3, Р=0:

NN МСА(Бп) Содержание олова, мкг/мг МСА Относиильная активность 99м-Тс, не связанного с МСА(Эп), % Накопле легких Тс-МС/ через 3 после и ции,

Введено Найдено

Зп(П) в реакцию с МСА Зп(И) Общее олово

1 10 2,5 ±0,1 2,9 ±0,1 0,2 94,6 ±

2 15 6,2 ± 0,2 7,2 ±0,3 0,7 96,6 +

3 20 8,6 ±0,3 8,7 ± 0,3 0,8 93,7 ±

4 25 10,2 ±0,3 12,3 ±0,5 3,5 93,6 +

5 30 13,2 ±0,4 - 5,9 -

6 35 18,2 ±0,6 20,1 ±0,8 7,8 86,3 ±

7 40 18,5 ±0,6 21,9 ±0,9 8,2 86,8 ±

8 50 23,0 ± 0,7 28,3 ± 1,1 12,4 3,6 ±

Как видно из табл. 5, содержание 8п(И) в МСА(вп) в значител степени "определяет и относительную активность не связанного с технеция-99м в препарате (РХП). Наименьшая (не более 4,0%) о^ тельная активность радиохимической примеси найдена в препаратах содержащих олово(Н) от 3 до 10 мкг/мг МСА. Накопление 99к МСА(Бп) в легких крыс при введении указанных образцов препарат; ставило не менее 93%, в печени - не более 1% (данные не приведе таблице). При этом в течение 1 часа после введения препарата вывс ся из легких крыс от 10 до 18% от введенной активности технеция-9! образцах, приготовленных из МСА(8п) и содержащих олова(П) боле 15 мкг/мг МСА, относительная активность радиохимической при увеличивается до 13%, накопление препарата в легких не превы 90%, а в печени - увеличивается до 14%.

Таким образом, содержание Зп(Н) в МСА(Бп) более 10 мкг/и, приводит к улучшению качества препарата. Из табл. 5 видно, что I мальное количество Вп(И), необходимое для проведения процесса л фикации и получения качественного РФП, составляет 15 мкг Бп(И) на микросфер.

Исследование образцов МСА(Бп), полученных при использое указанного расчетного количества £5п(И), показало, что содержание в МСА(Бп) составляет от 3 до 7 мкг/мг или от 17 до 35 мкг/флакон ( 6).

Таблица 6. Результаты определения Зп(П) в МСА(Бп), в реагентах и накопление 99м-Тс-МСА(Зп), полученных на их основе, в легких крыс

Содержание Накопление в лег-

5п(И) в Содержание Относительная ких 99м-Тс-

NN МСА(Зп), Эп(П) в реаген- активность РХП, МСА(Бп) через 3

мкг/мг те, мкг/флакон 99м-Тс, % мин после инъек-

(п=3,Р=0,95) ции, %

(п=3, Р=0,95)

27-1 7,1 ± 0,1 32,0; 34,0; 34,8 0,8; 1,2; 1,0 95,5 ± 0,5

27-2 6,9 ± 0,1 33,0; 32,8; 31,7 0,7; 0,9; 0,8 95,5 ± 0,9

27-5 5,3 ± 0,2 24,0; 23,8; 20,9 0,1; 0,7; 2,0 97,1 ± 1,0

28-1 5,9 ±0,2 28,1; 27,6; 28,0 0,8; 0,5; 0,1 96,8 ± 1,7

28-2 4,8 ± 0,1 21,0; 21,7; 22,4 0,3; 0,1; 0,6 95,9 ± 0,4

28-3 4,1 ± 0,2 24,3; 24,0; 23,5 0,6; 0,2; 0,1 97,5+0,8

28-4 3,4 ± 0,2 19,0; 17,8; 17,5 0,6; 1,0, 0,3 96,2+1,5

Примечание к табл. 6. Каждая цифра в 3 и 4 колонках таблицы соответствует результату анализа одного флакона с реагентом.

Характеристики и нормы показателей качества стандартных образцов МСА(Бп) сведены в табл. 7.

Таблица 7. Характеристики и нормы показателей качества МСА(Бп)

Наименование показателей Характеристика показателей и норм

Описание Сыпучий порошок светло-желтого цвета

Растворимость Практически нерастворим в воде, 95% этаноле,хлороформе, эфире (1:10 000)

Подлинность при 290 нм от 9,8 до 10,8; при 540 нм от 2,7 до 2,9

Прозрачность и цветность 1% раствора МСА(Бп) в 2 М №ОН Прозрачный раствор, цветность между 3 и 4 эталонами шкалы "б" эталонов желтых оттенков

эН 1% водной вытяжки 2,5 - 3,0

Циаметр 95% МСА(Эп), мкм 10 - 30

Средний диаметр МСА(Бп), мкм 19,2+ 1,3

Потеря массы при высушивании Не более 4,0 %

Циаметр 95% набухших МСА(5п), икм 10 - 35

Средний диаметр набухших \/1СА(8п) в 0,9% ЫаС1, мкм 23,4 ± 1,3

Содержание Бп(М) в МСА(5п), ^ кг/мг от 3 до 7

Содержание Бп(1У) в МСА(Бп), % не более 10 % от содержания ЭпО!)

4. Анализ реагента.

Реагент представляет собой апирогенную, С1ерильную лиофши рованную смесь, состоящую из MCA(Sn), твина-80 и хлорида натрия.

Помимо контроля качества реагента по таким параметрам, как ве ний вид, растворимость, подлинность, рН, определение диам< MCA(Sn), числа MCA(Sn) во флаконе, стояла задача по разработке м дик определения Sn(ll), белка, твина-80 и хлорида натрия. По внеш) виду реагент представляет собой лиофилизат белого или слегка же ватого цвета.

Для испытания на растворимость использовали 0,9% раствор h поскольку такой же раствор, содержащий технеций-99м без ноет применяется для приготовления препарата из реагента. Реагент непо стью растворим в этом растворителе и образует суспензию желтова цвета, при хранении которой выпадает осадок, легко переходящий в номерную взвесь при встряхивании. Жидкость над осадком - бесцвет!

Для разработки теста на подлинность реагента были проведень сколько испытаний. Микроскопическое исследование суспензии реаг дает возможность идентифицировать сферичесую форму частиц. I линность альбумина устанавливали по методу Лоури, основанном на разовании окрашенных продуктов реакции ароматических аминокисл цистеина (компонентов молекулы белка) с реактивом Фолина, при ; развивается темно-синяя окраска раствора. Наличие двухвалент олова устанавливали по методике с использованием комплекса дв\ лентного железа с о-фенантролином.

Для.определения рН суспензии реагента в 0,9% изотоническом творе NaCI использовали потенциометрический метод (ГФ XI [вып. 113]). Наличие микросфер в суспензии не мешает определению рН личина которого не зависит также и от объема суспензии реагента i тервале 1-4 мл. Величина рН суспензии реагента изменялась в пре/з от 3,9 до 4,3.

Для измерения диаметра модифицированных микросфер в реаг отбирали пробу суспензии реагента в 0,9% растворе NaCI, поскольк мерению диаметра частиц в сухом реагенте мешает наличие в нем б шого количества кристаллов NaCI. Вследствие некоторого набухание дифицированных микросфер в водном растворе диаметр их личивается и находится в интервале от 10 до 35 мкм, тогда как соо ствующий интервал для MCA(Sn) в сухом виде, используемых для п[ товления реагента, составляет 10-30 мкм. Не менее 95% частиц в ре; те имеют диаметр от 10 до 35 мкм (п=3, Р=0,95). Средний диа MCA(Sn) в реагенте составляет 21,9 ± 0,6 мкм (п=3, Р=0,95).

При определении числа микросфер в камере Горяева пользовс правилами, принятыми для подсчета лейкоцитов из-за схожести их меров. Число частиц во флаконе находилось в интервале от 800 000 500 000 штук. Относительная погрешность определения не превы ±11,0%.

Определение олова(П) в реагенте проводили с помощью разр танной спектрофотометрической методики, основанной на образоЕ окрашенного комплекса о-фенантрояина с Fe(ll), образующимся е зультате реакции восстановления Fe(lll) двухвалентным оловом. Сс

ание Sn(ll) в реагенте изменялось от 0,017 до 0,035 мг (т.е. от 3 до 7 кг/мг микросфер). Содержание Sn(ll) в реагентах близко к его содержание в соответствующих образцах MCA(Sn) при пересчете на 1 мг белка, аличие в реагенте твина-80 и хлорида натрия не влияют на результаты пределения Sn(ll).

Определение белка в реагенте проводили по биуретовой реакции с спользованием рассчитанного удельного показателя экстинкции для иуретового комплекса 1%-ного щелочного раствора MCA(Sn) - 2,79±0,12 1=5, Р=0,95). Наличие в реагенте твина-80 и хлорида натрия не влияет а результаты определения белка. Относительная погрешность опреде-ения не превышает ± 7,2%. Содержание белка в реагенте в виде микромер составляет от 4,0 до 5,5 мг.

Хлорид натрия определяли потенциометрически титрованием рас-зором нитрата серебра (ГФ XI [вып. 1,С. 120]). Наличие микросфер аль-умина и твина-80 не влияет на результаты анализа. Относительная по-эешность определения не превышает ± 2,0%. Содержание хлорида на-эия в реагенте изменяется от 8,7 до 9,3 мг.

Определение содержания твина-80 в реагенте проводили спектро-отометрически по методике, основанной на взаимодействии твина-80 с милозной фракцией крахмала. В реакцию вводили избыточное ко-ичество крахмала по отношению к твину.'Не вступивший в реакцию с зином избыток крахмала взаимодействует с вводимым в раствор иодом, бразуя окрашенный в синий цвет комплекс, полоса поглощения в спек-эе которого имеет максимум при 680 нм. Оптическая плотность раство-а окрашенного комплекса зависит от содержания твина в растворе (чем ыше концентрация твина, тем меньше оптическая плотность испытуемо-з раствора). Пропорциональная зависимость оптической плотности ис-ытуемого раствора от содержания твина наблюдается в интервале кон-ентраций 1-5 мкг/мл. Относительная погрешность определения не пре-ышает ± 10,0%. Наличие микросфер и хлорида натрия не влияет на оп-еделение твина-80. Содержание твина в реагенте изменяется от 0,17 до ,25 мг.

Стерильность реагента контролировали в соответствии с Инструкций по стерилизации и контролю стерильности радиофармацевтических репаратов для инъекций, радиоизотопных генераторов и нерадиоактив-ых реагентов для получения радиофармацевтических препаратов, ут-ержденной Минздравом СССР 01.03.90 г.

Определение пирогенности реагента проводили в соответствии с ГФ I на кроликах. Тест-доза составляла 1 мл суспензии, полученной после астворения реагента в 4 мл 0,9% изотонического раствора NaCI для нъекций, на 1 кг массы кролика.

Реагенты являются стерильными и апирогенными в течение всего оока годности.

Проведено изучение стабильности при хранении реагента при тем-вратуре +2-10 °С. Хранение реагента в течение 12 месяцев при темпе-атуре +2-10 "С в условиях холодильника не изменяет его свойств. Про-здено изучение хранения реагента в течение 14 суток при комнатной эмпературе. Установлено, что хранение реагента при указанных услови-• не влияет на его свойства.

Характеристики и нормы показателей качества реагента и препар "Микросферы альбумина, 99м-Тс" представлены в табл. 8.

Таблица 8. Характеристики и нормы показателей качества реагента

препарата "Микросферы альбумина, 99м-Тс"

Наименование показателей качества Характеристика показателей

РЕАГЕНТ

Описание Лиофилизат белого или еле желтоватого цвета

Растворимость При смешивании с 1-4 мл 0, раствора NaCI образуется сусп зия

Подлинность По микросферам, альбумину, о ву(М)

рН суспензии 3,9 - 4,3

Диаметр 95% МСА(Бп), мкм 10 - 35

Средний диаметр МСА(8п), набухших в 0,9% №С1, мкм 21,9 ±0,6

Количество микросфер 800 000 - 1 500 000

Содержание альбумина, мг 4,0 - 5,5

Содержание 8п(П), мг 0,017-0,035

Содержание №С1, мг 8,7 - 9,3

Содержание твина-80, мг 0,17-0,25

Срок годности 12 месяцев

ПРЕПАРАТ

Описание Суспензия желтоватого цвета

РН 3,9 - 4,3

Радиохимическая примесь, % не более 4,0%

Срок годности 5 часов

5. Анализ препарата "Микросферы альбумина, 99м-Тс" и к реляция с данными его биологического изучения.

Для приготовления РФП "Микросферы альбумина, 99м-Тс" во <| кон с реагентом вводят шприцем 1-4 мл раствора пертехнетата нат| 99м-Тс из генератора путем прокола иглой через резиновую про Флакон с содержимым помещают в свинцовый контейнер, энергк встряхивают и продолжают перемешивание в течение 20 мин. Преп; готов к применению по истечении указанного времени.

Препарат представляет собой суспензию желтоватого цвета, стоянии которой выпадает осадок микросфер, переходящий в равног ную взвесь при встряхивании; жидкость над осадком бесцветная, взаимодействии пертехнетата натрия, 99м-Тс с 8п(11) происходит вое новление технеция до более низкой степени окисления и его присо« нение к микросферам.

При выборе аналитических параметров, которые необходимо I тролировать в готовом препарате, мьг руководствовались тем, что пр< рат получают растворением реагента, качество которого определя

збованиями ВФС, в растворе натрия пертехнетата, 99м-Тс, удовлетво-ощего требованиям ФС 42-2837-92, поэтому отпадает необходимость □ведения полного контроля качества РФП, тем более, что срок его дности относительно мал (5 часов). По этим причинам при контроле <ества целесообразно определять те параметры, которые могут изме-гься при его приготовлении, а именно: рН и РХП - относительную ак-зность технеция-99м, не связанного с МСА(Бп).

Определение подлинности по радионуклиду и объемной активности проводили, поскольку эти параметры препарата соответствуют ФС 4237-92, так как приготовление радиофармацевтического препарата по деству сводится к растворению реагента в растворе натрия пертехне-га, 99м-Тс, качество которого отвечает требованиям упомянутой выше I При растворении реагента в элюате практически не происходит ре-дий, приводящих к изменению присутствующих в растворе веществ, ъемная активность технеция-99м в препарате равна объемной актив-сти технеция-99м в растворе натрия пертехнетата, используемого для иготовления РФП, так как изменения объема при этом не происходит.

Основным показателем качества любого РФП является его радиохи-ческая чистота - РХЧ. Однако в случае соединений технеция, когда от-гствуют доказательства химической индивидуальности основной доли ционуклида в составе препарата, употребление понятия РХЧ неправо-чно. В этом случае определяют "относительную активность радиохи-ческой примеси" - РХП. В препарате 99м-Тс-МСА(8п) радиохи-ческой примесью, могут быть растворимые химические соединения (неция-99м, не вступившие во взаимодействие с микросферами. Тра-ционные хроматографические или электрофоретические методы, ис-пьзуемые для контроля РХЧ и РХП в радиофармпрепаратах с технеци--99м, представляющих собой истинные растворы, не пригодны для -ггроля рассматриваемого препарата.

Разработана методика определения технеция-99м,несвязанного с :А, путем предварительного фильтрования препарата через мембран-й или бумажный фильтр с последующим сопоставлением скорости эта от пробы фильтрата и пробы раствора натрия пертехнетата, 99м-

используемого для приготовления препарата. Относительная актив-сть радиохимической примеси в препарате не превышает 4,0%.

Исследования радиохимического состава фильтратов образцов пре-эата 99м-Тс-МСА(5п), в которых и содержится РХП - не связанный с кросферами технеций-99м, показали, что наибольшая его часть (до Уо) находится не в виде пертехнетата натрия, а в виде коллоида - вос-жовленного гидролизованного технеция ТсОг-пНгО, который при вве--1ии препарата животным накапливается в печени. Результаты опреде-■1ия РХП хорошо согласуются с данными по его накоплению в печени: л больше РХП, тем больше накопление коллоида в печени и меньше -егких.

Поскольку РХЧ (в нашем случае РХП) - это основной показатель (ества радиофармпрепарата, определяющий в клинике фармакокине-су препарата, необходимо сравнить полученные данные по содержанию П в препарате 99м-Тс-МСА(Зп) с результатами функциональной примости препарата.

Результаты изучения распределения 99м-Тс-МСА(Бп) в орган! крыс в различные сроки после внутривенного введения показали, через 3 мин после инъекции в критическом органе - легких содержа около 97% радиоактивности от введенного количества. Незначител присутствие радионуклида в других органах (крови, печени, почках) г рит о том, что вводимые частицы сразу же блокируют капиллярную легких, распределяясь в легочной ткани. Начиная с 30 минуты, зам уменьшение содержания препарата в легких - около 91%, к 5-му ч, 71%; через 24 часа в этом органе оставалось 35% от введенного личества радиоактивности; при этом в печени было не более 5%.

Период полувыведения препарата из легких крыс составляв часов.

Выведение 99M-Tc-MCA(Sn) из организма происходит в осно через почки. Так, через 3 мин после инъекции в почках регистрирова 0,13 ± 0,01%, через 5 часов - 5,09 ± 0,33%, через сутки - 11,0 ± 1,1 введенной активности.

Выведение через гепатобилиарный тракт незначительно. Чер часов в печени и кишечнике содержание радиоактивности состаЕ 1,77 ± 0,09% и 2,16 ± 0,16%, соответственно. Незначительное накопл в этих органах свидетельствует о том, что в результате разруа частиц в легких не происходит образования меченых частиц белка т; размера, которые захватывались бы клетками РЭС и выводились i шечник. По-видимому, в данном случае поисходит отщепление рад| тивной метки от модифицированных микросфер и выведении 1 мочевыделительную систему, что подтверждается динамикой экскр РФП из организма во все сроки наблюдения, а также увеличением h¡ ления в желудке от 0,21% через 1 час до 1,3% через 5 часов после екции. Незначительное накопление РФП в печени и кишечнике в прс се его выведения из организма, по нашему мнению, может являться венным доказательством того, что в процессе получения MCA(Sn) i новном происходит поверхностное распределение Sn(ll), и, соотв венно, технеция-99м при приготовлении препарата, на микросферах.

Получены сцинтиграммы легких кроликов через 5 мин после bi ния отечественного 99м-Тс-МСА(Бп) и французского ТСК-5 препар Во всех случаях изображения были хорошего качества с четкими, рс ми контурами легких, с диффузноравномерным распределением е препарата. Другие органы на сцинтиграммах не регистрировались, личия между 99м-Тс-МСА(Бп) и ТСК-5 при визуальной оценке не выявлены.

Проведено сравнительное изучение распределения по орган тканям крыс 99м-Тс-МСА(Бп) и ТСК-5. Фармакокинетика отечестве! и французского препаратов аналогична. Однако наблюдается более ленное выведение ТСК-5 из легких по сравнению с 99M-Tc-MCA(Sn¡ может, по-видимому, также являться косвенным доказательством что олово(И) и технеций-99м распределяется по всему объему mi сфер в случае ТСК-5 и по поверхности - в случае 99M-Tc-MCA(Sn).

Величину рН суспензии препарата устанавливали потенцис рически (ГФ XI [вып. 1, С. 113]). Значение рН изменяется от 3,9 до 4,

Изучено влияние следующих факторов.

1) Содержания 8п(Н) в реагенте на качество радиофармпрепарата (м-Тс-МСА(Зп), т.е. содержание РХП. Относительная активность РХП в юпарате зависит от содержания Бп(Н) в реагенте. Оптимальное содер-шие Бп(П) в реагенте составляет 17-35 мкг/флакон (3-7 мкг/мг микро-эер).

2) Объема элюата, применяемого для получения РФП, а также воз-эжного разбавления уже готового радиофармпрепарата 0,9%-ным рас-ором ЫаС1 .на содержание РХП, поскольку, согласно медико-хническим требованиям на препарат его готовят растворением реаген-

в 1-4 мл раствора пертехнетата натрия, 99м-Тс. Растворение реагента 1К в 1 мл элюата, так и в 4 мл, позволяет получить препарат с содержа-юм РХП не более 4,0%. При необходимости готовый препарат может ить разбавлен 0,9% раствором №С1 (например, при получении препара-I с необходимой объемной активностью или с определенной концентра-1ей микросфер).

Полученные результаты хорошо согласуются с данными лаборатор-.IX испытаний на животных.

3) Времени хранения препарата на содержание РХП. Препарат хра-ши при комнатной температуре в соответствии с правилами ОСП-!/87. Относительная активность РХП практически не изменяется в ¡чение 5 часов после приготовления препарата. Результаты биоло-ческого изучения хранения готового препарата в течение 5 часов при знатной температуре показали, что он устойчив в течение 5 часов; не зняются его биологические свойства.

4) Объемной активности технеция-99м на содержание РХП в радио-армпрепарате 99м-Тс-МСА(5п).

При объемной активности технеция-99м в препарате от 18,5 до 296,0 Бк/мл (при общей активности от 74,0 до 1184,0 МБк) не наблюдается учимого изменения относительной активности РХП в препарате.

5) Стерилизации реагента ионизирующим излучением на показатели 1чества реагента и препарата. Стерилизация реагента облучением до-|й 1-Ю6 рад несколько снижает содержание Бп(Н) и твина-80 по сравне-ю с нестерильными реагентами, но относительная активность РХП в 1епарате, приготовленном из стерильного реагента, становится ниже.

6) Способа перемешивания раствора при приготовлении препарата, фемешивание вручную или с помощью прибора для перемешивания не азывает влияния на показатели качества препарата.

Проведено изучение стабильности реагента при хранении в течение месяцев при температуре +2-10 °С на качество РФП "Микросферы ьбумина, 99м-Тс". Хранение реагента в течение 12 месяцев при темпе-туре +2-10 "С в условиях холодильника не изменяет качества готового ОП. Фармакокинетика его в выбранные сроки 3 мин и 1 час не отчается от результатов, полученных с РФП, приготовленных из свежих агентов.

Проведено изучение стабильности реагента при хранении в течение суток при комнатной температуре на качество РФП. Хранение реаген-при указанных условиях не изменяет радиохимических и биологических ойств полученного из него радиофармпрепарата.

Срок годности РФП установлен, исходя из периода полураспада дионуклида (6,01 часа), радиохимического и биологического по в еде препарата, испытанного в различные сроки после его приготовле! Было установлено, что срок годности препарата составляет 5 часов.

Экспериментальная оценка безвредности препарата 99м-Тс-МСА проведена в лаборатории медико-биологических испытаний новых f Федерального научного центра "Институт биофизики". На основании онкологических исследований препарата 99M-Tc-MCA(Sn), проведенн! соответствии с "Общими методическими указаниями по эксперимент ным исследованиям новых радиофармацевтических препаратов" (199 установлено, что при введении белым крысам в клинической дозе он ляется безвредным. Препарат стерилен, апирогенен, не вызывает м ных реакций на введение. При введении белым беспородным мыш< дозе, в 1 300 раз превышающей клиническую, препарат не вызывал п ли животных.

Клинические испытания РФП 99M-Tc-MCA(Sn) были проведены i клинических базах: на кафедре лучевой диагностики и лучевой тер< ММА им. И.М. Сеченова, в Онкологическом научном центре РАМН, в дицинском радиологическом научном центре РАМН (Обнинск), в инст те клинической кардиологии им. А.Л. Мясникова КНЦ РАМН, в нической больнице N6, в Научном центре хирургии РАМН, в НИИ скс помощи им. Н.В. Склифософского, в клиническом центре передовых дицинских технологий (Санкт-Петербург), в Российской медицин академии последипломного образования МЗМП РФ, в московском ин туте диагностики и хирургии.

99M-Tc-MCA(Sn) использовали для исследования состояния ка лярного кровообращения легких с целью выявления очаговых или j фузных показателей легочной перфузии, а также определения сте этих растройств у больных с легочной патологией (тромбоэмболи? точной артерии, эмфизема легких, пневмония, туберкулез, бронхиал астма, бронхогенный рак, киста легкого и др.).

Нарушение легочной перфузии отражалось на сцинтиграммах С шим или меньшим снижением плотности сцинтилляций, деформироЕ ем изображения легкого. Определяли количественные показатели с ционапьной пригодности 99M-Tc-MCA(Sn): степень фиксации препа изменения клиренса крови, скорость выведения из органа, уровень t пления в окружающих тканях и др.

Результаты клинических испытаний позволяют утверждать, что парат 99M-Tc-MCA(Sn) соответствует требованиям, предъявляем! РФП, предназначенным для перфузионной сцинтиграфии легких. Пс зико-химическим параметрам и получаемой информации препарг уступает зарубежному аналогу ТСК-5 (Cis bio international, Франция).

ВЫВОДЫ

1. Разработаны схемы полного фармацевтического анализа hi отечественного препарата для радионуклидной диагностики заболе! легких "Микросферы альбумина, 99м-Тс" и реагента для его получ Проведено комплексное изучение физико-химических и радиохимич свойств реагента и препарата.

Разработаны схемы анализа микросфер альбумина и микросфер ьбумина, модифицированных оловом(И) - промежуточного вещества и новного компонента реагента для приготовления РФП "Микросферы ьбумина, 99м-Тс", соответственно. Обоснован выбор показателей чества МСА и MCA(Sn), которые необходимо контролировать, и разра-таны аналитические методики их определения. Установлены нормы казателей качества МСА и MCA(Sn).

2. Предложена методика количественного определения Sn(ll) в 2A(Sn). Разработаны методики количественного определения Sn(ll) и щего олова в постадийном контроле технологиии получения MCA(Sn). »казана правильность разработанных методик количественного опреде-ния Sn(ll) и общего олова в MCA(Sn) с помощью определения баланса

олову при получении MCA(Sn) и сравнения результатов определения ова, полученных методами эмиссионного спектрального анализа и ¡ссбауэровской спектроскопии.

3. Установлено оптимальное количество Sn(ll}, которое требуется язать с МСА при получении MCA(Sn), чтобы обеспечить максимальное язывание MCA(Sn) с технецием-99м. Оптимальное содержание Sn(ll) ставляет от 3 до 7 мкг/мг микросфер.

4. Разработаны методики количественного определения олова(И), >лка, твина-80 и хлорида натрия в реагенте для приготовления РФП.

5. Изучено влияние следующих факторов на относительную актив-сть РХП - основной показатель радиофармпрепарата.

а) Количества Sn(li) в реагенте. Установлено, что содержание РХП в епарате главным образом зависит от количества Sn(il) в реагенте. Оп-мальное содержание Sn(ll) в реагенте составляет 17-35 мкг/флакон (3-икг/мг микросфер); при этом количество РХП не превышает 4,0%.

б) Объема элюата, применяемого для приготовления препарата, а кже возможного разбавления уже готового РФП 0,9%-ным раствором орида натрия. Установлено, что на содержание РХП практически не азывает влияния объем элюата, используемого для приготовления •епарата в интервале от 1 до 4 мл, а также и возможное разбавление тового препарата 0,9%-ным раствором хлорида натрия.

; в) Времени хранения радиофармпрепарата. Установлено, что препа-т устойчив в течение 5 часов с момента его приготовления.

г) Объемной активности технеция-99м. Установлено, что при объем-й активности технеция-99м в препарате от 18,5 до 296,0 МБк/мл (при щей активности от 74,0 до 1184,0 МБк) не наблюдается значимого из-¡нения относительной активности РХП в препарате.

д) Стерилизации реагента ионизирующим излучением дозой 1-106 д на показатели качества реагента и препарата. Установлено, что сте-лизация реагента указанной дозой ионизирующнго излучения несколь-снижает содержание Sn(ll) и твина-80 в реагенте по сравнению с не-эрильным реагентом. Однако относительная активность РХП в препара-

приготовленном из стерильного реагента, становится ниже.

е) Способа перемешивания суспензии при приготовлении препарата, тановлено, что перемешивание вручную или с помощью прибора для ремешивания не оказывает влияния на количество РХП в препарате.

6. Проведено изучение функциональной пригодности но отечественного РФП "Микросферы альбумина, 99м-Тс" на крысах и ликах. Биологическое поведение РФП 99M-Tc-MCA(Sn) аналогично т вому препарата ТСК-5 ("Cis bio international", Франция).

Найдена корреляция между аналитическими и биологическими г затея ям и РФП "Микросферы альбумина, 99м-Тс".

Отечественный препарат "Микросферы альбумина, 99м-Тс" по литическим показателям качества и биоактивным свойствам отве требованиям, предъявляемым к препаратам, применяемым для перс} онной сцинтиграфии легких с целью исследования капиллярнрго кр бращения.

7. Исследована стабильность МСА с целью установления срок годности. Установлено, что микросферы могут храниться в течени месяцев при температуре +2-10 °С.

Установлен срок годности реагента. Он составляет 12 месяцев температуре +2-10 "С в условиях холодильника. При этом не изменя радиохимические и биологические свойства получаемого из него пр рата 99M-Tc-MCA(Sn).

Изучена стабильность реагента при хранении в течение 14 суто* комнатной температуре. Установлено, что хранение реагента при укг ных условиях не изменяет его химических и радиохимических свойсте

Установлен срок годности препарата 99M-Tc-MCA(Sn) исходя и: риода полураспада технеция-99м (6,01 ч), радиохимического и bv гического поведения РФП. Он составляет 5 часов с момента его nf товления.

8. Разработанные методики аналитического контроля качест данные анализа стандартных образцов реагента и препарата вош проект BdJC "Микросферы альбумина, 99м-Тс, реагент для получен! в Стандарт предприятия Медицинского радиологического научного тра РАМН "Микросферы альбумина (МСА)".

Основное содержание диссертации отражено в следуй: публикациях:

1. N.B. Epstein, Z.M. Potapova, Yu.Ya. Kharitonov, V.T. Kharlamov Khleskov, V.M. Petriev, V.G. Skvortsov. Protein determination in human s albumin microspheres with and without attached stannous //Pharmaceutical and Pharmacological Letters. - 1995. - V. 5, N. 3.- P 100.

2. Z.M. Potapova, N.B. Epstein, L.P. Starovoytova, Yu.Ya. Kharit V.I. Khleskov, V.T. Kharlamov, V.G. Skvortsov. Quality control of 99r labelled microspheres for studies of the pulmonary I circulation//Pharmaceutical and Pharmacological Letters. - 1995. - V. 5, - P. 135-138.

3. А.Ф. Цыб, Н.Б. Эпштейн, В.Г. Скворцов, Ю.Я. Харитонов, З.М тапова, В.М. Петриев, Л.П. Старовойтова, Ю.Б. Дешевой, Е.П. Па В.И. Хлесков, В.Н. Корсунский. Новый отечественный препарат для фузионной сцинтиграфии легких - микросферы альбумина, мече

¡хнецием-99м//П Российский национ. конгресс "Человек и лекарство": зз. докл. - М., 1995. - С. 270.

4. З.М. Потапова, Ю.Я. Харитонов, Н.Б. Эпштейн, В.Г. Скворцов, М. Петриев, В.И. Хлесков. Аналитическая химия нового препарата для зучения легочного кровообращения//ХХХ1 научн. конф. факультета физ.-зт. и естеств. наук, посвящ. 35-летию РУДН: Тез. докл. - М., 1995. - Ч. 3. С. 47.

5. З.М. Потапова, Ю.Я. Харитонов, Н.Б. Эпштейн, В.М. Петриев, В.Г. кворцов, В.И. Хлесков. Контроль качества микросфер альбумина, эченных технецием-99м, для радиоизотопной диагностики легких Российская национ. конф. "Формирование приоритетов лекарствен-)йполитики": Тез. докл. - М., 1995. - С. 136-138.

6. А.Ф. Цыб, В.М. Петриев, Н.Б. Эпштейн, З.М. Потапова, Л.П. Ста-эвойтова, Б.М. Мартьянов, В.Г. Скворцов, Ю.Я. Харитонов, В.И. Хле-:ов. Микросферы альбумина, меченные технецием-99м, для диагности-1 рака легких//Всероссийская конф. "Опухоли висцеральных локализа-1Й: ранняя диагностика, профилактика, лечение": Тез. докл. - Томск, )95. - С. 256-257.