Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Усовершенствование лабораторных методов диагностики бешества животных и идентификации возбудителя болезни

Нэ правах рукописи Для слукфффугтфо^кпя Экз. й

¿hbafxgm

'СЕЗТДА]1А FACA3ïOEtt

УС0ВЕРШЭ}СШЛпШ1Е ЛАБОРАТОРНЫХ МЕТОДОВ ДИАПЮСТИКИ БЕШЗНСТВА животных и ИДЕНТИФИКАЦИИ ВОЗБУДИТЕЛЯ Б01КРНИ

16.00.03 - всторишркзя микробиология, вирусология, опвзоотология, микология и иммунология

Автореферат

диссертации н:з соискание ученей сгепзия кандидата кэгоргиарши наук

Кэ-аиь 1998

РаЗота вшблнзшг ко Всероссийском научис~Есследовательском ъот^идарнса институте (г.Казань) и Б&ькврской научно-про-ii3BOA0TE0mtcil Есгерннзриой лаборатории (г.У$з).

Нэучпыз руководите.«'!

Осидильнке опдонеитш

Бздуцая организация:

- ааолу^ешшй дьятсль науки Pi i; FT, доктор BeiepaiiJpiiiiA наук, npojaooop Юсупов Р.Х,

- кандидат биолога чзскшс ьаук, стерашй н&учний сотрудкш: Хкспзтуляана H.A. •

- доктор ветеринарных паук, профессор Низаков Р,Н.

- доктор ыэдицзкскзх наук, про$еооор

, Поздооз O.K.

Всероссийский гооудвротвйкауЯ научно-исследовательский внститут контроля, стандартизации и оартнфшшции ветерана рншс препаратов (БГШЭД).

Ззд.вта состоится " " ............. T9SG г. в часов

ш заседании дпссертациопного Совета Д-120.05.01 при ¿осроооийо кои научно-исследовательском Еэтершшрнси вдотвтуто (42GOIO, г.Ксоаиь-18, На у 41 ей городок, 2 , Н1ИЕ1). _

G диссертацией. мо^ко ознакомиться в Оиблиогако Dcspoccniic-кот'о паучио-йсоледэватольокого ветеринарного института (г.Кэ-эаш>).

Автореферат разослан "

19Э8 г.

Ученый секретарь дассортационного совота -

СТЕПАНОВ В. И.

I. ОБПЙЯ ХАРА1ГГ2Е!СТ1ЕСА РАБОТЫ

I.I. Еагэпствэ зэиимзат ясшючвтельпо

BSXHOO ms сто в иафекцаыпюй патологии. Восправмадвосгь к зебо-лопаявю ;::.! всех пи до в докззямс а дшгазс гл.'всшдк;, ' огромная о:.пс-кость для чзловекп опрздоллз? ого социальной в окономаческсэ значение в привяйкгпг к пому пристальное внйызняе вэтерянэрнса, •• ¡гвдвдвкокой кэукя л зроктяка (СелЕмйв U»A*., 196?; Торшг-з Н.Г., Ковалев К. А., Кузпзгов ÍI.II,, 1930} Юсупов Р.Х., Хгсиатуллзкп H.A., 1991-199If Eoramcmt А.Д., 1992).

БЗДНОЗ М80Г0 В Öopl jO с бОНОКОМОМ ЬрИНОДЛааЦТ рЗККОЙ Д1ШГ-

ностяко, которая слудаг основанием о наобходккост" проведения _ лэтебно-про^идззггачсояих и дротивоэпызоо~ичосют мероприятий (Селвков U.A., 1975} Ко план М.М., IS75} Бкилзтень 303, 2енеза, 1937).

Дзи диагаоствкй бешзкотвз разработана и при,мнятся различите катоды ¿ГОСТ 2dü75-84). В калом, лаборзтор.таа пэтоды обеапс-чзг.япт поста давку диагноза всаонитва. Однако вое она в той пли иней стопок:) обладают рззлячшши недостатками. ,

В последнее время для ускоренной диагностика бегеястпз интенсивно раэзкаэстся метод иммунофорионтного анализа (Хисгдэтул-лннз H.A. и др.., 1985, Ï939, IS95; Юсупов Р.Х. а др., IS39, 1995} Ботпанкин А.Д. и дрт, 1935, 1987, 1992; Сззэловя С.Д., Нузнзцовэ G.B. I! др., 1931; Зэлютша--Т.З., Е;пнякоз И.9., IS92 П др.).

Язнь^а яроямущэотваки этого госта являются яроототэ быстрота вияол;:еиял, euci :ая чувствительность, доступность п стабильность .роогаятов, юзкозность автсг.'этдзпциз процзссэ а объективность пистидазигвлького учета результата (И?ссш:о З.А., Есстотекко ILT. и др., 19Э0, 1233).

Б плана усовзрхзнстшвзнля изтсдов днэгдостшсз бетанства з послодасе годы п.пктагг'.тся ¡гспмьзозеть нзтод ¿••ыдэдзцяя уллч-.чого рбапзского. взр7са в культур? зготок пзь^ата Гзсоероза уалп праоы (¡ЕГЛ{-1). Поязгаяо, что э доппоЗ кульгурз теток улвч-пкй рзбп^оскяа вяруо мс.?.эт быть вздзяэп'в звэчзжя&ао болаэ рэн-нвз орокз- (3 cyïos), чем арз 0кгрз'с5рг4роя£яо3 япояувдяи кипой (до SO cyrc-)' (Атада H.a. Л'др.» ISSî; Тятаряз А.Г., Сел^-ов U.A. 3 др., ICS5, IC37{ Хятзтуддгт:з H.A.* ISC3; Юоупоз Р.Х. и др., IS39).

. • Несмотря га Г4но£отао£3гашо штодв, прлкеаязгшв дяя лобора-

торной диагностика бсаекстаз, оцош'.а оффехтввцссти и дальнейшее усоворсо^ствовэшю совреглзшшх зкспресс-ызтодов диагносткай бешенство, а 'хакде-практическое их пршененае, по-преашду осто-ется оч нь ввшюй зсдачо* вомрянэрзи к здравоохранения,

1.2. Иоль, 11 ррг.пч^ .япслстав-гний. Основной целью исследований является усоБоряено'.'^овоисв лаборзтор:шх катодов двагноси;-ка бешенства - иглгуасйзрг/.снтлох'о шалкза 2 к/диунсйлуорсзцснда на основе применения ьобого фермента, флусрохро;.», а гку.е изучайте нокоторьс. •гг.'А^ьойиоЕогачисиз: свойств асузоотичосииз; изо-дяхоа вируса болбкства» аздодашшх в кебдагоаояушас оздгах Геспу&ш:;! Башкортостан.

В евши с отим <5ыш позтавлени следувдаз задачи:

1. Усооераоцзтговггь а:слт,оос-ыетоды виавлеивя и вдеитп&ь кация вируса йелоиствг на основе нового форманта в фауорохрс:.и:.

2. Провести срааавтедьну» оцзкку гф^зктивлоотв общепринятых и усовершенствованна: лзборагоргек катодов диагностики бе-иенотвг. '

3. Изучить иехохорио шялунсбиологическкй свойства егшзеога-чзских сзолягоь вируса баконотва, вздаизшшх не территории иортостана,

4. Енздрать в условиях ]ЗгаШШ1 ускороннвй готод вэделэнкя опвзоотичеокюс рзбачсского вируса а культуре глоток ИГУЙ-1 с носледувцх; анализом по К£А, 'а шад ЕЛ дяя ха*-иддевия елгигека вируса бешзкетва в ватаюх'ячсско^ {.аторуало.

5. Сосгвь»«. слсь:/ проведэнзя лрбортеох.иоИ д1.г.:ос*п:к бе-шепотвз.

С. Рсзр^статв рецецидаздз но лаборихорпед д^Н1>">С1;:;:о ио^зцетва «свссшг/.,

Габона В!;1.ол1Н'-;.п г. с плли'п ¡юу^г;: веследо-

вэнкд ЕШШ по те\;е: "Нау-лю обезшяать к рггрз^оитв изо &лиооогож>Г4;чаешч> кмшхоркцга'» сисин^ш сС'./лнгах.дыш нрограглиг,: кир по окдао седьзкскозяГютьлипих говело"; ш йе~ сенотва, ввшюз »релумрчкудаз к с2Ш»я иэ торриго]' ¿и саран, лохаевгадз» и дшз'Здодеи в случаи возшп-^иви;;.,.: сп4;>ю«.ч:<!;сскс~ го очига" (иог.зр ¿-осрс-гвоа-радз /01970032100, еш.3* 0^.9.70001020.

1,3. ШХЙШШ-Ш^ШШЬ. Усобзцинстеоззнц из ссиово нового

форманта у флуорохроиз катод 1ИА с для виявломя и идевтифк-

га ода опизостичесмж » лакцвннах птйжое вируса б^-лояства. Изучением шмунобаологячсски: сзоМстз ятажоз рзбянеского вирус л, цлркуларукз1Ил' га территорли Еппкортостана, установлена патогек-, ' пость их для д!"«!х, с9льскох08яйсте9япн5с, док8ених я лйборстср-

них зивотных. Дана сравнительная оцашсэ эффззстялиоогв лабораторных методов при заявлении вируса бохзиства в патояогвчесясм чзтеравлз. Тсст з культура исток ИГУК-1 по чувствительности не уступает иатрацзребральной инокуляцяп белых мцшаЗ. Этот /летод, а тайге усовершенствованные акспреос-матодц диагностики боной-ства на основе нового фермента и фдусрохрома позволяют в более ранние сроки по сравнению с оиоаробой на белнх мышах выявлять взрусспецифичзсяий снгигек и патологическом наторело,

- 4. Результаты исследований

сошли в слгедущке разрзботзшшэ в внедроинке в практику НТД.

• I, .'»¡етодичсскяо указания по лабораторной диагностика бешенства аявотных (/гаерядонь Двпапромвктом встерзпзряи Шниот.ер-стга сельского хозяйства и продовольствия Российской Федерацзп 14 г/ал 1937 г.);

2. Наставление то пргмеиенвю исбора ?-р?взргов для евязяз-:?вя аи?ип<5ячоскях ачгмзя иотодой вмг.унефзрг,:-2нкюго анализа (1Ш). Одобрено Нзучконкзгодяпесшя» севзгои (протокол Л 3 от 31.ОХ.1997 г.) ,'! укзоргд-зяо директором НШ1 35.0?Л£97 г.;

3. Схема лабораторией деошсогзкя йеггчжз. Одобрз;ш Пз-уптмаясйзчвсяад соготш (вротона 3 3 &г 31.01.1997 г.) в 1 утверздбйп директоров ШИШ 25.02.1597 г»;

4. Ийтод стауно^уорведашвю. Кнфэразцзошшй-листок д 93 -29, ГлТЕС "Еаитзхивформ",_199б; "

5. аяспросс-д?зг«оогйга беаенотга з яуль'гур-з кгвгок неври-нома Гйооороээ узла криси (ШУЮ. Йгфрхедаогпш.. лвогок ,'5 193-С-о, ГНТЖ 189*3;

6. Ускоренная мЕЗгпсотия бекекстЕЗ явзе-гак игуунс^зркент-газм аэтодом. 1&фркаизоипай лас?!» Я 10-37* РНШ "Бсзтззсвифорд",

1997.

7. й1нуко$эризн*яаЗ кэход оцчйзет ггзпряяеяноста ноствзкця-исяького шцунгтета прз беззгятгэ. .й£грсаи5оша»Л леотез •

3 1-37, Н'Ш 1237.

1.5. Ат-.г-г1гщкк работ??.. Иаторхаза даоссртацаа дадояана и полупили положительную уценку по каучнвх конвенциях ЕАУ (г.Уфа, 1395}, ШИШ (г.Кйзэнь, I9S5-I9S?), маддунородагам kcojj-динациошюм совецянии (г.Воррйзк, 1907), йэседанвях ученого Совета billEIi 199.1-1997 г.г. и ¿¡еШВЯ IS94-I9S7 г,г.

1.6. Рубрикации. Основное содзрконйз работы вздо&гно s 12 научных публикациях, в том чяшю 4. вп1>оршпяошшх гкотка в "Методические указвнкя..

1.7. Оаковике прлгжэккя, хшоошив ю защиту:

- усовершенствование метода ИМ и ША для вшпшшия и вдоя* "■"фвкоцвп вируса беиенства- на основе нового фермента у фауоро-хромзi

. - сравнительная оценка вафективноств общопрзкдтше о усовер.-иенствовашцвс мзтодов лабораторной диагностика бешенства;

- разработка катодачосквх рокомоидацаЦ ко лабораторной двар-ностйхе бесанствачкаБэткых.

1.0. Ствуктуго п обт-зм иослядорчнчЕ. Дасосртащш cooroi» из введения, 'обеора литоратурц, собственных исследований, сб~ оуздеквя результатов исследований, виврдоз, практических прад-лонений, списка ¿снодьзовашюй литературу в прилсжсквй.

Текст дасеоргацзи езлспзц ibïCO странкш:: изишиодаси, кл-люстрярован 3 фо?огрофвяш и 13 таблкцг<л'.. Список двтаратурл вагхючаот ISu кавиоиоьанвй, в тем '«««.з 139 отечостшшш и S3 аарубогаш:.

Првлошвд к диссертация зклотаат шдо Кате зпеоккх указаний к наставления.

. . • 2. сошшшгьа шсд:довж;я .

2.1. Е'чтпрвалп н woto»». • В работе вошшАовадй гвкэ-шв» 60 кродакрв, кпбоЦ .массой 3,1-1,0 кг; 20 корездх сюшоц, хтньой массой 0,3-0,35 кг, 4000 бслцх i.aneli, fci'ioii массой G-7 г.

В опытах пршешзт лшов культуры мехак н&зрааэш Гессе-рова уела краем • (HTKÎ-IÎ (Авдца А. П. и-др., ISG4). В кочзстео среды роста всполхзозшхв оралу Июш ККД с дви&ш каборои яма-.локвелот и мшшвнов, рП 7,2-7,4, с гл:охак;тоы, сц-

юоротки кров1! вибриона крупного рогатого скота (ВШШЛ г.Казань), В питательную среду добавляла пенацвлш: и стрептомицин но

100 цц/мл И I мг/мл соответственно.

Б исследованиях применяли разработанные во ВКШЗП (г.Казань) "Набор препаратов для лабораторной Диагностики бешенства яивот-ннх методом игауне-герментного анализа", утверэдзнныД ГУЗ ГА F СССР 30.12.87 г., "Сяуоресцярущий антврзбвческий глобулин", утвержденный Г/В UCX СССР II.11,83 г.

В качество исследуемого изтаравлз использовали 552 пробы патологического материала (головной мозг), из нвс 117 - от сельскохозяйственных, 93 - от различна* диких, 279 - от домашних животных, поступивших из неблагополучных по бешенству районов Башкортостана: КуюргэзикскиЗ (78 - неблагополучных пунктов) ; БиябулшсскиЛ (75), Бирсккй (63), Баколпнский (38), Зиончурсис-кпй (38), Федоровский (36), Мелеу • овскнй v32), Еуздякский (3"), Млешевский (25), Чипмиизкий (2о) и др., кроме того исследованы npo6jj мозга лабораторных йнвотнцх (кроликов, мороких -зинок, белых мшей), экспериментально зэрзяешшх эпизоотическими лзо-лятами вируса бепензтвз.

Контролем во всех опытах служили суспензии головного гсзгз интвктиых белых мыпей (контрольный отрицательный антиген), о также иммуноглобулин сыворотки крови неки'.уназврозанннх животных (отрицательные 1с ). В качество положительного контроля использовали контрольный положительный антиген из мозга белых мышей, зарагенша: рефзрзнс-шткшом Овечий" ШШ вирусч бсшен-стзв.. В качестве гзтерологичного антигена и лользовали мозг белых г.;ыпей, ззракенных птаммом ЕПШ1 вируса болезни Ауески. Все контрольные и ист-туег.ше образцы готовили в виде IQS-нсй суспензии иозга на 0,оо£-нои физиологическом растворе с добэв-легшзл1 пенициллина и стрептомицина. Антигены предварительно ос-ветлетв центрифугированием при 8СО5 в течзниа 15 мин.

Световую микроскопию нз обнаружение телец Ьабеиз-Негрп про-, водили согласно ГОСТу 26074-84, окрэш-шэя препарат по Саллерсу. ,

ЫФА ставила в прямом варианте на предоз' ■ их стеклах по ГОСТу 26075-84.

Прямой сэндвич-вариант ША для овроделения антигенов проводили согласно наставлению по применению "Набора 'препаратов' для лабораторной диагностика бекенства аивотких методом кслуно-фэрмзнтного анализа", разработанному во БНИЕИ и утвержденному

ГУБ ГАП СССР ЗЭ.12.87

Специфические иммунные сыворотки получали на овцах по охе-

ые, описанной Бусыгиным К.Ф. (1983). Е качестве "ионизирующего . антигена использовали очищенный и концентрированный вирус бешенства, штамм "Овечий" ГЯК11, с титром 4,5 1Л /0,03 мл.

Для проверки активности и специфичности ентирабических сывороток и глобулинов использовали РДСК, непрямой 1ЙД по методикам, разработанным во ЗШШЛ (1?е?(*'-1988).

Быделенпе иммуноглобулинов (1в ) из сывороток крови овод проводили путем оааздеиия нааищеннш растворог.1 сульфата аммония с последующей хроматографией на колонке с ДЗАЗ-целлшозой по Сидорову Ю.М. (1931). Часть 1е использовали для конъюгации с пе-роксэдезой (ПХ) корня хрона или пирофосфатазой (Па) из Е.оо11 , фяуоресцеинизоткоциопатом (ФИТД) или <*ЛР-4. Конъюгацию 1е с ШЦ и ГХ осуществляли по методам, разработанным во ШИБИ (1383, 1937). Препараты йЛР-1Б п случал ь по методике, изложенной Л.£ор-ци (196-1), 11Ф-1Б- по Н.А.Xисмптуллиной и Р.Х.Юсупову (1992). Получение конъюгаты разливали в ампулы по 0,1 см и хранили в замороженном и висущеккоц виде при +4°С, - 20° или -50°С. ' '

' остановку метода ИЗА осуществляли па иикроплашлетах с 96-о разъедшь.тш лункам; из полистирола производства Тедполимер", Санкт-Петербург.

Выделение уличного вируса бешенства проводили на перовивае-. мой линии культуры клеток ПГУК-1, заражение л титрование уличного вируса бешенства - по общепринятой методике. Анализ клети: на наличие рабического антигена осушествдгла прямим ПСА через кагишз 24 ч. в течение 5-6 дней после заражзнвк. Спепсфячпосхь результатов устанавливали пнтрацзробра: люк вшжуляцвей б ольх м;.'>зй культ/ралыюй жидкостью.

/ишшз опитов подвергали статистической обработке на про-гроихруеик I'.якрокалькуляжорах тгаа "Глвк^гопски-Ж-Со" (Тушиа-утов Г.Х., Нии.атуллпн П.Х., 1984).

2.2. Уоогещенс?вог.ансо метод* и^гто'^гг-'''ргного анплп.50.с применением нового (Еотаантп для диагностики .сЫрнотея. Дия приготовления пшуко^ерковхних коньигатоь, а также для сепсабглизациа шшшетов использовали онтгрзбвчесмй глобулин класса с ( 1е с ), выделенный методом ионообмзкной хроматографии на калошсо с ДЭАЭ-целлшсгой, из сыворотки крови овэц, иммунизированных вирусом бешенства, штамм "Овечий" ГНКИ, с титром кокплонэнтсвдаывагацпх

зшгитач не менее 1:320, с активностью в ПСА 1:32>.00.

Для получения энтпрэбнческого .пирофосфэтззного копъюгзха проводили связывание в с пирофосфотпзой в соотношении 1:1 (по I мг каццого). Для этого I мг пярофосфзтози из к.ооИ ^створяли в I ш 0,01 М калий-фосфатного буфера, рН 7,5, содеряацвм

• 0,15 Ы раствор хлористого натрия и I мг онтпрвбичеокого 1ц й .

• К I ш этой смеси добавляли по 0,01 мл 20 мМ растворов 'лористо-го кальц;:-1, пирофосфэта натрия и 0,01 ил 5/5-ного водного раствора глутарового альдегида. Смесь инкубировали I ч при (20^0,5)°С. Ечего било изготовлено 9 серий ентирэбяческсго пирофосфатазного конъегатз.

Присутствие фссфзте в реакционной с~еде выявляли о помощью молибдЕт-малзхятовой зелени по наличию интенсивной зелено-синей окраски. При отсутствии неорганического фосфата реакционная сызсь становилась светло-зеленой.

Изучение октррнооти и специфичности приготозлашшх ишуно-ферментнцх кокьктатоз проводили ьрямшл сэндвич-вариантом 1-Ш с использованием контрольные положительного, отрицательного я г-зте-.рологичного антигенов, а-также патологического материала, лссту-пявиого из Республиканских взтерннзринх лабораторий Татарстана и Башкортостана дая исследования на бесенство.

В результате проведению: исследований установлена активность и специфичность зюлунс^ерквнткшс коныагзтов з ИЖ 1!жунофзр:лент-ные коагюгатн реагировали с коптролыьчм полодвтольнш антигеном вируса бспх-кствз, гатам.! "Овечий" ШШ п но реагировали с -¡онтроль-¡шпя отрицательным п "еторологичннм антигене1.", что свидетельствовало у их специфичности. При "том актив; сть П$ КГ составила • 1:500, ИХ КГ - 1:1000.

На следующем отапз исследования«била установлена возможность применения ПФ коньюготов дая обнаружения антигена вируса бешепст-ва в патологпческо: ьатсраало методом Изучение 2-х впкцишдсс □таклов вируса бешенства, "Овечий" ПИИ в "В^/ково-ЗЗ", а таккз 12 эпизоотических,.выделенных от диких, домашних и сельскохозяйственных яивотиых, проведенное истодом ИГЛ с применением 1К и П-5 кокъюгатов, позволило установить бешенство во всех случаях. Сяс-дафвчкссть находсх подтвзрядзка катодом им^сфдусрвсцэнцка и бпо-пробой па бвлих шшх При отом антиген вируса бзгвветво обнаруживался Ш КГ в титрах от 1:80 до 1:2560 и ВХ 1а1 - от 1:20 до 1:2560.

Установлены некоторые преимущества использования вврофос-фатвзи пр.. изготовдзнва в применении пиро^осфатсзного копъкгата по сравнению с аналогом - яерокеидазой из корней хрена: I. Простота в острота изготовления Па КГ - б течение 3 ч вместо 3-х суток - для Iii КГ. 2. Извлечение пирсфосфатази не требует продукта растительного происхождения (хрена). Пирофосфатазу получают вз E.coli , которую легко вырастать в больших количествах (НПО "Фершнт" Республика Литва), 3. Оерыект Ш> а его субстрат (пнрофосфат) стрбв-шш в не опасны для здоровья. 4. íudicoe взыь-пение цвета продукта пврофосфатазной реакции (от светло-зеленого до' интенсивно сине-зеленого) очень удобно для визуального анализа.

Изучением стабильности ПФ коныагатов при хранении их в различных условиях установлено, что они на теряют своей активности в замороженном и лиофвльно висуиешюм состоянии при хранении -20°С влв -80°С в течение 6 в 12 месяцев соответственно. В жидком состоянии они не сникали своей активности ышюиуц 1,5 года при +4°Г Санин удобна и надежным способом хранения является еодер-. яанИе вх в лвофвльно высушенном состоянии при +4°С. В этой случае они сохраняют активность до 1,5 лет '(срок наблюдения).

Установлена чувствительность нирофосфатозыого вилуыоаналвзд, которая составила 3,5 lg Ы> 50, что отвечает ветерштрно-техни-'leciasi: требованиям, предъявляемы»! к дийхчностичсекш препарата;,:.

Чувствительность пврофосфатазного к ¿.зукозкализа цзздачател'-нэ отличается от таково!: иероксидззного вкцуноаналази, которая ' составляет 3,3 lg ь® ¿0"

Таким образом, усовершенствование технологии получения ягл.г/-нофармеитиого коныогыа с использованием нового $ср«зкра - пирсфосфатази яз в.coli в применение его для /.»агностики бешенства расширяем арсенал даахчшствческвх средств а штодов при бешенства.

¿•3. 2&Т10ги!енстог>Рл;;ип йлуорсоч:фу»х|1'х тгедтал с

прривнеииац tfaiyoroxwn ОАР-4 .шу. диагностики беиеноква.. Лля получения вьыуно^яуоресцонтяого конъэтгата проводили коиъигврование снтврабвческого глобулина овец с фяуоресшфувдвги, красителей оран-лево-красной ллмшеоценцив ШМ из расчета 100 мг глобулина на 4 мг красителя. Дгалаз проводили а течение 4 сут против 0,01 J.I wSP, pH 7,4-7,6 при С со сменой дцализущей нидкоотй 2 рааа

в день. -Активность и саои^фиодость аитирябичзского 'флуоресцируй щего глобулина определяли микроскопией мззков, прцхчэтовленных аз < мозга зараженных возбудителем бешенства а заводомо здоровых зиготных, под люминесцентным микроскопом ДХШ~И2 при увеличении 5 х 50, 7 х 90, светофильтрах СЗС 24-4, ЗС 11-3 и красном запиравшем светофильтре.

Н результате.проведенных исследований установлена специфичность и активность имлунофлуоресцсцтних конькгзтов, изготовленных на основе флуорохрома ФАР-4 а иммуноглобулинов (1е ) овца. Лчыунофлуоресцентные коньюгатн реагировали с положительным- контролем и не реагировали с отрицательным и. тетерологичным антигенами, что свидетельствовало о их специфичности. При этом активность коныогатв составила 1:32. На полояителышх препаратах, окрашенных антнрабическим глобулином, шзченйш <2АР-4, аитиг'л; вируса бе-леиствз енявлялся в виде ярких оронхево-красних гранул различной формы и гелач лш.нз отрицательных контрольных препаратах (отрицательный и гетершюгичныц антигены) подобных образований ке отг.;ечалось.

На аледупцги этапе исследований провала сравнительную оценку эффективное га конъкгатов овец, меченных. ШМ и 4'ЛТЦ для диагностики бешенства по

Ка примере изучения 55 итаммов эпизоотического и фиксированного вируса бешенства показано более гнрзЕенняя объективность доя диагностики бспеиства конъюгатов с шм по орзвненво с аонью-гатамя с :;:тц. Ксиъкгаты зитирабяческих 1с с 'ШМ позволяет обнаруживать антиген вируса бек:енствз в патмзтерклле, храниваонея в замороженном состоянии _и течение 23-24. мае.

Кроме того, с помочью хенъюгата с 4АР--4 на 12 из 17 исследованных отпечатках получен полояателышЯ результат, а с конъюга-том 1с с ®ИТЦ лишь 5 раз л 2 раза сомнвтельньЗ. Отрицательные результаты с конъи'ятамя 1д с £ИТЦ, в основном, получены при исследовании препаратов, хранившихся более 6 мое. Кроме того, отмечена белее четкая контрастно 'ь специфического свечения при вспользсванчв конгкгзтоз с -ШМ по ерзгнонш с коиъьгатаиа 1с с 4аТЦ.

Изучением стебшиноетя йнтяргбпчеекого глобуляяз оранзово-красноЯ лшзнесцеяцяо установлено, что он не теряет свою активность пря хранении в лнефглцзврозэнком состояния в течение 12 мэс (срок наблюдения) при +-1°0.

Определена чувствительность МФА'С применением антирабическо-io Ig , меченного САР-4, которая составила 3,9 ie ld 591 т-е. .была сопоставима с таковой при использовании Ig , меченного ¿¿ГГЦ - 3,8 ig хлз ÇQ, что соответствует ветеринарно-техничес-кпм требования:.!, предъявляемым к диагностическим препаратам.

Таким образом, разработка ацтврабичзского глобулина оранжево-красной люминесценции рзеширяет арсенал диагностических средств ' при бешенстве аивотних.

2.4. Изучение иммунобиологических свойств эпизоотических (итвммоч, вируса (Зевенотдя, пи^кудицукних на территория Башкортостана. Для идентификации возбудителя беаеыстьа, выделенного дама в республике,испальзовшзреакцию нейтрализации, ИФА и f.!iA. В опытах в качество специфических антител применяли антнраоичеокий гамма-глобулин, полученный аз сыворотки крови овец, иммунизированных вакцинным штаммом "Овеч;й" ЩСИ вируса бешенства с и и ок-сом нейтрализациа, равнш 2 и болео.

Результатами исследований 112 проб патологического материала от различных видов животных из неблагополучных рзйонов республики (Бижбулянский, Куюргазинскиц, Барский, Бузднхский, Ыелеузов-сквй, Бакалинсквй, Федоровский, Зяанчуринскмй) с помощью ИЗД и МФА с применением вышеуказанного антярзбического гамма-глобулина показано, что взрусспецифвческий антиген выявлялся в титрах от 1:10 до 1:320 при К^, равным 2,1 ù более. Эти данные указывают на специфичность как оболочечного, так с нуклеокапсидного антигенов, а такао на антигенное родство циркулирующих в Башкортостане шхвю-ов с вакцинным штаммом "Овзчай" IHKii. На следующем этапе экспериментов била установлена патогешюсть изучаемых штаммов, циркулирующих в регионе дая лабораторных ^квотных -'белых шшвй, морских свинок и кроликов. Специфичность клинических проявлений бешенство - у животных подавэрздэна методом ПСА л USA.

' Болыиинство испытанных ташов вызывали заболевание белых ьшпей с детальным всходом при ширрцаребральном'и подкожном способах заракзкия. Продолжительность Вадимах проявлений болезни (взъерошеиность карста, горбатость спины, тремор при поднятий на воздух пинцетом за койчак хвоста, нарушение координации двиезная задних конечностей, карзлич) обычно составляла менее суток 0 в редких случаях 2-3 суток. Epia этом нюубзцаойшй период варьировал в среднем от 7 до 34 суток.

Для характеристики вирулентности итакмов вируса использовали индекс инЕазвЕиооти, который определила как разницу титров в пересчете на I мл суспензии при интрэцзребральном и подкокнсм заражении.

Исследованиями показано различие штатов до степени пэто-гзшюсти для лабораторных аивоткцх. Индекс анвазивности варьирует от 1,8 до 3,2.

В результате экспериментов накоплены некоторые данные по случаю абортивного бешенства у белых шей, заряаешшх изсшшши от больных бешенством диких и домашних зпвотнкх. tiu наблгдали четыре случая выздоровления белых ï-uniisii, переболевших бепенствои с явно выраженными шшшческнми проявлениями, характеризуешься возбуждением с послодутсузмв парйлячзна задних конечностей. Лродо.а.хителы:осггь клинических проявлений длилась 2-3 дня, ;<ачи-ная с 9-1I, 25 дня после заражения.

Следовательно, в республике Башкортостан циркулируют как висоно— , так и слябопатогешше штпжн вируса бевеистдо.

На следущем этапе наших исследований иеойхрдпи.'о било изучить возможность 1нд0л8ния эпизоотических егенное 53, w-jp/ty-лируюцих на терркторви Башкортостана, па культура длзгс* НГУК-1, чувствительной :t удкчшз» вхэшод, установленной длл других регионов страны.

Заражение культуру клеток ГОК-I о последующим анализом по

проводил;' параллельно с н'бногсробоЯ из белых глгхзг.

Исследораппем 280 проб патологического глтэргалз, нолучзп-шлс от рзлячных декзх, сельскохозяйственш.'х и латенят лавотгог«, постулаших из неблагополучных районов Взшкортсстачэ, вирус бо-иенстга гчдолен как нз б&чнх ¡гелях, так и на гяетках HlTK-I. Цг-•геизтячеокого де£ст£зя язучвзгаж гстиков го сбпзруг.оно.

Антиген вируса боконствч появлялся в препаратах в ярких здзтевэто-звленде грзиул различней iopiu ц' гелячагп - от одез зшгетга« до юквдгссся 15-20 гл:м з дземетра. Иногда отаочя-лооь бо-шпоо кглвчео-гво кэнггах .гзлто-з&язнкх частиц (размером до 0,5 м?см ..округлой а овалт-нсй •§ор,«н).

В контроле, гдэ клзткч ЗГКМ иикуС-яровала с мозговой взвесью ст кяшич8«кя здоровых яизожпг:, при опраиввэнав их фтуорсЬ-шрущш внтярэбачеокш гдебулквом, опзцпфичоскЕх грзиул нз сб-на руг1: зал и.

Специфичность н&ходок подтье^г-дзна бвопробоЦ и МЗА.

Наличие вируса в культуре клеток, установленное по 1,'iA, подтверждено заражением белых ыыиеГ; культуральной жидкостью.

Таким образок, на основании изучения, иммунобиологических свойств штаммов вируса бешенства, циркулирующих на территории Боатортостана, установлена патогенность их для сельскохозяйственных, домашних и лабораторных животных. Показано антигенное родство эпизоотических штаммов раоического вируса с вакцинным. Исследованные штаммы но оказцвэли цатопатяческого действия и выделялись в культуре клеток НГУК-I с последующим анализом по МОД.

2.5. Сравнительная оценка э&гективкости общепринят^ и veo- • вершено.'вованных методов лабораторной диагностики бешенства. Исследованиями 151 пробы патологического материала (головной мозг) от различных видов животных, поступивших из неблагополучных районов Башкортостана положительны*! диагноз поставлен методом Ий в . 148 случаях, что составило 93,СЙ, no МСА - в 147 случаях (97,4$). В 3 пробах мозга (2%) педокительних по биенроба и нодовыявлешшх методом И£А вирус бешенства содержался в титрах менее IB 5q/0,03 1дл. При этом результатами световой микроскопии тельца Бабеша-Негра выявлены лишь в 37 пробах, что составило 24,5^, т.е. >не выявленными оказалось 75,Ь% проб. Это указывает на низкую чувствительность световой микроскопии.

В дальнейших исследованиях определяли корреляцию результатов И£А a üiA, определяя коэффициент соответствия.

Из 155 проб, двадих полонителышй результат хотя бы в одном из 2-х тестов, 152 пробы (98,1%) оказались полсяитеяьншо в обоих, одна проба (C,6í£) - только в »ФА и две пробы (1,3/ú) оказались полоз;,гельныма'только в КСЙ. 1'з 127 проб, отрицательными в обоих тестах оказалось 124 пробы (97,6$), две пробы (!,&%) - только по USA, одна проба (0,82) - только по ИЗгА.

Таким образом, установлена высокая корреляция результатов ЫМ n.íKA при всследовании 279 проб головного мозга различных аввотных (коэффициент соответствия 98,9$). Незначительное расхождение результатов этих тестов связано с более высокой чувствительностью И'йА по сравнению-о 1Ш, а текао избирательной локализацией вируса в отделах головного мозга.

. В то же время показано 100%-ноз совпадение результатов ИМ и МФА при исследовании пвтматерзала, полученного от экспериментально зараженных животных.

необходима такс указать, что в сдш-í олучпе патологическая материал от крупного роггтого скота нра положительных результатах по U'üh и JKA цо;;озол огрлцзтааьгагй результат по биспрсбе. По-ввдвксму, ото связано с мсшп количеством вируса в исходной прсбо я япойтигацяи его при транспортапогка п хранении.

Следовательно, метоп !'7Л яслязтся ол-оцафвчшпд и гысохочуз-стг-'лталыпя.! тестс:.! обяаруг.онля рзбичоскогр зотйгона в патолога-ческсм г.'.атсрззлз.

Тапс.м образом, d результата широкой япрсбэцаи метода о лржензнвсм !'Ifcâopa препаратов для лзборзгсрио:! диагностик] бе-иеастгэ методом Ш", рззрзботяюого во.ШЛИ (г.Козснь), покз-anuo, что c:i ycsoî бнть сспользоии гая 'обнаружения аитпгсиэ лп-руса беяенсма в гологлаз мэзгэ sksqtejc:, уш <н».:эз?оягельш<2 зксяр:сс-мгтод дпзгностаг.;.!, тз:: п л сочетании с М?Л я бзолробс!?. Одновременное прй.:гкенл9 лъуъ эксярасо~г.5?олоэ (1ЙА и гш) обе-спечигает более пядегниЛ диагноз, особенно'при сгсзштслыгс-м результате одного из них. При ото:,. кпуолыпШ учет р-ззулиатов USA нэ трзбуэт ciieipi'ïï-HOif еппзрзгур», *:то поэхатсз? nsîb'Tbaociîfb его n naies'jx условиях и лаборзторга га

цвкроскопзна» Ко здрзквв сйковболяззрогзпгпс yv.:-';- ч.-г"?' булташ . гошвктш розуллтзт П'ГА мо.'.ет 6i;t:s гголупп я *гепгЛ'«> R-0 ч»

'ùii: у."0 от:.*о'?алось, согласно ГОСТу з катагго одного гз когда» дпатяоотзка бгд?:!073з.рз::с,:згпуо?зя бяояоютзокзя пройа пз 'бзлих мкпах. «Тогтог'у ззхйо ¿и?» тркяь з врагяматьБсз оскэцта диагностическую цалгсста наслоим вируса бСЕСнотп а культуре клогск Ш'УК-J п путей гористого гиггаог*Зрзлsuero сгфз-спия

бслнх i.-'ül'oií.

Узучзигба 300 прсб вчгсгога'хспм'О >п13р?пля, ислутсгшого от лгм'.'У.. зел*«?.тасг*:5ет?.в:?ли5 " лпънвпх ~~'зwt, установлена ел пая г.пр1'.г:я:;;!я р:зультя?зп бгопрзЗн-м сгш;х !лпз:1 в па лашш глете-; ПГ7ь~1.

По.чзгаго, что в шшх пезрп.'!Ст.:а Гэосэрьвэ узла крысы рз» dircccwü лврус wc;-3T бигь ггпелзи в Оа'геэ епп.чиз орoral (через 1-3 сутс;: mww зарягепия)', чоп nr^inpsdpaib'.'cii рпокуляцрз í'M-ir;; (;л G-I0, ппот-лп г-:а 34-Д .сан»),

'îoi:j-?j сбрппсгл, í:ítcu шзшшвя биодглп и пульзурз ;:леток Щ.7К-1 не уступов? во изтвптельйостп злаосзчесхсН баипробч на б мыл ржах.

?,.6. Рпзрч6»ту:п Сх':гн лвборзтощо"; диагностики бенснс-тва ио.основе угопощенсу^оваинш: методов» Ез основании проваденннх исследования лабораторную диагностику бешенства рекомендуем про-зодить до следующей схеме: иарьонтвлыю дня быстрого выявления вирусного внтигона в патологическом материале использовать метода ИФА или /¿А. В случае отрицательных результатов по вызоукезап-нш тостом иле душ подтверждения диагноза проводить выделение уличного вируса ез инфицированного материала сосредс.вом культура клеток НГУК-1 с последующим анализом по МФА ила ИФЛ.

^нботтотжоЦ бешенства

следуемый материал.^^

(пробы мозга) ч

сэвдвич-варзанг. , ЫФА (мазки-отпеч .тки)

+ + + +

в случае получения отрацэтедышх результатов .йиопроба

в культура глетск НШ-1 с последуввцга „Ё1ШЛи'ЗОМ по ^ .

Ш

, + *

* 4 " - цолсЕагиЛьць& результат . •.

ЙТОГШ ес&КвДОВЗНВа ДОШКОЬ р38раб01ва "Изюдвчзсквг укс- . вашШ по лабораторной дсагностскс бегства", которые утворсдс-ва 1'СХиП да Р2 14 цоя 12Э7 г.

3, ВЫВОДЫ

■ ■ ' ï. Усовзрсекотпоггшные скспрзсс-мэтоды диагностика беден-отвз ко основе нового фермента - пэро£:осфзтзз»х из ;:,ooli. а

фзуорохрсг-а - ülP-1 расширяет арсенал диагностических средств о кетодоа псслэдогания.

2. Установлена петогешооть ;;зут:зшах атскков гаруса Cesáis-отвз, вдркулирукют на территорий БзауэртсотСкэ для оольсвсхо-сяйстиетшх я лабораторных гашожшх а га еиигстюа соответствий Еакцзшхску итожу "0взчзйи ПШ вируса Сзкэготез. .. ■

3. Вкврвда з отечественной прзкжо. .кэ бзсе БзгйШ прзвэ-дене широкая сяробзцвя оовпс:.:ен::*к згияр-зсс-иотедоз дезгпостзхя беодгстоа: №¡i\ и ечдохсяйо возбудтее^л боасапз и культура змв- ■ ток НГУК-1. .

4. Сэпдвяч-воргап? IBA пооволаег iî бодзз хоропшс срогл (5-6 ч) но орзвкснг» с íKcnpodoü из белгс пате (до 30 су?) и

о более вксокоЗ чухстзйголлГ'ссгш, ч:-:: LI H н овзтоэтя. микроскопия, выявлять вирус-опзцгХчигзокяй гнтггсн я пягсгкт-чсгком '..'.)-твривлз, гдо титр >:;1«кг.:-:сзпс1-о .кгрусл хгмо ï-K^/ivu

5. При cp3i;:;iT0::si:oü :;ссле;:ог:зг;:л 15! кробн вс;.о*огогяаго» :ifi-incKoro гзхврзкз, гсязгзшглог pvztn^-rix гвдез гзгогкя» по-лгп'птель';:::: диагноз ссстпгл"^ пролом i!.'\ д I-ÍB ао составило 53,0;?, по MiA з К7' олуччгх « 07,"'!, згш-сзой «aspo-спотаей в 37 случоя* ~ 24,

6. Узтевокзеяз г.тсппзд ъъ-яякгг-г.скь в-я/ач НГУК-1 для дг^'дзсг;-чезкого х^л'Сзпк.") r-üpyca. 17рз срг.":иите.~7:Хю:.т ЯГО б n"to,"ovr.;íaíu'ji3cic3ro глэте-рузла установлено iicio-j -^т;/;;:;^ orrcnpctíü бе-л)с: и в' ь^лмурэ плате.* Ivl'H'-I. 3 Л'а-п'Л гудмуг-1' юяток уяпчн1Л patenscKrti вягув £Гчл « зтпз'хзлыш 'Золео угляг» срока (24-72 ч), прз цдгр^'сбгзаьчой сзсзулясаа

7. Yí:3p"£cvr.iT;i я т: :;:;?г,зт;.п о;;с::п ¿зборз^ерчей дивгиос-ïбг-эноггз о ^гт-.ьз,:ivíí:;q:i;:i! возбудимей :j нот;,пр1ср"1лс ,чт; >>р\ з IIl-Л г Г?Л :< riv'tW^a побудителя оологии j.- irynbTjp? :tгоя

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОШБШОШШ ПО UAÏEPWAJOI ДОСЕРВДШ.

ч I. ЯнЗарисоЕО O.P., Тятвгачзв 1Ü.A., СоЯруивн Р.Ы. Основные методы диагностики бсвойства в Лэборзторцой практике // Матер, научно-проазв.конф, - Крзевая патология яивотных в условиях Республики Башкортостан» Уфа, IS35, - С.63.

'¿. Янбарасова O.P., Тятигвчев Ii1.А., Юсупов Р.Х. Испытания лабораторных штодов при диагностике беиенствэ яивотных в Башкортостана // Матер.нзучко-прочзводств.конф.по проблемам вете-рвнарии и аивотноводства. - Казань, 1995. - С.34..

3. Тятигачов U.A., йнбарисова O.P., Юоулов Р.Х, Эпизоотическая ситуация по беленству яивотиих в Республике Башкортостан// Ыатер.кзучно-произв.кокф.по проблемам Еэтеринарии и гшвотновод-ства, - Казань, 1895. г С.33.

4. Хисматудлаиз H.A., Янбарасова С,P.t Тятигачрв Ш.А., Юсупов Р.Х. Пршзазциа твердоцязного метода дая контроля за состоянием природных очагов бешенства //-Человек и природа: Тез. докл.П Реснубл,научной'конф.м&йодпх•учоных в специалистов. Казань, I9SS. - 0.56.

5. Хесматулдсна H.A., Тятигачов ¡Г.А,, ЯиЗарнсоза С.Р., Юсупов Р.Х. Оценка шыуиного статуса у ваздинврозэшшх против бе- • ыонствз еввотнкх и ладей методом яг&фнойерментного анализа // Человек и природа: Тез.дом.П Республ.кзучдой копр.молодых ученых в спецззлистсв. Казань, ISS3. -1.57.

6. Янбариоово O.P., Тятигачов П.Л., КЬувои Р.Х. Бэтод км-^¿'цофлуоресцанцуи IS36. - 4 с,

?. Якбарисова O.P., Юсупов Р.Х,, Хпойтудййпа H.A., Сеймов М.А, Эхтеярасо-дкзгкостш бшанотвз в культура клеток ю-вр2нош ГасоероЕэ уб«а краен <НГУК-1). ШЖ "БеатодаЗара", 39SS. - 4о,

8. Яабараоова G.P,, Гятсгачсв Ы.А., Юсупов Р.Х., Хвсштул-

лвна H.A. Ускорения дзагиейчаш бомолотва аигогндх Екмунофэр-мьнтшл мотодол. РЮЙЕС "Еалтакиггсрм", I9S7. - 4 с.

S. Тятвгачзв Ш.А., Янбарасова O.P., КЪуаог, Р.Х., Хисматул-лвгш H.A. 1Ьа<7кофор2.х:1тгшЁ мотод ецзшеи шшря^енностз поегюк-панельного шмунитето при беЕОЕОТЕО. ИНК "Баитехик&орм", I9S7. - 4о. ■ . '