Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ТРИХОФИТИЯ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ

ВСЕСОЮЗНЫЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА НЛУЧНО-ИССЛЕДОВЛТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО ВСЕСОЮЗНОЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ АКАДЕМИИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И. ЛЕНИНА

На правах рукописи

Для служебного пользования

Экз.м 000094 *

УДК 619:616,5-002.828-08] :636.93

НИКИФОРОВ Лев Иванович

ТРИХОФИТИЯ ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ

Специальность 16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Москва — 1984

Работа выполнена в лаборатории микологии и антибиотиков Всесоюзного ордена Ленина научно-исследовательского института эксперименталь-ьой ветеринарии имени Я. Р. Коизденко (Зав. лабораторией — академик ВАСХНИЛ, заслуженный деятель науки РСФСР, лауреат Государственной премии СССР, профессор А. X. Саркнсов).

Официальные оппоненты:

1. Член-корреспондент АН УСОР, заслуженный деятель науки УССР, лауреат Государственной премии СССР, профессор В. И. Бнлай.

2. Доктор ветеринарных наук И. А. Курманов.

3. Доктор медицинских наук, профессор П, Н, Пестерев.

Ведущее научное учреждение — Московская ордена Трудового Красного знамени ветеринарная академия имени К. И, Скрябина.

Зашита состоится « . 1984 г, в 14*00 на заседа-

нии специализированного совета Д.020.28.01 но защите докторских диссертаций при Всесоюзном ордена Ленина научно-исследовательском институте экспериментальной ветерннарнн нменн Я. Р. Коваленко,

Адрес: 10947Е, Москва, Кузьминки, ВИЭв.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЭВ.

Автореферат разослан « . > . . 1984 г.

Ученый секретарь Специализированного совета кандидат ветеринарных наук

Г. Тсрсшков

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ . ••. .

> ••• • • .•• т . " : г Актуальность проблемы. В «Основных направлениях экономического и социального развития СССР на 1981—1985 голы и на период до 1990 года», принятых XXVI съездом КПСС, большое внимание уделено дальнейшему развитию медицинской и ветеринарной науки, познанию механизма физиологических, биохимических, генетических и иммунологических процессов жизнедеятельности, разработке новых-лекарственных средств и препаратов. .....-- ■ -*' '

Среди микозов сельскохозяйственных и мелких домашн них животных наиболее широкое распространение получили кожные болезни — дерматофитии; и в частности трихофития, которые наносят; большой экономический ущерб промышленному звероводству и кролиководству, Переболевание пушных зверей трихофитией обесценивает товарные качества шкурко-вой продукции, нарушает племенную работу и'планьгпрода^ жи зверей. Больныекролики отстают в росте и развитии, снижаются привесы, срываются планы сдачи мясной продукции. Больные-<жквотные служат постоянным источником заражения обслуживающего персонала и членов их семей. -

Изучением трихофитии, особенно -крупного рогатого скота, занимались многие отечественные и зарубежные исследователи. Большое количество работ посвящено методам медикаментозной терапии, и профилактики путем'применения огромного количества препаратов в форме мазей, линиментов, растворов и дустов. Однако все предложенные ранее методы не могли"решить основной задачи—сйздания стойкого благополучия животноводческих ферм по трихофитии. """' - Принципиально новый путь решения этой задачи"1-был предложен -советскими учеными; Создание первой живой вакцины ТФ-130 (ЛТФ-130) против трихофитии крупного рогато-; го скота (А. X. Саркйсов, С. В. Петрович, Л. И. Никифоров, Л, М, Яблочник, 1971) и внедрение'ее в широкую'ветеринарную практику позволило за десять лет практически ликвидировать трихофитию крупного рогатого скота в'нашей-стране (А. Д. Третьяков и тф., 1980). • / / ., " . ч • - '

' Разработана и внедрена вакцина против трихофитии'лошадей С-П-1 (А. X., Саркйсов,Х.,В. Петрович, 1981)-.£>днако данные вакцины применимы только против трихофитии крупного рогатого скота и, лошадей. '- '■'.." . -' Дерматофитии, пушных зверей в отд&чьных звероводческих хозяйствах'получшш широкое -распространение, ;С переводом: кролиководства на промышленную основу при -содержании животных в закрытых помещениях участились . случаи; воз--никновения трихофитии кроликов. Значительное поголовье и

[УЦШЬИНк^уЩ^^го, .

высокая концентрация животных в

ниенн К.А. ТнмнрязеЬр ЦНБ нм«нн Н И, Железно»» Фонд научны Л^лн^жтури

разведения-Настоятельно требовали эффективных средств, : удобных для массовых'профилактических обработок.

Цель.и задачи исследований. Основной целью являлось — создать средство для специфической профилактики и терапии трихофития,пушных зверей и кроликов.

Для решения поставленной задачи необходимо было изучить: •

1. Эпизоотологию дерматофитнй пушных зверей.

2.- Видовой состав возбудителей дерматофитий пушных зверей и кроликов и их культурально-биологические свойства.

3. Формирование иммунитета при г трихофитии пушных зверей. , . *■■ -V : . . ' *'

4. Подобрать иммуногенный штамм и разработать технологию промышленного изготовления сухой вакцины'.::

5. Разработать метод применения, вакцины для оздоровления неблагополучных звероводческих и кролиководческих хозяйств от трихофитии. *■

6. Приступить к комиссионной апробации, широкому производственному испытанию и внедрению вакцины в практику.

Научная новизна.-Выяснен видовой состав возбудителей дерматофнтий пушных зверей и кроликов. Изученадннамика иммунобиологической перестройки (Организма, установлено формирование иммунитета у лисиц, песцов и кроликов, переболевших спонтанной и*экспериментальной трихофитией. Получен высокойммуногенный штамм, создана вакцина, разработана технология ее промышленного изготовления и метод применения. .

Защнта-.приоритета разработок. Государственный комитет по делам изобретений и открытий выдал, авторское, свидетельство Ki 835446 — «Вакинна для специфической профилактики и лечения трихофитии пушных зверей и кроликов — МЕНТАВАК, способ изготовления и способ ее использования» и'№ 792640—'«Штамм гриба 'Trichophyton gypseum № 135/1963, используемый для изготовления вакцины против трихофитии пушных зверей и кроликов».,. ■: . .. t;,' . -

На вакцину, метод изготовления вакцины, метод профилактики и.' лечения трихофитии получены патенты США № 436819Г. Канады № 1136042, Великобритании № 2025222, Франции Ki 7914602.

Теоретическое значение. Работами, проведенными в лаборатории микологии и антиботиков ВИЭВ, ■ установлено, что клетки бесполого размножения дерматофитов мнкроконидии (алейрии) ^являются* носителями нммуногениости/ Государственный Комитет'Совета Министров CGCP.no делам изобретений и открытий зарегистрировал открытие Ка 278 со следую-' щей формулировкой: «Экспериментально установлено неизвестное раиегсвойство клеток дерматофитов (алейрий) в стадии сапрофитного роста вызывать у млекопитающих пожиз*

нетшй иммунитет против паразитного развития возбудителей дсрматомикозов, обусловленное иммуногенной активностью алейрий (авторы — А. X. Саркисов, С. В, Петрович» Л. И-Никифоров, В. П. Королева, Л. М. Яблочник). - Это' послужило теоретическим обоснованием создания живых грибных вакцин, в'том числе н МЕНТАВАК.

Практическая ценность. Вакцина МЕНТАВАК- внедрена в ветеринарную, практику для профилактики и лечения трихофитии пушных зверей и кроликов (приказ Главного управления ветеринарии МСХ СССР № 67 от 22 декабря 1981 г.). Промышленный выпуск вакцины по разработанной технологии, внедрение МЕНТАВАК в практику звероводства и кролиководства позволило оздоровить от\ трихофитии многие зверохозяйства и кролиководческие комплексы, добиться стойкого благополучия хозяйств по этой инфекции.

Апробация работы. Проведена комиссионная .апробация вакцины'МЕНТАВА^. 19 февраля 1981 г..результаты иссле-дований'поизученикгдерматофнтий пушных зверей, созданию вакцины,.разработке технологии,ее изготовления.и эффектив-, ности применения рассмотрены па Научно-техническом совете МСХ СССР, одобрены и вакцина рекомендована .к внедрению в широкую ветеринарную практику. ■•„'-,■ л

Публикации. Основное содержание диссертации изложено в 21 статье, 4 патентах и 2 авторских свидетельствах.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 384 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы', описания материалов и методов исследований, экспериментальной части (8 разделов),, обсуждения полученных' результатов, практических предложений, выводов, списка1 литературы и приложения.

Список литературы содержит 714 наименований отечественных и зарубежных авторов, в том числе отечественных— 356, иностранных 358. Работа иллюстрирована 40 таблицами и 52 рнсунками. . . ч - , ■

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Экспериментальная часть работы выполнена в лаборатории микологии II антибиотиков ВИЭВ, Хальяласском биоцехе, ЭССР, зверосовхозах и кролиководческих комплексах. В опытах использовано 492 лабораторных животных (кролики, морские свинки, белые мыши), 458 лисиц и песцов. Широкое производственное испытание вакцины проведено в 1973—1980 гг. на поголовье один миллион триста тысяч лисиц, песцов ■ и кроликов. , ..

Для выяснения видового состава возбудителей дермато-фитнй отбирали патологический материал от зверей с види-■ ' ,3..

мымн дефектами, кожного и волосяного покровов. При определении вида дерматофита учитывали скорость роста, размеры, структуру и сложение колоний, растущего края, цвет, пигментацию.обратной стороны, Проводили микроскопию. Всего-исследовано 614 образцов патматериала.

Экспериментальное заражение подопытных животных проводили трех'-четы'рех недельными культурами дерматофитов и патматерналом. Результаты учитывали на основании клинического осмотра животных, микологических исследований {микроскопия, высев на элективные среды).

Длительность и напряженность иммунитета у лабораторных животных и пушных зверей определяли на основании клинического осмотра.и результатов микологических исследований, Динамику иммунобиологической перестройки организма животных изучали с помощью серологических (РА, РСК) и плазмоклеточной реакций. Материалом для серологических исследований "служили сыворотки крови от спонтанно больных и переболевших, экспериментально зараженных, иммунизированных и здоровых животных. PÄ ставили по общепринятой методике, антигены для РСК готовили по мстодугН, П. Блинова (1959)* путем обработки грибницы ß-нафтолом. ;

Гематологические исследования проводили по общепринятым методикам (А^ А,'Кудрявцев, Л. 'А.: Кудрявцева," 1974; В. А. Берестов; 1971). - . ■ ''Л ;V -

' Лиофилизацию'культур дерматофитов'»4вакцины проводи-ли"на: сублимационных- аппаратах системы К. Е. Долинова, «Edwards» (Англия), КС-30 (ЧССР). ' ■'; !

Содержание микрокоинднй определяли количественно — путем подсчета в камере Горяева. Колоннеобразующую способность (жизнеспособность) микрокониднЙ" учитывали, при-' готавлнвая'последовательные разведения от 10"' до I0"5. Из пятого разведения по 0,5 мл высевали в чашки Петри на сусловый агар и помещали в термостат при температуре 28е, Через 5—7 суток подсчитывали количество выросших колоний.

Разработку метода применения вакцины , (определение профилактической и .терапевтической доз, оптимального возраста для иммунизации молодняка, сроков наступления и длительности иммунитета, безвредности) проводили иа кроликах, лисицах и. песцах в возрасте от 14 дней до 4 месяцев и взрослых животных, \

Комиссионная апробация вакцины проведена в 1979— 1980 гг. в ВИЭВ'е, Хальлласском биоцехе ЭССР и зверохо-' зяйстае «Крётингское» Литовской ССР.

Полученные данные обрабатывали статистически по Кли-ленду (Cleland, 1967). Средняя квадратичная ошибка расчетов определялась по .таблице Мюллера (Müller, 1950), Статистическую обработку экспериментальных данных иа- достоверность различий проводили по таблицам Стьюдента.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ .

I. МАТЕРИАЛЫ ПО ЭПИЗООТОЛОГИИ ДЕРМАТОФИТИП , ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ '

Изучение некоторых вопросов эпизоотологии дерматофи-тнй проводили на 18 фермах зверохозяйств различных зон страны, где были зарегистрированы случаи заболевания лисиц и песцов трихофитией и микроспорией.

fj. Источники возбудителя инфекции и пути передачи. Проведенные исследования показали, что основными источниками дерматофитий являются больные и переболевшие животные. 1

Резервуаром Trichophyton mentagrophytes в природе являются мышевидные грызуны (Н. П. Пестерев, С, В, Стадухин, 1968; 1974; 3. Г, Стеианищева и др.', 1967; В, Д1. Шарапов, 1974). 1/ отловленных или отравленных'на территориях ферм крыс нами неоднократно диагностирована трихофития, выделена культура Т, mentagrophytes. ■,.,.;•

Установлено, что боенские отходы крупного рогатого скота, больного трихофитией, могут служить источником заражения пушных зверей Т. verrucosum. Больные ' микроспорией кошки, живущие На .фермах, заражают: лисиц и песцов.^

От больных пушных зверей заражается обслуживающий персонал. На лисьей ферме зверохозяйства «Муромцево» Омской обл.* у 7 работниц из 12 были выявлены трнхофптййные поражения —оозбуднтсль Т. mentagrophytes.

1.2. Сезонное проявление заболевания трихофитией и микроспорней в звероводческих хозяйствах. Изучение сезонности проявления" дерматофнтнй в условиях зверохозяйств различных зон страны показало, что они регистрируются в течение всего года с выраженными подъемами выделения больных. Основной подъем заболеваемости .регистрировали с мая по сентябрь месяцы. Начало резкого увеличения выделения больных совпадало с достижением щенками текущего года рождения одно-полуторамесячного возраста, длительность опреде-* лялась эффективностью проводимых лечебно-ирофплактиче-скнх мероприятий, выбраковкой и убоем зверей на шкурку.

При несвоевременной диагностике и промедлении с проведением-лечебно-профилактических: мероприятий дерматофи-тин могутпрннять характер эпизоотии с,охватом 25—40% поголовья зверей.* Нередко, несмотря на проводившиеся вете-ринарно-санитарные'. мероприятия, заболевание становилось стационарным п регистрировалось' в течение 5—7 и более лет.

1.3. Возрастная восприимчивость лисиц и песцов-к дерма-тофитиям; Клинически больные трихофитией и микроспорией щенки выявляются-начиная с 18—21 дневного возраста. Наиболее часто дерматофнтню днагносцировалн у 40—60 днев-

пых щенков.' Всего на молодняк до шестимесячного возраста приходится 81,2—95,3% заразившихся зверей. ,т. .

1.4. Клиническое проявление . , трихофитии и микроспории. Анализ локализации дёр'матофнтийных поражений на поголовье 6894 молодняка лисиц и песцов, 489 самок и самцов показал, что у щенков в возрасте от трех недель до четырех месяцев в ,44—62% случаев поражается .голова, 22—38% — конечности, 8—14%—туловище ir 1—2% —хвост. У зверей основного .стада поражения , чаще диагносцировали на конечностях— 49—60%. на голове и туловище—.40—51%.

По характеру клинического проявления дерматофитпйные. поражения.у лисиц и песцов, вызванные Т. mentagrophytes и Т. verrueosum, а также,микроспорию, обусловленную М. canis, следует отнести к глубокой дерматофитин..

2. ВОЗБУДИТЕЛИ ДЕРМАТОФИТИП ПУШНЫХ ЗВЕРЕЙ И КРОЛИКОВ

2,1. Видовой состав. Сведения о видах возбудителей дер-матофитий пушных зверей н кроликов в предвоенные годы практически отсутствуют. Отдельные сообщения, опубликованные в'пятидесятые—вначале шестидесятых годов (К. П. Анд-риенко, 1954; И, Г. Левенбсрг, 1960; Н. А. Спесивцева, 1964) не могли дать полного представления о составе п'ареале* дер-матофнтов клеточных пушных зверей.

Для'установления видооого состава дерматофнтов ' пушных зверей л кроликов микологическому исследованию были подвергнуты 614 образцов патологического материала из пятидесяти зверо- н кролиководческих хозяйств различных зон. страны. В течение 1964—1982 гг. исследовали патматериал от лисиц, песцов, морок, нутрнй и кроликов {табл. 1).

Таблица!,

Видовой состав возбудителей пушных зверей и кроликов (1964—1982 гг.) '

t Животные, Высеяно образцов лат. мате-'риала ■ • Выделено культур ' ■■■

Т, mentagrophytes Т. verrueo--som •М. cam's

Лисица Песец Норка НуТрКЯ Кролик ■„ ■ 157 . 136 J2 ri ■■ 73 : '236 101 ' .91, : •. - 67 т . 8 ■ зь - ¡М ' 8 ■ ■

614 | 470 (86,73%) 39 (6,9%) ■ 36 (6,37%)

Проведенные исследования показали, что основным возбудителем дерматофитнй пушных зверей и кроликов является Trichophyton mentagrophytes (Robin) Blanchard, 1896, который составил 86,73%. Только в 6,9% от лисиц н песцов был выделен Trichophyton verrucosum Bodin, 1902 и в 6,37% — Microsporum canis Bodin, 1902. Анализ выделения возбудителен за период 1964—1973 гг. и 1964—1982 гг. показывает, что произошло существенное увеличение выделения Т. mentagrophytes с 73 до 86,73%. С 17,2% до 6,9% уменьшилась частота выявления Т. verrucosum, при этом за последнее десятилетие не зарегистрировано нн одного случая поражения пушных зверей этим дерматофитом. Это связано с резким снижением заболеваемости крупного рогатого скота и практической ликвидацией трихофитии, вследствие широкого использования вакцины ЛТФ-130. Частота выявления М. canis, в целом; осталась на том же уровне.

2.2. Культу р а л ь но-м ор фол or и чески е свойства. Для выделения и изучения культур использовали сусловый агар pH— 6,2—7,0, МПГА с 2%глюкозы, глюкозный агар Сабуро. Основной возбудитель трихофитии пушных зверей и кроликов — Т. mentagrophytes образовывал колонии, которые по макро-морфолопш можно было подразделить на два типа. Колонии первого типа имели желтую окраску, зернисто-граиулярную поверхность, растущий край звездчатый или ворсинчатый, интенсивно пигментировали среду в желто-коричневый цвет. Колонии второго типа имели гипсовпдно-мучнистую поверхность бело-желтого цвета, растущий край ровный. Микроскопически культуры обоих типов были представлены многочисленными удлиненноовальными микрокониднями 2X4 мкм, отдельными 4—6 сегментными макроконидиями, обнаруживали кольцевидные и спиралевидные окончания гиф.

2.3. Патогенность для лабораторных животных. В эксперименте была проверена вирулентность штаммов Т. mentagrophytes, выделенных от лисий, песцов и кроликов. В целях унификации метода заражения гомогенаты трехнедельных культур наносили на скарифицированный участок кожи из расчета 0,5—1 млн мнкроконндий на 1 см2.

Экспериментальная трихофития, вызванная Т. mentagrophytes, протекала в глубокой пифильтратнвной форме. Более длительное и тяжелое — до 30—38 дней переболевание у морских свинок и кроликов вызывали штаммы, выделенные от пушных зверей. Из проверенных на патогенность культур для дальнейшей работы были отобраны штаммы №№ 135, 251, 257.

3. ИММУНИТЕТ ПРИ ТРИХОФИТИИ, ВЫЗВАННОЙ TRICHOPHYTON MENTAGROPHYTES

Исследованиями, проведенными отечественными и зарубежными учеными, установлено формирование иммунитета при трихофитии крупного рогатого скота (А. X. Саркисов и др., 1956; А. И. Носков, 1957; Л. М. Яблочник, 1966; В. А. Пла-уска, 1965; А. К. Ерошенко, 1965; Р. Kielstein, 1968* A. Lepper, 1974 и.др.), возбудитель — Т. verrucosum, лошадей — возбудитель Т. equinum (С. В. Петрович, 1976). Сведения об иммунитете при трихофитии пушнЫх зверей практически отсутствовали. Учитывая, что среди дерматофитнй пушных зверей преобладает трихофития, вызванная Т, mentagrophytes, мы уделили основное внимание этому заболеванию.

3.1. Иммунитет при трихофитии лабораторных животных. Проведенные исследования показали, что первичное перебо-левание морских свинок, несмотря на сильную степень поражения, не приводит к формированию иммунитета. Только после второго заражения большинство морских свинок —24 из 27 проявили устойчивость и не заболели. Другие результаты были получены в зкепернментах на кроликах. Переболевшие трихофитией кролики выдержали повторное экспериментальное заражение вирулентными штаммами Т. mentagrophytes, изолированными от пушных зверей и кроликов (табл. 2),

Таблица 2

Устойчивость морских свинок и кроликов к повторному заражению культурами Т. mentagrophytes

(-Вид t заражение 2 заражение 3 заражение

животного заразили заболело заразили заболело заразили заболело

Морские свинки 30 ■ 30 30 19 27 3

Контроль 3 3 3 3 3 3

Кролики 29 29 29 0 —

Контроль 3 3 3 3 —

Для изучения иммунной перестройки у экспериментально , зараженных кроликов при помощи РА определяли титр сывороток. У зараженных животных нарастание титров отмечено с 10 дня, что по времени совпадает с появлением первых клинических признаков трихофитии. Максимальный подъем титра 1 : 320—1 : 640 совпадает с моментом наивысшего клинического проявления и удерживается на уровне 1 : 160—1 :320 до 50—60 дня, то есть до момента полного выздоровления. Ста-а

тнстический анализ результатов динамики нарастания титра антител в РА у кроликов, начиная с 10 дня, показал высокую достоверность различий как с исходным титром (рс0,001), так и с титрами контрольных незараженных животных (р-< <0,001).

В опытах по изучению длительности иммунитета не удалось вызвать вторичного заражения кроликов спустя 6, 12 н 18 месяцев, что говорит о наличии иммунитета продолжительностью не менее полутора лет.

Проведенная работа показала, что экспериментальное заражение кроликов штаммами Т. mentagrophytes, выделенными от кроликов, лисиц, песцов и нутрий, после переболевания вызывает в организме животных иммунобиологическую перестройку и формирование напряженного иммунитета, которое подтверждается результатами серологических реакций и контрольного заражения.

3.2. Иммунитет при трихофитии серебристо-черных лисиц и песцов. В двух неблагополучных по трихофитии хозяйствах под наблюдение были взяты 107 самок лисиц и песцов, которые после переболевания трихофитией (возбудитель — Т. mentagrophytes) содержались в тех же клетках, дезинфекций клеток и домиков не проводили. На следующий год у щенков, родившихся у этих самок, была зарегистрирована трихофития. Ни одна из ранее переболевших трихофитией самок повторно не заразилась. Для подтверждения их невосприимчивости к дерматофитии 35 ранее переболевших самок через 2, 12, 24 и 36 месяцев были подвергнуты экспериментальному заражению (табл. 3).

Таблица 3

Устойчивость переболевших трихофитией лисиц н песцов к повторному

заражению

Время после выздоровления (мес.) Материал для заражения Заболело

2 Шт. № 251 S 0

Патматериал S 0

Контроль Шт. № 261.

патматериал 3 3

12! Шт. ife 251 5 0

Патматериал 5 0

Контроль Шт. -А* 25],

патматериал а 3

24 Шт. № 291 4 0

Патматериал 4 &

Контроль Шт. № 251.

патматериал 3 э

36 Шт. № 2Ы 4 0

Патматериал 3 0

Контроль Шт. № 251,

патматериал 4 4

Для установления титра агглютининов в РА исследовали сыворотки больных животных. Наивысшего развития клиническая картина трихофитии достигала к 20—40 дням, к этому же времени наблюдали максимальный титр — 1 : 320—1 :640. На высоком уровне он сохранялся к 50 дню (р<0,001), а затем начинал снижаться.

Наиболее активными в РСК оказались антигены, приготовленные из тридцатидневных культур штаммов (Кэ№ 254, 257), слабее проявили себя антигены из музейного штамма Кэ ¿3. Наибольшее количество положительных реакций — 97,2% (р<0,01) было получено с сыворотками от животных с сильной степенью поражения. При средней — процент положительных реакций составил 77,7 (р<0,01), а при слабой только 50, Всего при исследовании в РСК сывороток от, 66 лисиц больных трихофитией в 83,3% были получены положительные реакции, в 12,1% —сомнительные и только в 4,6% — отрицательные.

Проведенные исследования показали, что переболевшие спонтанной или экспериментальной трихофитией (возбудитель — Т. mentagrophytes) лисицы и песцы формируют стойкий иммунитет и выдерживают жесткое экспериментальное заражение. Серологические реакции подтверждают иммунобиологическую перестройку в организме животных.

4. СОЗДАНИЕ ВАКЦИНЫ МБНТАВАК

Лнофилнзация широко используется в производстве сухих вакцин, сывороток, днагностикумов и др. Накоплен определенный опыт по лиофнлизацин грибов, в том числе и коллекционных культур дерматофнтов (L. Е. Wickeriiam, А, А. Anderson, 1942; D. 1. Fenn eil et all., 1950; С. W. Hesseltine et all,, 1950). Однако, данные по таким вопросам, как содержание клеток в суспензии для сушки, состав защитных сред, режим замораживания и др. не всегда были совпадающими, а иногда даже и противоречивыми. Исследователи отмечают, что сохранность микроорганизмов в процессе сублимации может зависеть не только от вида микроорганизма, но даже от конкретного штамма.

Поэтому, для создания живой безвредной иммуногенной вакцины предстояло изыскать нммуногенный штамм, подобрать защитную среду, определить оптимальный возраст культуры и содержание микроконидий в материале для сушки.

4.1. Изыскание иммуногенного штамма. Изучение видового состава возбудителей дерматофитий пушных зверей и кроликов показало, что основным возбудителем является Т. mentagrophytes — 86,73%. Из многих эпизоотических-штаммов, изолированных от больных пушных зверей, мы выбрали шт. Г. mentagrophytes Кэ 135, выделенный в 1963 г, от лнси-

цы, нмевшей глубокие и обширные поражения, принадлежащей зверосовхозу «Сомовскнй» Воронежской области. Штамм обладал типичными культурально-морфологическнми признаками, был высоко вирулентен для лабораторных животных.

Используя метод ступенчатого отбора быстрорастущих и спороносящих моноколоннй, удалось повысить энергию спорообразования, снизить вирулентность при одновременном сохранении иммуногенных свойств. Вакцинный штамм Trichophyton mentagrophytes получил № 135/1963, в 1981 г. передан на хранение в ВГНКИ ветпрепаратов, в том же году депонирован в г, Баарне (Нидерланды) под № CBS 571.81.

При культивировании на сусловом агаре при 24—28° к 8— J0 дню штамм № 135/1963 образует мощную белую грибницу с бархатистой поверхностью, которая с 10—12 дня становится порошкообразной, желтоватой. Морфологически двух-трехне-дельная культура представлена многочисленными округло-овальными, реже палочковидными алейриями 1,5X3,5 мкм, мицелием.

При нанесении на скарифицированную кожу вызывает у лабораторных животных и пушных зверей шелушение эпидермиса. Самовыздоровленпе через 8—15 дней. Не опасен для животных, находящихся в контакте с привитыми, не опасен для человека при работе со штаммом, контакте с иммунизированными животными.

4.2. Подбор защитной среды. В качестве компонентов за-защитной среды нами были испытаны: обезжиренное молоко, сыворотка крови крупного рогатого скота, глюкоза, сахароза, сорбит, желатин, пептон, глутамат натрия и др. Опыты показали, что ряд компонентов и их.сочетаний стабильно обеспечивают сохранность алейрий культуры Т. mentagrophytes при сублимации. Замораживание проводили в низкотемпературном холодильнике при минус 35—50°, в смеси спнрт+сухой лед (минус 45—48°), использовали самозамораживание при центрифугировании под вакуумом в аппарате «Edwards». Лучшие результаты были получены при использовании в качестве протективной среды обезжиренного молока, сыворотки крови в сочетании с сахарами, желатина или пептона — с сахарозой или сорбитом. При этом от 40 до 90% алейрий сохраняли жизнеспособность.

Мы также учитывали, что компоненты среды высушивания не должны отражаться на антигенных свойствах биопрепарата, обладать токсичными и ннгибирующими свойствами и быть доступными для промышленного производства.

Остановившись на сочетании сахарозы н желатина (желатин обеспечивает создание хорошего коллоида, сахароза препятствует чрезмерному обезвоживанию), мы определили оптимальное их сочетание (табл. 4).

Т а б л н ц а 4

Влияние состава защитной среды на жизнеспособность микроконидий

при л и оф к лиза ции

Защитные среды Количество Колон необра э у ¡ошая способность микроконидий -(млн) М±т ■

Состав Содержание (%> микроконидий в материале для

сушки (млн) до сушки после сушки

Пептон Желатин 1 а 485-5.110 91'—9&±4,0 lÄfcO.l

Пептон Сахароза 1 10 485-510 &1<-9б±4,0 47,5±4,2.

Желатин Сорбит е 10 485—510 911—9б±4,0 50,4±4,6

Желатин Сорбит 4 20 4&5—540 . &1>—96rh4,0 86,2 ±4,8

Желатин Сахароза 4 CQ 485—5tl.O Э1|—9б±4,0 88,6±4,Э

Желатин Сахароза 4 30 485—510 91'—9б±4,0 88 ±4,3

Б результате проведенных исследований была подобрана защитная среда, содержащая водный раствор 20% сахарозы и 4% желатина, которая при смешивании в равных частях (1 : 1±25%) с суспензией культуры обеспечивала в процессе лиофилизацин высокую сохранность микроконидий,

4.3. Определение оптимальных сроков выращивания вакцинного штамма и содержания микроконидий. Работы с'вакциной ЛТФ-130 показали, что наибольшей иммуногенностью обладают мнкроконидии (А. X. Саркисов, 1973 и др.). Они же оказались .наиболее устойчивыми при лиофилизацин. Наши исследования по разработке технологии изготовления сухой вакцины против трихофитии крупного рогатого скота ЛТФ-130, а также опубликованные данные но лиофилизацин других микроорганизмов указывают, что лучше переносят лнофили-зацию культуры, находящиеся в стационарной фазе роста. Микроорганизмы, высушенные в логарифмической или экспоненциальной фазе, более чувствительны к воздействию низких температур и вакуума (3. А. Аркадьева и др., 1975; А.. А. Цу-цаева и др., 1980; R. Н. Heckly, 1961; Е. М. Foster, 1962). Грибные культуры лучше выдерживают сублимацию в стадии спо-роношения (Е. С. Татаренко, 1970; D, J, Fennel, 1950).

В нашу задачу входило определить сроки максимального накопления микроконидий при наибольшей их сохранности в процессе сублимационной сушки. Для этого из штамма № 135/1963 одной даты засева были приготовлены на 5, 16,

25, 33, 45 дни роста мнкросершг лнофильно высушенной вакцины. В каждой серии учитывали содержание и количество ко-лониеобразующих микроконидий. Во второй серии опытов микросерии были приготовлены на 10, 20, 30, 40 и 50 дни роста. Учитывая неодинаковую степень образования микроконидий в различные фазы роста, сушку проводили со стандартным содержанием клеток, составляющим 150—200 млн/мл.

Установлено, что с 5 по 15 дни происходит интенсивный рост спорообразования, который с 15 по 25—30 дни достигает максимума, стабилизируется и в дальнейшем практически не увеличивается. Жизнеспособность микроконидий в стадии логарифмического роста (5—10 дни) ниже — 36—78%, чем в период наибольшего спорообразования (15—25 дни)—91— 96%. С 25 дня происходит снижение колоннеобразующей способности микроконндий, которая на 30 день составляет 87%, 40—73% и 50 день — 51%. Это объясняется тем, что, несмотря на продолжающееся накопление биомассы грибницы, происходит старение культуры, которое проявляется в более ия-~ тенсивном окрашивании грибницы в желтый цвет, появлении участков роста вторичного мицелия, отдельных хламидоспор.

Выяснив, что алейрии двух-четырехнедельной культуры штамма Na 135/1963 наиболее устойчивы к лнофилизации, необходимо было определить оптимальное их содержание в материале для сушки.

По вопросу влияния содержания алейрий и вообще микроорганизмов в суспензии для сушки на их сохранность в процессе сублимации, мнения различных исследователей противоречивы. Одни читают, что с увеличением количества микроконидий возрастает и процент выживших клеток (М. Б. Куп-летская, 1961; В. Д. Кузнецов и др., 1967), а коллоиды погибших микроорганизмов проявляют протективное действие (В. R. Record et all., 1962; С. В. Конев и др., 1973). Противоположного мнения придерживается Z. Scharp (1947), Ю, А. Субботина (1960) и др., которые отмечают повышение сохранности микроорганизмов с уменьшением их количествен-, ного содержания в материале для сушки. Для отдельных штаммов Т. equlnum определены критические пределы концентрации, после чего может наступить гибель большинства и даже всех спор (С. В. Петрович, 1977).

Для изучения влияния содержания микроконндий вакцинного штамма Т. mentagrophytes № 135/1963 в суспензии для сушки на их устойчивость в процессе лнофилизации была проведена серия опытов. Из 18—25 дневной культуры были приготовлены гомогенаты с содержанием 200—1600 млн/мл микроконндий. Определено количество колоннеобразующих алейрий до и после лнофилизации. Лучшая сохранность была достигнута в гомогенатах, содержащих 200—600 млн/мл алейрий— 84—92,8% колоннеобразующих. Уменьшение микроко-

Ю

нидий до 100 млн/мл незначительно снижало жизнеспособность — 72—88,2%. Увеличение до 700 и, особенно, 800 млн/мл приводило к частичной гибели спор.. Колониеобразующая способность составила соответственно 81 н 52,4%. Дальнейшее увеличение содержания в гомогенате микроконидий приводило к гибели значительного количества спор.

4.4. Стабильность вакцины при хранении. При хранении лнофнлько высушенных микроорганизмов происходит постепенное отмирание меток, скорость которого определяется рядом факторов. Большинство исследователей отводят существенную роль составу защитной среды, отмечают важную роль защитной среды, где оптимальным для вакцин считают содержание влаги в пределах I—4%. Наши исследования по вакцине ЛТФ-130 также показали, что оптимальным процентом содержания остаточной влаги, с учетом хранения препарата в течение 12 месяцев под осушенным воздухом, являются 1,2—3,5. С целью изучения влияния температурного фактора на сохранность микроконидий в вакцине из штамма № 136/1963 были поставлены опыты по хранению вакцины с остаточной влажностью 2,18—2,56% в течение 18 месяцев при температурах 4—8°, 18—22° и 37°. Как показали полученные данные, хранение в условиях холодильника (плюс 4—8°) обеспечивает сохранность через 6 месяцев 85%, а 18—71% алей-рнй. Хранение при комнатной температуре приводило к снижению количества нолониеобразующнх клеток за 6 месяцев до 54%, 18—до 26%. Лучше сохранялась вакцина во флаконах, заполненных азотом и в ампулах под вакуумом.

Проведенные исследования показали, что при лнофнлиза-ции дерматофитов, в частности культуры Т. mentagrophytes штамм № 135/1963, для достижения наибольшей сохранности жизнеспособных нммуногенных микроконидий существенное значение имеет состав защитной среды, оптимальный возраст культуры и содержание микроконидий в суспензии для сушки.

Полученная вакцина названа МЕНТАВАК (MENTAVAK), МЕНТА — видовое название — mentagrophytes, ВАК — вакцина, которое защищено как товарный знак (свидетельство К» 71495).

Вакцина МЕНТАВАК Содержание алейрнй — 15—25 млн/мл Колониеобразующих алейрий — не менее 8 млн/мл Остаточная влажность— 1,0—3,5% Дозировка — 50, 100 и 200 доз Коммерческая доза — 1 мл

5, РАЗРАБОТКА МЕТОДА ПРИМЕНЕНИЯ ВАКЦИНЫ

Предстояло определить оптимальную профилактическую и терапевтическую дозировки, место и кратность введения,

безвредность вакцины, минимальный возраст щенков для иммунизации, сроки наступления и длительность иммунитета.

5.1. Определение оптимальных дозировок. Предварительно была проведена лодтитровка дозы на кроликах массой 2,5 кг, которым инъецировали вакцину в объеме 1 мл, содержащем от ОЛ до I млн мнкрокониднй. Вакцину вводили внутримышечно в заднюю конечность двукратно с интервалом в 10 дней. Было установлено, что иммунизация в дозах 5, 10, 20 и 50 млн/мл алейрнй вызывала у кроликов формирование выраженной устойчивости к экспериментальному заражению. Непривитые кролики (контроль) заболевали с проявлением типичной клиники, подтвержденной положительными результатами микроскопии и выделением ретро культур и.

С учетом первых результатов, а также получения возможной концентрации мнкрокониднй в вакцине в процессе ее изготовления в следующих экспериментах были использованы опытные серии с содержанием 10—20 млн/мл микроконидий (таол. 5).

Т а б л и ц а 5

Определение оптимальной вакцинальной дозы для песцов '

Результаты заражения

ш групп Содержание мнкрокониднй о млн/мл Доза в мл .Животных Клиника .Микологические исследования

в группе микроскопия ретро-культура

1 0,5 1 5 5/3±1 В/2±1 3/3

2 . ■1., 1 6 6/1 ±1 1/1

3 5 1 5 — — —

4 10 1 8 — —

' Б 20 1 7 — — —

6 40 0,5 7 — — —

7 Контроль — 3 3/3 3/3 3/3

Двукратное введение вакцины в дозах 0,5—1 мл, содержащих 5—40 млн/мл алейрий, во всех случаях формировало напряженный иммунитет и предохраняло песцов от экспериментального заражения вирулентными культурами.

Первое испытание в одном из неблагополучных хозяйств показало, что ни один из 230 привитых щенков песцов не заразился, среди непривитого поголовья заболели 344 щенка.

5.2. Изучение безвредности вакцины в организме иммунизированных животных. Исследователей давно интересовала судьба дерматофитов в инфицированном организме. Несмотря

на очевидный дерматропнзм этой группы грибов, все равно проводились исследования по выясненню способности дерма-тофитов развиваться и проявлять свои патогенные свойства во внутренних органах животных. Остаются невыясненными до конца вопросы патогенеза дерматофнтий, в том числе и человека — «Судьба патогенных грибов в организме больного изучена еще не достаточно», П. Н. Кашкин (1967).

Проведенные исследования на песцах, которым внутримышечно ввели вакцину, показали, что в высевах из мышц, взятых строго с места введения вакцины, жизнеспособную культуру гриба обнаруживали у кроликов до 12, песцов — 10 суток. Из крови, сердца, печени, почек, селезенки, лимфоузлов ни в одном случае не удалось выделить культуру. Животные удовлетворительно переносили введение увеличенных в 2, 5 и 10 раз, по сравнению с профилактическими, дозировок. Не наблюдалось отказа от корма, хромоты, температура тела, пульс, дыхание оставались в пределах физиологической нормы.

Исследования показали безвредность для кроликов, лисиц и песцов при внутримышечном введении вакцины МЕНТА-ВАК. содержащей Юх 10е—20X20® (кролики) и 20Х106— 20Х205 (песцы) мнкрокониднй.

При нанесении на скарифицированную кожу вакцина вызывает легкое шелушение, образовавшиеся поверхностные небольшие корочки отторгаются на 5—7 день. При микроскопии в них обнаруживаются отдельные мнцелнальные нити и отдельные алейрии. На 12—15 день по всей площади наблюдался рост волоса.

Лучшим местом введения вакцины для лисиц и песцов оказалась внутренняя сторона бедра.

5.3. Формирование иммунитета в зависимости от возраста. Изучение возрастной восприимчивости лисиц и песцов к дер-матофнтням показало, что чаще поражаются 2—3-месячные щенки. Предотвратить их заражение путем иммунизации в более раннем возрасте имеет важное значение для благополучия ферм.

Для изучения иммунологической зрелости организма животных и выяснения минимального для иммунизации возра* ста был поставлен опыт на 30 щенках песцов, которым двукратно инъецировали вакцнну в дозе 1 мл (табл. 6).

Опыт показал, что иммунизацию можно начинать у щенков с месячного возраста. Это удобно, так как по времени совпадает с отсадкой щенков, что позволяет в производственных условиях объединить эти два зооветеринарных мероприятия.

5.4. Определение сроков наступления и длительности иммунитета. Экспериментальное заражение привитых МЕНТА-ВАК лисиц и песцов показало, что спустя три недели у зверей формируется иммунитет и они выдерживают эксиерименталь-

Таблица 6

Формирование иммунитета у песцов, в зависимости от возраста '

групп Возраст иммунизированных щенков в днях Заразили Заболели Результаты заражения

Клшшка Микроскопия Регрокуль-тура

t 14 6 3 Тонкие 6/3 6/3

корки

2- 21 .. 7 э Отдельные 7/2 7/2

корочки

3 30 "б —. — — —

4 4& 7 — — —

. 5 ■ 14—45 4 4 Толстые 4/4 4/Ц

(контроль, неиммугшзнрованные) корки

ное заражение. Из 10 зверей 21-дневного возраста удалось заразить только 2, а из 30-дневных щенков все 10 подвергнутых заражению остались здоровыми, что указывает на выработку стойкого иммунитета,

v Для изучения длительности иммунитета проводили экспериментальное заражение лисиц и песиов спустя 1, 3, 12 месяцев, 2 и 3 года после иммуннзацин. Установлено, что иммунизация МЕНТАВАК вызывает у лисиц и песцов формирование длительного — не менее трех лет иммунитета. Ни одно из 87 привитых животных не заболело, все 10 контрольных на 12—10 дни проявили типичную клинику трихофитии.

Представляло определенный интерес проверить устойчивость лисиц и песцов к заражению штаммами гипсовндного трихофитона, выделенными в различных зонах страны. Такие эксперименты были проведены на 40 пушных зверях и 42 кроликах. Иммунизированных животных заражали вирулентными штаммами Т. mentagrophytes, изолированными от больных трихофитией лисиц, песцов, нутрии и кроликов в различных зонах страны: Белоруссии, Прибалтике, зоне Центра, Северного Кавказа, Сибири и Приморья, При этом лисиц и песцов частично заражали кроличьими и нутриевыми штаммами и наоборот. Вакцинированные животные выдержали заражение, контрольные (непрнвитые) заболели.

8,5. Изучение иммунного ответа на введение вакцины. Ис^ следователями давно предпринимались попытки создать у лабораторных животных иммунитет путем парентерального введения культур, фильтратов культур дерматофитов и сывороток переболевших животных. Лучшие результаты были получены при использовании для иммунизации полных антигенов в вк-

2—1023 17

де суспензии культур трнхофитонов, при этом убитые антигены по иммуногенности значительно уступали живым. Это особенно четко было показано в опытах на лабораторных животных, крупном рогатом скоте и лошадях (С. В. Петрович, 1967: Л. М. Яблочник, 1967).

Введение вакцины МЕНТАВАК лисицам приводило к увеличению титра агглютининов, который после первого введения составлял 1 : 80—1 : 160, а после второго — 1 : 320—1 : 640 и продолжал оставаться на высоком уровне 1—3 месяца (р<Ю,001). С четвертого месяца титр агглютининов снижался, а на пятом месяце практически возвращался к исходному (р —0,2), Повышение титра агглютининов свидетельствует об иммунологической перестройке организма, подтверждает формирование иммунитета у вакцинированных лисиц. Для более полного исследования антигенных свойств вакцины МЕНТАВАК была изучена иммунобиологическая перестройка организма с помощью плазмоклеточной реакции. Опыты были поставлены на белых мышах и песцах.

В ранее проведенных совместно с А. С. Прнтулой (1972) исследованиях по вакцине ЛТФ-130 была установлена прямая зависимость между жизнеспособностью инъецированного живого антигена и степенью пролиферации иммунокомпетентных клеток.'

У белых мышей, которым инъецировали МЕНТАВАК по 0,2 мл н песцов — 2,0 мл, заметная пролиферация плазматических клеток достигала максимума на 8—14 дни и несколько снижалась к 30 дню (табл. 7).

Та бл ица 7

Клеточная пролиферация регионарных лимфоузлов на внутримышечное введение вакцины МЕНТАВАК

Вид животного Клетки лимфоузлов к г г Сроки исследовании после иммунизации (дни)

2 4 6 8 10 12 14 | 18 22 26 30

Белые мыши Гемоцито-бласты 5 59 33 34 49 36 47 39 37 32 33 31

Плазматические 4 6 5 19 28 32 25 29 27 эо 32 26

Песпы Гемоцнто-бласты 6 36 39 43 38 29 30 39

Плазматические '1 18 23 2в| 30 29 28 | 29

У песцов регионарные—паховый, подколенный н мезеи-териалыше лимфоузлы — резко увеличивались в размерах. Как у представителей семейства Сашз, у песцов указанные * лимфоузлы представлены цепочкой мелких узелков, в норме слабо заметных. После инъекции вакцины они резко выделялись..

С 8—12 дня все больше обнаруживалось юных и зрелых плазматических клеток. Длительную пролиферацию плазматических клеток молаю объяснить наличием продолжительного раздражителя лимфондной ткани в виде сохраняющихся в мышце до 10 дней живых мнкрокониднн и образованием на коже специфической реакции в виде атипичного небольшого трихофитийного очажка. Сроки появления зрелых плазматических меток совпадают с данными других исследователей, использовавших для иммунизации антигены негрнбиой природы (А. А. Конопаткнн, 1967;- М. А. Сидоров и -др., 1971; А. С. Притула, 1972), которые также показали, что сохраняющиеся в органах животных бактериальные клетки, обуславливают развитие плазмоклеточной реакции. Появившиеся в лимфатических узлах характерные цитологические изменения соответствуют или отражают появление антител в лимфоузлах и в крови (А. Я. Фриденштейн, И. Л. Чертков, 1969; Л. Н. Фон-талин, 1960; Р. А. Кадымов, 1974). Спонтанно репродуцирующиеся в лимфоузлах группы клеток при повторном введении вакцины дают начало более интенсивной плазмоклеточной реакции.

5.6. Разработка метода терапии. Для целей терапии видимых кожных поражений у различных видов животных предложено множество различных средств и их комбинаций, которые применяются в форме мазей, линиментов, растворов, аэрозолей. Меры борьбы с применением этих препаратов трудоемки, требуют многократных аппликаций лечебных средств. Далеко не все используемые терапевтические средства безвредны, а частое взятие зверей в руки способствует их перезаражению.

Вакцина МЕНТАВАК была применена с лечебной целью п дозах 1—4 мл молодняку и взрослым зверям с различной степенью поражения (табл. 8).

Проведенные исследования по разработке метода применения вакцины установили минимальный возраст зверей для иммунизации — 30 дней, оптимальную профилактическую дозу молодняку 1—4 мес,—1 мл, взрослым — 2 мл. Лечебные дозы соответственно 2 и 3 мл. Показали полную безвредность вакцины в дозах, во много раз превышающих лечебно-профилактические, Это позволило перейти к испытанию вакцины в производственных условиях.

..........Таблица 8

Терапевтическая эффективность МЕНТА ВАК при трихофитии лисиц и песцов

с . .£! С «5 >, £ & Зверей в группе Возраст Доза в мл Выздоровело зверей Срок» выздоровления в сутках

I 25 , 1,5—4 мес. 1 122* 221—30

2 39 1,5—4 мес. ■2 39 12—22

3 В1 1.5—4 мес. 3 2:1 12—22 ' ■

4 16 .1—3 года 2 16 22—(28

б 20 |1—3 года 3 20 10-22

6 14 гола 4 14 10—22

7 3 (кон рольные) 1—4 Заболевание прогрессировало

* 3 зверям вакцина введена в дозе 2 мл в третий раз. Выздоровление.

6. РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПРОМЫШЛЕННОГО ИЗГОТОВЛЕНИЯ ВАКЦИНЫ МЕНТАВАК

В настоящее время лиофилизацня все больше применяется в биологической промышленности в производстве вакцин. Получив данные по основным моментам изготовления вакцины в лабораторных и пол у производственных условиях, мы перешли к разработке промышленной технологии ее изготовления. Для производства МЕНТАВАК был намечен Хальялас-ский биоцех Эстонской ССР, с 1973 г. специализированный для выпуска вакцины ЛТФ-130.

В основу технологии изготовления МЕНТАВАК были положены технологические принципы, разработанные нами ранее для изготовления первой противотрихофитийной сухой вакцины ЛТФ-130.

6.1. Составление технологической линии. Основная технологическая линия включает: первичный засев и выращивание матрасов с культурой штамма № 135/1963 при 26° в течение 20—25 дней. Третья — восьмая генерации культуры используются для изготовления вакцины. Грибницу снимают, измельчают, стандартизируют. Затем соединяют с защитной средой 1 : 1 (±25%) и подвергают лнофнлнзации. Продукт промораживают при минус 45° в течение 10—16 часов, сушку проводят в камерных аппаратах КС-30.

6.2. Сушка вакцины на сублимационных аппаратах. При достижении устойч!гвого вакуума 5—6 рлг включают нагрев

полок до 30—40®. Его поддерживают таким образом, чтобы температура в продукте повышалась каждый час на 1—3°. В зависимости от загрузки камеры через 20—40 часов температура вакцины достигает 0е. При достижении температуры 8— 10' снижают температуру нагрева до 25° и досушку вакцины проводят при этой температуре.

В 1975 г, работу начинали с выпуска первых серий в объеме 40—85 тыс. доз. По мере отработки технологии и увеличения спроса на вакцину увеличили и объем серий, доведя его до 460—500 тыс. доз или 22,5—28 литров вакцины в одну загрузку сублимационной камеры. В 1982 г, с контроля вышло 6 серий МЕНТАВАК в количестве 2,069 Млн. доз. Остаточная влажность вакцины составляла 1,78—2,93%, содержание мик-роконндий — 20,4—23,7 млн/мл при высокой жизнеспособности — 86,3—93%.

До 1982 г. биоцех выпускал опытно-промышленные серии с разрешения Главного управления ветеринарии МСХ СССР. С учетом накопленных данных по выпуску опытно-промышленных серий была разработана нормативно-техническая документация: 1. «Временная инструкция по изготовлению и контролю сухой вакцины МЕНТАВАК для профилактики и лечения трихофитии пушных зверей и кроликов»; 2, Технические условия ТУ 46—12—996—81 — вакцина МЕНТАВАК, утвержденные в 1981 г.

7, ШИРОКОЕ ПРОИЗВОДСТВЕННОЕ ИСПЫТАНИЕ ВАКЦИНЫ

Производственное испытание вакцины было начато в

1975 г. в ряде неблагополучных хозяйств, расположенных в Литовской, Украинской н Эстонской ССР, Центральных областях РСФСР, Поволжье, Урале и Сибири.

В зверохозяйстве «Кретин гское» Литовской ССР трихофития регистрировалась в течение предшествующих нескольких лет. Несмотря на принимаемые меры, в 1975 г. дерматофитией заболела 1081 лисица — 15% поголовья. Больные трихофитией выделялись на всех отделениях фермы, В 1976 г. зимой все основное стадо до. гона было привито МЕНТАВАК. С мая

1976 г. весь нарождающийся молодняк по достижении 30—45 дней также прививался вакциной. Всего было иммунизировано ¿47 самцов, 1370 самок и 5464 щенков. При регулярных клинических осмотрах было выявлено 105 (0.6%) щенков с начальными признаками трихофитии. Без дополнительных обработок все щенки выздоровели. Ни одно животное основного стада не заболело. Сравнительный анализ выделения больных трихофитией в 1975 г„ когда вакцину не применяли, и в 1976 г., когда иммунизировали все поголовье, показывает, что в 1975 г. заболели 464 (11,2%) зверей основного стада и 1935 (12%) щенков. С 1977 г. в хозяйстве все нарождающееся по-

2-1

головье молодняка лисиц и песцов регулярно продолжает иммунизироваться и с тех пор не зарегистрировано ни одного случая заболевания дерматофитней.

В ¡975 г. хозяйство затратило только на антибиотик гри-зеофульвин 22397- рублей, но не смогло полиостью предотвратить заболеваемость дерматофитней, Вследствие этого десятки шкурок были забракованы. В 1976 г. на приобретение вакцины МЕНТАВАК было израсходовано 1965 рублей, все поголовье зверей было предохранено от заболевания, прибыль по ферме составила 42000 рублей.

Высокая эффективность МЕНТАВАК при трихофитии песцов и лисий была установлена в зверохозяйствах «Аудру» ЭССР, ОПХ «Родники» Московской обл., «Сомовский» Воронежской обл., :«Тобольский» Тюменской обл. и др. {табл. 9).

Таблица 9

Эффективность опытных серий МЕНТАВАК в неблагополучных по трихофитии зверохозяйствах (1975—1977 гг.)

Наименование хозяйства, . Вакипиировано Заболело

Вид Всего голов Всего в %

республика, область животных Всего в т. ч, больных в 1 мес. спустя месяц

«Аудру» ЭОСР лисица, песец 25898 36 — — —

«Кретиигское» Лит. ССР лисица, песец 37473 23 96 9 0,2

«Сомовский» Воронежской обл. лисица :11818 36 93 3 0,8

«Тобольский» Тюменской обл. лисица, песец . 7460 161 2 8 0,1

ОПХ «Родники» Московской обл. лисица 4838 О 0,1

| Всего: 87487 1)10 196 » 0,2

Приведенные данные показывают, • что из привитых 87487 зверей в условиях неблагополучных хозяйств в течение первого месяца заболели 196 зверей (инкубатикп), спустя месяц — 20 (0,2%). Все 196 зверей, проявивших клинику, выздоровели без дополнительного медикаментозного лечения.

С высокой эффективностью вакцина была испытана в неблагополучных по трихофитии кролиководческих комплексах. В крупном комплексе совхоза им. Кирова Киевской области с 3000 кроликоматок основного стада воспроизводство и от-

корм были полностью остановлены, потому что зараженность кроликов трихофитией в отдельных помещениях достигала 40—60%, Хозяйство несло большие убытки. В'феврале—марте 1978 г. в комплексе, было начато применение вакцины. Комплектуя стадо нз иммунизированного молодняка, проведя дезинфекционные мероприятия, па комплексе уже в 1978 г. было получено 53,3 тыс. крольчат (112% плана). С 1978 г. хозяйство применяет МЕНТАВАК и стабильно поддерживает благополучие по трихофитии. ~ С хорошими результатами вакцина была испытана в совхозах «Бродовской» Свердловской обл., «Речной» Омской обл., «Перекоп» Кировской обл., «РаифскшЪ Тат, АССР, «Гурьев-ский» Калининградской обл. и др., где кролиководческие фермы ранее были неблагополучны по трихофитии кроликов.

Хорошие результаты были получены при применении МЕНТАВАК с лечебной целью на более 350 пушных' зверях и 2700 кроликах. Животные выздоровели без дополнительных медикаментозных обработок.

Всего в 1975—1980 гг., с разрешения Главного управления ветеринарии Л1СХ СССР, МЕНТАВАК была испытана на более 1 млн. лисиц, песцов и кроликов в сорока хозяйствах различных зон страны. Многие фермы практически оздоровлены от трихофитии н ежегодными допрнвивками нарождающегося поголовья поддерживают стойкое благополучие по трнхофн-тнн.

S. АПРОБАЦИЯ И (ВНЕДРЕНИЕ ВАКЦИНЫ МЕНТАВАК ' -. Ц . В ШИРОКУЮ ВЕТЕРИНАРНУЮ ПРАКТИКУ

8.1. Апробация вакцины МЕНТАВАК. В соответствии с «Положением! о порядке апробации новых биологических препаратов, применяемых в ветеринарии и жнвотнововдстве* в 1979—1980 гг. проведена апробация вакцины МЕНТАВАК. Проверка проводилась совместно с лабораторией по контролю препаратов против микозов ВГНКИ ветпрепаратов. Она включала: К^Изучепие вакцинного штамма; 2. Изготовление опытной серии вакцины; 3. Контроль вакцины; 4. Испытание иммуиогенности вакцины на пушных зверях.

Проведенное изучение культурально-морфологических свойств вакцинного штамма Trichophyton 'mentagrophytes № 135/1963 подтвердило его макро- л мнкроморфологическую характеристику. При этом установлено, что эталонный.штамм п.культура,«полученная нз образцов опытных серий вакцины, при рассеве на сусловый агар образует колонии только одного типа. Микроморфологпчески представлена мицелием и большим количеством овально-округлых, реже — палочковидных .микроконндий, ■ . - •

- Комиссионно в Хальяласском бноцехе 19 мая 1979 г. была приготовлена опытная серия вакцины № 20, . которая имела следующие показатели: остаточная влажность — 2,31%, содержание микрокоиндий— 19,1.млн/мл, из них колоииеобра-зугощнх—13,3 млн/мл. Вакцина не ^содержала роста посторонней микрофлоры, была безвредна для кроликов. При испытании нммупогенной активности МЕНТАВАК на кроликах все 8 иммунизированных ^выдержали контрольное,заражение штаммами № 251 н 257, непрнвнтые 4 кролика (контроль) заразились инфильтратнвнон формой трихофитии с появлением вторичных очагов.

В условиях изолятора зверохозяйства «Кретпнгское> серия МЕНТАВАК № 20 была проверена, на песцах на лммуноген-ную активность. Из 20 иммунизированных животных 10 были подвергнуты контрольному заражению, одновременно заразили и 6 непрнвнтых песцов (контроль). Из 10 иммунизированных только у 2 на месте заражения были обнаружены небольшие участки, покрытые шелушащимися чешуйками кожи. Микроскопические исследования дал!Г отрицательный результат, но из одной пробы была выделена ретрокультура. Все 6 контрольных заболели.-

Материалы апробации 16.09.80 г, были доложены на заседании Ученого совета ВГНКИ ветпрепаратов, одобрены й было рекомендовано принять от ВИЭВ вакцинный н два эпизоотических штамма №№ 251 и 257,

Полученные материалы по разработке вакцины, технологии ее изготовления и эффективности применения были представлены в Научно-технический совет МСХ СССР, 19.02.81 г, они были рассмотрены, одобрены и НТС рекомендовал внедрить вакцину МЕНТАВАК в широкую ветеринарную практику. ". ■

8.2. Внедрение вакцины в широкую ветеринарную практику, С каждым годом увеличивался объем использования вакцины, Крупнейшая звероводческая организация страны Производственно-научное объединение Зверопром РСФСР ежегодно использовало МЕНТАВАК во все возрастающих коли-* чествах: с 420 тыс. доз в 1978 г. до 855 тыс.—1979 г. и 1100 тыс.—1980 г. Все шире применяли вакцину хозяйства других объединений — системы Центросоюз и др. Только в 16 зверохозяйствах. Зверопрома РСФСР в 1979 г. с высокой, эффективностью было иммунизировано 173,0 тыс. кроликов и 48,3 тыс. лисиц и песцов.

Высокая эффективность лечебно-профилактический обработок была достигнута в зверохозяйствах «Тырма» ЭССР, «Забайкальский» Бурятской ССР, «Иодпетряй» Литовской ССР, кролиководческих фермах совхозов «Троицкнй> и «Каш-тановский» Красноярского края, «Мичуринский» Кустанайской 'области, «Солнцевский» Курской обл. и многих друг ил.,

Увеличение объема заявок на МЕИТАВАК потребовало расширения выпуска вакцины. Хзльлласекий биоцех перешел на производство крупных серий по 450—580 тыс. доз. Всего в 1982 г. было реализовано 3,5 млн, доз вакцины. По заявкам хозяйств через, республиканское, объединение Эстзооветснаб и местные объединения зооветснаба вакцина доставляется звероводческим it кролиководческим фермам различных зон страны, которые полностью обеспечены биопрепаратом.

Приказом по Главному управлению ветеринарии МСХ СССР Кг 67 от 22.12.81 г. вакцина МЕНТАВАК внедрена в ветеринарную практику.

ВЫВОДЫ

L' Лисицы и песцы болеют трихофитией с месячного возраста. Заболевание чаше дпапюсиируется у 1,5—3-х месячных ■ щенков в период с мая по сентябрь месяцы, что связано с появлением восприимчивого поголовья.

'' 2. Основным возбудителем дерматофитий пушных зверей' и кроликов является Trichophyton mentagrophytes' (Robin) Bianchard, 1896, реже выделяются Microsporum canis Bodin, 1902 и Trichophyton verrücosüm Bodin, 1902. ■'.

' 3. Пушные звери (лиенцы, песиы), кролики, спонтанно переболевшие или экспериментально зараженные трихофитией (возбудитель — Т. mentagrophytes), формируют напряженный иммунитет к трихофитии,

4. Получен высоконммуногенный штамм J Trichophyton mentagrophytes Ks 135/1963, который используется в промышленном производстве для изготовления вакцины. 'Штамм защищен'авторским свидетельством № 792640 и депонирован в Центральном бюро грибных культур в г. Баарне (Нидерланды) под №CBS 571/81. -

5- Установлено, что наивысшее накопление жизнеспособных микроконндий происходит в 20—25-дневной культуре штамма Trichophyton mentagrophytes № 135/1963. Оптимальное содержание микроконндий в вакцине для сушки составляет 300—500 млн/мл.

6. Использование защитной среды, содержащей водные растворы 4% желатина и 20% сахарозы, соединенные в равных частях с гомогенатом .20—25-дневной культуры Т. mentagrophytes № 135/1963, обеспечивает получение высокоактивной вакцины при лиофилпзацнн по установленным режимам.

7. Разработана технология изготовления сухой вакцины МЕНТАВАК против трихофитии пушных зверей и кроликов, налажен ежегодный промышленный ее выпуск в объеме двух миллионов пятьсот тысяч доз, полностью обеспечивающий звероводческие хозяйства.

3. Двукратное внутримышечное введение вакцины в' дозе I—2 мл с содержанием 10—25 млн/мл мнкроконндий создает у пушных зверей и кроликов практически пожизненный иммунитет, * :

9, Активное формирование иммунитета подтверждается накоплением агглютининов и комплементсвязывающих антител (реакция РА и РСК), показателями плазмоклеточной реакции, отрицательными,результатами контрольного экспериментального заражения животных, иммунизированных МЕНТАВАК.

10. Производственное испытание вакцины в условиях пяти неблагополучных хозяйств на 87,4 тыс. пушных зверей показало ее высокую эффективность — 99,8%.

И. Применение вакцины МЕНТАВАК в 1975—1983 гг. на поголовье более двух миллионов пушных зверей и кроликов позволило оздоровить ;■ многие ранее неблагополучные хозяйства. сохранить высокое качество шкурковои продукции, предотвратить потерю .мясной продуктивности кроликов, опасность заражения людей н повысить производительность труда ветеринарных специалистов по>борьбе с этой инфекцией.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Временное наставление по применению вакцины МЕНТАВАК против трихофитии пушных зверей.и кроликов.. •

Утверждено ГУВ МСХ СССР 28 июля 1980 г.

2. Наставление по применению вакцины МЕНТАВАК против трихофитии'пушных зверей и кроликов.

Утверждено ГУВ МСХ СССР 28 октября 1981 г. ' '

3. Временная инструкция rió изготовлению и контролю су-. хой'Ьакцнны'МЕНТАВАК против трихофитии пушных зверей. , и кроликов.

Утверждена ГУБ МСХ СССР IG октября 1981 г.

1. Вакцина МЕНТАВАК. Технические условия. ТУ 46— 12—996—81.

Утверждены ГУВ МСХ СССР 16 октября 1981 г.

Госреестр Кй 2262806 от 3 ноября 1982 г.

5. Временная инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации заболевания кроликов стригущим лишаем.

Утверждена ГУВ МСХ СССР 23 ноября 1981 г.

G. Наставление по-прнмененню.вакцины МЕНТАВАК против трихофитии пушных'зверей и кроликов.

Утверждено ГУВ МСХ СССР 4 апреля 1984 года.

список

ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Никифоров Л, И. Профилактика и терапия;стригущего лишая у лисиц. — Кролиководство и звероводство, 1965, № 9, е.*59.

2. Никифоров Л.' И. Гриб Trichophyton íavtforme — возбудитель трихофитии пушных зверей.'—Бюлл. ВИЭВ. Ш67, Ki 2, с. 90—91. '

3. Саркисов А. X., Никифоров Л. И., С л у г и и В. С. Стригущий лишай норвежских песцов и разработка мер борьбы с этим заболеванием.— Кролиководство и звероводство, 1968. т 6,'с, 28—29.

4. Аядриенкй К. П., Никифоров Л. И.. Олефир Н. С. Новые данные в этнологии трихофитии пушных зверей. — Труды Мое ордена Труд. Красного Знамени вет; акад., 1970, т. 54, с. 81—8¿

б. Никифоров Л. И., С л у г и и >В. С., Гр абовский С. Б. Моры борьбы с трихофитией пушных зверей, — Бюлл, ВИЭВ, 1972, ЛУ 12, с. 52—54, .'■

6. Саркнсов А, Х„ Никифоров Л, И., С л у г и и В. С. Лечение к профилактика трихофитии пушных зверей, — Ветеринария, 1972, ,№11 С, с. 81—82..

7. Никифоров Л. И. Возбудители дерматомик'озов пушных зверей и кроликов. — Бюлл. ВИЭВ, 1976, 25, с. 74—75.

8. Никифоров Л. И., Кузнецова О. В., Ч и м а к а д з е Г. А. Иммунитет при спонтанной и экспериментальной трихофитии кроликов, вызванной гипсовидным трнхофитоном. Бюлл. ВИЭВ, 1976. Jíi 32, с. 27—28.

' 9. Н и ки ф ор о в Л, И. Дерматомнкозы клеточных пушных зверей. Тезисы докл. И Всесоюз. науч. конф,, г. Киров, 1977, с, ККХ

10. Н н кифор о в Л. И. Иммунитет при трихофитии пушных зверей. — Бюлл. ВИЭВ, 11978. № 32, с. flS-^26.

^.Никифоров Л. И. .Возбудитель дермэтомпкоэов пушных зверей, кроликов п лабораторных животных.—Ветеринария, 1980, Ni И, с. 39.

12. Саркнсов A. X-, Никифоров Л. И, Результаты исследований по разработке и изучению вакцины МЕНТАВАК против трихофитии пушных зверей и кроликов. М.. 1980, 15 с.

13. Саркнсов А. X., Никифоров Л. И. Специфическая профилактика трихофитии пушных зверей.— Ветеринария, 1981, № 7, с. 37—38,

14. Никифоров Л. И. Вакцина МЕНТАВАК, — Кролиководство н звероводство, 19®!, № 4, с. 34—35.

15. Никифоров Л. И. Защитные среды для лнофнлиэации живых грибных вакцин. —бюлл. ВИЭВ, 1981, № 412; с. 27—29.

., 16. Саркисов А. X., Никифоров Л. И. Специфическая профилактика трихофитии пушных зверей. — Бюлл. ВИЭВ, 1981, № 45; с. 32—34.

17. Никифоров.Л. И. Показатели иммунитета при экспериментальном изучении вакцины МЕНТАВАК. — Бюлл. ВИЭВ, 1982, № 45, с. 62—63.

18. Никифоров Л. И. Профилактика и лечение стригущего лншпя пушных зверей. — Кролиководство и звероводство, 1982. Nt 4, с. 32—34.

19,.Н II к и ф о р о в Л. И. Вакцина МЕНТАВАК для профилактики и лечения трихофитии пушных зверей и кроликов, —М, ВАСХНИЛ, 1982. 2 с,

■ 2ft Никифоров Л, И. Эпизоотология трихофитии пушных зйе-рей. — Тезисы докл. Всесоюз. науч. конф. тго проблемам эпизоотологии, Казань, 1983, с. 1S2.

21. Саркисов А. X., Никифоров Л. И, Вакцнна МЕНТАВАК для специфической профилактики и терэшш пушных звере Л к кроликов.— М., Внешторгиздат, 1983, Ü3 с.

22. Саркисов А. X., Никифоров Л. И. Штамм Trichophyton gypseum № 135/1963, используемый для изготовления вакцины против

трихофитии пушных зверей и кроликов. Авторское свидетельство № 792640, Приоритет 7 июня 1978 г, ,. . ...",' ' , ...

23. Саркисов А. X'. "Н к к иф о р о в Л, И. Вакцина для специфической профилактики и лечения трихофитии пушных зверей и кроликов— МЕНТАВ АК, способ изготовления вакцины и способ использования. Авторское свидетельство № 83544& Приоритет 7 июня 1978 г. . ц; .

£4, С а р к и с о в А. X,, Никифоров Л. II, Вакцина и метод' профилактики и терапии: трнхофитоза, вызванного патогенным организмом Трихофитон .мента гр офит ее - и метод изготовления.— Патент - США № 4368191. Приоритет 7.шоня 1978 г, , ' . .

25, С а р к и с о в А!'Х-, Никифоров Л. И. , Вакшша и метод профилактики и лечения трихофитоза, .вызванного патогенным .микроорганизмом, Трихофитон . мёнтагрофитес- и метод изготовления препарата, — Патент Канады № 1136042. Приоритет 7. июня 1978 г. -

■ 26. Са р к исов А. X., Никифоров Л,*И. .Вакцина для профилактики терапии трихофитии, вызванная Трихофитон ментагрофитес и процесс изготовления вакцины. — Патент Франции М» 791,4602. 1983 г. Приоритет 7 июня 1978 г. ■ • ....-.= , .

, 27. Са р кнеов .А. Х„.Никифоров Л. И. В.акцина для профилактики и лечения трихофитоза, вызванного патогенным организмом Трихофитон ментагрофитес, , и г метод изготовления, — Патент Великобритании Л» £ОЛГ-2£В', 1983 г. Приоритет 7-июня 1978 г. * ■ , ,

28. С а р к и с о в А.' Х„ , Пе т р о в и ч С,' Б,, Никифоров Л. И., Королева В., П, Яблочник Л. „Свойство клеток дерматофитов■ (алейрнй) в стадии сапрофитного роста вызывать.у млекопитающих пожизненный иммунитет .против паразитного развития возбудителей -дерма-томикозов, — Официальный бк^тл. Госкомизобретеннй.. Открытия и изобретения, 1983,.Ча 47, с, I.-„

Заказ 1023" ' Тираж 110 экз;

Подп. в печ. 24/1У 1984 г.

Типография ВДСХНИЛ •