Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Токсикологическая характеристика и ветеринарно-санитарная оценка метаболитов гриба Fusarium Graminearum SCHW

На правах рукописи

Зотове Елена Владимировна

ТСКСИК0Л0П1ЧШШ ХАРАКТЕРИСТИКА И ВЕТЕРИНАРНО-САНИГ АРНАЯ СЦЕНКА ЫЕТАБОЖП'СВ ГРИВА эттмим айАКШЕАЛиы 8 с ни.

16.00.06.- ветеринарная санитария и экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Москва - 1996 г. | (

/Уг\

£

Работа выполнена во Всероссийской научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиена и экологии.

Научные руководители: доктор ветеринарию; наук В.А.Долгов, кандидат химических наук Г.П.Коконенко

Официальные оппоненты:

1.Доктор ветеринаршх наук, профессор Г.Н.Корзевижо

2.Кандидат биологических наук, ведущий научный сотруцинк Л.С.Львова.

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им.Я.Р.Коваленко (ВИЗВ)

Защита состоится " " МС)Я 1996 г. в -ДО пасов на заседании диссертационного Совета Д.020.50.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиеш и экологии ( 123022, Москва, Звенигородское шоссе,5, тел.256-35-81)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИИВСГЭ.

Автореферат разослан "9 "

Учедай секрехарь шй:сертанионного Сонета, кандидат биологически* наук

апРглА 1596 г.

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАЕОШ

Актуальность там. Изучение продуктов метаболизма гриба рц-1аг1ит 8тат1пеагип ЗсЬ«. , образуемых иы на зерновых субстратах, тноеится к числу особо ваяшх мешшо-биологкческих и ветеринарнс-анитарных проблем.

Гриб Р.егат1пеагиш является распространенным возбудителем фу-ариоза зерновых культур во многих странах мира и а ряде обширных 1вгионов зерносеяния в нашей страну в частности, на Северном Кав-:азе (Краснодарский и Ставропольский края, Ростовская оо'ласть) и I Белгородской области. Среди метаболитов, продуцируемых указанным илом гриба, известны соепкнеиия, о Слал, ас щи в высокой токсичностью, мутагенными, тератогенными и канцерогендами свойствами. Контамина-1ия пищевых продуктов и кордов токсичньши иотаболитами гриба может лазать отрицательное влияние на состояние здоровья человека и яи-ютных, понизить их сопротивляемость к заболеваниям незаразно® и инфекционной этиологии, а также явиться причиной значительного жономического ущерба, связанного с изъятием большие партий зерна 13 продовольственной сферы и сферы кормопроизводства, снижением |ропуктивности и воспроизводительна; фушший сельскохозяйственна, швотных.

Исследования изолятов этого вида гриба из озимой ппенищ, выращенной в хозяйствах Северо-Кавказского региона, показалк, что Уолее 9(Й из них являются продуцентами ыикотоксина - 4-д.езогсиии» )аленола (ДОК) , относящегося к группе В-оксотрихотэцемоВс Большие-:тво изолятов, продуцирующих ДОН, способ« образовывать еще четыре зтруктурьо-родс/верных метаболита - З-ацетил-^-де&оксиниьаленолО-\ЦСК), 15-ацетил-4-дезоксинивзлено л 15—АДСН), 4,7-дип.езогссштза-некол (7-ДДН) и 3,7,8,15-тс-тр,1якс>'-12,13-зпокситр1г.:отец-9--ь:! (7,8-шмсикалонектрин тетряол, 7,8-ДОКТ). Доля этих метаболитов иожат

- о -

достигать 45а от уровня ДОН. Кроме того, некоторые изолятн гриба в экспериментах при оптимальных условиях образуют на зерне метаболит из группы бутенолидов - 5-ацетамидо-2( 5Н) -фуралон (5-ААФ).

Токсичность моноацетильшх замещегсшх 3-АДШ и 15-АДОН и бу-теиолида 5-АА5 изучена крайне недостаточно, а данше но токсичности двух других метаболитов - 7-ДЩ1 и 7,8-ДОКТ отсутствуют вообще, Предварительная оценка показала, что токсичность этих соединений может быть равна или превышать токсичность ДОН. Действующие в настоящее время методики анализа зерна, принятые в системах Ыинсеяь-хозпреда и Минздрава Р8 не предусматривают определение в нем вкше-названных контамииантов, сопутствующих ДОН. В связи с этим представляет большое научное и практическое значение изучение токсичности метаболитов гриба Р.вгаа1поагиа , разработка методов их определения в зернофураже и кормах.

Цель работа. Целью данной работы являлось изучение параметров токсичности метаболитов гриба У.вгапИпвапип , разработка методов их определения в зернофураже и продуктах его переработки.

В задачи исследований сходило:

- оценить токсичность шести метаболитов гриба г.ЕгеШпввгив по действию на кожные покровы лабораторных животных, ростовую реакцию простейших ТвггаЬушепа игг1Гогп1в (Тетрахкмена пириформис), куриные эмбрионы, белых мыпей при пероралызом введении;

- отработать методические приаш извлечения из зерна, выделения из экстракта и количественно!! оценки токсичных когтаминантов пля разработки методов иг определения в фузариозяом зерне.

Научная новизна работа состоит в слевдвцел:

- разработана методика определения содержания остротоксичшх тргасотецеков в зернофураже и комбикормах по точечной пробе на козе кролика;

- впервые определена показатели острой токсичности '¿рихотеце-цоз 7-ДЦН и 7,8-ДОКТ, структурно-родственных ДОН, для белых мышей;

- проведена сравнительная оценка токсичности ДОН, 3-АДОН, 15-ДД®, 7-ДЦН и 7,8-ДОКТ ко показателям четырех биотестов;

- идя группы токсичных контшкнантов зерна усовершенствована процедура выделения из экстракта, найдены способы их направленной химической модификации м оптшизирован резаны хрояатографического разделения и детектирования.

Практическая ценность работа. Результата работы вошли в "Методические рекомендации по количественному определении дезоксини-валепола в зерне с применение* обращенно-фаэовой высокоэффективной лидкостной хроматографии", утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН а 1995 г., предназначенше пдя научно-исследовательских и производственных аайораторий, осуществляющих контроль санитарного качества зерна, и "Методику экспресс-анализа зернофураяа я кодбикориоа на содерзапие остротоксичпых трихотецеаов", представленную шш утверндетш в Департамент ветеринарии Минсельхозпрода Р5.

Апробация работа, ¿атернаш диссертации долозеш на ыегяабо-раторноы Совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ 28 февраля 1996г.

Что выносится к защите:

- оценка токсичности шести метаболитов гриба Р.егввйпаагшп по четырем биотестам;

- "Методика экспресс-анализа зернофуража и комбикормов па содержание остротокспчных трихотецевов" по точечной пробе на ноао кролика;

- "Методические рекомендации по количественному определении дезоксиниваленола в зерне с пршенешш обращеяно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии".

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 4 статьи» в ксторд: содержатся материалы исследований.

Объел работа.

Диссертация изложена па 40& страницах иошниогшсиого текста и состоит из введения, обзора литература, собсхзениах иссаедовелиА, обсуждения результатов, шводов, пр&цтичзсис: пргрлсжегшй, двух прилозений. Содержит таблиц, 4 рисунка, н ■/ схшЗ. Спрсок литература включает источника, в тем ч:!сда НО шаеграншз:.

2. СОШЕВШШЕ ШУЩДШАНШ 2.1. Материала и методы исследований

Работа проведена в секторе физико-химических методов исследования и сертификации кордов (сектор мпкотоксикояогии), в лаборатории Бетгринарно-санитарной экспертизы мяса ВНИИВСГЗ а на Рязанско!

бройлерной птицефабрике в период с 198Э по 1995 гг.

Обвитом исследования была группа из и ости метаболитов, типичных для вида р.згашЛпеагию » поражающего вегетирувщую пшеницу в

Краснодарском 1Сраб. Метаболиты трихо-геценового ряда ДСН, 3-АДШ, 15-ЛДОН, 7-ДЦН и 7,8-ДСКГ были получеш в секторе физико-хшичес-ких нотедоа исследования и сертификации корлов из мицелиально-зерновой биомассы ттаима 579а ВНИИЗ. Цутенолид 5-ААФ был получен синтетически из фурфурола в Краснодарском политехническое институте (исл. В.3.Посконин). Эталонный Т-2 токсин для исследования бия приобрети! через фирлу " Зег^а" (США).

Опыт по оценке дерлальной токсичности проводили на коже крыс массой 200-250 г, анестезированшх сибазоном (20 мг/кг, однократно вцутримшечно) перед депиляцией, и кролшюв породи шиншилла массой 2,5-3,0 кг с нелигаентированной коаей. По 20 мкл растворов зещестэ в отилецетато наносили на поверхность кожи микрошприцом в то'пу постепенно, порциями по 2 мкл (диачетр 5 мм). Токсическое действие веществ на коау определяли по степени проявления воспали-тельшх реакций на поверхности контакта через 24, 48 и 72 часа. Токсичность веществ выражали в показателях пороговых или минимально-действующа дерыатоксических доз (ЩД) - наименьших доз, вызывающих через 48 час реакцию слабого покраснения по периферии поверхности контакта. Для испытания готовили три серии растворов вещества из расчета соаераания 0,001-0,009, 0,01-0,09, 0,1-1,0 мкг в 20

»

'мкл раствора и, при необходимости, дополнительные дозн от 10,0 ао 100,0 и кг. В опытах использовали и серий растворов этанольного Т-2 товсина с содержанием актшжого вещества 0,001-0,009 мкг.

При оцшко токсиодости метаболитов для простейших использовали ¡?/ЛоТуру реснитчатых йк|уэсрнй ТоггаЬуиеаа рз?г1Гогта1в (Тетра-к»мена пирифорьше) , шращеиную на пептонгюй среде. Среду ии-актчьирозалн от посторонней микрофлоры в кипящеЯ веде в течение 30 пин. В остывщув срезу вносили содгае растворы исследуемых 'микоток-атюв а количествах о-г 0,5 до 40 мкг/мя, добавляли по 0,01 мл трех-

суточной культуры тстргшмен, инкубировали 24 часа при комнатной температуре. Регистрировали ростовуп реакцию путем подсчета инфузорий в счетной камере фукса-Розенталя, устанавливая концентрации ыи-котоксинов, вызывающих Щ1~пое снижение числа простейших по сравнению с контролем (ИКс^).

Сравнительную оценку токсичности для дашей ДШ, 7-ДДН и 7,8-ДОКГ проводили на 600 белых мышах кивой кассой 17-21 г. На каждый опыт формировали 10 групп по 10 голов. Раствор: нстиуешх токсинов вводили в 2($-ном этаноле однократно по 0,5 мл в аедудок через зогщ в дозах 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, S0 и 100 мг/кг веса тела животного. За кивотними наблюдали в течение 2-х суток. Павших животных, а такве животных, д.екапитировшшых по окончании срока иабяадеяия, аскрыряли, отбирали для гистологических исследований сердце, печаль селезенку, почки, фиксируя их в IOíS-ноы растворе формалина.

Оценку эмбриотокснчности ДШ, 7-ДДН и 7,8-ДОКТ проводили иа 559 односуточных куриных эмбрионах в ншо'батории птицефабря^к. Для приготовления испытуемых растворов рассчитанное количество токсина растворяли в 220 мкл 0,5^-кого физиологического раствора, содержащего по 210 ВД пенициллина и стрептомицина, и вводили по 10 мкл раствора на эмбрион. В опытах были испаташ следующие роли - 0,5; 1,0 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 25,0 и 50,0 мкг/яИцо. В иаааой опытной группе было по 20 амбрионов. албриотокснчесшо действие млкохокскнов оценивали по смертности змбриоиов, результатам патолого-акатомического вскрытия погибших эмбрионов, показателем вывошиосхи и физиологического состояния даплят.

При разработке методов обнаружения и количественного определения компонентов, проявивших токсичность, использовали приемы тонкослойной (ТСХ) и обращеино-фазовой шеокооффектипной жидкостной (О®-

ЗЭаХ) хроматографии.

ТСХ проводили на пластинках "Силуфол" с толщиной слоя 0,1 мм С Kavalier", ЧСФР). Для детектирования веществ использовали три режима обработки пластииох - 10%-ныы раствором хлористого алшиния в этаноле (10 мин, 92,0+0,1°С), 20^-шм раствором серной кислота в этаноле (2 мин, 92,0±0,1°С), реактивом Такитани (3^-нш раствором 4-нитробенэилпириаина (30 мин, 150+1°С) и 1(?6-ным раствором тетра-этиленпентамина в снеси хлорофорл-четнреххлористый углерод в соотношении (2:3)). Количество токсинов определяли на основании вигу-альной оценки в УФ при 366 кл и путеы денситсметрии на сканирующее денситометре " Сашаг TLC scener Ii" (" Camag", Швейцария), измеряя флуоресценции пятен при длине волш 315 ни. Интенсивность флуоресценции определяли по высотам пиков хроматограмм. 3 качестве компонентов поавижньгх фаз (ПФ) использовали метанол, изопропанол , ацетон, хлороформ, этилацетат, бензол, гексан.

(ХМШХ выполняли на хроматографе "Ыилихроч-Itf", снабженной ыикроколонкой размером 62 х 2 им, заполненной сорбентом Hucleceil Cjq (5 мкм) при скорости потока элаента 50 икл/мин. Вещества детектировали УФ-спектр-}фотометрически при длине волны 224 нл. В качестве органических модификаторов П5 использовали этанол, метанол, 'ацетонитрил и тетрагицрофу ран.

Запись УФ-спектроэ анализируемых веществ проводили на спектрофотометре " Hitachi 557" (Япония).

Для модификации трихотецвнов использовали растворы аммиака и едкого кали в смеси метанол-вода в соотнолении 9:1 в диапазоне концентраций 0,01-0,1 н., и активную овуокись марганца.

Результаты экспериментов обрабатывали с использование метопов вариационной статистики по Керберу, Стюдонту, Доспэхсву.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 2.2.1. Оценка токсичности метаболитов F.graminearum.

Точечная аппликация растворов ДОН, 3-АДСН и 15-АДОН на кожу крыс в дозах от 0,4 до 10000,0 мкг и Т-2 токсина в дозах 0,01-1,0 мкг показала, что минимально-действующие дерматоксические дозы (ВДДЦ) изученных- 3-оксогрихогеценов находятся в достаточно узкои диапазоне 0,5-2,7 мкг и оказываются существенно выше, чед 4ОДД T-J токсина в этом биотесте, равная,по нашим данным,0,02 ыкг Стабл.1),

Большая чувствительность этой биопробы достигалась на коже кроликов. ЦЦДД для ДОН, 15-АДОН, 7-ДДН составила ОД мкг и для 3-ДДОН 0,5 мкг. Эти 8-оксотрихотецены, имеющие близкие ЬЩДД 0,10,5 мкг, уступают по степени токсичности в этом биотесте Т-2 токсину и диацетоксисцирпеноду (НВДИ » 0,005 мкг), и 4-ацетилнивадв-ноду (фуэаренону X) (ЦЩЦ »0,01 мкг), но превосходят по этому по казателю другие трихотецены, в частности, ацетил-Т-2-токсин (НВДД 1,0 мкг). Установленная нами высокая чувствительность этой биопро бы для Т-2 токсина и диацетоксисцирпенола использована при разработке "Методики SKcnpecc-анализа зерна на содержание остротоксич-пьпс трихотеценов". 7,8-ДШТ и 5-ААФ практически не оказывали токсического действия, ВДЦД для них оказались равадми 20,0 и 60,0 и'-соответственно.

Вое исслевованные метаболиты оказывали ингибирующее действие на ростовую (генеративную) реакцио простейших Тетрахимена пнрифор мис и по степени ингибировакия располагались в следующем порядке 15-AF.0H»ДОН > '''-ДДН " 7,8-ДСКТ > 5-AAs£ > З-ДПОЯ. Близки показатели токсичности для 15-АДШ и ДШ (М50 соответственно 1,8 и 2,4 мн

Таблица I

ПОКАЗАТЕЛИ ТОКСИЧНОСТИ ЙЕТАБОШИШ FUSARIUM ОНАЫПЕШШ для 4-х ШСТЕСТС8.

Метаболита 1 ! \ (мкг) | кролик | крысы j «¡80 } (мкг/мл) { Тетрах.пириф. ^50 | (мкг/яйцо), КУрИН. aMÖpj %0 (мг/кг мыши

Д® 0,1 1.7 2,4 7,3 51,0

7-ДДН од 6,5 97,3 89,7

15-АДСН од 1,0 1,8 34,0х

7,8-ДШТ 20,0 7,2 301,0 72,0

З-АДОН 0,5 2,7 27,5 34,0х

5-АМ 60,0 12,5 >8000,0х 275,0

х - по литературным данным.

«л), а тагасе для 7-ДДН и 7,8-ДСХСГ (ИК50, соответственно, 6,5 и 7,2 мкг/мл). Наименее токсичным» являлись 5-АМ (ИК5дЛ2,5 мкг/мл) и З-АДОН (ИК^г?, 5 мкг/мл).

Значения ДДзд для куриных эмбрионов,составившие для ДШ - 7,3 мкг/яйцо, аля 7-ДДН - 97,3 мкг/яйцо и пля 7,8-ДОКТ - 301,0 мкг/яйцо показывавт, что в этом биотесте 7-ДДН и 7,8-ДСКТ были гораздо мспзэ токсичными, чем ДОН. Характер действия веществ в I и 2 период инкубации такге оказался различным. Гибель змбрионоз в опыте с ДОН наступала преимущественно в 1-ой половине инкубации. 7-ДДН и 7,8-ДОКТ вызывали гибель эмбрионов в равной мере а I и Р. половине инкубации.

По-видимому, эти структурно близкие метаболиты имеют различные механизмы действия на эмбрионы, и биотест " СЬез1-.т" не может быть использован для сравнительной оценки токсичности подобных метаболитов.

При определении острой токсичности трихотеценов на белых мышах п~ч введении внутрь значения ДДд0 составили для ДОН - 51,0 мг/ кг живой массы, 7-ДДН - 89,7 иг/кг, 7,8-ДСКГ - 7£,0 мг/кг. Полученные значения ДД^ и однотипные доаазависимые изменения в печени, почках, селезенке и сердце в виде застойных явлений на фоне дистрофии очагового типа, выявленные при патолого-анатомическоы вскрытии и гистологическом исследовании, показывает, что эти трихотецега имею? близкую токсичность при оральном одноразовом введении острах доз в организм мышей.

Сравнительная оценка результатов, подученных в 3-х биотестах позволяет отнести в числу токсичных метаболитов пять из шести исследованных соединения - ДШ, 15-ДДОН, 3-ДДОН, 7-ДДН и 7,8-ДСКТ.

2.2.2. Разработка методических подходов для определения токсичных метаболитов грибаТиваг1ада вгоя1пввпш в зерне.

2.2.2.1. Направленная химическая модификация трихотеценов.

Определение ДОН и сопутствуюФя ему токсичшх трихотеценов 15-АД ОН, 3-ДЦОН, 7-ДДН и 7,£-Д0КГ в зерне может быть выполнено и (.я.чавчьно, в частности, при обращенно-фазовой пмоохрзффэкт/вной «|*1К'»«тяой хпичто» (;Ч?ЯХ) или при даукрпгшй тонкослойной

хроматография (ТСХ) на силикат кг е при посд^овательпом пргаенеяии двух порвишнх фаз толуол-метанор (6:1) и зтилацетат-гексап (3:1) и последующи детектированием веиеств спектро- гаи фдуориметричос-ки. При выполнении серийных исследований раздельное определение достаточно трудоемко. На практике для анализа зерна на содержание гоптеминантов, имевших близкие показатели токсичности, достаточно определить их суммарное количество. Такое определение монет быть выполнено после модификации многокомпонентной группы трихотеценов таким образом, чтобы упростить ее состав, а следовательно, и заключительную стадию анализа.

В группе токсичных трихотеценов, сопутствующих ДШ, три метаболита - 15-ДЦОН, 3-ДДШ и 7,8-ДОКТ имеот одинаковое с ДСН расположения замепрющих групп при С3, С^ и С^. Различия со структурой ДШ состоят в одгоН ацетильной группе при С3 и С15 у З-ДДОН и 15-ДДШ н одной оксигрупле при Сд у 7,8-ДОКГ.

м Чк» он но сн

З-АДСВ (Ег-Ав, Н2«н) . Д® 7,8-ДСКТ

15-ДЦОН ( П^Н, Я2-Ас)

Эта идентичность в расположении заместителей в структурах трех перечисленных метаболитов и была использована нами пля разработки приемов их направленной модификации в ДШ.

Для превращения 3-ДДШ и 15-АДСН в ДШ нам л была использована реакция гидролиза. Учитывая присутствие в молекуле 15-АДОН Л?-группы при сближенной с ацетильной группой при 0| Г), модно было предположить, что гидролиз 15-ЛДШ будет происходить Л':гчр, гидролиз 3-АДОН.

Рисунок 1.

ЗАВИСИМОСТЬ СТЕПЕНИ ГИДРОЛИЗА 3-4Д0Н (I) И 15-АДОН (2) В (МЕСИ .ЕТ АНСЯ-ВОДА (9:1) ОТ НОРа1АЛЬНОСТИ РАСТВОРА АМ1АКА ЧЕРЕЗ 16 Ч РЕАКЦИЙ (А) И ОТ ВРЕлЕНИ РЕАКЦИЙ С 0,01 н. РАСЯВОРШ КСН (Б).

100 90 00

70

0,01 0,026 0,05 0,075 Иормааыюсть раствора аммиака

10 2 0 30 4 0 50 60 Вре^я реакции (мин)

Действительно, при гидролизе как аммиаком, так и КОН, смыденмс 15-АД ОН происходило значительно легче, чем 3-АДСН. Степень гидролд аа 15-АД® была существенно шле идя всех изученных концентраций раствора аммиака (рис. 1А). Большая степень гидролиза 15-АД ОН при обработке 0,01 к. раствором КОН хорошо лросдеаиваотся для интервала времени реакции 10-30 мин (рис. 1Б). Поскольку З-АДОН гидролизуется труднее, имеш:о для него мы исследовали степень гидролиза растворами аммиака и КШ возрастающей »»реальности от 0,1 до 0,1 н. дл? выявления миншаяьшх концентраций реагентов, обеспечивающих полный гидролиз ацетата. Получение результат показали, что при Еыдэрки-вании вещества с 0,05 н. раствором КОИ в течение 10 мин происходит лолшй его гидролиз.

Для превращения 7,8-ДОКТ в ДОН нами была изучена возможность применения реакции окисления Сд-гипроксильной группы в молекуле

7,8-ДОКТ в карбонильную группу. Результата показали, что при растворении 7,8-ДСКТ в анетокнтриле и добавлении активной двуокиси пар-ганца реакция превращения 7,8-ДУГГ в ДСН начинается через 10 мин и практически голносаьл завершается через 30 mai.

Таким образом, провзденче послегсЕателью 2-х реакций - окисления активной дзуокисыз марганца и глдрсяиоа вздно-метанольдам раствором КОН позволяот быстро и количественно превратить три тркхо-тецена З-АДОН, 15-АДСН и 7,3-ДСКГ в ДОН. В результате группа соеаи-пений из пяти компонентов оказывается двухкомпонентной 'ДСН и 7-ДДН).

2.2.2.2. Усовершенствование процедуры

очистки экстрактов.

Результата проведеншх экспериментов показали, что экстракция зерна сиесыэ ацетошгрила и воры, использованная в базовой методи-Н9 анализа на содержание ДОН, обеспечивает полное извлечение всозс пяти определяемых трихотеценов. Однако при выполнении адсорбционной очистки на колонке степень их извлечения оказалась неодинаковой. Необходимый процент извлечения всех соединений достигается прп асоировагеш наполнителя кэлонки 20 мл экстракта и еще одним таким аэ оЗьааои смеси вцетонитрила и воды (5:i).

2.2.2.3. Выбор реяшма хрома-х-огрзфии к детектирования для определения ДОН и 7-ДДН.

В баловой меточике анализа зерна на содержание ДСН для хрола-тографического разделения очищенной Фракции экстракта была и.лоль-зовача ТСХ на пластинках "Силуфол" и детектирование токсина через измерение интенсивности флуоресценции его комплексного соединтшя

с хяорисим мшинхад, образу во го на пластинке при нагревании (92°С, 10 мин). 7-ДДН» не •мекхциК 7-Ш группы, кеобходииой яда образования такого комплексного соединения с хлорисвьы алвыиыиы, не может быть детектирован таи« цэто дом. Более того, при ТСХ на ск-дуфоле в П4, составлении* из невсикх растворителей, хроматографи-чоскип подвшьости ДОН и 7-ДДН оказались одинаковыми.

Таблица 2. ПАРАМЕТРЫ БЗКХ РАЗДЕЛЕНИЯ ДОН И 7-ДДН В П4 БСДА-АЦЕГСКИГРИП И БОДА-ТЕГРАГВДРО&УРМ 1.

-1--1-1-1-Г

Содер.орг.! Объем удер*., 1 Х,се- 1 Содер.орг. ¡Сбъсы удер. цоаткат. 1 мкл_I аскти- ! иодификат. 1 мкл 1 л

об,%

| ДШ } 7-ДДН | анос-& |

об.5

се-лекти

¡7-ДДН } ДОН | '|Насть

Ацетокитр-.«

Тетрагидрофуран

33 311 364 1,09 15 313 356 1,19

36 303 321 1,03 18 254 267 1,20

40 260 274 1,08 20 250 281 1Д9

50 221 233 1,09 24 225 256 1,18

30 216 240 1,19

Для разделения пары ДОН и 7-ДДН в режиме 0&-ВЗЮС мы опробовали бинарше поллижше фазы, содерлацие в качестве органических модификаторов ац его нитрил и тетрагидрофуран (ТП5) (табл. 2). В I» во-да-ацегонитрил, содержащих 33, 36, 40 и 5<Й ацотонитрила, достигалось разделение этих компонентов, но с низкой селективности). Необходимая дня эффективного разделения компонентов смеси селективность достигалась в И аода-ТГ®. Наилучшее разделение обоих коипонентов и прирмд«1юв прэ<я анализа, равное 14 -ош, достигалось в ПФ, со держащей 2,1% ГГв.

Наксшум спектра У^-поглощения 7-ДДН в 113 2А% ТГ5 а воде находился яри 228 ш (£=5981), тогда как для ДШ - при 217 к.» [£5016). Оба вещества шели разную способность к поглощен:® при 224

154.

Найаеггшэ нами оптимальные рст&ы В31Х я детектирования исполь-зоваш для разработки " Методических рекомендаций по определения ДШ в зерно с применением сбращешонфазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии".

ШЗОД1

АЛроведена сравнительная токсикологическая оценка метаболитов грнба. гчшаг1«21 8гап1яеегша на различных тест-организмах (проливах» крысах,- иизш, енбрнонзх» простеГшгх) и опредеяеш параметра ттх токсичности (гЩД, ЗДбд» ИКс0).

2. Ддл трлхотецшов ДОН, 7-ДДН и 15-ДДСН мишмалыю-леЯстау»-• ятзя дедаатоксичссгсал доза была спаой пизкой в ряду исследованиях

метаболитов и равнялась 0,1 «кг; шш 3-ДЦСН она составляла 0,5 мкг, а для 7,8-ДС2СТ а 5-М& - соответственно 20,0 и 60,0 мкг.

3. По '.ттб'лруйпсиу действии па гигераттнуз реакции инфузорий Тетрахпмета пирхфорше метаболиты располагались в слецуюцш порядке (по мере убивания еффекта): 15-АДШ, ДОН, 7-ДЦН, 7,8-ДСКГ, 5-Ш, 3-ДДСН; при отом для первых четырех соединений значения ИК50 находились в пределах 1,8-7,2 мкг/мл, а для 5-ААФ н З-ДЦСЗ» они составили, соответственно, 12,5 я 27,5 мкг/ш!.. Показана возможность использования результатов биотестирования на инфузориях для ориентировочного определения параметров токсичности трихотсцепов для еисшх ки->зотннх.

4. В опытах на одкосуточшх курикас вибрионах значения ЯДэд вла ДОД, 7-ДДН и 7,8-Д(К1 составили, соответственно, 7,3; 97,3 и 301,0 нкг/яйцо; при сравнительной оценке трихотецеиов на этом биотесте показана целесообразность учега смертности эмбрионов по полному сроку инедбирования.

5. При оценке острой токсичности метаболитов на мыаих установленные значения ДД50 для 7-ДДН (89,7. иг/кг) и 7,8-ДОКТ (72,0 иг/кг) били близки аналогичному показатели для ДОН (51,0 иг/кг); гистологические исследования органов гивотгах выявили оаютилшо доаа-завискмне патологические изменения в печени, почках, сердце и селезенке.

о. На основании проведенной нами токсикологической оценки сопутствующие ДОН трихэтецснн 3-АДСН, 15-АД ОН, 7-ДДН и 7,8-ДОКГ отнесши к категории токсичных хонтаминантсв эсча, пораженного Ри-

ааг1иш сгакйпеегия .

7. Разработаны методические подходы, необходимые рля контроля фузариозного зерна на содержание всего комплекса токсичных конта-минантов: усовершенствована процедура очистки экстракта; опреаслоны условия направленной химической модификации группы тр-ссотщсноа, упрощающей ее состав; выбран оптимальней реши хршатографичсского разделения и детектирования трихотеценов.

8. Установлено, что окислите активной двуокисыз маргдоца и гидролиз водно-<асташльнам раствором КШ обеспечивает быстрое превращение трас трихс-тецснов 3-ДДСЯ, 15-ДДОН и 7,8-ДИГГ в ДШ, вследствие чего задача определен*.* всей группы конталинантов сводится к опрепелетая двух конпонекточ - ДШ и 7-ДДН.

9. Режим высокоэффективной жидкости^, хроматографии (ВЗЗХ) и обращедао-фазовом режиме в подвиргай фазе (Ш), содержащей 2А% тот-рагндрофурана в воде, обеспечивает эффективное и быстрое разделение ДШ и 7-ДДН; оптимальной для Уй-аетектирования обоих соединений является длина волны 224 ш.

10. По результатам проведеншх исследований разработаш "Методика экспресс-анализа зерюфураяа а комбикормов па содержание ос-тротсксичнах трихотеценов" и "Методические рекомендации по количественному определенна ДСН в зерне с применением обраценно-фазовой ЯНЗХ", предназначайте юш научио-и-аледовательских учреждений и производств епшх лабораторий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЗДШЕ8ИЯ

X. Разработана "Методика экспресс-анализа зернсфураза и комбикормов па содержание остротакога-зк трихотеценов", направленная для утверзлешл в Департамент ветеринарии Минсельхозпрода РЭ.

2. Разработаны "¿1 «одические рекомендация по количественному опредэденга дезоксиииваленола в зерне с применение! обращзнно-фазо-вой шгокоэффектнпной жидкостной хроматограф:«!'', утзерзденшо Отделенной'ветеринаркой медицина РАСХН в 1995 году.

СПИСОК 0ПУБЯИК03АНННХ РАБОТ ПО ДИССЕРТАЦИИ

I. Е.В. Маланина. Выделение и оценка токсического 4-дезоксини-валенола, вторичного метаболитаРисаМизи ггапЛпеагия .// Материалы конференции молодых учешх химического факультета МГУ. 1988. Рукопись депонирована в ВИНИШ,№730&~В88.

2. А.Н.Леонов, Е.В.Зотова, И.А.Соболева, Г.П.Кононеашэ. Дер-иатоксическоо действие структурно-близких трихотецегаа грибов Ри-ваг1ия .// Доклады ВАСХНИЛ. 1990. К. С.62-55.

3. Е.В.Зотова, Н. А.Соболева, Г.П.Кононенко, АЛ'..Леонов. Токсическое действие ниваленола, 4-дезоксиниваденола и их ионоацета-тов в локальной биопробе на ковэ крыс.// Лабораторше иавотше. 1933.Т. 111. 94. С.211-216.

4. Б.В.Зотова, А.Н.Леонов, Г.П.Кононенко, Н.Л.Соболева, Пороговый уровень токсического действия бутенолида 5-ацет&!1!Д0-2{51)-фуранона при аппликации на кояу кролика.// Лабораторные дивотше. 1994. Т.1У. »3. С. 154-157.

ВНИИВСГЭ, 19% г., Москва, Звенигородское шоссе, 5. Тираж 80 экэ., зак. ¿^А