Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Особенности токсинообразования у гриба Fusarium poae (Peck) Wollenweber, распространенного в зернофураже

На правах рукописи

ТОКАРЕВ СЕРГЕЙ ВИКТОРОВИЧ

ОСОБЕННОСТИ ТОКСИНООБРАЗОВАНИЯ У ГРИБА FUSARIUM РОЛЕ (PECK) WOLLENWEBER, РАСПРОСТРАНЕННОГО В ЗЕРНОФУРАЖЕ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

003467942

Москва-2009

003467942

Работа выполнена в Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии).

Научный руководитель: доктор биологических наук

Кононенко Галина Пантелеевна

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Долгов Виктор Андреевич (ГНУ ВНИИВСГЭ)

кандидат биологических наук Гулюшин Сергей Юрьевич (ГНУ ВНИТИП)

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации

лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ)

*

Защита диссертации состоится « » Л4а Я 2009 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 006.008.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (ГНУ ВНИИВСГЭ Россельхозакадемии)

Автореферат разослан « -/¿Э» сгя/'е**? 2009 г.

Учёный секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Павлова Н.С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Одним из важнейших условий успешного развития животноводства является обеспеченность хозяйств зерновыми кормами высокого санитарного качества. Загрязненность зернофуража токсинами, которые образуют грибы рода Fusarium, приводит к значительному экономическому ущербу, поскольку в последние годы поражение злаковых культур фузариозом отмечается в нашей стране практически повсеместно. В отдельные периоды, особенно в условиях повышенной влажности и температуры, заболевание способно приобретать характер эпифитотий. В разных эколого-географических зонах отмечено формирование специфической по составу фузариозной инфекции зерна, в которой, как правило, среди доминирующих патогенов встречается гриб F.poae (Peck) Wollenweber (Шипилова, 1994; Левитин и др., 1998; Иващенко и др., 2004; Малиновская и др., 2004).

Этот вид, обладающий экологической пластичностью, признаками резкой изменчивости и сложным биологическим статусом, в последние годы привлекает все большее внимание микотоксикологов. Его присутствие в зерне связывают с такими масштабными и эндемическими интоксикациями человека и животных как острый геморрагический синдром, алиментарно-токсическая алейкия, болезнь Кашина-Бека и др. (Joffe, 1978; Weidenborner, 2001). Зарубежные исследователи неоднократно высказывали предположение о том, что токсигенность F.poae связана с активным биосинтезом метаболитов трихотеценового ряда - диацетоксисцирпенола и ниваленола, которые являются близкими структурными аналогами таких широко известных фузариотоксинов как Т-2 токсин и 4-дезоксиниваленол (Marasas, 1991). Тем не менее, подробный анализ мировых данных литературы показывает, что сведения относительно токсигенного потенциала F.poae остаются весьма противоречивыми, а свойства природных популяций этого вида практически не исследованы.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение потенциала токсинообразования у гриба F.poae из состава микобиоты зерна колосовых культур фуражного назначения, а также у сопутствующих ему возбудителей фузариоза, с учетом разнообразия условий их обитания.

Для достижения этой цели были определены следующие задачи:

- оценить токсигенный потенциал региональных популяций F.poae в отношении группы токсинов трихотеценового ряда и зеараленона;

- изучить степень изменчивости токсинообразующих свойств F.poae в экспериментах, моделирующих разные условия его развития;

определить способность к биосинтезу высокотоксичных трихотеценов у других видов Fusarium, встречающихся в зерне;

- получить и охарактеризовать биологические и биохимические реагенты для иммуноферментного анализа диацетоксисцирпенола;

- разработать экспресс-метод индикации диацетоксисцирпенола в культурах грибов Fusarium и составить методические рекомендации для оценки степени токсигенности у санитарно-показательных видов.

Научная новизна работы состоит в следующем:

- впервые установлены основные факторы, степень и характер изменчивости токсигенных свойств региональных популяций гриба F.poae, участвующих в инфицировании возделываемого в России фуражного зерна;

- выявлен новый факт значительного варьирования признака биосинтеза ниваленолау морфологически однородного вида F.poae;

- впервые показано, что среди видов, часто встречающихся в фузариозном зерне, наибольшим потенциалом накопления диацетоксисцирпенола обладают F.poae и F.sporotrichioides\

- впервые в стране получены аналитические иммунореагенты для избирательного определения диацетоксисцирпенола и предложен новый высокочувствительный и экспрессный метод поиска продуцентов этого токсина среди санитарно-показательных видов Fusarium',

Практическая значимость работы.

Сведения об особенностях токсинообразования региональных популяций основных возбудителей фузариоза колоса, полученные в рамках данной работы, могут быть использованы для совершенствования приемов прогнозирования загрязненности микотоксинами зерна, возделываемого в нашей стране. Высокий токсигенный потенциал, установленный для отдельных популяций F.poae, указывает на необходимость контроля степени инфицирования зерна этим грибом при санитарно-микологической оценке качества зернофуража.

Разработанные «Методические рекомендации по определению диацетоксисцирпенола в культурах санитарно-показательных грибов рода Fusarium», утвержденные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии в 2007 г., предназначены для микотоксикологической оценки грибов Fusarium и могут быть использованы как в научных исследованиях, так и в практических ветеринарных лабораториях для диагностики и профилактики фузариотоксикозов животных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на I съезде ветеринарных фармакологов (Воронеж, 2007), на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2007, 2008 гг.), на межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ (декабрь 2008 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объём работы и структура диссертации. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 8 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением результатов, выводы, практические предложения, список литературы, включающий 180 источников (отечественных авторов - 30 и зарубежных - 150), список сокращений и приложение.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Материалы и методы исследований.

Диссертационная работа выполнена в период с 2005 по 2008 гг. в лаборатории микотоксикологии ВНИИВСГЭ.

Объектом исследований были природные штаммы грибов рода Fusarium, принадлежащие исследовательской коллекции культур лаборатории микотоксикологии ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (г. Москва), выделенные из зерна пшеницы, ячменя, овса и ржи фуражного назначения на разных территориях в 1991-2005 гг. Видовая идентификация культур выполнена ведущим научным сотрудником, кандидатом биологических наук Л.С.Малиновской и старшим научным сотрудником, кандидатом биологических наук Е.А.Пирязевой, в соответствии с таксономической системой Буса (Booth, 1971).

Среди изученных штаммов F.poae было представлено 9 популяций из разных регионов возделывания зерна - Центрального (40 штаммов), Центрально-Чернозёмного (107), Волго-Вятского (43), Поволжского (26), Северо-Кавказского (9), Уральского (115), Западно-Сибирского (100), Восточно-Сибирского (75), Дальневосточного (212). В работе также использовали 14 моноконидиальных культур F.poae из коллекции Всероссийского научно-исследовательского института защиты растений, любезно предоставленные ведущим научным сотрудником лаборатории микологии и фитопатологии им. А,А.Ячевского, кандидатом биологических наук Т.Ю. Гагкаевой.

Оценку видовых особенностей токсинообразования проводили на 319 природных штаммах грибов Fusarium разного географического происхождения - F.poae - 46, F.sporotrichioides Sherb. - 45, F.acuminatum Ell. et Ev. - 48, F.avenaceum Corda ex Fr. - 49, F.graminearum Scliw. - 46, F.equiseti (Corda) Sacc. - 38, F.tricinctum (Corda) Sacc. - 23, F. semitectum Berk, et Rav. -20 и F.sambucinum Fuckel - 4.

Культивирование грибов проводили в лабораторных условиях на зерновом субстрате (зерно риса) стационарно в темноте в следующих режимах: I - 29°С, 4 нед; II - 22°С, 4 нед; III - 25°, 2 нед + 8°С, 2 нед; IV - 8°С, 16 нед., а также на агаризованных питательных средах в течение 7-10 суток. Экстракты образцов мицелиалыю-споровой биомассы смесью ацетонитрил-вода в объемном соотношении (6:1) далее анализировали на содержание фузариотоксинов. Количественное определение ниваленола (НИВ) и фузаренона X (ФУЗ-Х) проводили методом инструментальной тонкослойной хроматографии (ТСХ) - флуориметрии с использованием сканирующего денситометра «CAMAG TLC II» (Швейцария). Хроматографический анализ выполняли на пластинках силуфол (ЧСФР) в подвижных фазах хлороформ-метанол (6:1) и толуол-этилацетат-муравьиная кислота (5:4:1).

Обнаружение дерматотоксичных трихотец-9-енов в экстрактах культур грибов проводили методом локальной аппликации на депилированной коже кролика с учетом минимально-действующей дерматотоксической дозы, равной 0,004 мкг (Леонов и др., 1990). Для количественного определения Т-2 токсина (Т-2) и зеараленона (ЗЕН) использовали метод непрямого конкурентного иммуноферментного анализа (ИФА), изложенный в ГОСТ Р 52471-2005.

Анализ диацетоксисцирпенола (ДАС) выполняли с помощью специфичных поликлональных кроличьих антител и иммобилизованного белкового конъюгата ДАС, получение и испытание которых проведено в рамках данной работы. Статистическую обработку результатов выполняли в соответствии с общепринятыми методами (Дерффель, 1994).

2. Результаты исследований.

2.1 Разработка ИФА диацетоксисцирпенола.

Для детального изучения токсигенного потенциала грибов Fusarium, прежде всего, было необходимо разработать высокоспецифичный и чувствительный метод определения трихотец-9-ена ДА С, который по уровню токсического действия не уступает Т-2 токсину.

Для получения аналитических иммунореагентов после успешной химической модификации ДАС в гемисукцинат ДАС нами было проведено конъюгирование 5-, 10-, 25-, 50- и 80-кратных избытков гаптена с белками -бычьим сывороточным альбумином (БСА), яичным альбумином (ЯА), желатином (Жел) и глюкозоксидазой (ГО) через активированный эфир (а) и карбодиимидной конденсацией (к). Далее конъюгат БСА-гсДАС(а)-80 был использован в качестве иммуногена, а остальные конъюгаты - в качестве твердофазных антигенов (ТФ-АГ). В самом начале иммунизации кроликов конъюгатом гсДАС с БСА при втором взятии крови были получены сыворотки с высокими рабочими титрами, которые позволяли детектировать ДАС в концентрации 0,8 нг/мл (габл.1).

Таблица 1

Взаимодействие анти БСА-ДАС антител от второго взятия крови с твердофазными антигенами, гетерологичными по типу белкового носителя, методу синтеза или гаптенной нагрузке

ТФ-АГ Рабочий Процент связывания антител

тип с, мкг/мл титр концентрация раствора ДАС, нг/мл

100 20 4 0,8

БСА-ДАС(а)-5 0,05 1 10000 30 55 79 95

БСА-ДАС(а)-10 0,05 1 25000 56 75 92 96

ЯА-ДАС(а)-10 0,05 1 13000 37 69 89 97

Жел-ДАС(а)-5 0,05 1 1000 47 51 65 80

Жел-ДАС('а)-10 0,05 1 500 47 67 80 89

ГО-ДАС(а)-Ю 0,05 1 10000 27 62 90 100

Жел-ДАС(к)-10 0,15 1 1000 23 46 72 88

Жел-ДАС(к)-25 0,15 1 16000 16 43 77 98

Жел-ДАС(к)-50 0,15 1 25000 32 66 87 95

Антитела, полученные по завершении всего цикла иммунизации, показали высокую специфичность узнавания ДАС, перекрестная реактивность к его ближайшим структурным аналогам - неосоланиолу и Т-2 токсину - составила всего 0,01%, а с остальными метаболитами, взятыми для сравнения, даже в концентрации 10 мкг/мл какого-либо взаимодействия обнаружить не удалось (табл. 2).

Таблица 2

Результаты оценки перекрестной реактивности анти БСА-ДАС антител в отношении структурно-близких трихотец-9-енов

Трихотецен Заместители ИКи, нг/мл Перекрестная реактивность, %

Я] Я2 Яз я,

диацетоксисцирпенол Н СОСНз СОСНз н 10 100

неосоланиол Н СОСИ, СОСН, он ю4 0,01

Т-2 токсин Н СОСИ, СОСН, ОСОСН,СН(СНз)2 10" 0,01

ацетил-Т-2 токсин СОСН, СОСНз СОСНз ОСОСН2СН(СНз>г >104 <0.01

НТ-2 Н Н СОСНз ОСОСН2СН(СНз)з >104 <0.01

Т-2 триол Н Н II ОСОСН2СН(СНз)2 »ю4

Т-2 тетраол Н н н он >>104

сцирпентриол Н н н н >>104 -

Наилучшие показатели конкурентного анализа ДАС были достигнуты при иммобилизации конъюгата Жел-ДАС(к)-25 (рис. 1). При рабочем титре антител 1:10000 и нанесении этого ТФ-АГ из раствора с концентрацией 0,15 мкг/мл ** оказалось возможным обнаруживать ДАС в растворах до концентрации 0,0004 мкг/мл (^ с = - 3,4), при этом процент связывания антител соответствовал пороговому уровню 89-90%. При многократном повторении анализа для растворов, концентрации которых различались на порядок, - 0,1, 0,01 и 0,001 мкг/мл (^ с = -1, -2 и -3), были получены результаты 14±2%, 54±3% и 84±2%, соответственно. Для раствора с концентрацией 0,02 мкг/мл (1§ с = - 2,7) показатель процента связывания антител 77±2% находился на участке плавной линии, соединяющей эти значения для концентраций 0,1 и 0,01 мкг/мл (рис. 1).

Поскольку нижняя граница обнаружения ДАС на силикагеле при обработке пластинок реактивом Такитани составляла 400 мкг/мл, то в оптимизированных условиях ИФА чувствительность определения ДАС в

экстрактах культур грибов (4 нг/мл) была в 105 раз выше, чем при использовании ТСХ.

100 -"!

¡3 80 S

60 ■-

40

20

-4

-l

lg с (м кг/мл)

Рис.1. Калибровочный график ИФА ДАС. По оси ординат - % связывания антител, указаны пределы отклонения от средних значений при доверительной вероятности 0,95 (±2S, и=10).

Возможность влияния сопутствующих веществ, извлекаемых при экстракции водным ацетонитрилом, на результаты анализа была изучена в экспериментах с двумя моноконидиальными культурами F.poae (№№ Р12, Р14), не способными к биосинтезу этого токсина. При поверхностном культивировании на агаризованных питательных средах и на зерне измеряемый аналитический показатель (% связывания антител) находился выше значения 95±2%. Это свидетельствовало об отсутствии нежелательных фоновых эффектов и о возможности избирательного определения ДАС в нативных экстрактах мицелиально-споровых культур грибов без дополнительной очистки от примесей.

Результаты последующих экспериментов с другими моноконидиальными культурами F.poae показали, что в условиях

краткосрочного 1-нед. культивирования наибольшая интенсивность биосинтеза ДАС наблюдается на сусловом агаре (табл. 3).

Таблица 3

Количество ДАС (нг/мл экстракта) у коллекционных культур Fusarium роае, выращенных на агаризованных средах

№ штамма Питательная среда (п=4)

агар Чапека-Докса картофслыю-декстрозный агар сусловый агар

PI 0 20±1 182±9

Р10 18±1 400±18 1216А63

Р13 0 7±1 56±3

Р21 0 76±5 158-Ь9

Р22 0 158±10 490131

Как следует из данных, представленных в табл. 4, при выращивании культур на зерне их реакция на смену температурного режима была различной - при понижении температуры во второй половине инкубации интенсивность токсинобразования либо в разной степени снижалась, либо возрастала. Это свидетельствует о том, что для исчерпывающей оценки потенциала грибов в этих условиях целесообразно использовать варьирование сроков и температурного режима выращивания.

Таблица 4

Количество ДАС (нг/мл экстракта) у коллекционных культур Fusarium роае, выращенных на зерновом субстрате

№ штамма Рис (п = 2)

23 °С, 4 нед. 23°С, 2 пед. +8°С, 2 нед.

PI 126±9 71±9

Р13 445±29 125±7

Р16 1000±68 79±8

Р20 | 645±34 1120±56

Р21 158±10 ' 407±33

Р23 100±14 331±23

Р28 724±42 288±19

Выбранный нами прием стационарной экстракции (ацетонитрил-вода, 14 ч) по длительности совпадал с подготовительной процедурой нанесения ТФ-АГ на поверхность ячеек планшета, поэтому для получения аналитического результата по подготовленному образцу биоматериала были

необходимы те же затраты времени, что и для ИФА (3,5 - 4 ч). Разработка высокочувствительного, специфичного, быстрого и простого в исполнении ИФА метода определения ДАС позволила приступить к выполнению следующей задачи исследования - оценке потенциала токсинообразования у природных популяций гриба Р.роае.

2.2 Токсигенный потенциал региональных популяций Р.роае.

В экспериментах по выращиванию культур Р.роае на зерновом субстрате 79,8% штаммов показали способность образовывать ДАС. Общий диапазон уровней накопления токсина составил 0,02 - 76 мг/мг. Количества более 10 мг/кг были свойственны только 4,2% продуцентов, у остальных диапазоны 0,01-0,1 мг/кг и 1-100 мг/кг реализовывалисъ с примерно равной частотой 23,5% и 21,8%, а уровни накопления от 0,1 до 1 мг/кг - в 34,5% случаев (рис. 2).

ДАС, мг/кг

10-100 1-10 0,1-1

0,03-0,1 <0,01

18,5%

23,5%

20,2%

1 34'5%

Рис. 2. Распределение штаммов Р.роае по уровням накопления ДАС

Для совокупностей штаммов, выделенных из зерна на географически удаленных территориях Северо-Кавказского, Уральского, ЗападноСибирского и Дальневосточного регионов страны как по числу продуцентов ДАС, так и по интенсивности их токсинообразования, существенных различий не было выявлено (табл. 5).

Таблица 5

Потенциал образования ДАС у региональных популяций К роае из зерна колосовых культур

Продуценты/ штаммы в том числе по диапазонам токсинообразования

граница диапазона, мг/кг субстрата число продуцентов, шт. количество токсина, мг/кг субстрата (медиана)

Северо-Кавказский регион

0,01-0,1 1 0,09

9/9 0,1-1 1 0,16

1-10 4 0,3-7,4

10-100 3 11; 20; 25

Уральский регион

0,01-0,1 8 0,03-0,1

26/39 0,1-1 14 0,12-1.0

1-10 4 2,5-6,3

10-100 - -

Западно-Сибирский регион

0,01-0.1 2 0,02; 0,03

8/12 0,1-1 4 0,2-1,0

1-10 2 1,3; 1,8

10-100 - -

Дальневосточный рег ион

0,01-0,1 17 0,02-0,1

52/59 0,1-1 22 0,13-1,0

1-10 12 1,1-9,4

10-100 1 76

Потенциал Р.роае в отношении Т-2 был гораздо ниже. Почти половина исследованных штаммов могла продуцировать Т-2, но в крайне малых количествах от 0,002 до 0,9 мг/кг с преобладанием уровней содержания 0,010,1 мг/кг (рис. 3).

Т-2, мг/кг

0,1-1 0,01-0,1 0,001-0,01 > 0,001

......; 6.:

33,4%

6,8%

53,0%

Рис. 3. Распределение штаммов Р.роае по уровням накопления Т-2

Таким образом, в целом возможности Р.роае по накоплению в зерне высокотоксичных трихотец-9-енов имеют среднюю степень выраженности и обеспечены в большей мере ДАС, чем Т-2.

Среди штаммов гриба Р.роае, выделенных из зерна в Европейской части страны, доля продуцентов НИВ составляла 47,6% (табл. 5). У популяций с территорий Центрального, Волго-Вятского и Поволжского регионов характер распределения продуцентов по уровням накопления токсина имел черты сходства - преобладающими были количества НИВ от 10 до 100 мг/кг субстрата. В Центрально-Черноземном регионе половина положительных штаммов реализовывапа уровни накопления от 100 мг/кг и более (табл. 5).

Таблица 5

Потенциал образования НИВ у региональных популяций Р.роае в Европейской части России

Продуценты/ штаммы в том числе по диапазонам токсинообразования

граница диапазона, мг/кг субстрата число продуцентов, шт. количество токсина, мг/кг субстрата (медиана)

Северо-Кавказский регион

2/9 1-10 - -

10-100 2 15; 15(15)

100-1000 -

> 1000 -

Центральный регион

22/40 1-10 4 2-9 (3)

10-100 10 30-100 (76)

100-1000 8 104-909(130)

> 1000 - -

Центрально-Черноземный регион

41/107 1-10 3 2-7(3)

10-100 16 19-98(58)

100-1000 20 102-539(266)

>1000 2 1288;1940

Волго-Вятский регион

28/43 1-10 7 1-8 (7)

10-100 18 13-92(430)

100-1000 3 145; 222; 312

>1000 - -

Поволжский регион

14/26 1-10 5 1-10(5)

10-100 8 11-88(29)

100-1000 1 177

> 1000 - -

НИВ, мг/кг

>1000 . 1,0%

100-1000 " ~ I 14,2%

SÄE... „__I

10-100

24,0%

1-10

<1

] 52,4%

Рис. 4. Распределение штаммов Р.роае по уровням накопления НИВ

{Европейская часть России)

В целом для F.poae на Европейской территории страны характерна средняя степень выраженности интенсивности биосинтеза НИВ -большинство продуцентов (73 штамма из 107) накапливали НИВ в количествах не более 100 мг/кг (рис. 4). В популяциях гриба из зерна в Уральском и Западно-Сибирском регионах продуценты не были обнаружены, а в Восточно-Сибирском и Дальневосточном они встречались крайне редко. Таким образом, сообщества^ исследованных природных штаммов гриба F.poae в отношении биосинтеза НИВ оказались неоднородными, что было связано, главным образом, с их ареалом.

При варьировании экспериментальных условий (температуры и продолжительности роста) у природных штаммов F.poae не удалось выявить каких-либо отчетливых тенденций в смещении интенсивности накопления трихотеценов ДАС, Т-2 и НИВ. В стрессовом режиме продолжительного роста при низкой температуре даже у наиболее активных продуцентов не наблюдалось резкого возрастания интенсивности образования ДАС и Т-2 в зерновом субстрате. Таким образом, ранее высказанные предположения о решающей роли фактора снижения температуры для токсинообразования F.poae (Joffe, 1974) не получили подтверждения при нашем исследовании.

2.3 Видовые особенности биосинтеза трихотец-9-енов.

Результаты, полученные на выборке из 46 природных штаммов F.poae разного географического происхождения, показали, что ускоренный способ выращивания культур на сусловом агаре позволяет адекватно определять токсигенный потенциал гриба и при этом имеет явные преимущества перед продолжительным и затратным культивированием на зерновом субстрате. Так, доля продуцирующих ДАС штаммов составила 76,1% на сусловом агаре (табл. 6) и 79,8% на зерне риса по обобщенным данным многофакторных экспериментов. В этой связи для сравнительной оценки видовых особенностей токсинообразования у грибов Fusarium мы использовали экспериментальный прием, включающий поверхностное выращивание культур на агаре в течение 7 суток, жидкостную экстракцию и ИФА.

Таблица 6

Результаты сравнительной оценки токсинообразования F.poae и F.sporotrichioides

Диапазон концентраций Число продуцентов токсинов

токсинов, ДАС Т-2

нг/мл экстракта

Р.роае

4-20 6 1

20-100 10 4

100-1000 11 -

> 1000 8 -

Всего 35/46 5/46

F.sporotrichioides

4-20 16 -

20-100 13 3

100-1000 4 7

> 1000 1 18

> 10000 - 16

Всего 34/45 45/45

Среди трех видов Р.сыепасеит, Р.зрого^сИШскя и Р.аситтаШт, которые, как и Рроае, преобладают в составе микобиоты фузариозного зерна (Малиновская и др., 2004), способность продуцировать ДАС показали только представители ^.^рото/пс/г/о;^. Число продуцентов ДАС оказалось близким таковому для Р.роае и составило 75,6%, хотя уровни накопления

были несколько меньшими (табл. 6). Среди сопоставимых по объемам выборок культур F.avenaceum (49 штаммов) и F.acuminatum (48 штаммов) продуценты ДАС не были найдены.

У локально распространенного вида F.graminearum ни один из 46 штаммов не имел способности продуцировать ДАС и Т-2, что подтверждалось высокой чувствительностью использованных методов. Для F.equiseti при значительном числе продуцентов как ДАС, так и Т-2, степень их накопления была низкой. Для двух видов, отличающихся меньшей частотой и рассеянной встречаемостью в фузариозном зерне, - F.tricinctum и F.semitectum, токсинообразование оказалось еще менее выраженным.

Полученные данные свидетельствуют о том, что виды F.poae и F.sporotrichioides являются наиболее вероятными источниками контаминации фузариозного зерна ДАС.

Как показали наши исследования, методическая схема, которая включает поверхностное культивирование грибов Fusarium на питательных средах или на зерне, жидкостную экстракцию мицелиалыго-споровой биомассы и ИФА экстрактов на содержание ДАС, может быть использована специалистами научно-исследовательских и практических ветеринарных лабораторий, занимающихся оценкой санитарного качества кормов. В этой связи были разработаны «Методические рекомендации по определению диацетоксисцирпенола в культурах санитарно-показательных грибов рода Fusarium», которые после комиссионной апробации были утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.11.2007 г.

ВЫВОДЫ

1. Для оценки токсинообразования грибов рода Fusarium разработан высокоспецифичный, быстрый и простой в исполнении метод непрямого конкурентного ИФА, обеспечивающий определение ДАС с чувствительностью в 105 раз выше, чем при тонкослойной хроматографии.

2. Установлено, что гриб Г.роае, широко представленный в составе микобиоты фузариозного зерна, является политоксигенным и способен к биосинтезу трихотец-9-енов (ДАС, Т-2), трихотец-9-ен-8-онов (НИВ, ФУЗ-X) и ЗЕН.

3. Показано, что потенциал накопления ДАС у Г.роае имеет среднюю степень выраженности - при значительной доле продуцентов (79,8%) уровни накопления токсина не превышают 10 мг/кг; популяции гриба из географически удаленных районов не имеют различий в способности к накоплению ДАС.

4. По степени продуцирования Т-2 и ЗЕН все исследованные популяции Ероае являются однотипными - на территориях Европейской части страны, в Уральском и Западно-Сибирском регионах при значительной доле образующих пггаммов уровни накопления не превышают 1 мг/кг.

5. Установлено, что Г.роае имеет высокую степень неоднородности в отношении биосинтеза НИВ и ФУЗ-Х, связанную с его ареалом. Для продуцентов НИВ (47,6% от общего числа штаммов), выделенных из зерна в Европейской части страны, характерны уровни накопления токсина до 100 мг/кг субстрата, способность к образованию ФУЗ-Х обнаружили 6,9% штаммов; в Уральском и Западно-Сибирском регионах продуценты НИВ и ФУЗ-Х не найдены, а в Восточно-Сибирском и Дальневосточном регионах встречались крайне редко.

6. Метаболические реакции на понижение температуры и продолжительность культивирования на зерне у природных штаммов Е.роае являются индивидуальными и не приводят к единообразному смещению интенсивности накопления ДАС, Т-2 и НИВ.

7. Среди основных возбудителей фузариоза наибольшим потенциалом накопления ДАС обладают виды Ероае и Е.$рого1г1сЫо1(1е$, у Е.аситгпаШт и ЕедшзеИ продуцирующая способность является низкой и отсутствует у Е^гаттеапт.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для повышения эффективности санитарной оценки качества зернофуража, пораженного фузариозом, необходимо осуществлять контроль степени его инфицирования токсигенными штаммами F.poae, способными к продуцированию ДАС и НИВ.

Разработанные «Методические рекомендации по определению диацетоксисцирпенола в культурах санитарно-показательных грибов рода Fusarium», утвержденные Отделением ветеринарной медицины Россельхозакадемии 20.11.2007 г., могут быть использованы как в научных исследованиях, так и в практических ветеринарных лабораториях для диагностики и профилактики фузариотоксикозов животных.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Токарев C.B. Микотоксикологическая оценка фузариозного зерна в Уральском регионе» // Кормопроизводство. - 2008. - №12. - С. 27-28.

2. Токарев C.B., Соболева H.A. Токсигенный потенциал Fusarium роае из зерна в Европейской части России // Материалы I съезда ветеринарных фармакологов России, Воронеж. - 2007. - С. 586-590.

3. Буркин A.A., Кононенко Г.П., Токарев C.B. Иммуноферментный анализ диацетоксисцирпенола в токсикологической оценке грибов рода Fusarium // Доклады Россельхозакадемии. - 2007. - № 6. - С. 28 - 30

СПИСОК СОКРАЩЕННЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДАС - диацетоксисцирпенол

Т-2-Т-2 токсин

НИВ - ниваленол

ФУЗ-Х - фузаренои X

ЗЕН - зеараленон

ИФА - иммуноферментный анализ

ТСХ - тонкослойная хроматография

ВНИИВСГЭ, г. Москва, Звенигородское шоссе д. 5 Заказ 313/3, тираж 80 экз.

Актуальность темь!. Одним из важнейших условий успешного развития животноводства является обеспеченность хозяйств зерновыми кормами высокого санитарного качества. Загрязненность зернофуража токсинами, которые образуют грибы рода Fusarium, приводит к значительному экономическому ущербу, поскольку в последние годы поражение злаковых культур фузариозом отмечается в нашей стране практически повсеместно. В отдельные периоды, особенно в условиях повышенной влажности и температуры, заболевание способно приобретать характер эпифитотий. В разных эколого-географических зонах отмечено формирование специфической по составу фузариозной инфекции зерна, в которой, как правило, среди доминирующих патогенов встречается гриб F. роае (Peck) Wollenweber (7, 15, 21, 30).

Этот вид, обладающий экологической пластичностью, признаками резкой изменчивости и сложным биологическим статусом, в последние годы привлекает все большее внимание микотоксикологов. Его присутствие в зерне связывают с такими масштабными и эндемическими интоксикациями человека и животных как острый геморрагический синдром, алиментарно-токсическая алейкия, болезнь Кашина-Бека и др. (91, 171). Зарубежные исследователи неоднократно высказывали предположение о том, что токсигенность F. роае может быть связана с активным биосинтезом метаболитов трихотеценового ряда - диацетоксисцирпенола и ниваленола, которые являются близкими структурными аналогами таких широко известных фузариотоксинов как Т-2 токсин и 4-дезоксиниваленол (31, 110, 134, 154).

Тем не менее, подробный анализ мировых данных литературы за период с 1960 по 2005 гг. показывает, что сведения относительно токсигенного потенциала F. роае остаются весьма противоречивыми, а свойства природных популяций этого вида практически не исследованы.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение потенциала токсинообразования у гриба F. роае из состава микобиоты зерна колосовых культур фуражного назначения, а также сопутствующих ему возбудителей фузариоза, с учетом разнообразия условий их обитания.

Для достижения этой цели были определены следующие задачи:

- оценить токсигенный потенциал региональных популяций F.poae в отношении группы токсинов трихотеценового ряда и зеараленона;

- изучить степень изменчивости токсинообразующих свойств F.poae в экспериментах, моделирующих разные условия его развития;

- определить способность к биосинтезу высокотоксичных трихотеценов у других видов Fusarium, встречающихся в зерне;

- получить и охарактеризовать биологические и биохимические реагенты для иммуноферментного анализа диацетоксисцирпенола;

- разработать экспресс-метод индикации диацетоксисцирпенола в культурах грибов Fusarium и составить методические рекомендации для оценки степени токсигенности у санитарно-показательных видов.

Научная новизна работы состоит в следующем:

- впервые установлены основные факторы, степень и характер изменчивости токсигенных свойств региональных популяций гриба F. роае, участвующих в инфицировании возделываемого в России фуражного зерна;

- выявлен новый факт значительного варьирования признака биосинтеза ниваленола у морфологически однородного вида F. роае;

- впервые показано, что среди видов, часто встречающихся в фузариозном зерне, наибольшим потенциалом накопления диацетоксисцирпенола обладают F.poae и F.sporotrichioides\

- впервые в стране 'получены аналитические иммунореагенты для избирательного определения диацетоксисцирпенола и предложен новый метод поиска продуцентов этого токсина среди санитарно-показательных видов Fusarium.

Практическая значимость работы.

Сведения об особенностях токсинообразования региональных популяций основных возбудителей фузариоза колоса, полученные в рамках данной работы, могут быть использованы для совершенствования приемов прогнозирования загрязненности микотоксинами зерна, возделываемого в нашей стране. Высокий токсигенный потенциал, установленный для отдельных популяций F.poae, указывает на необходимость контроля степени инфицирования зерна этим грибом при санитарно-микологической оценке качества зернофуража.

Разработанные «Методические рекомендации по определению диацетоксисцирпенола в культурах санитарно-показательных грибов рода Fusarium», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН в 2007 г., предназначены для микотоксикологической оценки грибов Fusarium и могут быть использованы как в научных исследованиях, так и в практических ветеринарных лабораториях для диагностики и профилактики фузариотоксикозов животных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены: на I съезде ветеринарных фармакологов (Воронеж, 2007), на заседаниях ученого совета ВНИИВСГЭ (2007, 2008 гг.), на межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ (декабрь 2008 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 3 статьи, в том числе 2 в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Объём работы и структура диссертации. Работа изложена на 103 страницах машинописного текста, содержит 26 таблиц и 8 рисунков. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, собственные исследования с обсуждением результатов, выводы, практические приложения, список литературы, включающий 180 источников (отечественных авторов - 30 и зарубежных - 150), список сокращений и приложение.

выводы

1. Для оценки токсинообразования грибов рода Fusarium разработан высокоспецифичный, быстрый и простой в исполнении метод непрямого конкурентного ИФА, обеспечивающий определение ДАС с чувствительностью в 105раз выше, чем при тонкослойной хроматографии.

2. Установлено, что гриб F.poae, широко представленный в составе микобиоты фузариозного зерна, является политоксигенным и способен к биосинтезу трихотец-9-енов (ДАС, Т-2), трихотец-9-ен-8-онов (НИВ, ФУЗ-X) и ЗЕН. i

3. Показано, что потенциал накопления ДАС у F.poae имеет среднюю степень выраженности - при значительной доле продуцентов (79,8%) уровни накопления токсина не превышают 10 мг/кг; популяции гриба из географически удаленных районов не имеют различий в способности к накоплению ДАС.

4. По степени продуцирования Т-2 и ЗЕН все исследованные популяции F.poae являются однотипными - на территориях Европейской части страны, в Уральском и Западно-Сибирском регионах при значительной доле образующих штаммов уровни накопления не превышают 1 мг/кг.

5. Установлено, что F.poae имеет высокую степень неоднородности в отношении биосинтеза НИВ и ФУЗ-Х, связанную с его ареалом. Для продуцентов НИВ (47,6% от общего числа штаммов), выделенных из зерна в Европейской части страны, характерны уровни накопления токсина до 100 мг/кг субстрата, способность к образованию ФУЗ-Х обнаружили 6,9% штаммов; в Уральском и Западно-Сибирском регионах продуценты НИВ и i '

ФУЗ-Х не найдены, а в Восточно-Сибирском и Дальневосточном регионах встречались крайне редко.

6. Метаболические, реакций на понижение температуры и i 1 , ♦ ! продолжительность культивирования на зерне у природных штаммов F.poae являются индивидуальными и не приводят к единообразному смещению интенсивности накопления ДАС, Т-2 и НИВ.

7. Среди основных возбудителей фузариоза наибольшим потенциалом накопления ДАС обладают виды F.poae и F.sporotrichioides, у F.acuminatum и F.equiseti продуцирующая способность является низкой и отсутствует у F.graminearum.

Практические предложения

Для повышения эффективности санитарной оценки качества зернофуража, пораженного фузариозом, необходимо осуществлять контроль Г степени его инфицирования токсигенными штаммами F.poae, способными к продуцированию ДАС и НИВ.

Разработанные «Методические рекомендации по определению диацетоксисцирпенола в культурах санитарно-показательных грибов рода Fusarium», утвержденные Отделением ветеринарной медицины РАСХН 20.11.2007 г., могут быть использованы как в научных исследованиях, так и в практических ветеринарных лабораториях для диагностики и профилактики фузариотоксикозов животных.