Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Совершенствование схем специфической профилактики бруцеллёза маралов с использованием живой слабоагглютиногенной вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-AB

На правах рукописи

Тяпин Владимир Валерьевич

СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СХЕМ СПЕЦИФИЧЕСКОЙ ПРОФИЛАКТИКИ БРУЦЕЛЛЁЗА МАРАЛОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ

ЖИВОЙ СЛАБОАГГЛЮТИНОГЕННОЙ ВАКЦИНЫ ИЗ ШТАММА Brucella abortus 75/79-AB

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Барнаул 2005

Работа выполнена в ГНУ Всероссийском научно-исследовательском институте пантового оленеводства СО РАСХН и ИВМ Алтайского государственного аграрного университета.

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук, профессор

Луницын Василий Герасимович

Научный консультант - доктор ветеринарных наук

Никифоров Иван Порфирьевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Димов Сергей Константинович;

кандидат ветеринарных наук Огнёв Сергей Ильич

Ведущая организация - Всероссийский научно-исследовательский институт бруцеллёза и туберкулеза животных

Защита диссертации состоится «13» мая 2005 г. в 10:00 часов на заседании диссертационного совета Д 220.002.02 в Алтайском государственном аграрном университете по адресу: 656922, Алтайский край, г. Барнаул, ул. Попова 276, ИВМ АГАУ. Факс (385-2) 31-30-48.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АГАУ.

Автореферат разослан «Л 2005 г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук, профессор

П.И. Барышников

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Бруцеллёз сельскохозяйственных животных является одной из основных проблем ветеринарной науки и практики, актуальность которой определяется, прежде всего, опасностью для здоровья человека, а также широкой распространённостью данного заболевания.

Уже давно стало очевидным, что успешная борьба с этой зоо-антропонозной инфекцией в широких масштабах практически невозможна без использования средств специфической профилактики (Косилов И.А., 1985, 1992; Шумилов К.В., 1987; Салмаков К.М., 1975,1987; Димов С.К., 1993; и др.).

Теория и практика управления эпизоотическим процессом бруцеллёза в популяциях животных неблагополучных и угрожаемых зон за счет рациональных схем вакцинации диктует необходимость обеспечения перманентного иммунитета. При этом не менее важно иметь максимальную возможность бесприпятственного проведения комплексной посвакцинальной диагностики бруцеллёза в целях быстрейшего оздоровления ферм и последующего объективного эпизоотоло-гического контроля за их благополучием (Никифоров И.П., 1980, 1981, 1985; Косилов И.А., 1985, 1992; Орлов Е.С., Шумилов К.В., 1992; СайченкоВ.И., 1995).

Таким требованиям, в частности, в большей степени соответствует широко используемая в настоящее время в нашей стране на маралах и крупном рогатом скоте вакцина из слабоагглютиногенно-го штамма Brucella abortus 82.

Указанная вакцина обладает достаточно высоким уровнем им-муногенности и противоэпизоотической эффективности, однако имеет и ряд недостатков, связанных, прежде всего, с продолжительной персистентностью антител в крови иммунизированных маралов, длительной приживаемости и возможности миграции штамма от вакцинированных к невакцинированным животным (Хлыстунов А. Г. с соавт., 1997). На нестабильность биологических свойств и аборто-генность штамма 82 у крупного рогатого скота указывают исследования ряда авторов: К.М. Салмаков (1975), С.К. Димов (1993), В.Г.Ощепков(1998).

Исходя из вышеизложенного, очевидна необходимость поиска новых, более совершенных противобруцеллёзных вакцин, лишённых

этих недостатков. Одной из таких вакцин является вакцина из штамма Brucella abortus 75/79-AB, которая была селекционирована и комплексно изучена И.П. Никифоровым (1979-1996) на крупном рогатом скоте.

Изучение указанного штамма на маралах с позиций требований, предъявляемых к вакцинам, никто не проводил.

Цель исследований - изучить основные свойства вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-AB на маралах.

Задачи исследований:

1. Изучить эпизоотическую ситуацию по бруцеллёзу маралов в Алтайском крае и противоэпизоотическую эффективность вакцины из штамма Brucella abortus 82.

2. Изучить приживаемость и возможность миграции вакцинного штамма 75/79-АВ в организме маралов.

3. Изучить иммуногенные свойства вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-AB на маралах, отработать оптимальную иммунизирующую дозу.

4. Сравнить иммунологическую эффективность вакцин из штаммов 82 и 75/79-АВ, изучить их антигенные свойства.

Научная новизна. Впервые на маралах изучены приживаемость, возможность миграции, а также иммуногенные свойства вакцины из штамма 75/79-АВ, при этом определена оптимальная иммунизирующая доза. Проведена сравнительная оценка иммуногенных и антигенных свойств вакцин из штаммов Brucella abortus 82 и Brucella abortus 75/79-AB на маралах; отработана методика эутоназии маралов миорелаксантом «Адилин-супер».

Практическая значимость. В ходе проведённых исследований разработаны рекомендации «Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов» (2005), утвержденные учёным советом ВНИИПО (протокол № 1 от 11 февраля 2005 г.), и рекомендованы к внедрению научно-техническим советом управления ветеринарии администрации Алтайского края (протокол № 2 от 18 марта 2005 г.).

Апробация работы. Результаты исследований доложены, обсуждены и одобрены на научно-практической конференции молодых ученых «Вопросы пантового оленеводства и болезней сельскохозяйственных животных» (г. Барнаул, 2003); региональной научной студенческой конференции «Достижения и перспективы студенческой науки в АПК» (г. Барнаул, 2003); Международной научно-практи-

ческой конференции молодых ученых СО РАСХН «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых» (Новосибирская область, п. Краснообск, 2004); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирская область, ГНЦ ВБ «Вектор», 2004); учёных советах ВНИИ пантового оленеводства (2001-2004) и научно-техническом совете управления ветеринарии администрации Алтайского края (2005).

Публикации результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Выносится на защиту:

1. Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов в Алтайском крае и противоэпизоотической эффективности вакцины из штамма Brucella abortus 82.

2. Приживаемость и возможность миграции вакцинного штамма Brucella abortus 75/79-AB в организме маралов.

3. Определение иммуногенных свойств вакцины из штамма 75/79-АВ, изыскание оптимальной иммунизирующей дозы для маралов.

4. Определение сравнительной иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов Brucella abortus 82 и Brucella abortus 75/79-АВ на маралах.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 144 страницах и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения, библиографический список, приложение. Библиографический список включает 183 источника, в том числе 33 зарубежных. Работа иллюстрирована 4 фотографиями, 21 рисунком и 11 таблицами.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследования

Работа выполнялась с 2001 по 2005 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте пантового оленеводства, на кафедре эпизоотологии и ВСЭ ИВМ АГАУ, а также в мараловодческих хозяйствах Алтайского края.

Эксперименты проводились на 50 маралах, 20 из которых ма-ралухи 4-5-летнего возраста и 30 телята 6-месячного возраста.

Материалом для изучения и анализа эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов послужили данные годовой ветеринарной отчётности Алтайского края за период с 1969 по 2003 гг.

Для иммунизации маралов использовались вакцины из слабоагг-лютиногенных штаммов Brucella abortus 82 и Brucella abortus 75/79-AB, которые вводили в дозах 50 и 100 млрд м.к. подкожно, в область средней трети шеи, в объёме 5 мл.

Реактогенные свойства вакцин изучали в течение 13 суток путем пальпации места инъекции. При этом учитывали болезненность, температуру на месте введения препарата, размеры отечности и её консистенцию, общее состояние животных, а также проводили термометрию опытных и контрольных животных по общепринятой в ветеринарии методике.

Всего подвергнуто комплексному исследованию на бруцеллёз 503 пробы сыворотки крови. При постановке серологических реакций в качестве диагностических тестов применяли РБП, РА, РСК с S- и R(ovis, bovis)-антигенами, постановку и учёт которых проводили согласно регламентированным методикам. При постановке РБП использовали цветной антиген (антиген бруцеллёзный для РБП, производства Щёлковского биокомбината, серия 4, годен до 12.2005 г.); для РА и РСК - единый бруцеллёзный биофабричный S- и R-антигены: ovis (изготовленный 01.2003 г. НПФ «Биоцентр», г. Омск, серия 1, контроль 1, срок годности - 12 месяцев) и bovis производства ВНИИБТЖ (из штамма 16/4 - Л.В. Дегтяренко). Пластинчатую РА на стекле изучали с S- и R-бруцеллёзными сыворотками и трипафлавином.

Забор и приготовление образцов сыворотки крови от маралов проводили следующим образом: животных фиксировали в панторезном станке (после заражения в специальном расколе), с правой стороны шеи, в области яремной вены выстригали шерсть, накладывали жгут, место укола дезинфицировали 70%-ным раствором спирта. Взятие крови осуществляли кровобрательной иглой Боброва Пробы крови отбирали в пробирки Флоринского в количестве 3-4 мл с трилоном-Б (3-4 капли), а для приготовления сыворотки - в бактериологические пробирки по 10-15 мл. Для получения сыворотки кровь помещали в термостат на 3 часа при температуре 37°С, после ретракции сгусток осаждали центрифугировани-

ем (1000-1500 об/мин). Сыворотку сливали и исследовали в течение 10 дней свежую либо замораживали, сохраняя в таком виде непосредственно до исследования.

В цельной крови определяли общее количество лейкоцитов и эритроцитов (в камере Горяева в 1 мкл крови); в сыворотке крови -содержание общего белка рефрактометрическим методом (ИФР-22), фракции белка - нефелометрическим методом по И.П. Кондрахину (1985).

Для заражения животных использовали культуру вирулентного штамма Brucella abortus 544 (музейный штамм, ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН) в дозах 15 и 30 млн м.к., которую вводили конъюнкти-вально, по 0,1 мл суспензии в каждый глаз, содержащей, соответственно, 7,5 и 15 млн м.к. бруцелл.

Пробы биоматериала для установления диагноза лабораторным методом отбирали согласно требованиям, предъявляемым к патологическому материалу при бруцеллёзе крупного рогатого скота.

Патологическую картину бруцеллёза у вынужденно убитых телят маралов изучали методом полного патологоанатомического вскрытия по методике М.С. Жакова (1977).

Отбор материала, приготовление и окраску гистологических срезов проводили согласно регламентированным методикам.

Для культивирования бруцелл использовали питательные среды с добавлением глюкозы и глицерина, а именно: мясопептонный печёночный глюкозо-глицериновый агар ^ППГГА) и бульон (МППГГБ).

Порядок посева и идентификацию выделенных культур проводили по общепринятым методикам.

Достоверность результатов подтверждали путем статистической обработки с помощью критерия Стьюдента. Результат считали достоверным при Р < 0,05.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Противоэпизоотическая эффективность вакцины

из штамма Brucella abortus 82 при бруцеллёзе маралов

Полученные аналитические данные годовой ветеринарной отчётности Алтайского края за период 1969-2003 гг. свидетельствуют о неблагополучии четырех маралоферм по бруцеллёзу: «Абайский» -2 фермы, «Чергинский» - 1 ферма, «Шебалинский» - 1 ферма.

В первые два года работы в этих хозяйствах осуществляли 2-3-кратное исследование маралов на бруцеллёз в РА и РСК. Животных исследовали в основном в летние и осенние месяцы с последующим убоем реагирующих.

По данным ветеринарной отчётности, в 1969-1971 гг. при исследовании 3224 проб сывороток крови, взятых от маралов разного пола и возраста на 4 фермах трех хозяйств, было выделено 610 реагирующих животных в РА и РСК (18,9%). По данным Н.Т. Третяка, который в то время занимался проблемой искоренения бруцеллёза маралов и испытывал на них противобруцеллёзные препараты, при исследовании 697 маралов в одном из хозяйств Республики Алтай он выделил 240 (34,5%) серопозитивных животных, причём в РСК реагировало 147 (21,1%), а в РА - 93 (13,3%) голов.

От животных с выраженными клиническими признаками (поражения суставов, баланопаститы) и имеющими высокие титры в РА (1:200 и выше) был отобран биоматериал для лабораторного исследования, в ходе которого были изолированы бруцеллы вида Abortus. В результате этого с 1976 г. было принято решение иммунизировать все поголовье маралов неблагополучных ферм вакциной из штамма В. abortus 82 в дозе 100 млрд м.к. Кроме этого маралов-перворожков и маралушек ежегодно ревакцинировали в течение последующих 4-5 лет, что составило 269-1426 голов в год в зависимости от полученного приплода.

В последующие годы при применении вакцины из штамма 82 количество серопозитивных животных резко уменьшилось, и к 1983 г. данные фермы были объявлены свободными от бруцеллёза. С них были сняты ограничения и разрешена продажа и вывоз ценных маралов не только в другие хозяйства Алтайского края, но и в другие регионы страны.

Однако в следующие 10-12 лет при исследовании сывороток крови в серологических тестах стали выявляться от 1 (0,06% из 1593 исследованных) до 43 (3,07% из 1400 исследованных) реагирующих животных. Взятый биоматериал исследовали лабораторно, при этом бруцеллёз был исключён, а в ряде случаев была выделена культура вакцинного штамма 82.

Кроме этого зарегистрированы случаи выделения серопози-тивных маралов по истечении 5 лет после вакцинации (совхоз «Ту-мановский» и ТОО «Медведевское» Солонешенского района). С

1992 по 1997 гг. реагировало от 5,4 до 8,27% рогачей (в РА 1:501:100; РСК 1:5-1:40; часть в тест-системе с ОПС-антигеном).

Применение данной вакцины в комплексе общих ветеринарно-санитарных мероприятий на маралах позволило в значительной степени ослабить напряженность эпизоотического процесса и оздоровить маралохозяйства Алтайского края от бруцеллёза, но при этом возникла проблема серопозитивности животных в отдалённые сроки после прививок, что, в свою очередь, затрудняет диагностику заболевания.

3.2. Изучение приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма Brucella abortus 75/79-AB в организме маралов

Изучение приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма В. abortus 75/79-AB проводили в ОПХ «Новоталицкое» Чарышского района на 20 маралухах 4-5-летнего возраста, раннее не вакцинированных никакими противобруцеллёзными вакцинами.

Животных в количестве 15 голов иммунизировали вакциной из штамма 75/79-АВ в дозе 50 млрд м.к. и содержали совместно с 5 не-вакцинированными маралухами в течение 4 месяцев.

Динамику появления и угасания серологических реакций изучали, исследуя сыворотку крови в РА и РСК с единым бруцеллёзным биофабричным S- и R(ovis)-антигеном на 15, 33, 55, 89 и 122-й день после иммунизации.

Данные серологических тестов свидетельствуют, что иммунологические реакции в РА и РСК с S-антигеном у всех животных в указанные сроки отсутствовали. Отмечена положительная РСК с R(ovis)-антигеном через 15 дней после иммунизации у 7 вакцинированных животных из 15 в титрах от 1:5 до 1:20, через 33 дня - у 2 из 12 в титре 1:10, а через 55 дней - у 1 маралухи из 9 в титре 1:10. Общий процент реагирующих в РСК с R(ovis)-антигеном составил 66,7.

В последующие сроки серодиагностики (89-й и 122-й день), реагирующих в тест-системах не было.

В группе контрольных животных серопозитивные во все сроки исследования не выявлены.

В каждый срок, после взятия крови, проводили убой 4 маралух (3 из опытной и 1 из контрольной групп) с последующим отбором

биоматериала и бактериологическим исследованием. От каждого животного были взяты от 18 до 24 объектов биоматериала (лимфатические узлы, печень, селезёнка).

Высевы из каждой пробы проводили на 1 пробирку мясопеп-тонного печёночного глюкозо-глицеринового бульона (МПШТБ) и 2 пробирки с агаром (МППГГА).

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37-38°С. Первичный рост наблюдали на 5-е сутки. На 15-й день изолировано три, на 33 день - одна и на 55 день - также одна культура вакцинного штамма 75/79-АВ.

В результате бактериологического исследования из биоматериала контрольной группы маралух ни в одном случае культур вакцинного штамма 75/79-АВ не выделено.

Таким образом, вакцинный штамм В. abortus 75/79-АВ приживается в организме маралов в течение 55 дней. При совместном содержании иммунизированных маралух с неиммунизированными явление миграции не установлено.

3.3. Изучение иммуногенных свойств вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-АВ, определение оптимальной иммунизирующей дозы

Изучение иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-АВ проводили в ОПХ «Новоталицкое» Чарышского района на 15 телятах 6-месячного возраста. При этом была поставлена задача определить оптимальную иммунизирующую дозу.

Животных первой группы в количестве 5 голов привили вакциной из штамма 75/79-АВ в дозе 50 млрд м.к., второй группы (5 голов) - в дозе 100 млрд м.к. Группа из 5 интактных тёлочек была контролем. Животных опытных и контрольной групп содержали совместно на протяжении всего опыта.

Спустя 6 месяцев после иммунизации всех саюшек заразили культурой вирулентного штамма В. abortus 544 в дозе 15 млн м.к. бруцелл.

Динамику появления и угасания серологических реакций изучали, исследуя сыворотку крови в РА и РСК с единым бруцеллёзным биофабричным S- и R(ovis)-антигеном, через 15, 33, 55, 89, 122 и 143 дня после иммунизации, а также перед заражением и через 16, 22, 28, 35 и 41 день после него.

Результаты исследования показали, что иммунологические реакции в РА и РСК с 8-антигеном у телят всех групп в указанные сроки до искусственного инфицирования отсутствовали. Отмечена положительная РСК с Я-антигеном через 15 дней после вакцинации у 9 животных из привитых 10 в титрах от 1:5 до 1:20, через 33 дня - у 2 животных в титрах 1:5 и 1:10.

В группе контрольных животных, реагирующих во все сроки исследования до инфицирования не выявлено.

Данные исследования сывороток крови после заражения свидетельствуют, что агглютинины у одной самочки первой опытной группы были обнаружены только через 22 и 28 дней в титре 1:25.

Во второй опытной группе саюшек наблюдали появление агглютининов на 22-й день у 3 животных в титре 1:25 с последующим нарастанием к 35-му дню. Комлементсвязывающие антитела в РСК с 8-антигеном появились также на 22-й день и лишь у 1 животного, а спустя 35 дней - у 3. На 41-й день реагировали в РА 1, а в РСК с 8-антигеном 2 тёлочки.

В группе контрольных животных агглютинины были выявлены на 16-й день у 2 телят из 5 в титрах 1:25 и 1:100, через 22 дня - у 3 в титрах 1:50 и 1:100, через 28 -у 4 телят в титрах от 1:25 до 1:100, а через 35 дней - у всех 5. Комлементсвязывающие антитела в РСК с 8-антигеном появились на 22-й день у 1 животного в титре 1:10 с последующим нарастанием к 41-му дню. В день последнего исследования чисто реагирующих в РА и РСК с 8-антигеном составило 4 саюшки.

В РСК с Щсм8)-антигеном реагирующих телят во всех группах в указанные сроки исследования не выявлено.

Исследования морфобиохимического состава крови годовалых саюшек показали, что возрастание эритроцитов у животных опытных групп (от 7,8 до 11,2 х1012 л) связано с повышением температуры окружающей среды, а снижение и увеличение их числа в контрольной группе (8,1 - 6,1 - 12,4 х 1012 л) - с мобилизацией защитных сил организма на ликвидацию инфекционного агента.

Колебания белых кровяных телец у телят первой группы не имели чёткой динамики, а во второй группе совсем не изменялись. Лейкоциты у животных контрольной группы на протяжении всего опыта повышались (от 3,9 до 5,6х109 л), лишь незначительно снижаясь в последний день исследования до 4,8х109 л, что свидетельствует о развитии инфекционного процесса.

На данное обстоятельство указывало также снижение количества общего белка у животных контрольной группы (от 64,7 до 53,4 г/л). Содержание общего белка у саюшек опытных групп повышалось от 56,1 до 67,2 г/л.

У телят первой группы альбумины имели тенденцию к возрастанию (от 42,6 до 54,5%), а во второй группе - как к возрастанию, так и к снижению. В первом случае гамма-глобулины чаще снижались (от 26,4 до 21,0%), а во втором повышались (от 20,0 до 27,5%).

Количественные показатели альбуминов у животных контрольной группы как снижались, так и повышались, предопределяя противоположные значения в данные сроки, гамма-глобулинов.

Значения альфа- и бета-глобулинов у тёлочек трёх групп не имели чёткой динамики.

По истечении 41 дня телят трёх групп подвергли эутаназии с помощью миорелаксанта «Адилин-супер», который вводили внутримышечно, в среднюю треть шеи, в дозах 0,09; 0,135; 0,18; 0,27; 0,36 и 0,45 г сухого вещества соответственно в 1,0; 1,5; 2,0; 3,0; 4,0 и 5,0 мл 3,5%-ного раствора.

Наблюдения за клиническими критериями проявления фарма-. кодинамики «Адилина-супер» показали, что животным, которым вводили препарат в дозах 0,18; 0,27, 0,36 и 0,45 г сухого вещества через 2-3 мин падали на живот, подгибая под себя конечности. Лишь на 1 телёнка миорелаксант подействовал через 1 мин.

Повышение температуры тела выше границ физиологической нормы (38,0-39,0) у исследуемых животных не отмечали.

После наступления действия препарата у опытных маралов обвисали уши, голова опускалась на пол, нижняя челюсть отвисала, и из ротовой полости вытекала вязкая слюна, язык выпячивался, глаза были открыты, зрачки расширены. Дыхательные движения, болевой и глазной рефлексы, акт руменации, тактильная чувствительность отсутствовали. Также было отмечено выпячивание ануса и незначительное выделение мочи и каловых масс.

Следует отметить, что при наступлении комы сердечные сокращения с элементами аритмии не прекращались в интервале от 8 до 18 мин в зависимости от дозы препарата, общего состояния и веса телёнка. В дальнейшем наступала смерть животного, характеризующаяся необратимым прекращением деятельности всех физиологических функций организма.

Малые дозы препарата (0,09; 0,135 г) не вызвали падения животного и дальнейшей гибели. Они вызвали заторможенное состояние: животные стояли как в оцепенении некоторое время, без лишнего беспокойства, но при непосредственном приближении к ним вдруг делали несколько шагов и вновь останавливались. Дыхательные движения, болевой и глазной рефлексы, акт руменации были сохранены. Такое состояние продолжалось 20 мин (время наблюдения). Не добившись необходимого эффекта, телятам вводили ещё 2 мл раствора, после чего наступала гибель животного.

В результате эксперимента минимальной летальной дозой при эутаназии маралов можно считать дозу, равную 0,18 г сухого вещества в 2 мл 3,5%-ного раствора.

Видимых патологоанатомических изменений у телят опытных групп не отмечали. В группе контрольных животных были увеличены в 1,5-2 раза лимфатические узлы головы (подчелюстные, заглоточные и околоушные).

Высевы из каждой пробы проводили на 1 пробирку мясопеп-тонного печёночного глюкозо-глицеринового бульона (МППГГБ) и 2 пробирки агара (МППГГА).

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37-38°С. Первичный рост наблюдали на 7-е сутки. На агаре бруцеллы формировали мелкие, блестящие, выпуклые, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающиеся колонии, имевшие в отражённом свете голубоватый оттенок.

В результате бактериологического исследования из органов телят первой группы бруцелл не выделено, во второй группе была изолирована одна культура патогенного штамма бруцелл.

В группе контрольных животных из биоматериала всех 5 телят были выделены культуры бруцелл референтного штамма 544 в количестве 14 из высеянных 98 объектов.

Таким образом, по результатам проведённых исследований оптимальной иммунизирующей дозой для маралов является 50 млрд м.к., так как создаёт стойкий иммунитет у подопытных животных при их искусственном заражении через 6 месяцев после иммунизации.

3.4. Изучение сравнительной иммунологической эффективности

и антигенных свойств противобруцеллезных вакцин из штаммов Brucella abortus 82 и Brucella abortus 75/79-AB в опыте на маралах

Изучение иммунологической эффективности противобруцеллезных вакцин из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ в опыте на маралах проводили в ОПХ «Новоталицкое» Чарышского района на 15 телятах 6-месячного возраста. При этом была поставлена задача изучить их антигенные свойства.

Животных первой группы в количестве 5 голов привили вакциной из штамма 82 в дозе 50 млрд м. к., второй группы (5 голов) -штаммом 75/79-АВ в той же дозе. Группа из 5 интактных тёлочек была контролем. Животных опытных и контрольной групп содержали совместно на протяжении всего опыта.

Оценку реактогенных свойств штаммов 82 и 75/79-АВ проводили ежедневно в течение 13 суток. При учёте реакции через 24 часа у телят обеих опытных групп на месте подкожного введения отмечали выраженную припухлость плотной консистенции, горячую и болезненную, размером 3 х 3 см. Разливной отёк при этом не развивался. Данное состояние места инъекции сохранялось в течение 8 суток. В последующем (с 9-го по 13-й день) отмечали снижение температуры и болезненности, а также размеров припухлости.

При наблюдении за общим состоянием телят снижения аппетита, угнетения не отмечали ни в первый, ни в последующие дни.

Спустя 6 месяцев после иммунизации всех телят заразили культурой вирулентного штамма В. abortus 544 в дозе 30 млн м.к. бруцелл.

Динамику появления и угасания серологических реакций у подопытных животных изучали, исследуя сыворотку крови на бруцеллез в РБП, РА, РСК с S- и R(bovis, ovis)-антигенами до вакцинации и через 5,10,13, 29, 62, 91, 125,153 дня после нее, а также перед заражением и через 7, 14, 21, 28, 35, 42, 50 дней после него.

Результаты исследования показали, что агглютинины у 2 из первой и 1 саюшки из второй опытных групп выявлялись с 5-го дня в титре 1:25. Титры в РА у теленка первой группы сохранились вплоть до заражения. Во второй группе животных агглютинины начинали выпадать с 29-го дня, а к 62-му дню исследования они уже не выявлялись.

Реагирующие в РСК с S-антигеном начали выявляться во всех группах иммунизированных телят с 10-го дня исследования и сохранились в первой до 153-го дня, а во второй группе реакции угасли уже к 62-му дню.

Комплементсвязывающие антитела в РСК с R(bovis)-антигеном появились у всех телят опытных групп с 5-го дня исследования. Во второй группе саюшек реакции угасали на 153-й день, а в первой сохранились у 2 животных вплоть до заражения.

В РСК с R(ovis)-антигеном антитела имели тенденцию выявления также с 5-го дня: у 3 животных из второй и лишь у 1 самочки из первой групп. В РСК с R(ovis)-антигеном реакции у телят второй группы полностью исчезли к 125-му дню исследования, чего нельзя сказать о животных первой группы, имеющих серопозитивность в данном диагностическом тесте до 125-го дня.

У саюшек контрольной группы во все указанные сроки исследования реакции были отрицательные.

При исследовании проб сывороток крови до инфицирования была установлена положительная РА в титре 1:50 и РСК с R(bovis)-антигеном в титре 1:10 у одного, а также в РСК с R(ovis)-антигеном в титре 1:20 второго животного первой опытной группы. У телят маралов второй группы реакции отсутствовали.

При серологическом исследовании сывороток крови после заражения у саюшек первой группы агглютинины были обнаружены на 7-й день у 1 животного из 4 в титре 1:25, а выпадение реакций наблюдали на 42-й день. В РСК с R(bovis)-антигеном в данный период реагировала также 1 саюшка в титре 1:10, а к 50-му дню реагировали 3 самочки в титре от 1:5 до 1:10.

Во второй группе телят наблюдали появление агглютининов лишь на 21-й день у 1 самочки из 5 в титре 1:25. Комплементсвязывающие антитела в РСК с R(bovis)-антигеном появились на 14-й день у одного животного в титре 1:5 с последующим возрастанием как титра антител, так и животных (до 3 голов) к 28-му дню. На 50-й день реагировала в РСК с R(bovis)-антигеном 1 саюшка в титре 1:5.

Положительные реакции в РСК с R(ovis)-антигеном появились в опытных группах животных в титрах 1:5 и 1:10 на 21-й день (по одной саюшке в каждой группе) и сохранились до убоя в первой у 2, а во второй у 3 телят.

В РСК с S-антигеном в данных группах во все сроки реагирующие не выявлялись.

Среди контрольных животных агглютинины были выявлены на 14-й день после заражения у 2 телят в титре 1:50 и 1:100, через 21 день - у 4 в титрах от 1:25 до 1:100, а через 28 дней - у всех контрольных саюшек в титрах от 1:25 до 1:100 с последующим нарастанием титров к 50-му дню. Комплементсвязывающие антитела (РСК с 8-антигеном) появились на 28-й день у 2 животных в титрах 1:5 и 1:10. К 50-му дню в данном тесте реагировали 4 телёнка в титрах 1:10 и 1:20. Животные серопозитивные в РСК с ЩЬот, оте)-антигенами во все сроки исследования не выявлены.

Данные исследований сывороток крови в РБП свидетельствуют, что реакции у саюшек опытных групп появились на 10-е сутки после иммунизации. Однако у телят второй группы они полностью угасли к 91-му дню, а у животных первой сохранились вплоть до заражения. После инфицирования серопозитивность в РБП у самочек первой опытной группы отсутствала, а во второй опытной группе реакция сохранилась у 1 телёнка до убоя.

В группе контрольных саюшек реакции появились на 7-й день после заражения и сохранились до убоя.

Сопоставляя результаты РБП с результатами классических серологических тестов, можно отметить, что в большинстве случаев реакции в РБП совпадали с данными РА и РСК. Это является свидетельством специфичности данного теста при диагностике бруцеллёза маралов.

Исследования морфобиохимического состава крови годовалых саюшек показали, что возрастание эритроцитов у животных опытных групп (от 5,1 до 12,0х1012 л) связано с повышением температуры окружающей среды, а снижение и увеличение их числа в контрольной группе (6,0 - 10,9 - 6,2 - 9,4 х 1012 л) - с мобилизацией защитных сил организма на ликвидацию инфекционного агента.

Количество белых кровяных телец у телят первой группы возрастало, лишь снижаясь на 14-й и 42-й дни исследования (от 3,8 до 1,9 х 109 л; от 6,0 до 4,2 х 109 л). У животных второй группы количество лейкоцитов не имело чёткой динамики: их количество то возрастало, то убывало. Лейкоциты у животных контрольной группы на протяжении всего опыта повышались (от 2,7 до 6,4 х 109 л), лишь незначительно снижаясь в последний срок исследования до 6,0 х 109л, что характерно для развития инфекционного процесса.

На данное обстоятельство указывало также снижение количества общего белка в контрольной группе (от 62,6 до 53,0 г/л). Количественные показатели общего белка у саюшек опытных групп имели волнообразные значения.

У телят первой группы альбумины имели тенденцию к убыванию (от 53,5 до 37,8%), а во второй группе чаще возрастали (от 34,2 до 45,9%, а также от 32,5 до 39,8%). В первом и во втором случаях гамма-глобулины имели противоположные альбуминам значения.

Альбумины у животных контрольной группы имели колебания своих значений как к снижению, так и к повышению. Показатели гамма-глобулинов чаще совпадали с кривой изменения альбуминов.

Значения альфа- и бета-глобулинов у тёлочек трёх групп не имели чёткой динамики.

По истечении 50 дней телят трёх групп подвергли эутаназии с помощью миорелаксанта «Адилин-супер». Препарат вводили внутримышечно, в дозе 0,18 г сухого вещества в 2 мл (3,5%) раствора.

Из видимых патологоанатомических изменений у телят контрольной группы отмечали увеличение в 1,5-2 раза лимфатических узлов головы, в отдельных случаях они были увеличены в 3-4 раза. Увеличение лимфатических узлов отмечено также у 1 животного первой (в 1,5-3 раза) и 1 второй опытных групп (в 1,5-2 раза).

Высевы из каждой пробы проводили на 1 пробирку мясопеп-тонного печёночного глюкозо-глицеринового бульона (МППГГБ) и 2 пробирки агара (МППГГА).

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37-38°С. Первичный рост наблюдали на 6-е сутки. На агаре бруцеллы имели вид мелких, блестящих, выпуклых, с ровными краями и гладкой поверхностью просвечивающихся колоний, имеющих в отражённом свете голубоватый оттенок.

У животных первой и второй опытных групп из биоматериала культур бруцелл не выделено, что обеспечило стойкий иммунитет у саюшек данных групп.

В результате бактериологического исследования из органов всех контрольных телят были изолированы культуры бруцелл референтного штамма 544 в количестве 10 из высеянных 83 объектов.

Вакцинный штамм В. abortus 82 более агглютиногенен, чем штамм В. abortus 75/79-AB, что подтверждается результатами серологических исследований.

3.4.1. Патоморфологические изменения при экспериментальном бруцеллёземаралов

Материалом для патоморфологического исследования на бруцеллёз послужили органы, взятые от 13 маралов (телята в возрасте 1 года), прошедших экспериментальное заражение культурой вирулентного штамма В. abortus 544, в том числе от 9 саюшек из опытных и от 4 из контрольной групп.

Из видимых патологоанатомических изменений у животных контрольной группы отмечали увеличение лимфатических узлов в 1,5-4 раза (подчелюстных, заглоточных, предлопаточных и надвы-менных). Паренхима лимфоузла сочная, граница коркового и мозгового слоя сглажена, при надавливании истекает опалесцирующая жидкость.

В группах опытных саюшек наблюдали увеличение лимфоузлов у 1 тёлочки первой (правого заглоточного в 3 раза и правого предлопаточного в 1,5-2 раза) и 1 телочки второй групп (подчелюстного в 1,5-2 раза). Это, видимо, связано с доброкачественным генерализованным процессом после иммунизации и возможными воспалительными заболеваниями (в одном из лимоузлов, заглоточном, была обнаружена гнойнонекротическая масса).

В печени и селезёнке изменений макроструктуры органа не наблюдали.

При гистологическом исследовании у саюшек опытных и контрольной групп в лимфатических узлах выявлены: скопления белковой массы и незначительное количество гистиоцитарных и лимфо-идных клеток, капсула и трабекула утолщены, образованы плотной соединительной тканью; лимфатические фолликулы увеличены, имеют округлую форму, внутри фолликула отмечается обилие клеточных элементов-лимфоцитов. Корковый и мозговой слои слаборазличимы. При этом мякотные шнуры утолщены и инфильтрированы клеточными элементами.

В гистосрезе у животного № 31188 в мозговом веществе лимфоузла наблюдали инфильтрацию ретикулярной ткани многочисленными клеточными элементами, а также наличие единичных лим-фоидных узелков (скопления лимфоцитов).

В гистологических препаратах печени у животных контрольной группы дольчатость слабо выражена, и дольки имели вид пяти-

угольника, между ними можно наблюдать узкие прослойки соединительной ткани. Просвет центральной вены расширен или сужен. В отдельных участках печени наблюдали дистрофические процессы, характеризующиеся разрушением печёночных долек, их балочной структуры (разрушение гепатоцитов и разрастание соединительной ткани между печёночными дольками).

В некоторых препаратах печёночные балки частично разрушались, сохранены лишь отдельные возле центральной вены, просвет которой расширен и заполнен эритроцитами.

Помимо двуядерных встречаются единичные одноядерные ге-патоциты, в которых ядро оттеснено в сторону клеточной мембраны, что свидетельствует о дистрофических процессах, протекающих в паренхиме органа; отмечается расширение межбалочного синусоидального пространства.

ВЫВОДЫ

1. Оздоровление маралоферм от бруцеллеза с применением противобруцеллёзной вакцины из штамма 82 вполне приемлемо, однако длительно сохраняющиеся серологические реакции существенно затрудняют диагностику болезни.

2. Слабоагглютиногенный вакцинный штамм Brucella abortus 75/79-АВ, введённый в дозе 50 млрд м.к., в объёме 5 мл физраствора, в область средней трети шеи, подкожно, приживается в организме маралух 4-5-летнего возраста в течение 55 дней. По результатам серологического и бактериологического исследований явления миграции штамма не установлено.

3. При иммунизации маралят вакцинным штаммом Brucella abortus 75/79-АВ в возрасте 6 месяце в дозах 50 и 100 млрд м.к. серологические реакции появляются независимо от дозы на 15-й день (РСК), выпадают на 33-й сутки. Защитный эффект при искусственном конъюнктивальном инфицировании животных референтным штаммом Brucella abortus 544 через 6 месяцев после вакцинации составил, соответственно, 100 и 80%. Иммунизирующей дозой для вакцинации маралов против бруцеллёза является 50 млрд м.к.

4. Из шести испытанных доз миорелаксанта «Адилин-супер» (0,09; 0,135; 0,18; 0,27, 0,36 и 0,45 г действующего вещества) доза, равная 0,18 г сухого вещества в 2 мл 3,5%-ного раствора, при внутримышечном введении обеспечила эутаназию подопытных животных.

5. Сравнительное изучение иммуногенных и антигенных свойств вакцин из штаммов Brucella abortus 82 и 75/79-АВ показало, что при одинаковой иммунизирующей дозе 50 млрд м.к. получен равный защитный эффект при искусственном конъюнктивальном инфицировании животных через 6 месяцев после иммунизации. Поствакцинальные серологические реакции у животных, привитых штаммом 82, сохраняются в РА и РСК с R(bovis)-антиген ом вплоть до заражения (в течение 6 месяцев), а у вакцинированных штаммом 75/79-АВ -в течение 4 месяцев и только в РСК с R(bovis)-антигеном.

6. У контрольных маралят после искусственного заражения в крови повышается в 1,5-2 раза уровень содержания лейкоцитов на протяжении всего срока исследования, чаще понижается количество общего белка и альбуминов. Соответственно, у вакцинированных лейкоциты не имеют чёткой динамики: их количество то возрастает, то убывает, содержание общего белка и альбуминов также неоднозначно, но чаще повышается. При понижении или повышении альбуминов у животных всех групп гамма-глобулиновая фракция чаще имеет противоположные значения.

7. Спустя 50 дней после искусственного заражения контрольных саюшек наблюдали увеличение в 1,5-4 раза лимфоузлов (подчелюстных, заглоточных, предлопаточных и надвыменных). Видимых изменений паренхиматозных органов (печень, селезёнка) не обнаружено. При гистологическом исследовании в лимфатических узлах выявлены изменения, свойственные серозному лимфадениту.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. При диагностике и ликвидации бруцеллёза маралов следует руководствоваться методическими рекомендациями «Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов», утверждёнными учёным советом ГНУ ВНИИПО СО РАСХН (протокол № 1 от 11 февраля 2005) и научно-техническим советом управления ветеринарии администрации Алтайского края (протокол № 2 от 18 марта 2005 г.).

2. В «Наставление по применению вакцины живой сухой из штамма Brucella abortus 75/79-АВ при бруцеллёзе крупного рогатого скота», утверждённое Департаментом ветеринарии Минсельхоза России (2003 г.) в п. 3.1.4 внести дополнения дозы для маралов

50 млрд м.к. Выделить отдельный пункт по иммунизации маралов согласно данным, изложенным в рекомендациях.

3. При серологической диагностике маралов на бруцеллёз наряду с РА и РСК рекомендуем применять РБП.

4. При проведении экспериментальных исследований на маралах с последующим их убоем и утилизацией применять миорелак-сант «Адилин-супер» в дозе 0,18 г сухого вещества в 2 мл 3,5%-ного раствора при внутримышечном введении.

СПИСОК РАБОТ,

ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Солнцева Е.Н., Разумовская В.В., Тяпин В.В. Испытание нового диагностического теста РИГА (реакция непрямой гемагглюти-нации) в комплексе противобруцеллёзных мероприятий крупного рогатого скота в Алтайском крае // Ветеринария Сибири. - 2003. -№9-10.-С. 68-70.

2. Тяпин В.В. Противоэпизоотическая эффективность вакцины из штамма Brucella abortus 82 при бруцеллезе маралов // Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых ученых: Сб. тр. междунар. науч.-практ. конф. молодых ученых СО РАСХН. -Новосибирск, 2004. - С. 225-228

3. Тяпин В.В. Применение миорелаксанта при эутаназии маралов // Достижения и перспективы студенческой науки в АПК: Сб. тр. межрегион. науч. студенч. конф., посвящ. 60-летию Алтайского государственного аграрного университета. - Барнаул, 2004. - Ч. 2. -С. 89-90.

4. Тяпин В.В., Солнцева Е.Н., Луницын В.Г. Изучение приживаемости и возможности миграции противобруцеллёзной вакцины из штамма В. abortus 75/79-AB в опыте на маралах // Вопросы пантового оленеводства и болезней сельскохозяйственных животных: Матер. первой науч.-практ. конф. молодых учёных. - Барнаул, 2004. -С. 90-91.

5. Тяпин В.В., Солнцева Е.Н., Луницын В.Г. Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-AB в эксперименте на маралах // Вопросы пантового оленеводства и болезней сельскохозяйственных животных: Матер. первой науч.-практ. конф. молодых учёных. - Барнаул, 2004. - С. 92-95.

6. Луницын В.Г., Тяпин В.В. Испытание противобруцеллёзной вакцины на маралах // Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний. - Новосибирск, 2004. -С. 282.

7. Луницын В.Г., Тяпин В.В. Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов: Методические рекомендации РАСХН, Сиб. отд-ние, ГНУ ВНИИПО. - Барнаул, 2005. - 19 с.

ЛР № 020648 от 16 декабря 1997 г. Подписано в печать 30.03.2005 г. Формат 60x84/16. Бумага для множительных аппаратов. Печать ризографная. Гарнитура «Times New Roman». Усл. печ. л. 1,0. Уч.-изд. л. 0,8. Тираж 100 экз. Заказ № ^

Издательство АГАУ 656099, г. Барнаул, пр. Красноармейский, 98 62-84-26

11АПР 2005 - 300

Актуальность темы. Пантовое оленеводство - динамично развивающая отрасль сельского хозяйства, дающая два вида продукции: основную (панты) и побочную (мясо, кровь, хвосты, пенисы, жилы, зародыши), которые, в свою очередь, служат ценным лекарственным сырьем, применяемым в восточной и отечественной медицине для лечения различных заболеваний. Существенным сдерживающим фактором её развития являются инфекционные заболевания, одно из которых - бруцеллёз.

Бруцеллёз сельскохозяйственных животных является распространённой инфекционной болезнью, поражающей животных всех видов и представляющей серьёзную угрозу здоровью людей.

Уже давно стало очевидным, что успешная борьба с этой зооантропоноз-ной инфекцией в широких масштабах практически невозможна без использования средств специфической профилактики (Косилов И.А., 1985, 1992; Шумилов К.В., 1987; Салмаков К.М., 1975, 1987; Димов С.К., 1993 и др.). Необходимость их применения особо возрастает в связи с изменениями, происходящими в агропромышленном комплексе нашей страны: расформирование колхозов, совхозов, создание акционерных обществ, фермерских хозяйств, расширение и увеличение крестьянских подворий.

Существуют различные типы противобруцеллёзных вакцин, но наибольший интерес вызвали живые вакцины из штаммов В. abortus 19 и 82. В настоящее время как на крупном рогатом скоте, так и на маралах используется вакцина из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 82. Указанная вакцина обладает достаточно высоким уровнем иммуногенности и противоэпизоотической эффективности, однако имеет и ряд недостатков, связанных, прежде всего, с нестабильностью её биологических свойств, а также абортогенностью (Димов С.К., 1993; Климанов А.И. с соавт., 1983; Новицкий А.А., 1988; Ощепков В.Г., 1998). Результаты применения этой вакцины на маралах свидетельствуют о ещё одной негативной стороне — длительном сохранении поствакцинальных реакций (от 12-18 месяцев и до 5 лет после иммунизации).

Таким образом, очевидна необходимость поиска новых, современных противобруцеллёзных вакцин. Одной из таких вакцин является вакцина из штамма В. abortus 75/79-АВ, которая была селекционирована и комплексно изучена И.П. Никифоровым (1996) на крупном рогатом скоте.

Апробация данной вакцины в производственных условиях показала, что её применение в общем комплексе противобруцеллёзных мероприятий позволяет резко ослабить напряженность эпизоотического процесса в течение 6-8 месяцев и добиться ликвидации очагов бруцеллёза крупного рогатого скота в более короткие сроки. Кроме того, вакцина не абортогенна, популяция микробных клеток однородна, угасание серологических реакций наступает через 2-3 месяца после иммунизации.

Все это позволяет считать работу с этой вакциной весьма перспективной, а её испытание на маралах - актуальным.

Цель исследований - изучить основные свойства вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-АВ на маралах.

Для выполнения указанной цели в задачи исследования входило:

1. Изучение эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов в Алтайском крае и противоэпизоотической эффективности вакцины из штамма В. abortus 82.

2. Изучение приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма 75/79-АВ в организме маралов.

3. Изучение иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-АВ на маралах, отработка оптимальной иммунизирующей дозы.

4. Изучение сравнительной иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ в опыте на маралах.

Научная новизна. Впервые на маралах изучены приживаемость, возможность миграций, а также иммуногенные свойства вакцины из штамма 75/79-АВ, при этом определена оптимальная иммунизирующая доза. Проведена сравнительная оценка иммуногенных и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ на маралах; отработана методика эутоназии маралов миорелаксантом «Адилин-супер».

Практическая значимость. В ходе проведённых исследований разработаны рекомендации «Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов» (2005), утвержденные учёным советом ВНИИПО (протокол № 1 от 11 февраля 2005 г.), и рекомендованы к внедрению научно-техническим советом управления ветеринарии администрации Алтайского края (протокол № 2 от 18 марта 2005 г.).

Апробация работы. Результаты исследований доложены, обсуждены и одобрены на научно-практической конференции молодых учёных «Вопросы пантового оленеводства и болезней сельскохозяйственных животных» (г. Барнаул, 2003); региональной научной студенческой конференции «Достижения и перспективы студенческой науки в АПК» (г. Барнаул, 2003); Международной научно-практической конференции молодых учёных СО РАСХН «Новейшие направления развития аграрной науки в работах молодых учёных» (Новосибирская область, п. Краснообск, 2004); Международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний» (Новосибирская область, ГНЦ ВБ «Вектор», 2004), учёных советах ВНИИ пантового оленеводства (2001-2004) и научно-техническом совете управления ветеринарии администрации Алтайского края (2005).

Публикация результатов исследований. Основные положения диссертации отражены в 7 научных работах. Научные исследования, изложенные в диссертации, являются составной частью научных проблем Всероссийского научно-исследовательского института пантового оленеводства, тема № 02.01.01.

Выносятся на защиту:

1. Анализ эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов в Алтайском крае и противоэпизоотической эффективности вакцины из штамма Brucella abortus 82.

2. Приживаемость и возможность миграции вакцинного штамма Brucella abortus 75/79-АВ в организме маралов.

3. Определение иммуногенных свойств вакцины из штамма Brucella abortus 75/79-АВ, изыскание оптимальной иммунизирующей дозы для маралов.

4. Определение сравнительной иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов Brucella abortus 82 и Brucella abortus 75/79-АВ на маралах.

1. Обзор литературы

119 Выводы

1. Оздоровление маралоферм от бруцеллеза с применением противобру-целлёзной вакцины из штамма 82 вполне приемлемо, однако длительно сохраняющиеся серологические реакции существенно затрудняют диагностику болезни.

2. Слабоагглютиногенный вакцинный штамм В. abortus 75/79-АВ введённый в дозе 50 млрд м.к., в объёме 5 мл физиологического раствора, в область средней трети шеи, подкожно, приживается в организме маралух 4-5 летнего возраста в течение 55 дней. По результатам серологического и бактериологического исследований явления миграции штамма не установлено.

3. При иммунизации маралят вакцинным штаммом В. abortus 75/79-АВ в возрасте 6 месяце в дозах 50 и 100 млрд м.к. серологические реакции появляются независимо от дозы на 15-й день (РСК), выпадают на 33-и сутки. Защитный эффект при искусственном конъюнктивальном инфицировании животных референтным штаммом В. abortus 544 через 6 месяцев после вакцинации составил 100 и 80 % соответственно. Иммунизирующей дозой для вакцинации маралов против бруцеллёза является 50 млрд м.к.

4. Из шести испытанных доз миорелаксанта «Адилин-супер» (0,09; 0,135; 0,18; 0,27, 0,36 и 0,45 г действующего вещества) доза равная 0,18 г сухого вещества в 2 мл 3,5%-ного раствора при внутримышечном введении обеспечила эутаназию подопытных животных.

5. Сравнительное изучение иммуногенных и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ показало, что при одинаковой иммунизирующей дозе 50 млрд м.к. получен равный защитный эффект при искусственном конъюнктивальном инфицировании животных через 6 месяцев после иммунизации. Поствакцинальные серологические реакции у животных привитых штаммом 82, сохраняются в РА и РСК с R(bovis)-aHTHreHOM вплоть до заражения (в течение 6 месяцев), а у вакцинированных штаммом 75/79-АВ в течение 4 месяцев и только в РСК с R(bovis)-aHTHreHOM.

6. У контрольных маралят после искусственного заражения в крови повышается в 1,5-2 раза уровень содержания лейкоцитов на протяжении всего срока исследования, чаще понижается количество общего белка и альбуминов. Соответственно у вакцинированных лейкоциты не имеют чёткой динамики; количество их то возрастает, то убывает, содержание общего белка и альбуминов также неоднозначны, но чаще повышается. При понижении или повышении альбуминов у животных всех групп гамма-глобулиновая фракция имеет противоположные значения.

7. Спустя 50 дней после искусственного заражения контрольных саюшек наблюдали увеличение в 1,5-4 раза лимфоузлов (подчелюстных, заглоточных, предлопаточных и надвыменных). Видимых изменений паренхиматозных органов (печень, селезёнка) не обнаружено. При гистологическом исследовании в лимфатических узлах контрольной группы выявлены изменения свойственные серозному лимфадениту.

Практические предложения

1. При диагностике и ликвидации бруцеллёза маралов руководствоваться методическими рекомендациями «Диагностика, профилактика и меры борьбы с бруцеллёзом маралов» утверждённые учёным советом ГНУ ВНИИПО СО РАСХН (протокол № 1 от 11 февраля 2005 г.) и научно-техническим советом управления ветеринарии администрации Алтайского края (протокол № 2 от 18 марта 2005 г.).

2. В «Наставление по применению вакцины живой сухой из штамма Brucella abortus 75/79-АВ при бруцеллёзе крупного рогатого скота», утверждённого Департаментом ветеринарии Минсельхоза России (2003 г.), в п. 3.1.4 внести дополнения дозы для маралов 50 млрд м.к. Выделить отдельный пункт по иммунизации маралов согласно данным, изложенным в рекомендациях.

3. При серологической диагностике маралов на бруцеллёз наряду с РА и РСК рекомендуем применять РБП.

4. При проведении экспериментальных исследований на маралах с последующим их убоем и утилизацией применять миорелаксант «Адилин-супер» в дозе 0,18 г сухого вещества в 2 мл 3,5%-ного раствора, при внутримышечном введении.

122

Заключение

Во многих странах, в том числе в России, проблема искоренения бруцеллёза животных не теряет своей актуальности.

Инфекция представляет угрозу не только животным, но и человеку, так как является типичным зооантропонозом. В связи с этим борьба с бруцеллёзом имеет не только экономическое, но и социальное значение.

Заболевание регистрируется как среди мелкого и крупного рогатого скота, так и маралов.

В маралохозяйствах вакцина из штамма 82 является приемлемой для иммунизации маралов. Однако результаты практического применения вакцины свидетельствуют, что отдельные животные, иммунизированные будучи молодняком (телята), реагируют в РСК спустя 2 и более лет, а в некоторых случаях маралы могут быть серопозитивны как в РСК, так и в РА спустя 12-18 месяцев, 5 и более лет, что затрудняет диагностику болезни.

Обобщая материалы литературных данных по проблеме специфической профилактики бруцеллеза животных, можно констатировать ее ведущую роль в системе противобруцеллезных мероприятий. При этом важно иметь такую вакцину, которая бы при обеспечении длительного иммунного состояния в стадах давала возможность беспрепятственной поствакцинальной диагностики в самые короткие сроки после введения, учитывая закономерности вторичного иммунного ответа и была бы максимально экологически безопасна.

У инагглютиногенных вакцинных штаммов низок уровень иммуногенно-сти, но его можно повышать как за счёт увеличения дозы, кратности и интервалов, а также при помощи иммуномодуляторов различной природы. Однако материалов для окончательного решения данного вопроса пока недостаточно.

Живые агглютиногенные и слабоагглютиногенные вакцины обладают, по сравнению с убитыми культурами, достаточно высоким уровнем иммуногенно-сти и эпизоотически безопасны. Однако это весьма относительно в связи с высокой степенью аглютиногенности первых и нестабильностью антигенных свойств-вторых.

Определенные надежды в решении проблем, существующих при проведении специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота, связывают с вакциной из слабоагглютиногенного штамма В. abortus 75/79-АВ, успешно зарекомендовавшего себя при оздоровлении неблагополучных пунктов в Алтайском крае.

2. Собственные исследования 2.1. Материалы и методы исследования

Работа выполнялась с 2001 по 2005 гг. во Всероссийском научно-исследовательском институте пантового оленеводства, на кафедре эпизоотологии и ВСЭ ИВМ АГАУ, а также в мараловодческих хозяйствах Алтайского края.

Биологические особенности маралов и систему ведения отрасли мы описывали, руководствуясь работами B.C. Галкина, В.Н. Егеря, И.И. Миронова, П.В. Митюшова, а также основываясь на собственных наблюдениях.

Материалом для изучения и анализа эпизоотической ситуации по бруцеллёзу маралов послужили архивные данные годовой ветеринарной отчётности Алтайского края за период с 1969 по 2003 гг. При этом выясняли количество неблагополучных по данной инфекции пунктов, число исследованных и реагирующих в серологических тестах (РА, РСК) животных, вынужденно убитых и иммунизированных противобруцеллёзными вакцинами маралов.

Для изучения приживаемости и возможности миграции вакцинного штамма В. abortus 75/79-АВ в ОПХ «Новоталицкое» было взято 20 маралух 4-5-летнего возраста, раннее не вакцинированных никакими противобруцеллёзными вакцинами. Всех животных забирковали индивидуальными новозеландскими бирками и сформировали 2 группы: в I группе — 15 животных (опытные), во II группе — 5 (контрольные).

Перед закладкой опыта всех животных исследовали в реакции агглютинации (РА) и реакции связывания комплемента (РСК). Их постановка и учёт регламентированы действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Взятие крови и получение сыворотки для серологических исследований (РА, РСК) проводили следующим образом: животных фиксировали в панторезном станке (при содержании в виварии ВНИИПО в специальном расколе) и с правой стороны шеи в области яремной вены выстригали шерсть, накладывали жгут, место укола дезинфицировали 70°-ным раствором спирта (фото 1). Взятие крови осуществляли кровобрательной иглой Боброва А-26х4017И52. Пробы крови отбирали в бактериологические пробирки по 10-15 мл. Для получения сыворотки их помещали в термостат на 3 часа при температуре 37°С, после ретракции сгусток осаждали центрифугированием (1000-1500 об/мин). Сыворотку сливали и исследовали в течение 10 дней свежую либо замораживали, сохраняя в таком виде непосредственно до проведения серодиагностики.

Фото i. Взятие крови у опытных животных

Животных опытной и контрольной групп содержали совместно на протяжении всего опыта (4 месяца). Кормление маралух осуществлялось по типовым рационам, в который входило (из расчета на 1 голову); сена — 6-7 кг, силоса -5-6 кг, концентратов - 0,5 кг, соли - 15-18 г. Общая питательность суточного рациона составила 3,9-4,2 к, ед., что удовлетворяет потребностям для данной возрастной группы. Источником питьевой воды в зимнике служил ручей.

Иммунизацию маралух опытной группы проводили комиссионно, в панторезном станке. Вакцину из штамма В. abortus 75/79-АВ вводили подкожно, в область средней трети шеи, в дозе 50 млрд м.к., в объёме 5 мл. Разводили данный препарат в стерильном остуженном физиологическом растворе (0,85%-ный) из расчета одна доза для крупного рогатого скота в 10 мл растворителя. Шерсть на месте инъекции предварительно выстригали ножницами, а кожу обрабатывали 70° спиртом.

Динамику появления и угасания серологических реакций изучали, исследуя сыворотку крови в РА и РСК с единым бруцеллёзным биофабричным S- и R(ovis)-aHrareHOM (изготовленный 15.01.2003 г. НПФ «Биоцентр», г. Омск, серия 1, контроль 1, срок годности 12 месяцев).

Сыворотку крови исследовали на 15, 33, 55, 89 и 122 день после иммунизации. В каждый срок, после забора крови, проводили убой 4 маралух (3 из опытной и 1 из контрольной групп) с последующим отбором биоматериала и бактериологическим исследованием. От каждого животного были взяты следующие органы: парные лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные, околоушные, предлопаточные, паховые, надвыменные, бронхиальные, тазовые, мезентериальные, парааортальные), непарные (средостенный и портальный), а также печень и селезёнка.

Высевы из каждой пробы проводили на питательные среды, предварительно проверенные на ростовые качества: мясопептонный печёночный глюко-зо-глицериновый бульон (Ml 11Ш Б) и агар (МППГГА). Приготовление указанных питательных сред и методика посева регламентировано действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37-38°С. Первичный осмотр проводили через сутки. В дальнейшем посевы просматривали каждые 3-4 суток визуально, при необходимости через лупу. На 7-й и 14-й день инкубирования их орошали посевным материалом и трижды учитывали результаты.

Выделенные культуры идентифицировали по тинкториальным (окраска мазков по Козловскому), морфологическим, культуральным свойствам и в реакции агглютинации на стекле с использованием набора компонентов для серологической дифференциации бруцелл. Методика окраски, а также постановка и учёт реакции регламентированы действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Для изучения иммуногенных свойств вакцины из штамма В. abortus 75/79-АВ и определения оптимальной иммунизирующей дозы в ОПХ «Новота-лицкое» были сформированы 3 группы телят (6-месячного возраста) по 5 в каждой: I и II группы - опытные, III - контрольная. Всех животных забирковали индивидуальными новозеландскими бирками с последующим взятием крови для серологического исследования в РА и РСК. После получения отрицательных результатов нами была проведена закладка эксперимента.

Содержание телят маралов всех групп было совместное на протяжении всего опыта: в течение 6 месяцев в отдельном зимнике на маралоферме «Покровка», а по истечении данного срока в виварии ВНИИПО. Кормление животных в зимний период осуществлялось по типовым рационам, в который входило (из расчета на 1 голову): сена - 2,5-3 кг, силоса - 2-3 кг, концентратов - 1 кг, соли - 15-18 г. Общая питательность суточного рациона составила 2,2-2,5 к.ед., что удовлетворяет потребностям для данной возрастной группы. Источником питьевой воды служил ручей, текущий через зимник.

В виварии ВНИИПО телят кормили луговой травой (фото 2).

Корм задавали три раза в день по 10 кг, что составило по питательности 2,0-2,5 к.ед. (из расчёта на 1 голову). Воду для питья наливали при помощи шланга в специальную поилку. Источником соли служил «лизунец», расположенный в углу вивария.

Фото 2. Кормление опытных саюшек в виварии ВНИИПО.

Кормление и поение животных после инфицирования проводили в специальной одежде, которую по завершении опыта автоклавировали. Перед виварием был устроен дезбарьер с раствором едкого натра (3-5%-ный). При взятии крови использовали халаты и одноразовые перчатки. Кровобрательные иглы после очередного забора крови обеззараживали кипячением. Руки исследователей обрабатывали раствором хлорамина (1%-ный) или спиртом (70°).

Иммунизацию телят опытных групп проводили комиссионно, в панторезном станке. Вакцину из штамма В. abortus 75/79-АВ вводили подкожно, в область средней трети шеи, в объёме 5 мл, в дозе 50 млрд м.к. (животным первой группы) и 100 млрд м.к. (телятам второй группы). Разводили данный препарат в стерильном остуженном физиологическом растворе (0,85%-ный) из расчета одна доза для крупного рогатого скота (100 млрд м.к.) в 10 и 5 мл растворителя соответственно. Предварительно шерсть на месте инъекции выстригали ножницами, а кожу обрабатывали 70и спиртом.

Динамику появления и угасания серологических реакций изучали, исследуя сыворотку крови в РА и РСК с единым бруцеллёзным биофабричным S- и R(ovis)-aHTHreHOM на 15, 33, 55, 89, 122, 143 день после иммунизации, а также перед заражением и через 16, 22, 28, 35, 41 день после него.

Кроме того, для определения естественной резистентности телят были проведены исследования морфобиохимического состава крови по общепринятым методикам. Пробы крови отбирали в пробирки Флоринского в количестве 3-4 мл с добавлением антикоагулянта трилона-Б (3-4 капли). В цельной крови определяли общее количество лейкоцитов и эритроцитов (в камере Горяева в 1 мкл крови); в сыворотке крови: содержание общего белка - рефрактометрическим методом (ИФР-22), фракции белка - нефелометрическим методом по И.П. Кондрахину (1985).

Технология взятия крови и приготовление образцов сыворотки подробно описана в предыдущем опыте.

Заражение животных патогенным штаммом В. abortus 544 (музейный штамм, ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН) с целью проверки иммунитета проводили через 6 месяце после иммунизации, комиссионно, с соблюдением правил работы как с маралами, так микроорганизмами. Для этого всех телят перевезли из ОПХ «Новоталицкое» в виварий ВНИИПО; каждое животное фиксировали в специальном расколе силой 3 человек, 4-й наносил суспензию в объёме 0,1 мл на конъюнктиву каждого глаза с последующим растиранием (фото 3). Инфицирующая доза была равна 15 млн м.к., что составило 7,5 млн м.к. бруцелл в 0,1 мл.

Суспензию из патогенного штамма готовили путём последовательных разведений взвеси бруцелл в физиологическом растворе (по стандарту мутности).

Фото 3. Заражение телят патогенным штаммом бруцелл

Убой животных проводили по истечении 41 дня после заражения при помощи миорелаксанта «Адилин-супер» (изготовленный ООО «Ветбиосервис», г. Казань, партия № 1, дата выпуска 26.05.2002 г., срок годности - 18 мес.). Раствор в концентрации 3,5% вводили внутримышечно, в среднюю треть шеи в объеме 1, 1,5, 2, 3, 4 и 5 мл на животное, что составило, соответственно, дозу 0,09; 0,135; 0,18; 0,27; 0,36 и 0,45 г сухого вещества. Во время эксперимента вели учет: температуры тела, частоты дыхания, сердечных сокращений, акта ру-менации, глазного и болевого рефлекса, тактильной чувствительности, а также времени начала действия препарата и наступления летального исхода.

Указанные клинические методы исследования проводили по общепринятым в ветеринарии методам.

Патологическую картину бруцеллёза у вынужденно убитых телят маралов изучали методом полного патологоанатом и чес кого вскрытия по методике МС. Жакова (1977).

Вскрытие с последующим отбором биоматериала и бактериологическим исследованием, а также утилизацию животных проводили на скотомогильнике учхоза «Пригородное». От каждого животного были взяты следующие органы: парные лимфатические узлы (подчелюстные, заглоточные, околоушные, пред-лопаточные, паховые, надвыменные, бронхиальные, тазовые, мезентериальные, парааортальные), непарные (средостенный и портальный), а также печень и селезёнка.

Высевы из каждой пробы проводили на питательные среды, предварительно проверенные на ростовые качества: мясопептонный печёночный глюко-зо-глицериновый бульон (МППГГБ) и агар (МППГГА) - фото 4. Методика посева регламентирована действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных»(2000).

Фото 4. Лабораторные исследования

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37-38°С. РОССИЙСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННА. ■

41 *

Первичный осмотр проводили через сутки. В дальнейшем посевы просматривали каждые 3-4 сутки визуально, при необходимости через лупу. На 7-й и 14-й день инкубирования их орошали посевным материалом и трижды учитывали результаты.

Выделенные культуры идентифицировали по тинкториальным (окраска мазков по Козловскому), морфологическим, культуральным свойствам и в РА на стекле. Пластинчатую РА на стекле изучали S- и R-бруцеллёзными сыворотками и трипофлавином.

Методика окраски, а также постановка и учёт реакции регламентирован действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Для изучения иммунологической эффективности и антигенных свойств вакцин из штаммов В. abortus 82 и В. abortus 75/79-АВ в ОПХ «Новоталицкое» были сформированы 3 группы телят (6-месячного возраста) по 5 в каждой: I и II группы - опытные, III - контрольная. Всех животных пометили индивидуальными новозеландскими бирками и произвели взятие крови с последующим серологическим исследованием сыворотки в РА и РСК. После получения отрицательных результатов в тест-системах была проведена закладка опыта.

Содержание телят маралов всех групп, на протяжении всего опыта, было совместное: в течение 6 месяцев в отдельном зимнике на маралоферме «Покровка», а по истечении - в виварии ВНИИПО. Кормление животных в зимний период осуществлялось по типовым рационам, в который входило (из расчета на 1 голову): сена - 2,5-3 кг, силоса — 2-3 кг, концентратов - 1 кг, соли — 15-18 г, что по питательности составило 2,2-2,5 к.ед. Источником питьевой воды служил ручей, текущий через зимник.

В виварии ВНИИПО телят кормили луговой травой. Корм задавали три раза в день по 10 кг, что составило по питательности 2,0-2,5 к.ед. (из расчёта на 1 голову). Воду для питья наливали при помощи шланга в специальную поилку. Источником соли служил «лизунец».

Кормление и поение животных после инфицирования проводили с соблюдением санитарных правил.

Иммунизацию телят опытных групп проводили комиссионно, в панторезном станке. Вакцину из штаммов В. abortus 82 и 75/79-АВ вводили подкожно, в область средней трети шеи, в объёме 5 мл, в дозе 50 млрд м.к. Разводили данные препараты в стерильном остуженном физиологическом растворе (0,85%-ный) из расчета одна доза для крупного рогатого скота (100 млрд м.к.) в 10 мл растворителя. Предварительно шерсть на месте инъекции выстригали ножницами, а кожу обрабатывали 70° спиртом.

Реактогенные свойства вакцины изучали в течение 13 дней путем пальпации места инъекции. При этом учитывали болезненность, температуру на месте введения препарата, размеры отечности и её консистенцию, также проводили термометрию опытных и контрольных животных по известной в ветеринарии методике. Кроме этого нами были проведены наблюдения за общим состоянием животных.

Динамику появления и угасания серологических реакций у подопытных животных изучали, исследуя сыворотку крови на бруцеллез в РБП, РА и РСК с единым бруцеллёзный биофабричный S- и R(bovis, оу1з)-антигенами до вакцинации и через 5, 10,13, 29, 62, 91, 125, 153 дня после нее, а также перед заражением (спустя 6 месяцев) и через 7, 14, 21, 28, 35, 42, 50 дней после заражения. Постановка и учёт указанных методов проводили согласно регламентированным методикам. При постановке РБП использовали цветной антиген (антиген бруцеллёзный для РБП, производства Щёлковского биокомбината, серия 4, годен до 12.2005 г.). Для РСК использовали R(ovis) — производства НПФ «Биоцентр», г. Омск; и R(bovis)-aHTHreHbi — производства ВНИИБТЖ (из штамма 16/4, JI.B. Дегтяренко).

Кроме того, для определения естественной резистентности телят были проведены исследования морфобиохимического состава крови по общепринятым методикам.

• Заражение животных патогенным штаммом В. abortus 544 (музейный штамм, ГНУ ВНИИБТЖ СО РАСХН) с целью определения иммунологической эффективности вакцин из штаммов 82 и 75/79-АВ проводили через 6 месяцев после иммунизации. Для этого всех телят перевезли из ОПХ «Новоталицкое» в виварий ВНИИПО; каждое животное фиксировали в специальном расколе силой 3 человек, 4-й наносил суспензию в объёме 0,1 мл на конъюнктиву каждого глаза с последующим растиранием. Инфицирующая доза была равна 30 млн м.к., что составило 15 млн м.к. бруцелл в 0,1 мл.

Суспензию из референтного штамма 544 готовили по аналогии с предыдущим опытом.

Убой животных проводили по истечении 50 дней после заражения при помощи миорелаксанта «Адилин-супер» (3,5%-ный). Раствор вводили внутримышечно, в среднюю треть шеи, в объеме 2,0 мл на животное, что составило дозу 0,18 г действующего вещества.

Патологическую картину бруцеллёза у вынужденно убитых телят маралов изучали по методике М.С. Жакова (1977).

Вскрытие с последующим отбором биоматериала и бактериологическим исследованием, а также утилизацию животных проводили на скотомогильнике учхоза «Пригородное». От каждого животного были взяты, как и в предыдущем опыте, парные и непарные лимфатические узлы, а также печень и селезёнка.

Высевы из каждой пробы проводили на питательные среды, предварительно проверенные на ростовые качества: мясопептонный печёночный глюко-зо-глицериновый бульон (Ml И 11 1 Б) и агар (Ml И111 А). Методика посева регламентирована действующим «Наставлением по диагностике бруцеллёза животных» (2000).

Посевы инкубировали в термостате в течение 30 суток при температуре 37-38°С. Первичный осмотр проводили через сутки. В дальнейшем посевы просматривали каждые 3-4 сутки визуально, при необходимости через лупу.

На 7-й и 14-й день инкубирования их орошали посевным материалом и трижды учитывали результаты.

Выделенные культуры идентифицировали по тинкториальным (окраска мазков по Козловскому), морфологическим, культуральным свойствам и в РА на стекле. Пластинчатую РА на стекле изучали с S- и R-бруцеллёзными сыворотками и трипофлавином.

Патоморфологические изменения макрокартины органов при экспериментальном бруцеллезе изучали на секции у животных визуально, а микрокартины — при анализе микроструктуры приготовленных гистологических срезов под 56-кратным увеличением биологического микроскопа МБИ-1. Методика приготовления гистосрезов подробно описана в соответствующем разделе. При описании микрокартины руководствовались атласом микроскопического и ультрамикроскопического строения клеток, тканей и органов.

Полученный цифровой массив подвергался стандартной статистической обработке в операционной системе Windows 2000 ХР на PC Pentium 4 с помощью программы Microsoft Excel 2000 г.