Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Самопогрызание соболей (вирусологические и цитохимические исследования)

Омский государственный веторинарный гаготитут

Ш1 правах ругаписи УДК 619:616. 983-074+635.93

БЕСПАЛОВА Тамара Ажжсесвна

САМОПОГРЫЗАНИЕ СОБОЛЕЙ (Вирусологические и дагаохишгоескиэ исследования)

16.00.03 - ветеринарная микробиолога, вирусология, эпизоотология, мштохогга и ишсунояоглл

Автореферат диссертация! на сснсгсаннэ учеггай степени кандидата ветеринарных наук

Омск , 1994

Рабога выполнена на кафедрэ микробиологии, вирусологии и им-иуш логин Омского гас/дарственного ветеринарного института и в лаборатории по изучению болезней пушных зверей Сибирского НИШ (ныне ВШШЙ).

Научные руководители - доктор ветеринарных наук, профессор В.Ф. ¿йртшгов; кандидат ветеринарных наук, доцент O.A. Приступа

Официальные оппоненты- доктор ветеринарных наук, профессор Е IL Смирнов; доктор ветеринарных наук, профессор Е Г. Оадапков.

Ведупре учреждение - Новосибирский государственный

аграрный университет.

Защита состоится "ЭСи^кЛрЯ. 199^~г. в 10 часов на эаседа-

ША

vä ]

нии специализированного совета К 120.48.01 при Омском государственном ветеринарном институте.

Адрес инст.ггута: 644007. Омск-7, ул. Октябрьская, 92.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института

v

Автореферат разослан " ^ " г.

Ученый секретарь специализированного

совета, доцент .. ^ ■ • .13. И. Барабанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теш. Среди диких и клеточных соболей повсеместно встречается заболевание, именуемое самопогрызанием. lütyp-!сн, полученные от гакнх убитых больных соболей, имеет ряд существенных дефектов, приводящих их к обесцениванию. Инфекционная природа заболевания подтверждается эпиэоотологическими, вирусологическими и патошрфологическими исследованиями (В.Ф. Мартынов, 1971; И. А. Прохорова и др. ,1971; M. Е. Жданова и др. 1975; Л И. rfeTposa, 1977; 0. А. Приступа, 1980). Исследования последних лет показали, что самопогрызание имеет сходство с персистентными формами нейроинфекций (ПН. Захаров, 1087; 0. А. Приступа, 1983; Л. В. Гежес, 1989).

Успехи, достигнутые теоретической вирусологией, привели к выяснению многих молекулярных механизмов жизнедеятельности вирусов животных. Применение однослойных тканевых культур позволило выявить не только особенности цитопатогенного действия вирусов, но и изучить некоторые стороны обмена вещэств инфицированных клеток. Получены данные о цитопатологических и цитохимических изменениях, вызываемых многими вирусными инфекциями (ЕЯ Кармшева, 1976; А.Ф. Быковский и др. 1979; Д. В. Голубев, 1979; Е Д. Соловьев, Я.Е. Хесин, 1973; В. H Сюркл и др. 1991; Сшфнов П. К и др. 1992). Одна!«), патологические изменения, происходящие в клеточных культурах, зараженных агентом от больных самопогрызанием зверей, не исследованы. Поэтому каучение этой проблемы представляет большой научный и практический интерес. Детальное описание цитологических изменений под действием после дуемого патогена может внести вашшй вклад в разработку методов диагностики. Кроме того, раскрытие взаимоотношений возбудителя с {меткой кокет служить теоретической основой для разработки способов профилактики и лечения заболевания.

Настоящее исследование представляет собой фрагмент кош-лексной темы по изучении самопогрызшшя у пушных зверей, лад которой работают сотрудники кафедры микробиологии, вирусологии и иммунологии Омского ветеринарного института (ti госуд. регистрации 01.91.00. за. 708).

- г -

Ш-Ок исследования выявить наиболее характерные

лршжаки, определяющие цитоморфологическую и цитохимическую специфичность интактных и инфицированных агентом сачюпогрызания культур клеток почек золотистого хомяка.

Основные задачи исследования:

1. Провести вирусологическое изучение агента сашпогрызания, пассированного через различные Биологические объекты, и выяснить оптимальные условия его культивирования.

2. Научить особенности цитоморфологической и цитохимической дифференциации интактных культур клеток почек хомяка в различные периоды культивирования.

3. Установить воздействие агента сашпогрызания на морфологическую характеристику культур клеток почек хошка и некоторые показатели клеточного метаболизма.

4. Получить цитофизические данные, свидетельствующие о функциональном состоянии интактных и инфицированных цитопатогеном сашпогрызания клеточных культур.

5. Провести электронномккроскопическое изучение коры большого мозга золотистых хомяков при экспериментальном сашпогрызания и зараженной культуры клеток ВНК-21.

Научная новизна:

- отработаны оптимальные условия культивирования агента сашпогрызания в почечных культурах золотистых хомяков для получения его с наивысшей инфекционной активностью;

- методами световой микроскопии уточнены некоторые аспекты цитопатогенного действия агента сашпогрызания на культуры клеток почек золотистых хомяков;

- установлены особенности распределения и изменения в содержании РНК, ДНК, гликогена, белков, липидов и некоторых' окислительно-восстановительных ферментов в интактных и инфицированных агентом сашпогрызания культурах клеток ПХ и ВНК-21;

- получены данные о митогической активности и кариометрии, свидетельствуйте о различии в функциональном- состоянии интактных и инфицированных цигопатогеноы сашпогрызания культур клеток;

- дана ультрасгруктурнач характеристика коры большох'о мозга золотистых хомяков при экспериментальном самопогрыаании и зара-гкенной культуры клеток ВНК-21.

Прзстическая значимость. Полученные данные позволяют рекомендовать:

- отработанные нами оптимальные условия культивирования исследуемого агента сашпогрызания в клеточных культурах золотистых хомяков;

- культуры клеток ИХ и ВИК-21, как модель для культивирования агента саиопогрыэаиия, изучения его цитопатогенного действия и диагностики заболевания;

- цитоморфологичеокйн и цитохимические критерии в качестве дополнительного метода диагностики заболевания в культурах клеток.

- при лабораторией диагностике заболевания в Омской областной ветеринарной лаборатории;

- в научно-исследовательской работе и учебном процессе «а кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ОГБИ;

- в учебном процессе на кафедрах патологической, анатомии и вскрытия с. -х. животных, эпизоотологии е. -х. животных.

Результаты работы вошли в рекомендации по диагностике само-погрызания пушных зверей, утвержденные и рекомендованные к использованию Омским, Тюменским и Оренбургским агропромами.

Предложены ряд устройств и приспособлений (шесть удостоверений на рационализаторские предложения), облегчающих проведение лабораторных исследований при самопогрызаши.

Основньгз положим^ выносимые на защиту: 1. Определены основные ^геоморфологические признаки размножения агента самопогрыза-ния в клеточных культурах.

2. В основе патологии инфицированных цитопатогеном самопог-рызания клеточных культур лежат изменения в распределении и содержании нуклеинового, Белкового, углеводного, жирового обменов и некоторых ошгслнтелы»-восстановительных ферментов.

3. Возмодность воспроизведения ааболевания в эксперименте на лабораторной модели, динамика патологического процесса в зараженных агентом самопогрыэания культурах клеток, данные цитохимии, световой, люминесцентной и электронной микроскопии показывают, что самопогрызание имеет сходство с персистентныыи формами нейро-инфекций.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены на пятой региональной конференции молодых ученых и специалистов Сибири и Дальнего Востока (Новосибирск, 1983); на заседаниях ученого совета ВШИБИ (Омск, 1983-1986); на Всесоюзной научной конференции по проблемам эпизоотологии (Казань, 1983); на четвертой Всесоюзной конференции по биологии и патологии клеточных пушных зверей (Киров, 1985); материалы экспонировались на областной выставке молодых ученых и специалистов (Омск, 1985); на научной конференции преподавателей и аспирантов ОГШ (Омск, 1989, 1990, 1993); на третьем Всесоюзном совешдиии го культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1990); на четвертом Международном совещании по культивированию клеток животных и человека (Пущино, 1994); на Всероссийской научно-производственной конференции "Гигиена, ветсанитария и экология кивотноводства" (Чебоксары, 1994).

Публикация результатов исследований. По материалам исследований опубликовано девять работ.

Структура и объем работы. Диссертация изложена ка 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, предложений, списка литературы и приложения . Работа иллюстрирована 11 таблицами, S2 рисунками, в том числе SO маиро и микрофотографий. Список литературы представлен 176 наименованиями, из них 97 отечественных и 78 работ зарубежных авторов. В приложении представлены документы, подтверждающие результаты работы, ее научную и практическую ценность.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материал и методика

Материалом для заражения лабораторных животных слугшла куль-туральная жидкость различных пассажей от Сольных саыопогрызаниеы клеточных и диких соболей. В опытах использовали половозрелых золотистых хомяков Ufesocricetus auratus) двух-трехмэсячного возраста. Нявстннх предварительно осматривали на наличие поражений волосяного и кожного покровов и распределяли со принципу аналогов в опытные и контрольные группы. Хомяков заражали: интрацеребраль-но в дозе ОД мл, шгграперитонеально в дозе 0,3 ш и внугришаеч-

но а дозе 0,2 мл.

Контроляии служили группы хомяков, которым вводили раствор Ленкса, суспензий головного мозга и внутренних органов от -здоровых соболей. Наблюдение за подопытными кизотными вели до шести месяцев или до по явления типических признаков болезни. Содержание хошков было строго индивидуальное.

В работе были использованы: первичная культура метек почек золотистых хомяков (IDO; перевиваемые линии клеток почек новорожденных золотистых хомяков ЕЖ-21 (клон-13), клеток фиброблаетов эмбриона мыои (L), клеток зпидермальной карциномы шейки натки (fíela).

Хранили клеточные суспензии а медком азоте, используг методику Л. П. Дьяконова и др. (1977). Подсчет ¡слеток в полученной суспензии проводили по методике Г. Игарке (1970) в камере Горяе-ва.

Клетки культивировали в вида мочослоя а пробирках и на покровных стеклах во флаконах из-под пенициллина. Для культивирования использовалась среда, состоящая из 0,5% ГЛА в растворе Хенкса и среда Игла с 10Х-ной сывороткой крупного рогатого скота. К среде добавляли антибиотики - ICQ ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/нл стрептомицина. Концентрация первично-трипсинкзированных ¡«леток для посева составляла 650-670 тис. на 1 мл суспензии, переливаемых - 150-200 тыс. Пролиферативнув активность кпэток определяли по методике О. Г. Анджапаридзе и др. (1962).

Заражение первичной культуры клеток ГК и перевиваемой культуры клеток ВНК-21 проводили материалом от больных сашяогрызани-еы соболей, хошков и культуральной жидкостью различных пассажей. Для заражения культуры клеток фнбробластов эмбриона мыт (L) и клеток эпидерыальней карцнпош клетки натки (Иэ1а) исшихаоваяи 20Х-ную суспензию головного мозга и внутренних органов от больных сашпогрызанием соболей. Контролем служили невараженные культуры клеток ПХ, ВИС-21 „ I и Hela, куда были введены 20%-нда суспензии головного ¡.юз га и внутренних органов от интактных соболей.

Суспензии для заражения культур клеток готовили в соответствии о вирусологическими методиками А. К. ¡Цгбяадвэ, с. Я. Гай-дамоаича (1954); Ей Сатина и др.(1991).

Для искяшения бактериальной обсешненности каадув пробу

суспензии высевали нп ifflA, МПБ и среду Китт-Тароццн. Для проверь на грибковую контамшацив пробы суспензии высевали на среду (агар) Сабура Посевы на ША и ЫПВ выдерживали в течение 10 суток при 37'С, на полужидком агаре - 14 дней при 37"С. Контроль клеточных культур на содержание ыиколлазм проводили по методике Г. Р. •Михайловой и др. (1981). Б случае наличия одного из контаминантов суспензию браковали.

Титр вируса по цитопатическону действию определяли путем заражения клеточных культур 10-кратными разведениями исследуемого патогена Результаты учитывали по Риду и Менчу в модификации IL П. Ашмарина и др. (1363) и выракали в Щ5У50. Динамику накопления агента в культурах клеток изучали в клеточной фракции и в культу-ральной жидкости. Контролем служила незараженная культура клеток с питательной средой без сыворотки. В целях изучения влияния дозы, используемой для заражения культур клеток, на накопление патогена, а так же на время появления и характер дегенеративных изменений, использовали различную.множественность заражения.

Цитологические исследования интактных культур проводили через каждые 24 часа до их возрастной' дегенерации, а также одновременно с инфицированными клеточными культурами через 3, 6, 12, 24, 72 часа после введения цитолатогенного материала и далее один раз в сутки по общепринятой методике. Для этого в указанные сроют из пешшкллиновых флаконов извлекали покровные стекла с шнослоем, отмывали теплым раствором Хенкса и после фиксации окрашивали по соответствующим методикам.

Морфологическое изучение нормальных и инфицированных патоге-. ноы самопогрызamra клеточных культур проводили после окраски препаратов гематоксилин-эозином по Майеру (Р. И.Роскин, JL Б. Лэвинсон, 1957). Исследования проведены совместно с к. в. н., доцентом O.A. Приступа.

Для цитохимического изучения культур были использованы еле-дувдие методики: 1) на ДНК - по Фельгену (здесь и далее Э. Пирс, 1962); 2) на РНК - по Враше; 3) общая реакция на белки - по Ясукз и Итчикава; 4) на гликоген - по Шайадашу; Б) на липиды - по Бе-ренбауму; б) на сукцикатдегидрогеназу - по' Нахласу; 7) на цитох-ромоксидазу - по Муг; 8) на кислую фрсфатаау - по Гомори; 9) на щелочную фосфатаау - по Гомори.

При выявлении а клетках ДНК и РНК методом дгминесцентной микроскопии использовали окраску анилиновым о ранг/? в им по Брапо. Для определения митотического индекса проплаты фиксировали смесью Шабздава и окрашивали по методу Фольгена. При анализе патологических (Цорм митоаоп испольаовали классификацию И. А. Алова, (1965), модифицированную В. Н. Шишкиным и В. М. Ддановым (1970). Кариометрические исследования проводили по методике Я. К. Хесина (1967).

Интенсивность цитохимических показателей и степень отложения продукта реакции оценивали полуколичественно с помощью вычисления среднего гистохимического • коэффициента (СГК) по aAstaldi, L. Verga (1957).

При морфологическом и цитохимичесгеэм исследованиях старались весь материал одного опыта окрашивать одновременно. Препараты контрольных и зараженных культур таю® обрабатывали в одно и тоже время. На всс серию воздействовали одними и теми ,тя реактивами. По каждому варианту исследований было поставлено не менее трех серий опытов. Цифровой материал обрабатывали статистически с использованием критерия н уровня значимости Р (по Стъгаденту).

Для электронномикрсзкопического изучения корн большого мозга золотистых хомяков и культуры клеток ВНК-21 материал фиксировали 2%-ным раствором глютарового альдегида и 2%-ным раствором четырех окиси осмия на 0,1 и фосфатном буфере по методике V.Karlson, R. Shults (1965). Исследования проведены совместно с эав. лабораторией электронной микроскопии, к. б. н., доцентом Л R Гегтсес, Заливку проводили в араздит по Н. Haxley (1957) и К. Папе г t (ig58). Ультратонкие срезы готовили на ультратоме УМГП-4 и поел® двойного контрастирования ЗХ-ным водным раствором уранилацетата и цитратом свинца (J. Variable, R. Coggeslial 1, 1965) исследовали в электрону ном микроскопе ЭМБ - 100В.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Вирусологическое изучение агента самопогрызания, пассированного через различные биологические объекты

Один из существенных 1Чрятериев подтверлдения ' патологии -воспроизведение болезни. В данном случае оно необходимо для определения патогенности исследуемого агента.

В налих опытах материал, взятый от больных соболей и проведенный на культуре ПХ и ВНК-21, при заражении хомяков вызывал характерную клиническую картину заболевания. В первой группе хомяков, заратенпых суспензией культуры клеток ПХ, на протяжении всех пяти пассажей заболело 37% зверьков. Во второй группе хомяков, зараженных суспензией культуру ¡слеток ВНК-21 „ на протяиэнии всех пяти пассатей заболело 482 лабораторных животных.

Продолжительность инкубационного периода у хомяков, зараженных цитопатогенной суспензией культуры клеток ГОТ, колебалась от 47 до 72 дней, а у хомяков, зараженных культуральным материалом клеток Е'Ж-21 - от 42 до 59 дней. Пассажи материала на хомяках не способствовали значительному сокращению сроков наступления признаков болезни ( Р > 0,05 ).

У больны" хомяков наблюдали повышенную реакцию на яуи, в отдельные периоды - агрессивность. При осмотре обнаруживали взъеро-пэнный волосяной покров, сечение волоса, , гиперемию кожи, следы поиусов: ранки, коросточки, особенно в области спины, боках, корня хвоста. Поражения ком у зараженных хомяков и у больных само-погрызанием соболзй, от которых был взят материал для исследования, были идентичны.

При вскрытии больных хомяков на мездре шкурок наблюдали следы старых и евемх покусов, отмечали иньекцию росудов шаговых оболочек, гиперемию и слабый отек вещества головного мозга При бактериологическом исследовании патогенной микрофлоры не выделили. Контрольные хомяки в течение всего опыта развивались нормально, гибели не было. После убоя на шкурках как со сторона волоса, так и со стороны мездры изменений не отмечено.

Таким образом, введение хомякам материала от больных собо-

лей, пассированного через различные биологические системы (ПХ, ВНК-21), подтвердило патогенность исследуемого агента.

Материал от больных самопогрызанием соболей, инокулированный в культуру клеток ПХ и ЕНН-21, в двенадцати пассаиах вызывал стойкое ЦГЩ. Б культуре клеток ПХ дегенеративные изменения, приводящие к деструкции клеток, отмечали на 4-5 день со второго по пятый пассаг. и па 3-4 день в последующих пассажах. В культуре клеток ВНК-21 ловрездения клеток отмечали на 3-4 день в первых трех пассанах и на 2-3 день - в последующих.

Материал от больных самопогрыэаннем хошков, введенный в культуру клеток ПХ и ВНК-21, в двенадцати пассажах вызывал стойкое ЦГЩ. В культуре клеток ПХ дегенерация клеток проявлялась на Б-б день с первого по шестой пасса« и на -1-5 день в последующи: пассатах. В культуре клэгок ВНК-21 разрушение меток регистрировали на 4-5 день в первых пассажах к 3-4 - в последующих.

При наблюдении за инфицированными агентом самог.огрызакия клетгеамн L и Hela на протягкнии 12 дней п течении семи пассажей не отмечено явлений специфической дегенерации клеток. Видимо, эти культуры не чувствительны к изучаемому агенту.

Цитопатичеекое действие адаптированного к культуре ткани ПХ и ВНК-21 патогена характеризовалось появлением на поверхности но-нослоя набухших свегопремлсмляющнх ¡слеток. OSmjift рисунок монослоя нарушался, становился шнео четким, ¡иетии округлялись, их цитоплазма становилась зернистой, отмечаюсь пикноэ и фрагментация ядер. В течение двух-трех дней количество набухших клеток увеличивалось, они отделялись от стекла, разрезались и в шиослоз образовывались пустые "orara" различной величины. В контрольных культурах ПХ и ВНК-21 д&генэрация клеток отсутствовала.

Степень выраданносги цдаопатогешгого действия зависела от характера исследуемого материала. Четкую деструкцию клеток и большее количество совпадений -показателей. титров в клеточной культуре наблюдали при использовании кзолятов, прошедшяс несколько пассажей в культуре ткани. Последнее указывает на необходимость отбора исследуемых штерналов, вызывающих в чувствительных культурах наиболее выраженный цитопатнческий эффект.

Оптимальной теютературой культивирования агента самопогрыза-ния в культурах клеток ПХ и ВНК-21 определена t 37,5*С при рН«7,2

с множественностью заражения 2-5 ТЦД/50 на клетку для получения наивысшего инфекционного титра. Температура 35^и 42еС оказалась непермиссшшой для большинства исследованных изолятов.

При сопоставлении данных о динамике размножения и накопления вирусного агента в различных кульгуральных фракциях, сроках появления цитопатических изменений ь клеточных культурах установлено выделение его в наивысших титрах в культуральную среду на третий - четвертый день до значительного поражения клеточного слоя. Титр культурального агента с пассажами не увеличивался и составлял 3,87 - 4,12 lg ТЦЛ 50/мл, что подтверлздено в серии опытов. В культурах с выраженной дегенерацией клеток отмечалось снижение тигра патогена на 0,5 - 0,8 lg ТЦД 50/мл по сравнению с максимальным. При наибольшей множественности заражения ЦОД выявлялось через 48 часов с момента заражения, при наименьшей - через четыре дня. При этом титры инфекционного агента были ниже, чем после введения высоких доа. Однако максимальные титры цитопатогена в культуре достигались примерно в одинаковые сроки и выражались величиной одного порядка.

Проведенные исследования свидетельствуют о необходимости тщательного подбора оптимальных условий культивирования клеточных систем почек хомяка для получения цитопатогенных изолятов агента самопогрыэания с наивысшей ин$йкидонной активностью.

Морфологическая характеристика интактных культур теток почек хомя!са

tuicjeK¿DS&S&^

Культура клеток ПХ через двое суток'представляла собой отдельные островки клеток со значительными пустыми пространствами между ними. В это время в мелких зпителяолодобньн клетках с интенсивно окрашенной цитоплазмой встречались один-два митоза на 1000 неделящихся клеток. Но, ' в основном, деление было амитоги-ческим. Средние размеры ядер клеток колебались в довольно широких пределах. Различия между крайними величинами средних логарифмов-площади ядер клеток, выявленные в опытах N1 и'.ЙЗ (l,6405t0,00995 и 1, 7б97±0,0101Z), статиЬтиЧёски'достоверны (t-9,1; p^O.OOOl), что указывает на особеннос1*й! в функциональной активности клеток, полученных' в разных серйях опытов. ' Индекс пролиферации культуры

- и -

ПХ составлял 0,6-2,0.

Ife третьи-четвертые сутки культивирования монослой был почти сплошным и состоял из двух видов эпителиоподобных клеток крупных полиморфных, разросшихся без определенной системы, и более мелких, многоугольных. Митотическая активность исследуемой культуры варьировала от 10,12 до 15,72 Число аномальных митозов не превышало 2,14-4,32Z от числа делящихся клеток.

На пятые-шестые сутки элителиоподоблые клетки, активно размножаясь, образовывали сплошной пласт. В отдельных иэ них найдены от двух до пяти и более ядер. Начинался рост фибробластолодобных клеток, занявших оставшуюся свободную пловвдь. В этот период отмечена максимальная митотическая активность клеток, индекс которой достигал 18-20%, для эпителиоподобных клеток и 28-357.« - для фкбробластоподобиых. Среди делящихся клеток процент аберрантных митозов был равен 4,33-6,05. Основную часть патологических митозов составляли метафазы с рассеиванием, отставанием и неупорядоченным. расположением утолщенных хромосом. |.Ьксимальная функцио-пальная активность элементов культуры совпадала по времени с достижением ядрами клеток их максимальных размеров.

По данным опыта с третьих ло пятые сутки культивирования среднее геометрическое площади ядер эпителиоподобных клеток возросло на 45,97. (t-11,5; р<0,0001), в то вреда как тот яе показатель для фибробластсподобных клеток вырос лишь на 5,27. (t-1,75; р>0,05), т. е. увеличение статистически недостоверно. Следовательно, хотя средние данные на 200 ядер за это вреш увеличились на 23,9% (L-7.7; Р<0,0001), в основном возрастание их происходило за счет ядер эпителиоподобных клеток.

На восьмые-девятые .сутки фибробласты становились более массивными, интенсивно окрашивались. Митотическая активность клеток составлял^ 10,73-12,652«. Число патологических митозов не превышало 2,31% от числа делящихся клеток.

После образования на стекле сплошного слоя клеток оазмеры их ядер стабилизировались и средние логарифмы пломзди ядер в равных сериях опытов колебались в пределах 1,92-1,95. Среднее логарифмов плоаеди ядер клеток о пятых по одинкадиат!« сутки кулмчвнровсаш^ (на 1000 клеток) равнялось 1,352310,0044; среднее геометрическое* - 89,6

Йя 13-15-е сутки культивировали начиналась возрастная дегенерация культуры Фибробластоподобные глетки становились более мощшми, эпителиоподобныэ округлялись, выходили из пласта и погибали в результате пикноза или рексиса ядер. В сплошном клеточном пласте образовывались микро дефекты в форме своеобразных "окон".

Митотическая активность эпуггелиоподобных клеток падала до нуля, а среди фиброблаетоподоОных еще встречались три-четыре митоза на 1000 клеток. Во многих клетках, не имеюших грубых структурных изменений, ядра несколько уменьшились, что, по-видимому, отражало снижение интенсивности процессов синтеза в стареющм клетках и функциональное сморщивание их ядер. Б зависимости от соотношения числа крупных и мелких ядер средние логарифмы площади ядер стареющих культур колебались в разных сериях опытов от 1,8695±0,О1654 до 2,000510,2397 (1=4,5; р<0,0001).

Старение и гибель культура отмечали на 17-20-е сутки культивирования. К этому времени на стекле сохранялись лишь единичные интенсивно окрашенные гематоксилин-эозином клетки.

Для культуры ИХ характерна, начиная с ранних сроков культивирования, резко выраженная вакуолизация клеток. Светлые, округлые вакуоли располагались по всей цитоплазме чаще всего в фиброб-ластоподобных клетках и стареющей культуре.

Культура БНН-21 в первые сутки культивирования состояла из веретенообразных меток с про долго ватыми ядрами. Клетки соедини-, лиеь ыедду собой тонкими цитоплазматическими отростками. По мере формирования ¡щеточного пласта культура становилась более полиморфной, чаш,е встречались двухядерные и многоядерные клетки с неправильной конфигурацией, йорма ядер разнообразная - вытянуто-овальная, округлая. Встречались клетки с неправильно сегментированными ядрами.

Для клеток ВНК-21 хараетерна высокая функциональная активность, выраяащаяся быстрым формированием ионослоя на стекле. Де- ' ление клеток, в основном, амитотическое. Митотическая активность в начале развития составляла от 5,72 до 9,08ХС. Максимум митоти-ческой активности был зарегистрирован на третьи-четвертые сутки (15,13-25,24%«), минимум - на 13-15 сутки (1,02%„). На пятые-девятые сутки роста культуры митотическая активность клеток не превышала 11,63-17,25%с. Количество патологических митозов достигало

нзютиизльного уровня в клеточной популяции на третьи четвертое сутки в период формирования монослоя и составляло -1,24-7,307. от числа делящнсся клетогс.

В процессе культивирования ¡слеток Е1К-21 изменялись размеры их ядер. Уж? через 24 часа после посева клеток средние размеры ядер в трех сериях опытов колебались медду 1 ■ 7225+0,00334 и 1,9605Ю, 00953. С третьих по десятые сутки культивирования среднее логарифмов площади ядер клеток равнялось 1,903010,00396; среднее геометрическое -81,1м®. После 12-15 суток культивирования средние рог меры ядер клеток становились неустойчивыми.;

Таким образом, перевиваемая линия ¡слеток ВШ-21 отличается от первичной. культуры ПХ морфологлчес»сой и физиологической однородностью составлявших ее .клеточных элементов, обусловленной высокой степенью адаптации к условиям культивирования вне организма. Динамика изменений ¡теток а процессе культивирования от первых суток до начала дегенерации такте угадывает на наличие различий между первичными и перевиваемым;) кулмурами.

Цитохимическая характеристика иитактшд культур клеток почек: хаияка

Первичная культура клеток ПХ характеризовалась неоднород-ностьв ¡слеточного состава и различным содержанием в клетках ДНК, РНК, гликогена, белков » липндов. Эпителиоподобные ¡слетки содержали их значительно больше.

Перевиваемая линия клеток ВШ-21 была более однородной по морфологии и содержанию исследуемых веществ, Высокое их содержание характеризовало интенсивный уровень метаболизма культуры.

Культуры ПХ и ВПК-21 отличались не только количеством исследуемых веществ, но и их динамикой, которая находилась в полной соответствии с ростом и развитием клеток.

В первичной культуре ПХ синтез ДНК, РНК, белков, гликогена отставал на двое-трое суток от аналогичных процессов в ¡слетках перевиваемой линии ВНК-21. ' Одновременно с усилением гистохимических реакций начиналось усиление митотического размножения.

В перевиваемой культур»1 ВШ1-21 содержание ДНК, РНК, белков, гликогена интенсивно было выражено уда в первые сутки культивиро-

вания, достигая своего наивысшего уровня к третьим суткам параллельно с высокой мототической активностью культуры.

■В культуре ¡слеток ПХ с третьих по шестые сутки наблюдалось наибольшее накопление исследуемых ьеществ и самая высокая митоти-ческая атаивность, в то время как в ВНК-21 отмечалось снижение иитотической активности и уровня изучаемых веществ.

Обе категории культур отличались динамикой даровых веществ. В культуре ПХ образование жировых включений начиналось уж с первых суток культивирования и достигало наибольшей интенсивности в период стабилизации роста культуры. В культуре ВШ-21, напротив, с первых по третьи сутки, т. е. в период наибольшей метаболической активности, наблюдалось более низкое накопление жиров, , чем в последующие сроки культивирования.

Изучение РНК, ДНК, белков, гликогена, липидов в динамике развития культур показало значительное изменение содержания этих веществ в зависимости от физиологического состояния клеток и возраста культуры. Так, близкие к делению и делящиеся клетки на раннем этапе развития культур содержали больше исследуема веществ, чем клетки в интеркиневе.

В процессе роста культур изменялся характер отложения изучаемых веществ. В начале развития, особенно в лаг- и ранней логарифмической фазах наряду с зернистым выявлялось и гомогенное окрашивание РНК, белков, гликогена, что говорило о свободном, не связанном с другими веществами и структурами клеток их состоянии. Вскоре гомогенное окрашивание исчезало и указанные вещества выявлялись в клетках в зернистой, связанной форме. На поздних сроках культивирования наряду с зернистой формой наблюдалась диффузная, гомогенная окраска, характерная для гибнущих клеток. Появление большого количества лиогликогена в стареющих культурах говорило не только о нарушении комплекса гликогена с ¿ёлками клеточных структур, но и об угнетении способности клеток к утилизации отложившегося в ней гликогена

При изучении активности гидролитических ферментов были отмечены сравнительно высокая активность кислой фосфатазы и слабая реакция на щелочную фосфатээу. Активность сукцинатдегидрогеиазы была сравнительно высокой во всех клетках исследуемых культур.

Таким образом, цитохимически выявленные различия по содержа-

пип в клеточных культурах ПХ и ВНК-21 изучаемых ве^ств - дня, РНК, гликогена, белков, липидов, ферментов, обусловлены морфологической и физиологической характеристиками данных культур.

Морфологические изменения стльтур клеток почек хомяка, инфицированных агентом сашпогрызания

Нами было выделено 18 изолятов, прошедших по 12-14 пассажей на пермиссивних культурах клеток. Из них только восемь "закрепились" в пассажах и сохранили способность размножаться в системах клеток ПХ и ВНК-21 с проявлением четко выраленного цитопаткческо-го действия.

При сравнительном морфологическом исследовании реакции культур клеток различного происхождения на инокуляцию агента самопог-рызачия установлено, что патологические изменения в них протекали, в основном, по одному типу. Выявленные различия зависели от цитоморфолсгической дифферэнцирозкн культур.

В зараженных культурах ¡теток первые цигоморфэлогические изменения наблюдали через 15-18 часов после внесения аируссодорзка-щего материала. Инфицированные клетки ярче окрашивались. По периферии монослоя появлялись клетки с Т!03Ш131Ш0й рсфрактильностью цитоплазмы. В эпителиазНЗЬйГ' клетках отмечали набухание ядер. Сходные деструктивные процессы поз;© развивались и в фибробласто-подобных клетках.

К 33-43 часам после заражения клетки округлялись, между иш.:и появлялись пустоты, монослсй становился рыхли,1.- В ядрах происходило перераспределение хроматина вдоль ядерной, оболочки- к в виде. глыЭок, фрагментация ядршек. В центре кметак.. Сшш. видны плотные, резко оксифильиые, скруцлко сг.устн,, цитоплазмы, зернцстрсть.

К 72 часам отмечали, ¡увеличение кр.енсипиостл. {заэрядения, кк^г точного пласта, отчетливо проявлллдоь, дэгепрра'лганке изменения, клеток: пикноз, кариорексис, клаеыатоа, цвдоплзаш, отслоение 1слег ток с образованием, детрита. Были, выявлены, небольшие. сцмрласты, : постепенно уналичизаэдиеся: в. размерах, содер-

жащие от трех до десяти ядер.

Через 96 часов эпителноподобныэ клетки полностьв погибачл, среди фибробластоподобных клеток наблюдали округление и гглерхро-

иги'оз. На шести? сутки после инфицирования культур выявлялась почти полная деструкция ионослоя клеток и их дегенерация.

Кариоыетрическое изучение зараженных культур показало, что, несмотря на некоторые различия морфологической картины цитопати-ческого эффекта, Kaie в первичной, так и в перевиваемой культура* уЪ' в первые часы онига отмечалось увеличение размеров ядер на 17-40%. Причем в последующее часы укрупнения ядер не происходило. Так, средние размеры ядер культуры ПХ через четыре часа после за-ралдния возросли на 17,3%. При этом средние размеры ядер фиброб-ластоподобных глегок к этому сроку оказались увеличенными на 23%, а ядер эпителиоподобных клеток - лишь на 11,9X. В обоих случаях укрупнение ядер статистически достоверно (t«2,S7; р<0,005). Откачено более интенсивное увеличение размеров ядер фибробластоподоб-них клеток, хота морфологические их изменения обнаруживались несколько позже. В дальнейшем различия в реакции фибробластоло-добных и эпителиоподобных клеток сглаживались и к восьми часам опыта степень увеличения ядер клеток практически била одинакова: "2,2% для фибробластоподобных и 23,4£ для эпителиоподобных клеток. Средний показатель площади ядер инфицированной культуры ПХ к ..'тому времени отличался от показателя контрольной культуры на 22,8Х.

Кариометрическое изучение клеток ВПК-21 через четыре часа после заражения позволило обнаружить увеличение средних размеров ндер на 62,6%. Дальнейшего увеличения плошдди ядер не отмечали.

Заражение культур клеток вирусным патогеном привело к изменению их митотической активности и появлению патологических мито-. зов. Ыитотическая активность клеток ПХ через 24 часа после заражения была'равна 15,67%с, а интактннх -22,71%^ (р<0,01). Через 48 часов миготическая активность зараженной и контрольной культур (.•оставила 13.17&» и 18,0Q2C (р<0,01), а через 72 часа соответственно - 3,33£„ и 7,21%с (р<0,01). Спустя 96 часов клетки контрольной культуры продолжали делиться (3,97%с), а в зараженных встречались лишь единичные митозы - 0,70%<,(р<0,01), среди которых' наблюдалось до 2,00% патологических.

В культуре ВНК-21 через 24 часа после заражения наблюдалось статистически достоверное снижение митотической активности до 7,00%е против 32,Б0%с в контроле. Этот показатель к 48 часам

соответствовал 4,00Ха в сравнении с 24,00%«. В д.-1лысейЕ«м, по м»р<* развития цигопатических изменений, зараленпрн культура вообще не содержала делявдхся клеток.. Количество патологических митопов а клетках через 24 часа после инокуляции вирусного агента п 2,5 раза вьше, чем в контроле (р<0,01).

Аномальные митозы га культурах ПХ и ВПК-21 были представлены иетафазами с отставанием хромосом и многогругповыми к-метафазами с неупорядоченным расположением хромосом.

Таким образом, вирусный агент самопогрыаания вызывал изменения • . порагенных клеток, сопровождающиеся тбухпнием ядер с последующей фрагментацией, конденсацией и маргингщией хроматина, пикнозом, гиперхроматоаом и кариорекс'исом ядер. В цитоплазме 1<да-ток отмечали повышние розинофнлии цитоплазмы с последующим уменьшением ее количества, вакуолизацию, а такл? увеличение индекса патологических митозов по мере развития инфекции. Дегенерация клеток, деструкция клеточного монослоя с образованием детрита происходила через 24-96 часов после внесения исследуемых изолятов в культуру.

Цитохимические изменения культур клеток почек хомяка, инфицированных агентом самопогрызания

Цитопатогенный агент самопогрызания вызывал однотипные реакции клеток чувствительных к нему культур. Имелись различия лишь в сроках их проявления. Инфицирование культур вирусным патогеном ухе через четыре-восемь часов вызывало увеличение суммарных РНК и обкуэго белка в ядрах и ядрьшках, что совпадало по времени с увеличением их размеров. Затем интенсивная реакция равномерно распространялась на цитоплазму клеток, особенно ее перииуклеарную зону. Ряд исследователей (А. Г. 'Букринская, А. К. Гитедьмая, Г.К. Воркутова, 1964; Я Е. Лесин, 1967), говорят об аномальном неспе-цифтюском усилении синтеза нуклеиновых кислот, белков н углеводов в зараженных клетках на ранних стадиях вирусной инфекции.

Цитохимические исследования выявили увеличение содержания гликогена в значительной части клеток еще до появления морфологических изменений. Отмечалось образование диффузных скоплений лиол, гликогена, появление которого она валю возможным нарушением симп-1

- ш -

аскса когзду белком и гликогеном. Позже гликоген выявлялся преиму-ярстве.чно в гомогенной форме, что обычно имеет место в стареющих культурах.

По-видимому, этап накопления гликогена отражает елолиые процессы перестройки энергетического метаболизма клетки, а последующе уменьшение количества гликогена, которое по времени коррелирует с наступлением тнлалых цитопатологических нарушений, вероятно, объясняется нарушением синтеза гликогена или хз выходящим из под контроля усилением его расхода в ходе общей деструкции клетки.

При изучении изменений липидов в начальном периоде развития ЦГЩ выявлено незначительное их содержание преимущественно в пери-нуклеарной зоне ¡теток. По мере развития в культурах дегенеративных процессов количество липидов увеличивалось,

В инфицированных агентом самопогрызания клетках, морфологически еще не измененных, наблюдалось усиление активности щелочной фосфатааы. Активность этого фермента равномерно возрастала по всей цитоплазме, что совпадало по времени с периодом наиболее интенсивных цитохимических реакций на РНК и белкн. Значительная активность щелочной фосфатааы отмечена и в дегенерирующих клетках, что связано, вероятно, с повреждением клеточных структур.

При воздействии агента самопогрызания уже через шесть часов в ¡¡ультурах повышалась активность цитохромоксидаэы и сохранялась 'на значительном уровне в течение последующих сроков наблюдения.

В меточных культурах, зараженных агентом самопогрызания, по мере развития дегенеративных процессов, наблюдалась повышенная активность сукцинатдегидрогеназы (СД). Вероятно, это связано с усилением окислительно-восстановительного метаболизма пораженных ¡слеток. Аналогичные изменения активности мотохондриального фермента СД в процессе вирусного поражения клеток, связанные с патологической перестройкой митохондрий, отмечали Б. к Ерман (1969), Д.Е Голубев (1965,1979).

Таким образом, по изменению содержания изучаемых веществ в инфицированных агентом самопогрызания культурах, можно выделить два периода. Первый период характеризовался увеличением содержания РНК, суммарного белка э ядрах и ядрышках, которые при этом увеличены в размерах ещэ до появления ЦЦД. Во втором периоде ин-

тенсивность реакций на РНК, ДНК, белки, гликоген, еще более усилена, что совпадает по времени с дегенеративными процессами в клетках.

Электронношкроскопическое изучение заракзнной культуры клеток ВЕЖ-21 и ¡юры большого мозга золотистых хомяков

Основные деструктивные изменения выявлены во всех структурных элементах коры большого мозга подопытных гшвотных. Основу их составляли вакуолизация и литические процессы в перикарионах и тершналях нервных клеток. Характерен отек астроцитов, светлые бесструктурные отростки которых пронизывали нервную ткань. Как правило, на границах та-сзга астроцитов и их отростков происходил распад разграничивающих их мембран и прилегающих к ним стру1стур.

Указанные изменения слуднди причиной споягиозного состояния нервной ткани в очагах порамгния. Контрольные препараты кусочков коры большого мозга золотистых хомяков имели ультраструктуру характерную для нормальной ткани. Выраженный дистрофический характер изменений центральной нервной системы при сашпогрызашга идентичен изменениям отмечаемым при спонгкофоршых знцефзлопати-ях.

В ааранениой культуре ВНК-21 в цитоплазме клеток выявлены участки формирования вирусоподобных частиц размером около С5-С7 ям. В ядрах большинства ¡теток находили мелкозернистые компактные тела размером 0,1- 0,15 мш, слсшшэ стругагуры, вакуоли и скопления неоформленных осмиофилышх частиц размером 60-65 нм. Этиологическая роль выявленных вирусоподобных частиц требует дальней!®- ' го изучения. В контрольных культурах аналогичные изменения отсутствовали, все элементы клеток имели четко выраяенную без признаков патологии ультраструктуру.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЯ02ЕНИЯ

1. Нзши практичесгаге предложения вошли составной часгыз в "Рекомендации по диагностике и профилактике сам^по^рызаящ душных, зверей", утвержденные наулю-техническими .соЕеташ^, Оыдюга,, Оренбургского и Тюменского агропромов . и1( в „ мат^ри^^ы,, Омского ЩЭД^

- 20 -

"Опыт борьбы с самопогрызанием пушных зверей".

2. Материалы исследований исаольауклся в учебном процессе ряда кафедр Омского государственного ветеринарного института при чтении лекций по пегсистентным нейроинфекциям и заболеваниям пушных а верей.

ВЫВОДЫ

1. При введении золотистым хомякам материала от больных са-мзгюгрызашкм клеточных и диких соболей и материала, пассированного через различные биологические объекты, выявлены идентичные признаки заболевания у лабораторных животных, что является важным доказательством индукционной природы заболевания.

2. Культуры клеток ПХ и ВШ-21 являются чувствительными к агенту самопогрызания, что позволяет использовать их для выделения патогена иа исследуемого материала Установлена зависимость между интенсивностью цитопатического действия к инфекционным титром в культуральной жидкости зараженных агентом самопогрызания культурах клеток.

3. Исследования показали, что оптимальной температурой культивирования агента самопогрызания на клетках ПХ и ВНК-21 является 37,5*С , при рН=7,2 с множественностью заражения 2-5 ТЦД/50 на клетку, для получения наивысшего инфекционного титра При серийном пассировании титр агента не увеличивался и не превышал 3,86-4.121в ОД 50/мл.

4. После заражения клеток ПХ и ЕШ-21 патогеном самопогрыза- -ния первые признаки дегенерации наблвдалиеь с 3-5-го дня после заражения, в то время как цитоиорфологичеекими методами они выявлялись уже через 15-18 часов, т.е. этот метод дает возможность выявить изменения в инфицированных клетках в более ранние сроки.

б. Общей реакцией клеток ПХ и ЕНК-21 на воздействие агента самопогрызания явилось увеличение размеров ядер и ядрышек на 17-40% еще до наступления морфологических изменений, снижение ми-' тотической активности, увеличение индекса патологических митозов. Характерно появление мномэства вакуолиаированных клеток и клеток с окснфильной цитоплазмой, образованна плотных сгустков цитоплаз-кы в центре клетки.

6. Дитохимически изучена динамика нуклеинового, белкового, углеводного, липидного и ферментного обменов в клетках интактных и инфищровшшых культур почек хомяка. Показана связь содержания этих веществ с динамикой роста казвдой культуры и фиаиологическим ее состоянием.

7. Обшие цитохимические изменения при воздействии агента са-мопогрыэания выражались в увеличеиии содержания РНК, общего белка, гликогена, щелочной фосфатазы, сукцинатдегидрогеназы и цито-хромоксидааы еще до появления цитопатического действия. Большее усиление этих реакций совпадало по времени с дегенеративными процессами в клетках.

8. В основе ультраструктурных изменений ЦНС золотистых хомяков в клинической стадии самопогрызания лежат вакуолизация нейронов, отек астроцитарной глии и логические процессы, которые определяют спонгиоаное состояние нервной ткани. Характер и динамика поражений нервной ткани во многом идентичны изменениям отмечаем™ при персистентных нейроинфекциях.

СПИСОК РАБОТ, ОТРАЖАЮЩИХ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Беспалова Т. А. Цитохимическая характеристика первичной культуры клеток почек сирийского хоыячка//3пизоотология и шту-юпрофилактика болезней с. -х. хивотних /СО ВАОШГАЛ. -Новосибирск, 1983. -С89-94.

Z. Приступа О. А., Беспалова Т. А. Исслзщовпиаэ материала от экспериментально зарахенних саыовогршантм песцов на сирийских хомяках и в культуре клеток почек хошка//Эптоотология я иммунопрофилактика болезней с. -х. хнвотных/СО ВАСХ1ШЛ - НовоаI-бирск, 1983. -С. 94-98,

3. Приступа 0. А., Шртынив В. С>., Беспалова Т. А Саиовогрыза-лпэ ¡щеточных песпрв я лиенд //Актуальтгэ проблемы эптоогою-гнн/Твз. докл. Всесоюз. науч. юнф. по проблемам эпизоотологии. -Да ват, 1983. -С. 150. ' . \

4. Приступа О. А., Беспалова Т. А Диагностика самопогрызания песпрв я лисиц разных мутант них форы //Профилактика и диагностика болезтй хивотшх/СО ВАСХШЛ -Новосибирск, 1983. -С. 131-135.

5. Приступа О. А.. Беспалова Т. А Опьг борьбы с саювозрюа-

ниек] пушных а верей//ИнформационнШ листок N223-84/Ома кий ЦИТИ, 1984. - 4с,

6. Шртшюь В. Ф., Яда нова АС Я., Петрова JUL, Приступа О. А., Захаров И. Н., Ееспалова Т. А., Гехес Л В. Рекомендации по диагностике и п;офнла1Сгипэ самопогрызания пушных зверей / СО ВАСХПИЛ. h)Kk-HÖnp:'K, 1987. -24с.

7. Беспалова Т. А., Чартынов В. Ф. Цчтопатологическне изменения в клеточной культуре почек золотистого хомячка, инфицированной возбудителем сашпогрьззния //Профилактика инфекционных бо-л-.л/еГ/ с. -х. животных/СО ВАСХНИЛ -Новосибирск, 1988. -С. 101-103.

8. Беспа/юm Т. А., Приступа О. А. Цптоморфологтеское и цитохимическое научение культура клеток почки хомяка в норме и при югздчйотвии агента самопогрызания /л, ¡тье Всесоюа. совещние АН ('VP гю культивированию клеток животных и человека/Теа. аОкп. -Uicma, 1990. - С. 133-134.

9. Приступа O.A., Беспалова Т. А., Мартынов В.Ф., Сохно Э.11. ХуЛ-гыж вируса сашшгрьшния на культуру клеток почек золо-vitfio-M хомяка и организм хомяков //Бактериальные, вирусные и па-раачтарныё заболевай® с. -х. животных и птиц Сибири и Дальнего ВостокаАЖтуч. тр. Омск, 1992. -С. 44-48.

Подписано к печати ¡2. 08. 94. Формат 60*84. 1/16 Шч. л. 1,0. Тираж 100 экз. Зак. 239

ОГВИ, Омск - 7, Октябрьская, 92