Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Роль представителей семейства Enterobacteriaceae в этиологии желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят

НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

р г В &д •

гОМКЙОЗТ „апра,ахруттсу

САДОВСЫШЙ Владислав Ярославович

РОЛЬ ПРЕДСТАВНИКІВ РОДИНИ

Ектеїювастекіасеае

В ЕТІОЛОГІЇ ШЛУНКОВО-КИШКОВИХ ХВОРОБ НОВОНАРОДЖЕНИХ ТЕЛЯТ

16.00.03. — ветеринарна мікробіологія, вірусологія, епізоотологія, мікологія та імунологія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Київ - 1997

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в лабораторіях кафедри мікробіології та вірусології, кафедри епізоотології Національного аграрного університету.

Наукові керівники: доктор ветеринарних наук, професор БОРТНІЧУК Володимир Андронович, доктор ветеринарних наук, професор, академік АН ВШ України ЛИТВИН Володимир Петрович.

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук

ВОЛИНЕЦЬ Леонід Кузьмович, кандидат ветеринарних наук ПАВЛЕНКО Микола Степанович

Провідна організація: Білоцерківський державний аграрний університет

Захист дисертації відбудеться 28 травня 1997 року о 12 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 01.05.10 при Національному аграрному університеті за адресою:

м.Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, уч.корпус 3, ауд. 65.

Запрошуємо Вас взяти участь у обговоренні дисертації при її захисті, або надіслати відгук на автореферат у двох примірниках, завірених печаткою, за адресою:

252041, м. Київ - 41, вул. Героїв Оборони, 15, НАУ, сектор захисту дисертацій.

З дисертацією можна ознайомитись. у бібліотеці Національного аграрного університету.

Автореферат розіслано " кі'&і 1997 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої рада, доктор ветеринарних наук,

професор / В.А.Бортнічук

І. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Серед захворювань, які мають значне поширення в тваринницьких господарствах України, одне з перших місць займають шлунково-кишкові хвороби новонароджених телят. Не дивлячись на те, що ветеринарна наука і практика має відчуті здобутки щодо їх вивчення, природа хвороб до кінця залишається не з'ясованою. Встановлено, що розлади функції кишечника у телят, як правило, виникають на фоні різних ветеринарно-санітарних порушень при утриманні, годівлі корів та догляді за новонародженими в перші дні житія.

В тваринницьких господарствах широко циркулюють ентеропатогенні віруси: рота-, корона-, астро-, каліці-, енгеровіруси, а також значна кількість бактерій, деяких грибів, найпростіших, які складають так звану умовно-патогенну мікрофлору. Остання обумовлює порушення функції шлунково-кишкового тракту у тварин зі зниженою резистентністю організму (Л.К.Волинець, 1979, 1994; В.Г.Скибіцький, 1994; А.Я.Пустовар і співавт., 1995; В.А.Ушкалов, 1995; П.П.Фукс, 1997; L.Pivnik, 1987). В цьому процесі майже не з'ясованою залишається роль представників родини Enterobacteriaceae, зокрема, із родів Klebsiella, Yersinia, Proteus, Citrobacter, Hafhia і деяких інших.

Як правило, шлунково-кишкові захворювання телят супроводжуються дас-бактеріозами, але стосовно до кількісних і якісних змін мікрофлори це явище вивчене поверхнею. З метою вирівнювання дисбіотичного стану і нормалізації мікробіоценозу кишечника застосовують антибіотики, які у більшості випадків не тільки не покращують, а навіть погіршують ситуацію. Використання препа-ратів-ангагонісгів переслідує мету витіснити анормальну мікрофлору кишечника

і стабілізувати її видовий склад, що також не завади дає бажаний ефект. Виникає необхідність пошуку нових, нетрадиційних прийомів і засобів, використання яких дало б змогу створювати нормальний мікробіоценоз кишечника вже з перших годин жгатя новонароджених тварин і тим самим попереджати виникнення шлунково-кишкових захворювань.

Значний внесок в розшифрування етіології шлунково-кишкових захворювань телят зробили вчені Г.Ф.Бовкун, Л.К.Волинець, В.ІЛевченко, АЛ.Завірюха,

В.П.Онуфрієв, В.М.Апатенко, В.Г.Скибіцький, В.ПЛитвин, П.П.Фукс, А.М.Го-ловко, В.М.Ушкалов, ЄХ.Павлов, Г.В.Гнатенко, В.Г.Зароза, Р.В.Епштейн-Лиг-вак, ФЛ.Вильшанская.

З

Мета і завдання досліджень. Вивчити роль деяких представників родини Enterobacteriaceae в етіології шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят та розробити препарат із представників облітаної мікрофлори кишечника для профілактики розладів його функції в перші дні житія тварин. Для виконання цієї мети були поставлені слідуючі завдання:

1. Вивчити епізоотологічну ситуацію відносно шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят в раді господарств України та з'ясувати роль представників родини Enterobacteriaceae в їх етіології.

2. Провести кількісні та якісні дослідження з визначенням роду і виду виділених з шлунково-кишкового тракту телят мікроорганізмів.

3. Дослідити основні біологічні властивості виділених нами представників родини Enterobacteriaceae, та встановити у них наявність факторів патогенності.

4. Визначити титри антитіл у сироватці крові корів та телят по відношенню до виділених ентеробакгерій та наявність антигену ротавіруса у фекаліях новонароджених теяят.

5. Розробити бактеріальний препарат дія нормалізації мікробіоценозу шлунково-кишкового тракту телят в перші годиш їх життя.

6. Визначити економічну ефективність застосування препаратів-про-біотиків,

Наукова новизна. Встановлено, що представники родини Enterobacteriaceae із родів Klebsiella, Yersinia, Proteus, Escherichia з адгезивними К -антигенами мають безпосередній зв'язок з етіологією шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят. Підтверджено поліетіологічний характер цих хвороб завдяки участі в їх розвитку також деяких вірусів, особливо рота-, і коронавірусів. Вивчені морфологічні, іінісгоріальні, культуральні та біохімічні властивості деяких представників родів ентеробакгерій. Охарактеризована динаміка зміни мікрофлори шлунково-кишкового тракіу телят в процесі розвитку дисбактеріозу.

Практична цінність робот Розроблено препарат-пробіотик "Бакхонорм" із представників облігатної мікрофлори для створення нормального мікробіоценозу кишечника новонароджених телят з метою профілактики шлунково-кишкових захворювань і дисбакгеріозів. Запропоновано сумарний (кумулятивний) метод визначення чутливості бактерій до антибіотиків, використання якого особливо доцільне при поліетіалогічних захворюваннях (Посвідчення про

раціоналізаторську пропозицію № 56,від 1.12.1996 р.).

Апробація роботи. Основні положення дисертаційної робити обговорені з позтивною оцінкою на науково-практичних конференціях професорсько-викладацького складу та аспірантів факультету ветеринарної медицини Національного аграрного університету в 1995, 1996, 1997 роках.

Публікація результатів досліджень. Опубліковано 5 робіт, в яких висвітлюються основні положення дисертації.

Впровадження результатів дослідження. Отримані особисто пошукачем дані використані при складанні інформаційного листка, випущеного Хмельницьким центром науково-технічної та економічної інформації, в якому даються рекомендації щодо практичного використання препарату "Бактонорм" та модифікованого методу визначення чутливості бактерій до антибіотиків.

Структура та обсяг дисертації. Дисертаційна робота представлена у вигляді традиційного рукопису і складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методик власних досліджень, їх результатів, обговорення, а також висновків, списку літератури та додатків. Праця має ІЗЗ сторінок, 13 таблиць, 15' малюнків.

Особистий внесок дисертанта. Під час проведення науково-дослідних робіт особисто дисертантом виконані клінічні, бактеріологічні, серологічні дослідження, проведені епізоотологічні обстеження дослідних господарств, проведені дослідження на лабораторних тваринах і телятах, проаналізовано літературних джерел по темі дисертації.

Основні положення, які виносяться на захисп

1. Теоретичне і практичне обгрунтування ролі окремих представників родини ЕпіегоЬааегіасеае в етіології шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят.

2. Біологічні маститості деяких видів бактерій родини ЕтегоЬасіегіасае.

3. Забезпечення нормального мікробіоценозу кишечника у новонароджених телят за рахунок профілактичного пробіотика "бактонорм".

2. ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

2.1. Матеріали і метода досліджень. Робота виконувалась на протязі 1993 -1996 років в умовах лабораторій кафедри мікробіології та вірусології, кафедри

епізоотології Національного аїрарного університету.

В процесі виконання наукових досліджень було використано 92 телят, проведеш клініко-епізоотологічнс дослідження 2085 голів тварин, бактеріологічно досліджено 187 проб вмісту кишечника телят, виділено всього 105 штамів бактерій, з яких до родини Enterobacteriaceae віднесено 76 штамів. При визначенні патогенності окремих ентеробакгерій для лабораторних тварин використано 136 білих мишей та 20 мишей ліній F3H, F57. Для вивчення морфологічних, культуральних та біохімічних властивостей виділених бактерій використали 3450 пробірок і чашок з простими та диференційно-диагностичними середовищами, виготовлено 280 мазків.

Клініхо-епізоотологічні дослідження та відбір матеріалу проводились на базі селянської спілки (с.с.) "Дністер" Тисменецького району Івано-Франківської області та колективного селянського підприємства (к.с.п.) "Селищанське" Ба-ришівськош району Київської області. Дані господарства відрізнялись за епізоотологічною ситуацією по шлунково-кишкових хворобах новонароджених телят. Безпосередньо в умовах ферм проводили клінічний огляд, дослідження хворих та умовоно-здорових новонароджених телят, вивчали умови утримання, годівлі, санітарний стан, проводили лікувальні та профілактичні обробки молодняка великої рогатої худоби і визначали їх ефективність.

Об'єктом дослідження були новонароджені телята хворі з ознаками діареї та умовно-здорові (без видимих клінічних ознак хвороби). Дослідні групи формували за принципом аналога враховуючи вік тварин та клінічні показники.

В бактеріологічних дослідженнях використовували триптозо-соєвий агар (TSA), дезоксирибонукленїновий агар (ДНК -агар) бакгоагар (ВА) виробництва Difeo, триптозо-соєвий бульйон (TSB), середовище Левіна виробництва Oxoid, Евдо та MPC.

З метою уточнення етіології шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят нами проведені кількісні та якісні дослідження фекальних проб хворих та клінічно здорових новонароджених телят. Матеріал від хворих тварин відбирали у с.с. "Дністер", від клінічно здорових к.с.п. "Селищанське", в яких по мірі народження були сформовані по одній групі телят кількістю п’ять голів в кожній. Проби фекалій відбирали через 18 - 20 шд. після народження, та через 24 год. в наступні дні до 5 денного віку телят. Кількісні дослідження бактерій

проводили чашковим метолом шляхом серійних розведень матеріалу до величини 10'11 та посіву на середовища TSA, Левіна, Евдо з наступним культивуванням в аеробних умовах при 37 °С протягом 24-36 год. Для збереження кількісного та якісного складу ентеробактерій матеріал консервували фосфатно-буферним розчином з величиною pH 8.0 (В.И.Покровский, 1985) та доставляли в лабораторію НАУ у термосі з льодом. З метою збереження кількісного та якісного складу лак-тофлори у матеріалі, відібраному від хворих телят, посіви проводили не пізніше

4 год. в умовах Тисменицької районної лабораторії ветеринарної медицини, використовуючи при цьому селективне для даної ірупи мікроорганізмів середовище MPC. Кількість мікроорганізмів перераховувати на 1 г. вмістимого кишечника.

Визначення видового складу мікрофлори фекалій здійснювали на підставі культуральних, морфологічних, тінхторіальних та біохімічних ознак, використовуючи визначник Бергі (Bergeÿs Manual, 1986). Біохімічні властивості бактерій, які мають вирішальне значення при визначенні виду, вивчали за допомогою набору спеціальних диференційно-діагносшчних середовищ типу кольорового ряду, систем індикаторних паперових типу СИБ - №2 "Б", мультімікротест систем ММТ Е - 1. Значну юлькість мікробних культур ідентифікувати за допомогою автоматизованої мікробіологічної системи "Avantage" у лабораторії мікробіології і вірусології НДІ урології та нефрології АМН України під керівництвом професора А.В.Руденко, за що вислоатюємо їй сердечну подяку.

Приклад ідентифікації одного із штамів ентеробактерій на мікробіологічній системі "Avantage"

Specimen ID: 6-1 ENTERICS-NONFERMENTERS 3,0

Report Time : 4:06 pm 16-Jan-9 6 Test Time: 4:36

GLU LYS ORN CIT MAL ESC URE ADO ARA INO

+ + + — — + — + —

MAN RHA SOR sue XYL ARG IND ACE PLB OXI

+ — ■ 4" — -L + * *

ORGANISM IDENTIFICATION LIKELIHOOD___________

HAFNIA ALVEI 81.41 % PSEUDOMONAS CEPACIA 7.50 % SALMONELLA ARIZONAE 3.29 % CITROBACTER FREUNDII 3.15 % ENTEROBACTER CLOACAE - UREA POSITIVE 1.82 %

'Чутливість виділених культур до антибіотиків визначали загальновизнаним методом дифузії антибіотиків в агар з використанням стандартних паперових дисків з антибіотиками вітчизняного та зарубіжного виробництва.

Фактори патогенності у видалених мікроорганізмів родини ЕглегоЬас-егіасеае вивчали: за ДНК -азною, лецитиназною, гемолітичною активністю, а також за наявністю фімбрилярних К -адгезинів (для Е.со1і) та патогенностю для білих мишей.

ДНК -азну, лецитиназну, гемолітичну активність визначати чашковим методом шляхом посіву досліджуваних культур на тест середовища та культивування при 37 °С протягам 24 год. При визначенні ДНК -азноГ активності використали ДНК -азо агар (виробництва Шсо). Після культивування чашку з досліджуваними культурами заливали 0,1 нормальним розчином соляної кислоти. Довкола культур, які володіти ДНК -азною активністю, утворювалась зона деполімеризації. Лецитиназну активність вивчали на середовищі для визначення лецитинази (Ь-Б.МсСІиіщ, Т.ТоаЬе., 1974). Довкола культур, які володіли ензимом лецитиназою, утворювалась зона опадесценсії. Гемолітичну активність визначали на 5 % кров'яному агарі з урахуванням зони гемолізу навколо досліджуваних культур.

Наявність фімбрилярних К -адгезинів (для Е.соїі) визначали шляхом постановки крапельної реакції аглютинації на предметному склі з використанням набору сироваток ешерихіозних адгезивних аглютинуючих.

Патогенність виділених ентеробактерій визначали шляхом зараження білих мишей в черевну порожнину добовими культурами в дозі 0.5 — 1 млрд. м.к.

Визначення титру аглютинінів по відношенню до виділених ентеробактерій у сироватці крові корів та телят проводили у пробірковій реакції аглютинації з використанням одноразових мікропланшетів для серологічних реакцій.

Вірусологічні дослідження по виявленню ротавірусного антигена у фекаліях хворих та клінічно-здорових телят проводились на базі науково-дослідної вірусологічної лабораторії НАУ старшим науковим співробітником С.В.Міське-вичем за нашою участю шляхом постановки реакції довготривалого зв'язування комплементу згідно методики В.П.Онуфрієва і співавг (1990).

На основі проведених досліджень із представників різних вадів бактерій нами сконструйовано препарат "бактонорм", до складу якого ввійшли деякі

представники родини ЕшегоЬайепасеае без факторів патогенності та біфідобактерії. Нешкідливість препарату для новонароджених телят перевіряли на мишах ліній РЗН Р57, шляхом їх зараження в порожнину очеревини нативною формою препарату.

Профілактичну дію препарату, а також пробіотиків, вигото&лених на основі штамів Вас.аіМіїіз, Моноспорикну-ПК та Зооспорину, проводили в умовах с.с."Дністер'' на 5 -ти групах телят.

Тваринам перших двох груп кількістю по 4 гол. випоювали пробіотики до даванки молозива в дозах: моноспорин-ПК — 5 мл. (15 млрд. м.к.), зооспорин —

2 мл. (6 млрд. м.к.) через 1 — 1,5 год. після народження один раз на добу протягом трьох діб. Препарат "Бактонорм", задавали новонародженим телятам (група 20 гал.) один раз до даванки молозива в дозі 10 мл. (15 млрд. м.к.) мікроорганізмів через 1 — 1,5 год після народження. Тварини п’ятої групи кількістю 5 гол. служили контролем.

Лікувальну дію препаралів-пробіотаків моноспорину-ПК та зооспорину, визначали у тому ж господарстві на двох групах телят по 9 гол. у кожній. Препарати застосовували у подвійних профілактичних дозах один раз на добу протягом трьох діб. У тяжких випадках препарати-пробіотики випоювали двічі на добу у подвійних лікувальних дозах до зникнення клінічних ознак хвороби.

Статистичну обробку даних проводили на ПК ІВМ 586 з використанням відповідної прикладної програми.

2.2. РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

2.2.1. Елізоотологічна сіпуація по захворюваності новонароджених телят в ряді областей України та базових господарствах.

Серед хвороб молодняка сільськогосподарських тварин, особливо новонароджених, переважну більшість складають гострі захворювання шлунково-кишкового тракту. За даними Державного департаменту ветеринарної медицини Міністерства сільського господарства і продовольства України у 1994 році захворіло всього 7 816 400 телят, у яких шлунково-кишкові розлади реєстрували у —

4 415 200 тварин або 56 % поголів'я. Загинуло 475 000 телят, або 9,1 % новонароджених. В останні роки спостерігається тенденція до збільшення числа зах-ворівших і загинувших телят.

Серед інфекційних хвороб найчастіше діагнозують колібактеріоз та сальмонельоз тварин. За 1996 рік в Україні зареєстровано 118 неблагополучиях щодо ешерихіозу пунктів, де захворіло 1494 телят, з них 494 тварини загинуло, або 33,6 %. Лише за січень 1997 року захворіло 134 телят, затнуло 47, (показник летальності 35 %. Статистичні дані засвідчують, що найбільша кількість неблагополуч-ких пунктів та захворівших на колібактеріоз телят зареєстровано в Харківській, Одеській, Миколаєвській та Київській областях.

Власні дослідження нами спрямовувались переважно на виявлення природи масових шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят і, зокрема, участі в етіології цих хвороб представників родини ЕтегоЬааегіасеае. Для вирішення поставлених завдань експериментальні дослідження проводились на базі к. с. п. "Селищанське" Баришівського р-ну Київської обл., та с. с. "Дністер" Тисменицького р-ну Івано-Франківської обл., які за багатьма характеристиками істотно відрізнялись між собою, а це, в свою чергу, помітно вплинуло на проявлення шлунково-кишкових хвороб у новонароджених телят. Епізоотологічні обстеження господарств проводились на протязі 1993 - 1996 років посезонно та у випадку спалахуй захворювань.

К.с.п. "Селищанське" за епізоотичною ситуацією по захворюванню молодняка віднесено до умовно здорових господарств. Захворюваність телят з ознаками діареї у ньому протягом року склала 10 % від числа народжених, а летальність 8 % від числа захворівших. Характерно, що перші клінічні ознаки хвороби у телят проявляються у віці 6 — 8 діб. Поряд з гемолітичними штамами ешерихій виділені криптоспориоії (дослідження проведені разом з аспірантом Карпуленко

С.В.).

У господарстві "Дністер" телята з ознаками діареї хворіли з перших днів після народження. Захворювання носило масовий характер в зимово-сгійловий період, характеризувалось ензоотичністю, перебігало в гострій формі і охоплювало 98 % новонароджених телят. Лише влітку цей показник знижувався до 45 %.

Клінічні симптоми хвороби властиві для колібактеріозу; тривала діарея, загальне пригнічення, слабкість скелетних м'язів, ослаблення серцевої діяльності, короткочасне підвищення температури тіла до 40 °С, а через 1-2 доби — зниження до 35 — 36 °С, Діарея сприяла зіущенню крові, втраті елекіролігів, що призводило до парезів і паралічів кінцівок із значною летальністю (30% і більше).

Сприятливими умовами прояву ензоотії ешерихіозу в господарстві були порушення умов утримання і годівлі як корів і нетелів,так і новонароджених телят, відсутнє родильне відділення, скупченість тварин різних вікових груп в одному приміщенні, в 3 — 5 разів підвищення в повітрі аміаку та контамінація повітря мікроорганізмами, відсутність належної дезинфекції, дезінсекції, дератизації та низький імунологічний статус телят.

Аналіз епізоотологічних даних засвідчує, що захворювання шлунково-кишкового тракту у телят створюють важливу проблему в тваринництві України, оскільки завдають йому значних економічних збитків через загибель, зниження продуктивності у хворих і перехворівших тварин, витрат на лікування та профілактичні заходи.

2.2.2.Внвчення кількісного і якісного складу бактерій у фекаліях хворих та здорових телят.

В результаті досліджень встаноатено, що на першу добу у фекаліях хворих та здорових телят загальна чисельність мікроорганізмів була в однакових межах, що зображено на графіку (мал. 1). Кількість молочнокислих та пропіоновокислих бактерій у хворих телят була дещо менша в порівнянні з результатами, отриманими Р.М.Шевчуком (1996) від здорових телят, (табл. 1). В наступні дні у хворих телят кількість мікроорганізмів наростає, а чисельність лак-тобактерій мала тенденцію до зниження, тоді як у здорових спостерігалось їх наростання.

Порівняння даних графіку та таблиці 1 свідчить про те, що, починаючи з другої доби життя, в кишечнику хворих телят порівняно стрімко збільшується загальна чисельність мікроорганізмів, тоді як кількість молочнокислих і пропіоновокислих бактерій з цього періоду зменшується, що має прямий зв'язок з появою перших клінічних ознак хвороби. Летальний кінець у хворих телят наставав на 4 — 5 -ту добу; при цьому загальна кількість мікроорганізмів збільшувалась порівняно з початком хвороби більше ніж у 4 рази з одночасним зменшенням молочно- і пропіоновокислих бактерій більше ніж удвічі. Ці дані свідчать про прояв дисбактеріозу.

» 18000 §16000 .§>.14000 12000 10000

О

s 8000

ja

н

о

V

шО

с;

6000 4000 2000

0 1 2 3 4

Вік телят (доби)

Мал. 1. Динаміка зміни загальної кількості мікроорганізмів у здорових телят та тварин з розладами функції кишечника. Розведення матеріалу 10 'п.

Таблиця 1.

Показі піки чисельності молочнокислої мікрофлори в фекаліях

Хворі телята Здорові телята

Вік телят Молочнокислі бактерії Пропіоново-кислі бактерії Молочнокислі бактерії Пропіоново-кислі бактерії

1 доба 2 доба 3 доба 4 доба 5 доба 6,31±0,3 6,12±0,1 6,83±0,4 5,24±0,3 5,38±0,3 6,27 ±0,1 6,91±0,2 5,28±0,2 5,78±0,1 4,32+0,4 7,63+0,1 * 8,79±0,3 * 9,8710,4 8,39+0,3 * 8,50±0,4 * 8,68±0,1

Умовні позначення: * — дослідження не проводились.

2,2.3. Біологічні властивості енгеробакгерій, швділегагс від телят.

Із вмісту кишечника телят виділено нами 10 родів бактерій із родини Enterobacteriaceae, а саме: Escherichia, Klebsiella, Citrobacter, Proteus, Shigella, Yersinia, Hafrua, Serratia, Enterobacter, Edwardsiella, які за більшістю показників характеризувались як типові ентеробакгерії. За морфологією це — грамнегативні рухливі палички величиною 1 - 3 х 0,4 - 0,8 мкм., які не утворюють спор і капсул, добре ростуть на звичайних поживних середовищах з величиною pH 7,2 -7,5 при оптимальній температурі 37 °С, факультативні анаероби, в мазках розміщуються поодиноко, невеликими скупченнями, або короткими ланцюжка-

ми. Клебсіели, як виняток, утворюють капсулу, яка втрачається в лабораторних умовах, але відновлюється при пасажах через організм білих мишей.

На звичайних щільних середовищах енгтеробактерії утворюють колонії S -типу, величина яких коливалась від 0,5 мм. у роду Serratia до 4 - 5 мм. у клебсіел. У більшості представників родини діаметр колоній складав 2-3 мм. вони мали сірувато-білий колір, інколи — з ніжним блакитним відтінком. Представники роду Proteus, як правило, були схильні до роїння і на поверхні середовища утворювали вуаль.

В рідких середовищах типу трептозо-соєвого бульйону у більшості випадків спостерігалось рівномірне середнього ступеня помутніння з випадінням невеликого осаду, який при струшуванні розбивався у рівномірну суспензію. У представників родів Yersinia осад розпадався на пластівці, у Proteus і Serratia — звертався у косу, у Echvardsiella — розбивався на ниткоподібні структури. Пристінкове кільце утворювали представники із родів Hafnia, Proteus, Yersinia, а поверхневу плівку — Shigella, Citrobacter, Enterobacter.

Біохімічні властивості виділених нами ентеробактерій показані в таблиці 2.

Таблиця 2.

Біохімічні властивості бактерій родини Enterobacteriacae.____________

Тест або субстрат Види мікроорганізмів

Esche- rieht» сої» Shigella Citrobacter Klebsiella Entero bacter aero« qenes -Ha<- nia alvei Serra- tia odari ІЄГ9 Proteus Yersi- nia entero colitic« Ed- ward- iiella tarda

disen- terias sonne freun- dü dtver sus pneu- moniae 02M- iue vulga- ris mira- bilis

[Цктрат Симонса — — — + + + — + + + — — — —

Уреаза ± — — + + + + — ± ± + + + —

ІМалонат натрію — — — — + + — ± ± ± — — —. —

(Сірководень — — — + — — — — — — + + — +

¡Ацетат натрію ± — — + — + + + ± ± — — — —

[Рухливість + — — + + — — + + + + + — +

1 індол ± ± — — + — — — — + — — +

Лізиндекарбоксклаза ± — — — -f- + + ± + — — — +

Реакція з метиленовим черв. + + + + + + — + + + + 4- +

Реакція Фогеса-Проскауера — — — + — + ± ± — — — —

Орнгтикдекарбоюкчзза — + — — — — + + + +

1 Фенілаланждез г міназа — — — — «_ — — _ — + — —

ІАрзбіноза — + 4* + ± + + -fr — — — ±

¡Глюкоза (газ) + + + + + + + •fr + + ± — -f-

Інозит ± — — — ~ + -t + — — — — ± ~ і

¡Лактоза + — + + + + -f + ± ± — — ± —

ІМанґг + — — — + + ± + j. ± — — ± —

1 Мальтоза + + + + -f + + + ± ± + — + +

Сахароза ± — — 4" — + + + ± ± + — —

Сорбіт ± — — + — ± ± +■ — — — — + —

В-галактозидаза + “ — 4- + H H — ± H H H + ±

Умовні позначення + - позитивний результат реакції ± - різні результати реакції;

— • негативиий результат реаіщіі н • дослідження не проводились.

Встановлено, що від хворих та здорових телят регулярно виділяються енте-робактерії різних родів, однак їх частота коливалася в залежності від фізіологічного стану тварин (табл. 3).

Таблиця 3.

Проценте співвідношення різних родів ентеробактерій

Назва роду бактерій Фізіологічний стан тварин

Хворі % Умовно здорові %

Escherichia з К-актигеном 33 13

Escherichia без К-антигену 12 46

Klebsiella 16,5 2

Citrobacter 12,5 8

Proteus 9 4

Shigella 6 12

Yersinia 4 не виділялось

Hafnia 1 5,5

Seratia 4,5 не виділялось

Enterobacter 0,5 9,5

Edwardsielia 1 не виділялось

2.2.4. Визначення факторів патогенності у ентеробактерій.

У зв'язку з тим, що від хворих та умовно здорових телят виділялися практично одні і ті ж ентеробактерії, необхідно було визначити їх причетність до етіології шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят.

Відомо, що хвороботворні бактерії володіють факторами патогенності, в той час як у представників нормальної мікрофлори вони відсутні. З відомих тестів визначення патогенності ми вибрали такі показники як ДНК -азна, леци-тиназна, гемолітична активність, патогенність для білих мишей та наявність адге-зивних К -антигенів для ешерихій. Результати досліджень засвідчили, що згадані вище фактори патогенності виявлені у представників окремих родів у різних поєднаннях (табл. 4). Із 22 штамів виділених нами ешерихій виявлено 8 штамів бактерій, які володіти такими К -адгезивними антигенами: К -99; F -41; Att -25; К -88ab; К -88ас, причому у окремих із них встановлено наявність двох К -антигенів одночасно (наприклад К - 88 ab і F - 41).

Серед всіх представників ентеробактерій найбільш патогенними виявились Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae, які володіли трьома факторами патогенності і Escherichia coll. У останньої, окрім фімбрилярних К - адгезинів, були ще й

три інших фактори патогенності. У решти представників родини (роди Citrobacter, Hafhia) виявлені 1 — 2 фактори патогенності, на підставі чого їх можна віднести до умовно-патогенних мікроорганізмів з низькою вірулентністю. Одночасно представники родів Serratia, Edwardsiella, Enterobacter, Escherichia без K - адге-зинів, у яких не виявлено жодного із названих факторів патогенності, можуть бути віднесені до представників нормальної мікрофлори кишечника.

Таблиця 4.

Наявність факторів патогенності у ентеробактерій.____________

Назва виду бактерій Наявність'факторів патогенності

ДНК -азна активність Лецитиназна активність Гемолітична активність Патогенність для білих мишей

Escherichia coli

з К антигеном — + ~r -г

Escherichia coli

без К антигену — — — —

Klebsiella pneumoniae -r + — -г

Klebsiella ozaenae — — +

Citrobacter freundii — — +

Citrobacter diversus — — + —

Proteus vulgaris — — *f -f

Proteus mirabilis — -г + +

Shigella sonnei — — + —

Shigella disenteriae + — —- _

Yersinia enterocolitica — + —

Hafnia alvei — + —

Seratia odorífera — — —

Enterobacter aerogenes — — —

Edwardsiella tarda — — — —

2.2.5. Визначення тіару аглютинінів до ентеробактерій в сироватці крові корів та гагат. Виявлення ротавірусного антигену.

Дослідженням цього напрямку передбачалось показати динаміку приросту антитіл до ентеробакгрерій, керуючись тим положенням, що по відношенню до патогенних бактерій організм тварин значно інтенсивніше утворює антитіла порівняно з представниками нормальної мікрофлори. Для вирішення цього завдання як тест вибрали класичний варіант реакції аглютинації (РА), яку ставили у мікропланш етах.

В сироватці крові корів та телят аглютиніни виявили по відношенню до всіх видів ентеробактерій, що вивчались нами. Проте динаміка прирослу антитіл

і висота їх титрів відчутно коливались. По відношенню до ентеробакгерій (Е.со1і

з К -антигеном, Proteus mirabilis, Klebsiella pneumoniae), що мали фактори патогенності, аглютиніни наростали у корів із збільшенням терміну тільності і були високими (1:512 — 1:1024). Заслуговує на увагу і такий представник родини ен-теробактерій як Yersinia enterocolitica, по відношенню до якого титри антитіл були середніми (1:128 — 1:256) і високими, не дивлячись на те, що у цього виду виявлено лише один фактор патогенності, а саме — лещггинизана активність. До ентеробакгерій (Edwardsieila tarda, Serratia odorífera, Enterobacter aerogenes), у яких ці фактори відсутні, титри аглютинінів були низькими (1:32 — 1:64) і не мали тенденції до приросту.

Ротавірусна інфекція є одною з найпоширеніших серед новонароджених телят. Виявлення титру ротавірусного антигену у фекаліях як хворих так і здорових телят давало б змогу встановити ще один етіологічний чинник хвороби або відкинути його. Вірусологічними дослідженнями встановлено, що в кінці першої доби життя, у фекаліях хворих телят, титр антигена ротавіруса становив 1:32, поступово знижуючись до 1:8 на десяіу добу. У фекаліях здорових телят на першу добу антигена ротавіруса не виявлено, на десяту добу цей показник становив 1:8.

2.2.6. Чугливіспь ентеробакгерій до антибіотиків.

В роботі використані стандартні паперові диски з антибіотиками вітчизняного та зарубіжного виробництва. З кожного виду енгеробактерій відбирали по одному представнику. Отримані результати свідчать, що з вітчизняних антибіотиків найбільш ефективним виявився левоміцетин. До нього були чутливі всі види ентеробакгерій, за виключенням Klebsiella ozaenae. Найменш ефективним виявився пеніцилін, до нього були чутливі тільки деякі види бактерій. З зарубіжних антибіотиків ефективним був байтрил, до якого були чутливі всі без виключення ентеробактерії. Практично не ефективним був лінкоміцин, до якого була чутлива тільки Edwardsieila tarda.

Зважаючи на те, що шлунково-кишкові хвороби новонароджених телят за своєю природою є поліетіологічними, тобто такими, у виникненні яких бере участь декілька видів умовно патогенних бактерій, існуючий традиційний метод визначення чутливості мікрофлори до антибіотиків не може дати чіткого результату. Це пояснюється неоднаковою чутливістю до конкретного антибіотика при-

четких до захворювання видів бактерій. Для одержання практично обгрунтованих результатів нами запропонований модифікований метод визначення чутливості бактерій до антибіотиків, який одержав назву кумулятивного або сумарного, (посвідчення про раціоналізаторську пропозицію № 56, видане 1.12.1996 р.)

Таблиця 5.

Визначення сумарного (кумулятивного) показника чутливості окремих вадів ентеробактерій до антибіотиків.

Діаметр зони затримки росту в О.Ч.

Види бактерій Стрел ТОМІ- цин Ле- вомі- цетин Ері- тро- міцин Нео- мі- цин Бай- трил Амо кси- ципін Полі- мік- син Пені ци- пін Лін- комі- цин Ауг- мен- тін

E. coli з К антигеном 1,4 2,4 1,2 1,2 1,6 1.6 1.0 0 0 2.0

Klebsiella pneumoniae 2,0 2,8 1,3 1,4 3,0 0 1.5 1.0 0 1.0

Klebsiella ozaenae 1,0 0 0 1.4 1,9 0 1.2 0 0 0

Proteus vulgaris 2,1 3,2 0 1,8 2,9 1.0 0 0 0 2.1

Proteus mirabilis 1,0 1,9 0 0 2,5 0 0 0 0 0

Shigella disenteriae 2,6 2,8 0 3,2 3,0 3.0 1.4 1.6 0 4.0

Yersinia enterocoirfica 1,9 3,6 2,4 1,6 3,2 1.4 1.7 1.6 0 1.7

Сумарні (Кумулятивні дані) 1.7 2.3 0.7 1.5 2.5 1 0.9 0.6 0 1.5

Суть методу полягає у окремому визначенні чутаивосгі до антибіотиків бактерій кожного виду, причетних до захворювання і виділених з одного матеріалу. Відомо, що культура вважається чутливою до антибіотика за умови, якщо величина зони затримки її росту разом з диском становить не менше ніж 10 мм. У нашому методі ця величина приймається за 1 одиниць чутливості (1 04), а кожен наступний міліметр зони в бік її збільшення чи зменшення відповідно буде дорівнювати 0,1 04. Діаметр зон кожного виду бактерій по відношенню до конкретного антибіотика сумують, одержують середнє арифметичне, яке й буде кумулятивним (сумарним) показником чутливості бактерій до цього антибіотика. Ефективним слід вважати антибіотик, чутливість бактерій до якого була не менше ніж 1 04 (табл.5).

2.2.7. Вивчення профілактичної та лікувальної дії бактеріальних препаратів.

На наступному етапі наші дослідження були спрямовані в напрямку профілактики дисбактеріозу новонароджених телят шляхом нормалізації

мікробного ценозу кишечника з перших годин їх життя. Сконструйований нами препарат нового типу під назвою "Бакгонорм” за участю співробітників кафедри мікробіології та вірусології НАУ містшь в собі живі культури представників нормальної мікрофлори кишечника телят. Застосування цього препарату передбачає створення нормального мікробіоценозу шлунково-кишкового тракту телят з перших годин життя. До складу новоствореного препарату ввійшли представники родини ЕтегоЬааегіасеае, у яких не виявлено факторів патогенності та біфідобактерії. Профілактичну дію цього препарату випробовували в порівняльному аспекті з пробіотиками типу моноспорину-ПК та зооспорину, які створені на основі штамів Bac.subt.ilіг.

За обробленими тваринами спостерігали на протязі 15 перших діб життя з урахуванням клінічних (тривалість і тяжкість перебігу хвороби) та

епізоотологічних (захворюваність та смертність) показників, а також шляхом бактеріологічних досліджень фекалій телят до та після застосування пробіотиків.

В результаті проведених досліджень встановлено, що при застосуванні пробіотиків моноспорину-ПК та зооспорину з метою профілактики шлунково-кишкових хвороб серед новонароджених телят, спостерігалась легка та середня форма хвороби. У дослідних трупах телят, де застосовувались ці препарати з ліуквальною метою, в основному відмічалась середня форма хвороби.

Бактеріологічними методами виявлено зменшення загальної чисельності грамнегативних мікроорганізмів в фекальних пробах при застосуванні зооспорину у 2,2 рази, моноспорину-ПК — у 4 рази.

Методом клініко-епізоотологічних досліджень встановлено, що серед тварин оброблених лрепарггом “Бакгонром”, більшість хворіли лепсою формою і швидко видужували після звичайного лікування. Слід відмітити, що у ЗО % телят, яким випоювали з профілактичною метою “Бакгонорм”, клінічних симптомів розладу функції кишечника взагалі не спостерігалось.

У телят контрольної групи (5 гол.), розвивалась середня та важка форми діареї, яка закінчилась загибеллю 3 -х голів.

Економічний ефект на 1 грн. витрат при застосуванні: пробіотика монос-порин-ПК склав — 2 грн.79 коп.; при застосуванні пробіотика зооспорин — 2 грн. 6 коп.; при використанні препарату бакгонорм — Зірн. 4§коп.

висновки.

1. Шлунково-кишкові захворювання новонароджених телят широко розповсюджені у господарствах України. На підставі клініко-епізоотологічних, бактеріологічних та вірусологічних досліджень підтверджена їх поліетіологічна природа.

2. Провідна роль як етіологічних чинників при розладах функції кишечника у телят належить умовно-патогенній мікрофлорі, до якої в основному відносяться такі представники родини Enterobacteriaceae як Klebsiella, Yersinia, Proteus, Shigella, ентеропатогенні ешерихії. Ці мікроорганізми активізуються на фоні зниження природної резистентності організму телят та первинної патогенної дії деяких вірусів, особливо рота-, та коронавірусів.

3. Основними складовими фону, на якому виникають шлунково-кишкові захворювання новонароджених телят, є порушення зоогігієнічних умов утримання та годівлі тільних корів, наявність ланцюгів передачі збудників через організм сприйнятливих тварин, утворення стійких видів мікроорганізмів до антибіотиків.

4. Інші представники родини Enterobacteriaceae, зокрема, із родів Edwardsiella, Enterobacter, Serratia, а також ешерихії без факторів патогенності відносяться до облігатної мікрофлори і формують нормальний мікробіоненоз шлунково-кишкового тракту.

5. При роатаді функції кишечника, що супроводжується діареєю, у телят розвивається дисбактеріоз, який характеризується помітним зменшенням кількості молочнокислих, пропіоновокислих бактерій, нормальних ешерихій з одночасним збільшенням кількості ентеропатогенних ешерихій, клебсіел, єрсіній, протея, у яких виявлено такі фактори патогенності як лецитиназна-, ДНК -зна-, гемолітична активність та здатність викликати загибель білих мишей в дозі 500 млн. - 1 млрд. м.к. на тварину.

6. Встановлено, що по відношенню до представників умовно-патогенної мікрофлори, які володіють факторами патогенності, в організмі тільних корів аглютиніни наростали із збільшенням терміну тільності і сягали величини 1:512 -1:1024, тобто були високими, в той час як до представників нормальної мікрофлори кількість аглютинінів збільшувалась повільно і їх титри були відносно низькими (1:32 - 1:64).

7. Формування мікробного біоценозу шлунково-кишкового тракту у здорових телят істотно відрізнялось від телят з розладами функції кишечника. Загальна кількість мікроорганізмів, починаючи з першої доби життя по п'яту, відповідно збільшувалась у першому випадку від 1760 ± 152 • 10й до 1818 ± 185 • 10й і в другому — від 1788 ± 164 • 10й до 16737 ± 979 • 10й на 4-ту добу. Пік підйому мікроорганізмів співпадав із загибеллю тварин.

8. Вивчено морфологічні, тінкгоріальні, культуральні та біохімічні властивості виділених нами ентеробактерій із родів Escherichia, Yersinia, Klebsiella, Proteus, Citrobacter, Hafriia, Shigella, Serratia, Enterobacter, Edwardsiella, які за названими ознаками були типовими для родини Enterobacteriaceae.

9. Застосування пробіотиків типу зооспорину та моноспорину-ПК сприяло перебігу хвороби в легкій і середній формах з відсутністю летальності.

10. Запропонований нами сумарний (кумулятивний) метод визначення чутливості бактерій до антибіотиків дає можливість вибрати найбільш ефективний препарат, який був би активним по відношенню до тих видів бактерій, які мають зв'язок з етіологією хвороби.

11. Розроблений нами і виготовлений у експериментальній серії комплексний препарат "Бактонорм" на основі декількох видів ентеробактерій — представників облігатної мікрофлори кишечника телят — показав високий профілактичний ефект. При випоюванні препарату не пізніше 4 -ї години після народження у більшості телят клінічні ознаки гастроентериту не розвивались, у окремих тварин хвороба перебігала в легкій формі, тривала одну, рідко дві доби і закінчувалась видужуванням.

ПРАКТИЧНІ ПРОПОЗИЦІЇ.

1. На основі декількох видів ентеробактерій — представників облігатної мікрофлори телят — розроблений комплексний препарат "Бактонорм" для профілактики шлунково-кишкових захворювань новонароджених телят та дис-бактеріозів, що їх супроводжують.

2. При визначенні чутливості бактерій до антибіотиків у випадках, коли захворювання обумовлене кількома видами бактерій, пропонується розроблений нами сумарний (кумулятивний) метод, який дає можливість відібрати найбільш

активний препарат по відношенню до всіх мікроорганізмів, що мають зв’язок з етіологією хвороби.

3. Нові пробіотики моноспорин -ПК та зооспорин можна рекомендувати для широкого виробничого випробування як засоби профілактики і лікування гострих шлунково-кишкових роатадів у новонароджених телят.

4. В умовах недостатнього забезпечення господарств фабричними біопрепаратами доцільно застосовувати названі вище пробіотики в рідкій на-тивній формі, яка за ефективністю не поступається ліофілізованій. Такі препарати можуть бути виготовлені в обласних та районних державних лабораторіях ветеринарної медицини.

СПИСОК РОБІТ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Борпіічук В.А., Садовський В.Я., Сорокіна Н.Г. Роль представників родини ЕпЬегоЬайегіасеае в етіології шлунково-кишкових хвороб новонароджених телят. // Ветеринарна медицина. - 1997. - № 4. - С. 26 - 27.

2. Садовський В.Я., Бортнічук В.А. Видовий склад сальмонел в зоні Прикарпаття. // Тваринництво України - 1995. - № 9. - С. 28.

3. Бортнічук ВА, Садовський ВЛ., Сорокіна Н.Г. Шлунково-кишкові захворювання новонароджених телят. // інформаційний листок -Хмельницьк: Хмельницький ЦНТЕІ, 1996. - № 51 -96.-3 с.

4. Садовський В .Я., Бортнічук В.А. Циркуляція сальмонел серед сільськогосподарських тварин в зоні Прикарпаття. // "Актуальні питання ветеринарної медицини" Матеріали науково-виробничої конференції присвяченої 75 -річчю факультету вет. медицини НАУ 18 - 20 жовтня 1995. - Київ. - 1995. - С. 119.

5. Садовський В.Я., Бортнічук В.А. Зміна мікробного ценозу у новонароджених телят при масових шлунково-кишкових захворюваннях. // Сучасні проблеми ветеринарної медицини: Матеріали наук. конф. проф.-викл. складу та аспірантів березень 1996. - Київ. - 1997 - С. 24 - 25.

6. Садовський ВЛ. Профілактика шлункою-кишкових захворювань новонароджених телят. // Тваринництво України. - 1997. - N5. - С. в друці.

Аннотация.

Садовский В.Я. Роль представителей семейства Enterobacteriaceae в этиологии желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят.

Диссертация (рукопись) на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03. — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология. Национальный аграрный университет, Киев, 1997. •

Работа посвящена изучению этиологии желудочно-кишечных болезней новорожденных телят. Установлена полиэтиологичность таких заболеваний, которые возникают на фоне разного рода нарушений условий кормления и содержания глубокостеяьных коров и новорожденных телят.

Бактериологическими, серологическими и вирусологическими исследованиями подтверждено, что б развитии процесса дисфункции аппарата пищеварения новорожденных телят непосредственное участие принимают ротавирусы и отдельные представители семейства Enterobacteriaceae (преимущественно из родов Klebsiella, Proteus, Yersinia), у которых установлено наличие факторов патогенности. Из представителей облигатной кишечной микрофлоры телят разработан препарат, действие которого направлено на создание нормального микробиоценоза у телят с первых часов их жизни. Предложен усовершенствованный метод определения чувствительности микрофлоры к антибиотикам, принимающей непосредственное участие в развитии желудочно-кишечных заболеваний новорожденных телят.

SUMMARY

Sadovskii Vladislav. The Role of Representatives of the Enterobacteriaceae Family in Aetiology of Stomach-intestinal Diseases of the Newborn Calves (manuscript).

The Veterinary Sciences Candidate (Ph.D.). The dissertation on speciality 16.00.03 — Veterinaiy Microbiology, Virology, Epizootology, Mycology and Immunitology. National Agricultural University, Kiev, 1997.

The work is devoted to studying of the aetiology of stomach-intestinal illnesses of the newborn calves. The poliaethiologycal character of the diseases, which arise on a background of different kinds of infringements of feeding and keeping conditions of the pregnant cows and newborn calves was established.

Bacteriological, serological and virologica! researches confirmed, that rotaviruses and individual representatives of family Enterobacteriaceae (mainly from genus Klebsiella, Proteus, Yersinia), at which presence of the pathogens factors is established in the indigestion evolution of a newborn calves.

From the representatives of obligatory intestinal microflores of calves the preparation has been developed, the action of which is directed on normal microbe biocynoz in calves from the first hours of their life.

The proposed method of sensitivity determination of the microflore to taking which a direct participation in the evolution of stomach-intestinal diseases in newborn calves antibiotics was offered.

Ключові слова: шлунково-кишкові хвороби, етіологія, мікрофлора, дисбактеріоз, енгеробактерії, фактори патогенності, пробіотики, профілактика.

Підписано до друку 14.04.97р. Формат 60x84/16. Ум. друк. арк. 1,0. Обл.-вид. арк. 1,0.

Наклад 100. Зам. 144.

Відділ оперативної поліграфії Центру Міжнародної освіти 227-12-75, 227-37-86