Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Роль патогенов в этиологии мастита коров и рациональные способы его терапии

На правах рукописи

ДАВЛАТМУРОДОВ ТОИРДЖОН МИРЗОАЛИЕВИЧ

I

РОЛЬ ПАТОГЕНОВ В ЭТИОЛОГИИ МАСТИТА КОРОВ И РАЦИОНАЛЬНЫЕ СПОСОБЫ ЕГО ТЕРАПИИ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологчей и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

1

I

Душанбе 2004

Работа выполнена в Таджикском аграрном университете и научно-исследовательском ветеринарном институте Академии сельскохозяйственных наук Республики Таджикистан

Научные руководители: доктор ветеринарных наук, профессор,

академик ТАСХН Сатторов И.Т. кандидат ветеринарных наук, доцент Мирзахметов Ш. Р.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук

Бозоров М.А. доктор ветеринарных наук Муминов А.М

Ведущая организация: Таджикский научно-исследовательский

ящурный институт

Защита состоится 30 декабря 2004 года в Ю00 на заседании диссертационного совета Д 050.001.01 при Таджикском научно-исследовательском ветеринарном институте Академии сельскохозяйственных наук Республики Таджикистан по адресу: 7340005, г.Душанбе, ул Каххорова. 43

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Таджикского научно-исследовательского ветеринарного института по адресу: 7340005, г.Душанбе, ул. Каххорова, 43

Автореферат разослан ноября 2004 года

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат ветеринарных яаук^я^й^3 Ш. А. Гурдиев

2005-4 1569

ММ

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. В решении задач «Среднесрочной программы вывода из кризиса Агропромышленного комплекса Республики Таджикистан и реализации приоритетных направлений стратегии развития его отраслей на период до 2005 г» важное значение имеет разработка эффективных средств борьбы с болезнями животных и повышение их продуктивности. Однако, интенсивное развитие молочного скотоводства сдерживается из-за широкого распространения среди маточного поголовья болезней молочной железы, приводящих к снижению молочной продуктивности и качества молока, а также к преждевременной выбраковке высокоценных животных.

Маститы, являясь одной из распространенных болезней коров, наносят животноводческим хозяйствам республики значительный экономический ущерб, который выражается в ухудшении качества молока и молочных продуктов, снижении молочной продуктивности, увеличении случаев инфекционных энтеритов у людей и новорожденных телят, преждевременной выбраковке животных и затратах на диагностику и лечение.

Несмотря на то, что этой болезни уделяется значительное внимание, совершенствуются методы диагностики, этиопатогене-тической терапии

(И.И. Архангельский, 1963; Д. Д. Логвинов ,1979; В. М. Кар-ташова, А.И. Ивашура, 1988; А. Я. Батраков, 1985; А. И. Ивашу-ра, 1991; В. А. Париков, 2000 и др.) и специфической профилактики (И. И. Архангельский и др., 1985, В. С. Авдеенко и др., 1996), поиск новых эффективных химиотерапевтических препаратов продолжает оставаться актуальной проблемой ветеринарной науки и практики.

РОС НАЦИОНАЛЬНАЯ

ливлиотека

✓б-Петербург

Широкое распространение мастита коров в хозяйствах республики и острый дефицит эффективных средств борьбы с ним в современных условиях послужил предпосылкой для проведения наших исследований.

Данная работа проводилась в рамках Республиканской научно-технической программы 3.1 на 2001-2005 гг., зарегистрирована в Национальном патентно-информационном центре (НПИЦентр) Республики Таджикистан № 00000971

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы явилось изучение распространение мастита у коров и разработка эффективных средств лечения.

Задачи исследования:

1.Изучить распространение мастита коров в животноводческих хозяйствах республики.

2.Изыскать эффективный антибактериальный препарат и определить его стабильность по биологической активности и безвредности.

3. 3.Изучить терапевтическую эффективность препарата при различных формах мастита коров в экспериментальных и производственных опытах.

Научная новизна. Выяснена роль патогенных микроорганизмов в возникновении мастита у коров, определена распространенность различных форм мастита коров в животноводческих хозяйствах республики.

Разработано новое эффективное антибактериальное средство «Лактовит» для лечения мастита коров (Положительное уведомление Управления государственной экспертизы объектов промышленной собственности НПИЦентра Республики Таджикистан № 04000832 от 13. 08.2004 г.) и отработаны методы его изготовления и микробиологического контроля, изучена его стабильность и терапевтическая эффективность.

Практическая ценность. На основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация на препарат лактовит:

1. инструкция по изготовлению и контролю препарата лактовит для лечения мастита животных (одобрена Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2003);

2. технические условия на препарат лактовит (одобрены Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2003);

3. наставление по применению лактовита для лечения мастита животных (одобрено Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2003);

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

данные изучения этиологии мастита у коров и его распространения в хозяйствах Республики Таджикистан;

разработка и изучение свойств противомаститного препарата лактовит;

эффективность препарата лактовит при лечении больных маститом коров.

Апробация работы. Оснбвные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученых советов Таджикского аграрного университета и Таджикского научно-исследовательского ветеринарного института в 2000-2004 гг., на республиканских конференциях и семинарах-совещаниях (Душанбе, 1999-2004), международных научных конференциях (Душанбе, 2003; Феодосия, 2004; Самарканд, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 8 научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 111 страницах и включает введение, обзор литературы, соб-

ственные исследования, обсуждения результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы и приложение. Работа иллюстрирована 10 таблицами и 5 рисунками. Список литературы включает 143 источника.

2.СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1.Материал и методы исследования

Работа выполнена в период 1999-2004 гг в Таджикском аграрном университете и Научно-исследовательском ветеринарном институте Таджикской академии сельскохозяйственных наук. Экспериментальные и производственные опыты проведены в 13 животноводческих хозяйствах республики.

В опытах использовали 120 белых мышей, крыс, 34 кролика и материалы от 1417 коров. Распространенность мастита коров по республике определяли по данным ветеринарной отчетности и результатам исследований патологического материала от животных.

Диагностику мастита проводили на основании эпизоотологи-ческих, клинических, патологоанатомических данных и результатов бактериологического исследования секрета пораженной доли вымени или кусочков от пораженной доли паренхимы по общепринятой методике (утв. ГУВ МСХ СССР, 1973).

Для выделения, идентификации и видовой дифференциации патогенов применялись общепринятые в микробиологии методы.

В качестве селективных питательных сред для стафилококков использовали: 5% кровяной агар; молочно-соевый агар; лактозно-солевой бульон с фенолротом; агар с маннитом; среда Чемпена. Для выделения стрептококков использовали среды: Эдварда; лак-тозно-сывороточный бульон (В.М. Карташовой); селективная сре-

да с антибиотиками (пропись фирмы Oxoid, 1982) и агар с сахарозой.

В работе применяли препарат лактовит, разработанный нами совместно с доктором химических наук, профессором 3. Н. Юсуповым и кандидатом химических наук, доцентом У. Р. Раджабо-вым.

Антимикробную активность испытуемого препарата в отношении патогенных возбудителей мастита коров изучали in vitro в жидкой питательной среде методом последовательных разведений.

Минимальное количество препарата, дающее полную видимую задержку роста культуры (прозрачный бульон), соответствовало минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата и по нему определялась степень чувствительности бактерий.

Для установления бактерицидного действия лактовита, из последних, прозрачных пробирок после осторожного взбалтывания жидкости проводили посев на мясо-пептонный агар. Наименьшую концентрацию лактовита в пробирке посев из которой при инкубации в течение 48-72 ч не дал роста в питательной среде, принимали за минимальную бактерицидную концентрацию.

Стерильность препарата определяли на питательных средах: МПБ, сусло-агар, среды Китт-Тароцци и Чапека по общепринятой методике.

Безвредность препарата лактовит изучали в соответствии с «Методическим указанием по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (утв. ГУВ Госагропрома СССР, 1987).

При этом определяли острую и хроническую токсичность препарата. Оценивали действие препарата на массу, температуры тела, поведенческие реакции, анафилактического и раздражающего действия на лабораторных животных.

Для определения сроков годности лактовита отобрали образцы 14 серий и заложили на хранение при режиме 4-8°С и 2025° С. По истечению определенного срока образцы подвергли исследованию на стерильность, безвредность и суммарную биологическую активность.

Остаточное количество ингибирующих веществ в молоке коров , после применения препарата лактовит определяли на 20 головах лактирующих коров методами последовательных разведений на жидкой питательной среде и диффузии в агар.

В экспериментальных условиях терапевтическая эффективность препарата лактовит при мастите коров изучалась в сравнении с известным препаратом мастисан А.

Эффективность препарата при различных формах мастита коров в экспериментальных и производственных условиях определяли на 310 гол. С этой целью животным опытных групп вводили лактовит внутрицистернально в дозе 10 мл на голову два раза в день в течение 3 - 5 дней. Животные контрольной группы получали мастисан А согласно наставлению по его применению. Учет результатов проводили путем контроля за срстоянием здоровья вымени в течение всего периода лечения и в конце опыта для исключения возможных рецидивов и осложнений.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятой в биологии методов.

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.2.1. Распространение мастита у коров в хозяйствах Республики Таджикистан

В результате исследований 997 проб молока лактирующих коров в 208 (20,8%) случаях диагностирован мастит. Из них с

клинически выраженным маститом болели 72 (34,6%) и субклиническим маститом - 136 (65, 4%) голов животных ( табл 1).

Из данных таблицы видно, что маститы у коров в различных регионах республики распространены неравномерно. Показано, что субклиническая форма мастита по сравнению с клинической формой регистрируется в 3,8 раз больше.

Таблица 1

Заболеваемость животных маститом в лактационном периоде

Регионы Кол-во хозяйств Кол-во исследованных животных Всего выявлено больных Клинический Субклинический

Хатлон- ская область 6 509 95 (18,6%) 36 (37,9%) 59 (62,1%)

Согдийская область 3 154 25 (16,2%) 9 (36,0%) 16 (64,0%)

РРП 4 334 88 (26,3%) 27 (30,6%) 61 (69,3%)

Итого 13 997 208 (20,8%) 72 (34,6%) 136 (65,4%)

При обследовании 420 коров в сухостойном периоде выявлено 88 (20,9%) больных маститом и из них 6 (6,6 %) случаев с клиническим и 82 (93,4 %) случая с субклиническим течением болезни.

Бактериологическому исследованию были подвергнуты 997 проб молока и секрета вымени коров. Рост микрофлоры выявлен в 284 (28,4%) пробах, в том числе в 96 (33,8%) пробах молока коров, больных клинической и в 188 (66,2%) - субклинической формой мастита. В 713 (71,6%) пробах рост микробов на питательных средах отсутствовал (табл. 2).

Таблица 2

Результаты бактериологического исследования молока больных маститом коров

Характер вос- Исследо- Staphylo- Strepto- Е coli Staphylococcus

паления вано проб coccus coccus + Streptococ-

cus

Серозный 86 24 19 5 2

Катаральный 91 32 28 9 4

Фибринозный 69 44 30 8 7

Гнойно-

катаральный 50 39 23 7 3

Всего: 296 139 100 29 16

(46,9%) (33,7%) (9,7%) (5,4%)

Из данных таблицы 2 видно, что молоко (секрет) лактирую-щих и сухостойных коров чаще всего обсеменено стафилококками (46,9%) и стрептококками (33,7%), что указывает на их главную роль в возникновении мастита у коров. Бактерии группы кишечной палочки выделялись в 9,7% случаев. Ассоциация стафилококков и стрептококков была выявлена в 5,4% случаев.

Показано, что наименьшее количество патогенных бактерии выделяется при серозном мастите, тогда как при других формах мастита существенных различий в видовом составе микрофлоры

не отмечается.

Изучение культуральных и биохимических свойств выделенных микроорганизмов позволило отнести их к следующим видам: Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Streptococcus agalactiae, Streptococcus faecalis. Выделенные стрептококки и стафилококки в 58 -65 % случаев обладали гемолитической активностью.

Результаты клинического исследования вымени и ее секрета показали, что существует зависимость возникновения клинических маститов от возраста. Чаще коровы болеют маститом в возрасте от 3 - 5 лет, причем существует тенденция к увеличению заболевания с возрастом.

По клиническим признакам, отражающим характер воспалительного процесса в животноводческих хозяйствах республики выявлены следующие формы мастита (диаг. 1).

Установлено, что маститом чаще поражены левосторонние доли вымени, эта же тенденция отмечена и при скрытых маститах. Поражение левосторонних долей объясняется доением коров с правой стороны: правые доли лучше видны, доступны для доения, аккуратно выдаиваются и массируются. Скрытые маститы чаще поражают одну, а клинические - две и более долей вымени.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что маститы коров распространены повсеместно в животноводческих хозяйствах республики. У коров субклиническая форма мастита по сравнению с клинической формой диагностируется в 3,8 раз больше. В возникновении различных форм мастита коров важную роль играют патогенные стафилококки и стрептококки.

Диаграмма 1.

Заболеваемость коров различными формами мастита

3,00%

9,10%

6,20%

10,10%

11,40%

60,«)%

□ Серозный Ш Катаральный

Ш Фибринозный □ Гнойный

9 Гнойно-катаральный □ Геморрагический

2.2.2. Изыскание эффективных препаратов против мастита коров

С целью изыскания эффективного химиотерапевтического средства испытанию подвергали препарат лактовит, разработанный учеными Таджикского научно-исследовательского ветеринарного института и Таджикского аграрного университета. Препарат лактовит - лекарственная форма, состоящая из нитрофурана, сульфаниламида, дибаферола и формообразующей основы. Представляет собой суспензию серовато-желтого цвета, без запаха. В состав лекарственной формы входят компоненты, выпускаемые медицинской промышленностью. Препарат стерильный, выпускается в стеклянных флаконах объемом 50-200 мл или по 10-20 мл в шприцах с суммарной биологической активностью 100 мкг в мл.

Эффективность препарата оценивали в сравнении с препаратом мастисан А по следующим показателям: антимикробная активность, безвредность и терапевтическая эффективность.

2.2.2.1. Антимикробная активность лактовита

Результаты опытов показали, что лактовит обладает бактери-остатическим и бактерицидным действием в отношении возбудителей мастита коров: стафилококков, стрептококков и эшерихии коли. Антимикробная активность препарата изучалась по отношению к 9 изолятам Staphylcoccus aureus, 8 - Streptococcus aga-lactiae и 4 - Escherichia coli.

Показано, что бактериостатическая активность лактовита по отношению к изолятам Staphylcoccus aureus и Streptococcus aga-lactiae составляла 7,8 мкг/ мл, а по отношению к Escherichia coli - 3,9 мкг/мл (табл. 3).

Бактерицидная активность препарата по отношению к указанным возбудителям проявлялась в концентрации 7,8 - 15,6

мкг/мл. Наиболее чуствительной к препарату оказалась Escherichia coli. Патогенные бактерии Staphylcoccus aureus и Streptococcus agalactiae были более устойчивыми.

Антимикробная активность известного препарата мастисан А проявлялась в концентрации 31,2 - 62,5 мкг/ мл..

Таким образом, установлено, что препарат лактовит обладает высокой антимикробной активностью, превышающей таковую у мастисана А .

Таблица 3

Бактериостатическая активность препарата лактовит

Вид бактерий Концентрация действующего вещества мкг/мл Контроль

1000 500 250 125 62,5 31,2 15,6 7,8 3,9

Staphylcocc us aureus - - - - - - - - + +

Streptococc us agalactiae + +

Escherichia coli +

Примечание:- отсутствие роста в питательной среде + наличие роста

2.2.2. 2. Безвредность лактовита

Исследование препарата проводили на белых мышах, беспородных крысах и кроликах породы шиншилла. Оценивали его действие на массу и температуру тела, поведенческие реакции, определяли острую и хроническую токсичность, анафилактическое и раздражающее действия. Препарат выпаивали крысам по 1 мл, кроликам по 2 мл 1 раз в день. Регистрацию показателей проводили через 2, 4, 12, 24 ч и 14 дней после введения препарата.

Влияние лактовита на массу тела животных. Для определения динамики изменения массы животных при применении 14

лактовита их взвешивали до начала эксперимента и через 2, 4, 12, 24ч и 14 дней после дачи препарата. Проведенные исследования показали, что испытуемый препарат не снижал массу животных по сравнению с контролем.

Влияние лактовита на температуру тела животных. Измерение ректальной температуры проводили через 2, 4, 12 и 24ч после введения препарата и в последующем ежедневно в течение 14 дней. У всех исследованных животных не было отмечено достоверного увеличения температуры тела, связанного с применением лактовита.

Влияние лактовита на поведенческие реакции животных. Установлено, что введение препарата не повлияло на характер динамики локомоторной активности, стереотипное поведение и выносливость животных.

Определение токсичности препарата для лабораторных животных. Для оценки максимально переносимой дозы и LD50 опытным животным вводили препарат лактовит. Контрольным животным вводили препарат, представляющий собой аналогичное количество наполнителя. Объемы вводимых смесей были одинаковы для контрольных и опытных животных.

Установлено, что максимально переносимая доза препарата для белых мышей при подкожном введении составляет 550-600 мг/кг; для кроликов - 450 - 500 мг/кг.

LD50 на 1 кг массы тела для белых мышей составила 950 -1000 мг/кг; для кроликов 800- 850 мг/кг.

На основе проведенных опытов по изучению токсичности установлено, что новая лекарственная форма - лактовит относится к категории малотоксических соединений.

Для оценки хронической токсичности препарат из расчета 2, 5 и 10 доз вводили подкожно кроликам в течение 10 дней и контролировали физиологические показатели организма в течение

1 месяца. Установлено, что длительное применение препарата не оказывает отрицательное влияние на организм лабораторных животных.

Исследования аллергенного действия препарата проводили по тесту наличия анафилактического действия на кроликах породы шиншилла массой до 3 кг. В качестве контроля брали физиологический раствор.

Оценка общего анафилактического действия препарата осуществлялось на кроликах методом сенсибилизации с последующим введением разрешающей дозы препарата. Сенсибилизацию проводили введением препарата в течение 3-х дней однократно по 3 доз / кг массы тела. На 14-й день после сенсибилизации вводили разрешающую дозу - 10 доз/кг массы тела. После введения разрешающей дозы за животными наблюдали в течение 1 ч. У опытных животных по сравнению с контрольными видимых изменений не выявлено.

Оценка раздражающего действия препарата проводилась методом конъюнктивальной пробы. Одну каплю суспензии препарата закапывали в конъюнктивальный мешок кролика. Во второй конъюнктивальный мешок (контрольный) закапывали 1 каплю физиологического раствора. При внесении препарата оттягивали внутренний угол конъюнктивального мешка, затем в течение 1 мин прижимали слезно-носовой канал. Результаты учитывали через 24 часа. Наблюдалось легкое покраснение конъюнктивы и инъецирование сосудов склеры глаза, что отмечалось и в контроле. Следовательно, лактовит обладает слабым раздражающим действием.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что препарат лактовит относится к категории малотоксичных соединений, не оказывает местного раздражающего и аллергизирующего действий.

2.2.2.3. Стабильность биологических свойств лактовита при

различных условиях и сроках хранения.

Терапевтическая эффективность антибактериальных препаратов определяется в основном по бактерицидной и бактериостати-ческой активности в отношении патогенов. Исходя из этого нами были проведены опыты по изучению стабильности этих свойств. В опытах использовали 14 серий лактовита при температурном режиме хранения от 4 до 25° С в течение 3-24 месяцев после изготовления.

Исследования показали, что внешний вид, консистенция, рН препарата оставались без видимых изменений в течение 24 месяцев. Для исключения бактериальной и грибной контаминации пробы лекарственной формы с активностью 25 и 1000 мкг/мл высевали на МПБ, сусло-агар, среды Китт- Тароцци и Чапека. Результаты наблюдения за посевами показали, что испытуемый препарат в течение 24 месяцев остается стерильным.

Показано, что суммарная биологическая активность серий лактовита, находившихся в холодильной камере при температуре 4-8° С, была в пределах исходного значения 7,8 - 15,6 мкг/мл в течение 24 месяцев. При хранении препарата при 20-25°С первичная суммарная биологическая активность сохранялась в течение 14 месяцев,а через два года она равнялась 31,2-62,5 мкг/мл.

Результаты изучения безвредности препарата лактовит спустя 12 и 24 месяцев хранения при различных температурах показали, что он был нетоксичен для лабораторных животных.

2.2.2.4. Содержание ингибирующих веществ в молоке коров

после применения лактовита

Анализ на остаточное количество антибактериальных веществ в молоке коров, которым внутрицистернально вводили препарат

лактовит, проводили в хозяйстве имени Латифа Муродова Гис-сарского района. В опыте использовали 20 коров.

Для исследования брали проб молока от коров, подвергнутых лечению лактовитом. В качестве питательной среды использовали 1% пептонную воду с дополнительным добавлением глюкозы и реактива Андрадэ. Результаты учитывали по интенсивности роста тест-культуры и цвету среды.

В 28 пробах молока от 14 коров, исследованных через 12-96 часов после внутрицистернального введения лекарственной формы, ингибирующие вещества не были обнаружены уже через 24 ч, равно как и в 6 контрольных пробах, взятых до введения препаратов. Для подтверждения достоверности результатов, полученных методом последовательных разведений, указанные пробы молока одновременно исследовали методом диффузии в агар. Полученные данные были идентичны.

К этому времени и отрицательных изменений в органолепти-ческих показателей молока не наблюдалось.

Результаты исследований послужили основанием для ограничения использования молока в пищевых целях от коров в период лечения и в течение 2 суток по завершению. Указанные рекомендации внесены в « Наставление по применению лактовита для лечения мастита животных», утвержденное ГУВ МСХ Республики Таджикистан (2003).

2.2.3.Терапевтическая эффективность лактовита в экспериментальных и производственных опытах

Терапевтическая эффективность препарата лактовит при различных формах мастита коров в экспериментальных и производственных условиях изучалась в сравнении с известным препаратом мастисан А.

Животных опытных групп получали внутрицистернально лактовит в дозе 10 мл на голову два раза в день в течение 3-5 дней. Терапия больных коров контрольных групп осуществлялось препаратом мастисан А согласно наставления по его применению. Контроль за состоянием здоровья вымени проводили в течение всего периода лечения и в конце опыта для исключения возможных рецидивов и осложнений.

Результаты экспериментальных опытов показали, что двухкратное внутрицистернальное применение лактовита в дозе 10 и 15 мл является наиболее эффективным. Эффективность лечения мастита коров препаратом лактовит достигала 100%, что на 12,7% выше эффективности известного препарат мастисана А (табл. 4).

Таблица 4

Эффективность лактовита при терапии больных маститом коров в экспериментальных условиях

Группа Препарат Доза Кол-во Из них Средний срок

жи- препара жи- выздоро- лечения, дни

вотных та в мл вотных (гол) вело

1 Лактовит 3,0 12 58,3 7

2 Лактовит 5,0 12 66,6 5,3

3 Лактовит 7,5 12 91,6 4,0

4 Лактовит 10,0 12 100 3,6

5 Лактовит 15,0 12 100 3,6

6 Мастисан А 10 12 83,3 7,0

1римечание. Препарат лактовит вводили внутрицистернально 2 раза в день

С целью определения терапевтической эффективности препарата лактовит в производственных условиях по принципу аналогов распределяли 238 коров больных маститом на 8 групп (табл.5).

Таблица 5

Терапевтическая эффективность препаратов при мастите у коров в производственных условиях

Форма Коли- Вид препа- Кратность Срок Эффек-

мастита чество рата введения выздоров тив-

коров препарата ления, ность,

(гол) в день дни %

Серозный 33 Лактовит 2 ,0 2,3 97,0

Катаральный 35 2,5 94,3

Фибринозный 30 3,6 93,4

Гнойно-

катаральный 25 4,0 92,0

Серозный 30 Мастисан А 3,0 90,0

Катаральный 35 4,5 85,7

Фибринозный 25 6,3 80,0

Гнойно-

катаральный 25 2,0 8,0 72,0

'Из данных таблицы 5 видно, что лактовит по сравнению с мастисаном А позволяет сократить срок выздоровления больных в зависимости от формы мастита на 30,0 - 95,1 % . Эффективность лечения при этом в среднем увеличивается на 7,1 - 20,1%.

Таким образом, результаты проведенных исследований показывают, что препарат лактовит безвреден для животных и обладает выраженным терапевтическим эффектом при лечении различных форм мастита коров, наилучший терапевтический эффект достигается при внутрицистернальном введении препарата в дозе 10 мл два раза в день в течение 3- 4 дней.

выводы

1.Установлено, что маститы коров, обусловленные патогенными бактериями распространены повсеместно в молочно-то-варных фермах республики и вызывают значительный экономический ущерб. В возникновении мастита у коров большую роль играют патогенные стафилококки (46,9%) и стрептококки (33,7%).

2. Заболеваемость животных маститом достигает 20,8%. Субклиническая форма мастита коров по сравнению с клинической регистрируется больше в 3,8 раз.

Клиническая форма мастита коров проявляется в форме серозного (11,4%), катарального (60,1%), фибринозного (10,1%), гнойного (6,2%), гнойно-катарального (9,1%) и геморрагического (3,0%).

3. Разработанная лекарственная форма - лактовит на основе нитрофурана, сульфаниламида и дибаферола обладает высоким антимикробным действием. Бактериостатическая и бактерицидная активность препарата по отношению к стафилококкам и стрептококкам составляет 7,8 и 15,6 мкг/мл, соответственно.

4.Определена стабильность физико-химических и биологических свойств препарата при различных температурных режимах в течение 2-х лет. Лактовит стабильно сохранял активность в течение 18 месяцев.

5. Установлено, что препарат относится к категории малотоксических соединений, не оказывает местного раздражающего и аллергизирующего действий.

6. Определены ограничительные сроки использования молока в пищевых целях от коров в период внутрицистернального применения лактовита и последующих двух суток.

7.Отработана технология приготовления, контроля и применения препарата. Показано, что наилучший терапевтический эффект достигается при внутрицистернальном введении лактовита больным маститом коров в дозе 10 мл два раза в день в течение 3-4 дней.

8. Результаты производственного испытания препарата лакто-вит при различных формах мастита коров показали, что его терапевтическая эффективность составляет 92,0 - 97,0%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Инструкция по изготовлению и контролю препарата лакто-вит для лечения мастита животных (одобрена Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г. утв., ГУВ МСХ РТ, 2003)

2.Технические условия на препарат лактовит (одобрены Ученым Советом Тадж НИВИ, пр.№2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2003)

3.Наставление по применению лактовита для лечения мастита животных (одобрено Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2003)

список

ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 .Давлатмуродов Т.М., Мирзахметов Ш.Р. Распространенность мастита коров в колхозе им. Ленина Пархарского района / Актуальные проблемы сельскохозяйственной науки, Душанбе .ТАУ, 1999.-С. 24-25.

2.Мирзахметов Ш.Р., Жумаев Н.С.,Ульджит Т.,Кулаков С.Д.,Давлатмуродов Т. М. Распространение и лечение мастита коров в колхозе имени Раджабова Ленинского района / Актуаль- 1 ные проблемы в ветеринарии, Душанбе, ТАУ, 2000.- С. 60-63.

3.Мирзахметов Ш. Р., Давлатмуродов Т. М. Препарат ПВЭНТИ для лечения суклинической формы мастита коров / Актуальные проблемы в ветеринарии, Душанбе, ТАУ, 2000.- С. 63 - 66.

4.Давлатмуродов Т.М., Мирзахметов Ш. Р. Этиология и профилактика мастита у коров в хозяйствах республики Таджикистан / / Матер, науч.- практ. конф. / / Вклад молодых ученых в развитии сельскохозяйственной науки, Душанбе ,2001. - С.25 - 26

б.Давлатмуродов Т. М. Эффективность лечения субклинического мастита коров в сухостойный период / / Матер. Междунар. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях» Душанбе, 2003. С. 114.

6.Давлатмуродов Т. М., Мирзахметов Ш. Р. Использование лактовита для лечения коров, больных маститом // Матер. Междунар. науч. - практ. конф. «Актуальные проблемы болезней животных в современных условиях», Душанбе, -2003. С. 114. •

7.Мухамедов Н.Д. Сатторов И.Т., Давлатмуродов Т. М., Мирзахметов Ш.Р., Довбня В.М. Эффективность лактовита при лече-

нии маститов у коров / / Матер. Междунар. науч. конф. «Мониторинг распространения и предотвращения особо опасных болезней животных», Самарканд, 2004. - С. 120 - 121

8.Сатторов И.Т., Мирзоев Д. М., Мирзахметов Ш.Р., Давлатмуродов Т.М. Лактовит - перспективный противомастит-ный препарат. Душанбе. ТАУ, 2004. -100 с.

Сдано в набор 29.11.2004 г. Подп. к печ. 29.11 2004 г. Формат бум. 60 х 84 '/i6 Зак. 110. тираж 100 экз. Объем IV4 п-л-Гарнитура Times New Roman.

Издательство «ХУМО

РНБ Русский фонд

2005-4 1569

Актуальность работы. В решении задач «Среднесрочной программы вывода из кризиса Агропромышленного комплекса Республики Таджикистан и реализации приоритетных направлений стратегии развития его отраслей на период до 2005 г» важное значение имеет разработка эффективных средств борьбы с болезнями животных и повышение их продуктивности. Однако, интенсивное развитие молочного скотоводства сдерживается из-за широкого распространения среди маточного поголовья болезней молочной железы, приводящих к снижению молочной продуктивности и качества молока, а также к преждевременной выбраковке высокоценных животных.

Маститы, являясь одной из распространенных болезней коров, наносят животноводческим хозяйствам республики значительный экономический ущерб, который выражается в ухудшении качества молока и молочных продуктов, снижении молочной продуктивности, увеличении случаев инфекционных энтеритов у людей и новорожденных телят, преждевременной выбраковке животных и затратах на диагностику и лечение.

Несмотря на то, что этой болезни уделяется значительное внимание, совершенствуются методы диагностики, этиопато-генетической терапии (И.И. Архангельский, 1963; Д. Д. Логвинов ,1979; В. М. Карташова, А.И. Ивашура, 1988; А. Я. Батраков, 1985; А. И. Ивашура, 1991; В. А. Париков, 2000 и др.) и специфической профилактики (И. И. Архангельский и др., 1985, В. С. Авдеенко и др., 1996), поиск новых эффективных химиотерапевтических препаратов продолжает оставаться актуальной проблемой ветеринарной науки и практики.

Широкое распространение мастита коров в хозяйствах республики и острый дефицит эффективных средств борьбы с ним в современных условиях послужил предпосылкой для проведения наших исследований.

Данная работа проводилась в рамках Республиканской научно-технической программы 3.1 на 2001-2005 гг., зарегистрирована в Национальном патентно-информационном центре (НПИЦентр) Республики Таджикистан № 00000971

Цель и задачи исследований.

Целыо настоящей работы явилось изучение распространения мастита у коров и разработка эффективных средств лечения.

Задачи исследования:

1.Изучить распространение мастита коров в животноводческих хозяйствах республики.

2.Изыскать эффективный антибактериальный препарат и определить его стабильность по биологической активности и безвредности.

3. Изучить терапевтическую эффективность препарата при различных формах мастита коров в экспериментальных и производственных опытах.

Научная новизна. Выяснена роль патогенных микроорганизмов в возникновении мастита у коров, определена распространенность различных форм мастита коров в животноводческих хозяйствах республики.

Разработано новое эффективное антибактериальное средство «Лактовит» для лечения мастита коров (Положительное уведомление Управления государственной экспертизы объектов промышленной собственности НПИЦентра Республики Таджикистан № 04000832 от

13. 08.2004 г.) и отработаны методы его изготовления и микробиологического контроля, изучена его стабильность и терапевтическая эффективность.

Практическая ценность. На, основании полученных результатов разработана нормативно-техническая документация на препарат лактовит: инструкция по изготовлению и контролю препарата лактовит для лечения мастита животных (одобрена Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2004); технические условия на препарат лактовит (одобрены Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2004); наставление по применению лактовита для лечения мастита животных (одобрено Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2004);

Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:

Данные изучения этиологии мастита у коров и его распространения в хозяйствах Республики Таджикистан; разработка и изучение свойств противомаститного препарата лактовит; эффективность препарата лактовит при лечении больных маститом коров.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученых советов Таджикского аграрного университета и Таджикского научно-исследовательского ветеринарного института в 2000-2004 гг., на республиканских конференциях и семинарах-совещаниях (Душанбе,

1999-2004), международных научных конференциях (Душанбе, 2003; Феодосия, 2004; Самарканд, 2004).

Публикации. По теме диссертации опубликованы 8 научных работ.

ВЫВОДЫ

1 .Установлено, что маститы коров, обусловленные патогенными бактериями распространены повсеместно в молочно-товарных хозяйствах республики и вызывают значительный экономический ущерб. В возникновении мастита у коров большую роль играют патогенные стафилококки (46,8 %) и стрептококки (33,3%) .

2. Заболеваемость животных маститом достигает 21,8%. Субклиническая форма мастита коров по сравнению с клинической регистрируется больше в 3,8 раз.

Клиническая форма мастита коров проявляется в форме серозного (11,4%), катарального (60,1%), фибринозного (10,1%), гнойного (6,2%), гнойно-катарального (9,1%) и геморрагического (3,0%).

3. Разработанная лекарственная форма лактовит на основе нитрофурана, сульфаниламида и дибаферола обладает высоким антимикробным действием. Бактериостатическая и бактерицидная активность препарата по отношению к стафилококкам и стрептококкам составляет 7,8 и 15,6 мкг/мл, соответственно.

4.0пределена стабильность физико-химических и биологических свойств препарата при различных температурных режимах в течение 2-х лет. Лактовит стабильно сохранял активность в течение 18 месяцев.

5. Установлено, что препарат относится к категории малотоксических соединений, не оказывает местного раздражающего и аллергизирующего действий.

6. Определены ограничительные сроки использования молока в пищевых целях от коров в период внутрицистернального применения лактовита и последующих двух суток.

7.0тработана технология приготовления, контроля и применения препарата. Показано, что наилучший терапевтический эффект достигается при внутрицистернальном введении лактовита больным маститом коров в дозе 10 мл два раза в день в течение 3-4 дней.

8. Результаты производственного испытания препарата лактовит при различных формах мастита коров показали, что его терапевтическая эффективность составляет 92,0 - 97,0%.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Инструкция по изготовлению и контролю препарата лактовит для лечения мастита животных (одобрено Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г. утв., ГУВ МСХ РТ, 2004)

2. Технические условия на препарат лактовит (одобрено Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2004)

3. Наставление по применению лактовита для лечения мастита животных (одобрено Ученым Советом Тадж НИВИ, пр. № 2 от 30. 04. 2002 г., утв. ГУВ МСХ РТ, 2004)

1.6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Правительство Республики Таджикистан проявляет постоянную заботу о наиболее полном удовлетворении растущих потребностей населения. В успешной реализации продовольственной программы одно из ведущих мест отводится животноводству, дальнейшее развитие которого предполагает 'наряду с увеличением численности поголовья повышение продуктивности животных.

Одним из важнейших факторов, сдерживающих рост молочной продуктивности является мастит, который приводит к резкому уменьшению надоев, ухудшению качества молока и молочного сырья и преждевременной выбраковке животных. В молоке больных маститом нередко содержатся бактерии болезнетворные для человека. При употреблении такого молока у людей могут возникать различного рода расстройства желудочно-кишечного тракта, ангины с последующими осложнениями и- т.п. Диплококковые септицемии и колибактериозы у телят нередко бывают связаны с выпаиванием им молока от больных маститом коров.

В настоящее время установлено, что мастит является одна из основных болезней, обусловливающих выбраковку коров. Около 30

50 % из общего числа выбракованных животных составляют коровы с воспалением вымени и атрофией молочной железы.

В США ежегодно переболевает около 30% коров маститом, а ущерб от этой болезни составляет 1200 млн. долларов. В Англии экономические потери достигают 13- 20 фунтов стерлингов, а в Швейцарии - 30 -40 млн. франков в год. В России в 1997 потери молочной продуктивности на 1 голову при мастите составлял 300 кг в год. Экономический ущерб из-за снижения молочной продуктивности коров, переболевших маститом составил 270 млн. рублей.

Экономический ущерб, наносимый маститом, слагается более чем из 12 различных факторов, среди которых ведущее место занимают: снижение молочной продуктивности; преждевременной выбраковки; затраты на ветеринарные мероприятия; высокая заболеваемость и падеж; снижение оплодотворяемости; заболевание людей, особенно детей зоонозами, желудочно-кишечными и другими расстройствами.

Поэтому в настоящее время селекционная работа в молочном скотоводстве должна быть направлена не только на создание новых парод и популяций скота с ценными хозяйственно-биологическими признаками ( высокая молочная продуктивность, жирномолочность, хорошая скорость молокоотдачи, пригодность к машинному доению, длительность хозяйственного использования, высокие репродуктивные качества, крепкая конституция), но и резистентность к различным заболеваниям, в том числе к маститу.

Причиной неудач при разведении животных, устойчивых к маститу, является одностороння селекция на увеличение продуктивности. Селекционная работа должна предусматривать следующие моменты: исключение из племенного использования коров, пораженным маститом, в качестве матерей быков и быков -производителей, чьи дочери наиболее восприимчивы к маститу.

Для обеспечения высокой молочной продуктивности коров, а также производства молока высокого качества, большое значение имеет предупреждение заболеваний молочной железы.

В последние годы достигнуты определенные успехи в области контроля за маститами. Разработаны и совершенствуются методы диагностики, особенно скрытых маститов. Внедрены в клиническую ветеринарию новые методы этиопатогенетической терапии маститов. Однако, болезнь не ликвидирована и трудно ожидать, что она будет ликвидирована в ближайшие годы. Попытки иммунизации против мастита пока не дали удовлетворительных результатов из-за большого числа возбудителей.

Практические наблюдения показали, что возникновение маститов связано с множеством предрасполагающих факторов, поэтому применение только ветеринарных методов борьбы не может обеспечить ожидаемого эффекта.

Следовательно, наравне с проведением ветеринарно-санитарных мероприятий по борьбе с маститом необходимо проводить и организационно-хозяйственные, агрономические, инженерные и зоотехнические мероприятия.

Во многих странах мира созданы и положительно действуют государственные, или национальные, программы по борьбе с маститом.

Создание государственной программы по борьбе с маститами у крупного рогатого скота в нашей республике сыграла бы огромную роль в профилактике этой болезни и повышении молочной продуктивности животных.

В настоящее время установлено, что мастит возникает во все физиологические периоды. Имеются научные данные и клинические наблюдения о взаимосвязи болезни молочной железы с патологией половых органов. Наиболее часто одновременное поражение органов возникает в послеродовой период. Это объясняется тем, что существует тесная сосудистая связь через лимфо- и кровообращение и функциональная - через нервно-гормональную регуляцию их функции, а также контаминация одной и той же микрофлорой.

Из внешних воздействий наиболее отрицательное влияние на вымя оказывают: механические, физические, биологические и предрасполагающие факторы.

Факторы биологической этиологии возникают вследствие действия специальных инфекций ( туберкулез, ящур, актиномикоз, оспа), а также возбудителей неспецифических инфекций (стафилококки, стрептококки, бактерии группы кишечной палочки, синегнойная палочка, сальмонеллы, микоплазмы, кандидамикозы, корнебактерии и др.) порознь или в различных ассоциациях, проявляющие болезнетворное действие на фоне ослабленной естественной резистентности организма.

Учитывая частую сочетаемость болезней матки с маститом или мастита с метритом, необходимо при выявлении мастита тщательно исследовать половые органы на их состояние, а при установлении патологии матки - вымя на клинический и скрытый мастит для проведения совместного комплексного лечения болезни. Установлено, что если один патологический процесс протекает в клинически выраженной форме, то смежный, как правило, в скрытой или слабозаметной форме.

В ответ на действие отрицательных факторов в молочной железе наступает резкое расстройство ее функций, связанных с выведением альвеолярного молока в молочные ходы и цистерну вымени, и гемо- и лимфообразования. Это приводит к застою молока, увеличению внутритканевого давления, нарушению крово- и лимфотока и расстройству питания тканей вымени, при этом усиливается проницаемость кровеносных сосудов, вследствие чего в очаг воспаления проникает жидкая часть крови с высоким содержанием белков, а также форменные элементы крови.

В начале заболевания маститом в большинстве случаев развивается асептический воспалительный процесс вымени, а затем он осложняется микрофлорой.

Инфицирующие вымя микроорганизмы почти всегда попадают в молочную железу через просвет соскового канала, в связи с обратным током молока, которое возникает в связи с разностью давления в подсосковой камере.

Кроме этого микроорганизмы попадают в вымя через сосковый канал при лежании коров на грязных полах, инфицированных выделениями от коров больных маститом или при заболевании половых органов.

Под действием микроорганизмов происходит распад белков молока, повышается щелочность секрета, в нем появляются сгустки и хлопья. Мастит вызывает уменьшение содержания в молоке казеина, лактозы, витамина С, увеличение концентрации хлоридов и резкое повышение щелочной реакции.

В этой связи своевременная и правильная диагностика мастита коров с применением клинических и лабораторных методов исследования является главным в борьбе с маститами коров.

Стоимость рациональной профилактики маститов обычно во много раз ниже, чем экономический ущерб, наносимый болезнью, включая стоимость недополученного молока. В идеале программа профилактики борьбы с маститом в хозяйствах должна включить в себя комплекс следующих мероприятий: организационно-хозяйственных, инженерных, зоотехнических, агрономических и ветеринарно-санитарных.

Основная цель лечебной помощи животным при маститах-устранение воспалительного процесса в тканях вымени и восстановление молочной продуктивности. Каждый час отсутствия квалифицированной ветеринарной помощи увеличивает риск потери функциональной способности вымени или даже коровы. Поэтому лечение должно быть своевременным: чем раньше оно начато, тем благоприятнее исход заболевания.

В настоящее время для терапии животных, больных маститами, предложено множество методов и лекарственных средств. Однако, эффективность их разная, к сожалению, через 2-3 лактации основная масса животных выбраковывается с диагнозами: гипогалактия, агалактия, атрофия четвертей вымени, индурация, абцедирование, гангрена и другие.

Такая низкая терапевтическая результативность объясняется зачастую отсутствием условий для проведения леченой работы, лечением без проведения лабораторных исследований секрета вымени, недостаточным кормлением и доением больных животных.

Терапевтическая эффективность зависит не только от выбора лекарственного средства или сочетанного его применения и пути их введения.

Для лечения животных при Мастите существует много методов и лекарственных средств, однако предпочтение отдают антибиотикам широкого спектра действия, сульфаниламидам и производным нитрофурана. При этом наиболее часто применяют мастисан А, Б и Е., мастицид, мастаэрозоль, дифурол-А, менэрсин А, мстивален, лактопен, неотил, аэродит и др.

Результаты научно-практические исследования В.А. Парикова и др. (2000) по сравнительной оценке терапевтической активности различных препаратов при маститах у коров показали, что при лечении больных маститом коров в лактационном периоде предпочтение отдается тем препаратам, которые в своем составе не содержать антибиотики (диофур, дифурол, дифумаст), чтобы не допускать потери молока. В то же время в периоды запуска и сухостоя необходимо использовать для лечения препараты широкого спектра действия, содержащие антибиотики ( диеномаст, эримаст, колимаст, тетрамаст, эроксимаст).

Все химиотерапевтические препараты, в том числе и антибиотики. По своей природе обладают избирательной активностью по отношению к микроорганизмам, которая изменяется при выработке изменчивости к ним.

С учетом вышеизложенного разработка эффективных противомаститных препаратов на основе нитрофурана, сульфаниламида и координационных соединений железа играет большую роль в успешной борьбе с маститами коров.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материал и .методы исследования

Работа выполнена в период 1999-2004 гг в Таджикском аграрном университете и Научно-исследовательском ветеринарном институте Таджикской академии сельскохозяйственных наук.

Экспериментальные и производственные опыты проведены в 13 животноводческих хозяйствах республики.

В опытах использовали 120 белых мышей, крыс, 34 кролика и материалы от 1417 коров. Распространенность мастита коров по республике определяли по данным ветеринарной отчетности и результатам исследований патологического материала от животных.

Диагностику мастита проводили на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов бактериологического исследования секрета пораженной доли вымени или кусочков от пораженной доли паренхимы по общепринятой методике (утв. ГУВ МСХ СССР, 1973).

Клинические формы мастита определяли методом клинического осмотра вымени и по изменению внешних признаков молока. Клинически больными маститами считали животных, имеющих в вымени и молоке заметные отклонения от нормы, свойственные различным формам воспаления молочной железы. Субклинические формы воспаления молочной железы коровы выявили с помощью препарата димастин, пробой отстаивания и иногда подсчетом клеточных элементов молока.

Для исследования молока готовили 5%-ный раствор димастина на дистиллированной воде. Исследования проводили при помощи молочно-контрольных пластинок. В каждое углубление этой

41. L f'OCCHltCKAP I пластинки из соответствующей четверти вымени надаивали по 1 мл молока и из бутылки с автоматом - клювиком добавляли 1 мл раствора димастина. Смесь молока с реактивом перемешивали палочкой в течение 30 секунд. Реакцию учитывали в крестах по густоте желе и по изменению цвета, как дополнительного показателя.

1. Отрицательная реакция - однородная жидкость и цвет смеси - оранжевый или оранжево-красный.

2. Сомнительная реакция г следы образования желе и цвет смеси - желтый.

3. Положительная реакция - ясно видимый сгусток, который при перемешивании палочкой наполовину или целиком выбрасывается из луночки пластинки, цвет смеси красный.

Для постановки пробы отстаивания из каждой доли вымени коров, дающей положительную реакцию с димастином после окончания дойки, надаивали в пробирки по 10-15 мл молока. Пробы ставили в холодильник (4-8 С) через 16-18 часов, учитывали реакцию. При наличии на дне пробирки осадка высотой более 0,1 см реакцию считали положительной.

Молоко /секрет вымени/ для бактериологического исследования брали из последних порций удоя непосредственно после окончания доения в стерильные пробирки с ватными пробками, с соблюдением правил асептики. Для этого перед взятием молока вымя коров подмывали и вытирали чистым полотенцем. Соски протирали ватным тампоном, смоченным 70 денатурированным спиртом. При выдаивании молока старались, чтобы соски не касались края пробирок.

Исследование пробы молока на наличие патогенных стафилококков. Доставленные в лабораторию пробы молока, после смешивания высевали на МПА, содержащей 7,5% поваренной соли.

Для этого 1-2 капли молока наносили на поверхность питательной среды в чашку Петри и растирали ее по всей поверхности агара стерильным шпателем, приготовленным на пастеровской пипетки. Засеянные чашки в положении крышкой вниз, выдерживали в термостате при температуре 37 °С, в течение 24 часов.

При получении однородной по морфологии популяции культуры для дальнейшего исследования брали по одной колонии с чашки. Если колонии были различны, то брали по одной колонии каждого образца.

У выделенных штаммов стафилококков изучали: морфологические, культуральные, гемолитические, плазмокоагулирующие, пигментообразующие свойства, а также способность ферментировать среды с углеводами.

Морфологические и культуральные свойства стафилококков изучали по характеру роста на МПА и МПБ. Кроме того после выращивания на МПА в термостате при температуре 37° С в течение 24 часов, для определения формы и расположения кокков из выросших культур готовили мазки, окрашивали по Граму и микроскопировали.

Пигментообразующие свойства стафилококков определили путем выращивания на МПА в течение 24 часов при температуре 37° С последующим выдерживанием в течение 2-3 дней при комнатной температуре.

Гемолитические свойства выделенных штаммов отмечали после просмотра посева на МПА, содержащего 5,0% крови барана.

Для приготовления кровяного агара к расплавленному МПА с температурой не выше 55°С добавляли 5% дефибринированной крови барана. После перемешивания кругообразным движением агар разливали по чашкам. Посев на кровяной агар производили из культур стафилококков, выращенных в МПБ. Через 24 часа у выращенных культур, определяли тип гемолиза. При этом учитывали окраску зоны гемолиза: бета-зелено-оливковой цвет, альфа - в виде бесцветного прозрачного поля вокруг колоний микробов.

Плазмокоагулирующие свойства изучали в реакции плазмокоагуляции с плазмой крови кролика. Кровь брали из сердца кролика в центрифужную пробирку, со стерильным 5%-ным раствором лимонно-кислого натрия, в соотношении 4:1 и центрифугировали. Полученную плазму разводили стерильным физиологическим раствором в соотношении 1:4, разливали в агглютинационные пробирки, по 0,5 мл.

Затем 12-18 часовую бульонную культуру испытуемого штамма стафилококка вносили по 2 капли в пробирку с разведенной плазмой. Посевы ставили в термостат при температуре 37 С. В качестве контроля в термостат помещали пробирки, одна из которых содержала смесь плазмы с физиологическим раствором, а другая с заведомо коагулазоположительной культурой стафилококка. Наблюдения за реакцией проводили после 1, 2, 3, 4, 6, 18, 24 часа. Коагуляцию плазмы определяли путем переворачивания пробирок. При этом, если содержимое пробирки образовало густое желе и не выливалось, то реакцию считали положительной. При отрицательной же реакции содержимое пробирок оставалось жидким.

Способность ферментировать маннит. В пробирки, содержащие пептонную воду и индикаторы с добавлением 0,5% маннита, вносили каплю свежей бульонной культуры испытуемого штамма стафилококка. Среду выдерживали в термостате при температуре 37 С. Посевы проверяли ежедневно в течение 7 суток. При наличии пузырков газа внутри поплавка и окрашивании среды в розовый цвет считали доказанным расщепление углевода, а только розовое окрашивание среды указывало нарасщепление

Для обнаружения патогенных стрептококков исследуемые пробы засевали на среду накопления, В.М.Карташовой, которую готовили следующим образом: к 500 мл. МПБ с РН-7, 2-7,3 добавляли 2,5 г лактозы, 1 мл спиртово-водного раствора бромкрезолпурпура (соотношение 1:100), затем МПБ ставили в водяную баню, доводили до кипения и кипятили 5-7 мин. После остывания до 50-55 в колбу добавляли 50 мл стерильной сыворотки без консерванта и 0,5 мл раствора неомицина содержащего 2500 ед. антибиотика. В стерильных условиях приготовленную среду разливали по 5 мл в пробирки.

Посевы выдерживали в термостате при температуре 37°С в течение 24 часов. Изменение сине-фиолетового цвета среды в лимонный или желто-зеленый указывало на рост стрептококков. Из пробирок с измененным цветом готовили мазки, окрашивали по Граму и микроскопировали. При наличии в мазках окрашенных грамположительно стрептококков их пересевали на мясопептонный агар, содержащий 5,0% эритроцитов крови барана.

Посевы выдерживали в термостате при 37 °С в течение 24 часов. После чего определяли тип гемолиза.

Для дифференциации агалактийного стрептококка с выделенными гемалотическими стрептококками ставили КАМП-тест. Для этого суточную культуру бета-гемолитического стафилококка высевали на МПА с 5,0% крови барана. Посев делали петлей сплошной линией по диаметру чашки. Перпендикулярную к линии посева стафилококка, не доходя.5-6 мм высевали ровным штрихом испытуемую культуру стрептококка. Чашки помещали в термостат на 24 часа при температуре 37°С.

При наличии четко выраженного гемолиза в виде усеченного треугольника или полукруга в зоне бета-гемолитического стрептококка испытуемых культуру считали КАМП-положительной.

Кроме того, для дифференциации выделенных штаммов стрептококков их высевали в бульон с 6,5% хлористого натрия с 40,0% желчи крупного рогатого скота и на 5 мл стерильно обезжиренного молока с добавлением 0,5 мл 1,0%-го раствора метиленовой сини, а также в бульон с 0,5% сорбита.

Для изучения сахаролитических свойств, выделенные штаммы стрептококков высевали в среды, содержащие глюкозу, лактозу, сахарозу, мальтозу и раффинозу.

Морфологические и дсультуральные свойства бактерий группы кишечной палочки были изучены у 11 штаммов. Все выделенные штаммы хорошо росли на обычных питательных средах. На МПА образовали серовато-белые, сочные колонии, легко сливающимся между собой. В МПБ росли с образованием помутнения, с последующим образованием осадка, легко разбивающегося при встряхивании. На среде Эндо колонии красного цвета с металлическим отблеском или без него.

В мазках, окрашенных по Граму, бактерии имели вид палочек с закруглыми концами, окрашенные грамотрицательно.

Для выделения бактерий группы кишечной палочки высевы молока производили на среду 'накопления Карташовой, в состав которой входили следующие компоненты: 10 г пептона, 10 г лактозы, 5 г хлористого натрия, 12 г порошкообразного сульфаната, 2 мл брореволпурпура в разведении 1:1000 мл стерильной дистиллированной воды, рН = 7,8. после добавления всех компонентов среду стерилизовали при 0,5 атм. в течение 15-20 минут. После разлива среды в пробирки, производили посев молока. Пробирки с посевами выдерживали в термостате при 370С в течение 24 часов. При наличии изменения цвета среды из сине-сиреневого в ярко-зеленый с помутнением делали дробные высевы на чашки с агаром

Эндо. Мазки из выросших выпуклых, округлой формы колонии, красного цвета с металлическим оттенком или без него, окрашивали по Граму и микроскопировали.

Если морфологии бактерий в мазке была схожа с морфологией семейства кишечных бактерий, то колонам отсевали на МПА и для дальнейшего исследования.

У выделенных нами культур изучали следующие свойства: гемолитические, ферментацию Сахаров, образование сероводорода и индола, образование ацетилометилкарбонила из глюкозы (реакция Фогес-Проскауэра), подвижность, патогенность для белых мышей и серологические свойства.

Для изучения сахаролитических свойств из суточной бульонной культуры испытуемых штаммов, делали посевы на среды с глюкозой, лактозой, сахарозой, мальтозой, маннитом и дульцитом.

Образование ацетилметилкарбинола определяли при помощи реакции Фогес-Проскауэра. Для этого к 5 мл четырехсуточной культуры испытуемых штаммов кишечной палочки на среде Кларка добавляли 5 мл 10% раствора едкого калия. Смесь помещали в термостат при температуре 37° С. Учет реакции проводили через 18-24 часа. При положительной реакции, в результате образования в среде ацетилметилкарбинола, появлялось розовое окрашивание среды. При отрицательной реакция среда оставалась без изменения.

Образование сероводорода у выделенных штаммов кишечной палочки определяли с помощью полоски фильтровальной бумаги, смоченной 10% раствором уксуснокислого свинца. Свинцовые бумажки фиксировали ватной пробкой в пробирке с посевом. Реакцию считали положительной если от образовавшегося сероводорода наступало почернение полоски фильтровальной бумаги. При отсутствии изменения цвета бумаги, реакцию считали отрицательной.

Серологические свойства выделенных штаммов группы кишечной палочки изучали в реакции агглютинации с типовыми «О моно и поливалентными агглютинирующими колисыворотками. Предварительно реакцию ставили с поливалентной сывороткой. Для постановки реакция агглютинации на предметное стекло наносили каплю поливалентной агглютинирующей сыворотки. Затем в эту каплю платиновой петлей вносили часть испытуемой колонии и хорошо перемешивали. Реакцию учитывали в течение первой минуты при покачивании стекла. Положительная реакция характеризовалась образованием агглютината в виде комочков и зернышек с полным или частичным просветлением жидкости. К отрицательной реакции относили те штаммы, которые в капле сыворотки образовали равномерную муть.

Штаммы кишечной палочек, давшие положительную реакцию агглютинации с поливалентной агглютинирующей сывороткой, пересевали на скошенный МПА и через 19-24 часа роста культуры типировали в капельной реакции агглютинации на стекле при помощи моновалентных сывороток, предварительно разведенных физиологическим раствором в соотношении 1:10. культуры кишечных палочек, давших положительную реакцию на стекле с моновалентными сыворотками, исследовали с соответствующей моновалентной сывороткой в пробирочной реакции агглютинации.

Пробирочную реакцию агглютинации ставили в объеме 1 мл в пробирках. Для этого соответствующую моновалентную агглютинирующую сыворотку разводили в двух рядах пробирок стерильным физиологическим раствором в разведениях: 1:25, 1:50, 1:100, 1:200 и т.д. до предельного титра. В каждой пробирке обоих рядов наливали по 0,5 мл сыворотки соответствующего разведения. Для реакции готовили антиген путем смыва физиологическим раствором исследуемой культуры;после 18-24 часового роста на МПА. Густота взвеси доводилась до 500 млн микробных тел в 1 мл по стандарту мутности. В каждую пробирку первого ряда добавляли по 0,5 мл антигена, прогретого в водяной бане в течение 1,5 часа при температуре 100°С, в пробирки второго ряда вносили по 0,5 мл антигена не подвергавшегося нагреванию (живая взвесь микробов).

После внесения антигенов пробирки выдерживали в термостате при 37°С в течение 18-20 часов. Одновременно ставили контроли на самоагглютинирующие свойства прогретого и не подвергавшегося прогреванию антигенов и соответствующей агглютинирующей сыворотке (1 мл в наименьшем разведении 1:25).

Реакцию учитывали при помощи лупы. Положительной считали агглютинацию при условии просветления жидкости и образования на две пробирки осадка склеенных микробов в форме раскрытого зонтика, разбивающегося при встряхивании на отдельные зернышки хлопья. Реакцию считали отрицательной, когда на дне пробирки образовался точкообразный осадок, который при встряхивании легко разбивался и давал равномерную взвесь.

В работе применяли препарат лактовит, разработанный нами совместно с доктором химических наук, профессором 3. Н. Юсуповым и кандидатом химических наук, доцентом У. Р. Раджабовым.

Антимикробную активность испытуемого препарата в отношении патогенных возбудителей мастита коров изучали in vitro в жидкой питательной среде методом последовательных разведений.

Минимальное количество препарата, дающее полную видимую задержку роста культуры (прозрачный бульон), соответствовало минимальной подавляющей концентрации (МПК) препарата и по нему определялась степень чувствительности бактерий.

Для установления бактерицидного действия лактовита, из последних, прозрачных пробирок после осторожного взбалтывания жидкости проводили посев на мясо-пептонный агар. Наименьшую концентрацию лактовита в пробирке посев из которой при инкубации в течение 48-72 ч не дал роста в питательной среде, принимали за минимальную бактерицидную концентрацию.

Стерильность препарата определяли на питательных средах: МПБ, сусло-агар, среды Китт-Тароцци и Чапека по общепринятой методике.

Безвредность препарата лактовит изучали в соответствии с «Методическим указанием по определению токсических свойств препаратов, применяемых в ветеринарии и животноводстве» (утв. ГУВ Госагропрома СССР, 1987).

При этом определяли острую и хроническую токсичность препарата. Оценивали действие препарата на массу, температуры тела, поведенческие реакции, анафилактического и раздражающего действия на лабораторных животных.

Для определения сроков годности лактовита образцы отобрали и заложили на хранение 14 серий - при режиме 4-8°С и 20-25° С. По истечению определенного срока образцы подвергли исследованию на стерильность, безвредность и суммарную биологическую активность.

Остаточное количество ингибирующих веществ в молоке коров , после применения препарата лактовит определяли на 20 головах лактирующих коров методами последовательных разведений на жидкой питательной среде и диффузии в агар.

В экспериментальных условиях терапевтическая эффективность препарата лактовит при мастите коров изучалась в сравнении с известным препаратом мастисан А.

Эффективность препарата при различных формах мастита коров в экспериментальных и производственных условиях определяли на 310 гол. С этой целью животным опытных групп вводили лактовит внутрицистернально в дозе 10 мл на голову два раза в день в течение 3-5 дней. Животные контрольной группы получали мастисан Л согласно наставлению по его применению. Учет результатов проводили путем контроля за состоянием здоровья вымени в течение всего периода лечения и в конце опыта для исключения возможных рецидивов и осложнений.

Статистическую обработку полученных результатов проводили по общепринятой в биологии методов.