Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка технологии промышленного производства пробиотического препарата Бифилакт

РАХМАНИН Павел Сергеевич 003056948

Разработка технологии промышленного производства пробиотического препарата Бифилакт

Специальность 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

003056948

РАХМАНИН Павел Сергеевич

Разработка технологии промышленного производства пробиотического препарата Бифилакт

Специальность 16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Работа выполнена в отделе противобактерийных препаратов ВНИТИБП, на бактерийном производстве ФГУП «Щелковский биокомбинат», кафедре клинической диагностики ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, Московской областной ветлаборатории, СПК «Новое Литвинове» Щелковского района, Московской области.

Научные руководители:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор ветеринарных наук, профессор,

академик РАСХН

Самуйленко Анатолий Яковлевич

доктор биологических наук Малик Нина Ивановна

доктор ветеринарных наук, профессор Белоусов Василий Иванович

доктор биологических наук, профессор Дьяконов Лев Петрович

ГОУ ВПО Московский государственный университет прикладной биотехнологии

Защита диссертации состоится «Я » ОЦЧ/СщлЯ 2007 г. в

т

часов

на заседании диссертационного совета по зДците диссертаций на соискание ученой степени доктора наук Д 006.069.01 во Всероссийском научно-исследовательском и технологическом институте биологической промышленности РАСХН по адресу: 141142, Московская область, Щелковский район, п/о Кашинцево, пос. Биокомбинат.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВНИТИБП. Автореферат разослан 2007 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Ю.Д.Фролов

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Исследования последних лет выявили большое количество новых заболеваний, названных болезнями индустриализации. Постоянные стрессовые воздействия на поголовье животных и птиц, несбалансированное кормление, нарушение общепринятых норм санитарной гигиены и другие отрицательные факторы приводят к значительным изменениям микроорганизмов желудочно-кишечного тракта, изменению популяцион-ного уровня кишечных бактерий (Тараканов Б.В., 1987 г.; Воронин Е.С., Дев-ришов Д.А., Ставцева Л.Я., 1989 г.; Панин А.Н., Малик Н.И., 1999 г.; Сидоров H.A., Субботин В.В., 2000; Субботин В.В., Сидоров М.А., 2001 г.; Малик Н.И., Панин А.Н., 2001 г.; Малик Н.И., 2002 г.).

Ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства заставило пересмотреть многие методические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом болезней, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора, и признать необходимость разработки нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных (Сафонов Г.А., Калинина Т.А., Романова В .П., 1992 г.; Панин А.Н., Серых Н.И., 1993 г.; Сидоров М.А., Субботин В .В., 1998 г.; Тихонов И.В., Гаврилов В.А., 2003 г.).

Наиболее полно этим требованиям могут отвечать пробиотические препараты, в состав которых входят живые бактерии из числа основных представителей нормального кишечного биоценоза, такие как лактобациллы, бифидобактерии, стрептококки. Использование пробиотиков в ветеринарии затрагивает довольно широкий круг проблем, начиная от коррекции кишечного биоценоза и распространении на коррекцию иммунной, гормональной и ферментной систем молодняка животных (Вилыпанская Ф.Л., 1987 г.; Сидоров М.А., Скородумов Д.И., Федотов В.Б., 1995 г.; Грачева Н.М., Партий О.С., Леонтьева Н.И., 1996 г.; Парфенов А.И., 1998 г., Малик Н.И., 2002 г.).

Потребность в пробиотиках привела к тому, что для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней животных и птицы стали использовать препараты медицинского назначения. Поэтому ряд отечественных и зарубежных ученых считают, что разработка новых пробиотиков является актуальной задачей, т.к. данные препараты представляют собой отдельный класс биологических препаратов, успешно применяемых вместо антибиотиков (Козлова Э.П., Курносова H.A., Феклисова Л.В., 1986 г., Дебабов В.Г.,

Лившиц В .А., 1988 г., Каширская Н.Ю., 2000 г.; Малик Н.И., Панин А.Н., 2001 г.).

Наиболее часто из имеющихся пробиотических групп используются молочнокислые бактерии - лактобациллы, стрептококки, энтерококки, бифи-добактерии. Акцент на использование молочнокислых бактерий происходит частично от факта существования свидетельства, что молочнокислые бактерии играют главенствующую роль в кишечной флоре, влияя на ее состав благоприятным для хозяина образом.

Способ введения препарата должен также учитываться при оценке результатов испытания пробиотиков. Правильный выбор должен быть сделан между использованием порошка, добавляемого в корм или воду; пасты или таблетки для индивидуального введения; или аэрозоля для соответствующего применения.

Разработка и внедрение в практику ветеринарной медицины новых высокоэффективных препаратов отечественного производства для лечения и профилактики болезней животных и птицы представляет собой задачу, актуальность которой не вызывает сомнения.

Цели и задачи исследования. Цель настоящих исследований — разработка промышленной технологии получения пробиотического препарата ветеринарного назначения Бифилакт и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Разработать жидкие питательные среды для культивирования пробиотических штаммов.

2. Разработать технологический процесс глубинного культивирования производственных штаммов лакто- и бифидобактерий в биоферментере.

3. Разработать технологию приготовления жидкой и сухой форм пробиотика.

4. Разработать временную технологическую и нормативно-техническую документацию на препарат.

5. Приготовить опытные образцы пробиотического препарата и изучить его биологические свойства.

6. Отработать схемы применения разработанных препаратов в реальных условиях свиноводческих хозяйств.

7. Изучить лечебно-профилактическую эффективность пробиотика Бифилакт, полученного по разработанной технологии, при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

Научная новизна исследований.

1. Разработана промышленная технология производства лакто- и бифидо-бактерий в биоферментерах с использованием жидких питательных сред из недорогого, доступного отечественного сырья.

2. Разработана технология приготовления жидкой и сухой форм пробиотика Бифилакт.

3. Разработана временная нормативно-техническая и технологическая документация на пробиотик ветеринарного назначения Бифилакт.

4. Приготовлены опытные образцы пробиотика Бифилакт и изучены его биологические свойства. Показано, что разработанные препараты обладают высокими биологическими свойствами, отличающими их от других пробиотиков: подавление размножения патогенных и условно-патогенных бактерий (стафилококков, сальмонелл и др.), стимуляция роста лакто- и бифидобактерий in vitro и в желудочно-кишечном тракте молодняка свиней.

5. Проведены исследования по отработке схем применения разработанного пробиотика Бифилакт в свиноводческом хозяйстве репродукторного типа. Разработана временная инструкция по применению пробиотика Бифилакт при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

6. Рассчитана и показана лечебно-профилактическая эффективность применения разработанных препаратов при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

Практическая значимость.

1. Разработана рецептура питательных сред из недорогого, доступного отечественного сырья, отработана методика и техника их приготовления.

2. Разработана технология глубинного культивирования пробиотических штаммов бифидо- и лактобактерий.

3. Разработана и апробирована технологическая схема производства жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт.

4. Подготовлена временная технологическая инструкция и технические условия (ТУ), утвержденные директором ВНИТИБП.

5. Опытные образцы жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт прошли испытания с положительным результатом в лабораторных условиях и в свиноводческом хозяйстве репродукторного типа.

6. В опытах на поросятах-сосунах и поросятах-отъемышах определено влияние Бифилакта на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных, показана высокая лечебно-профилактическая

эффективность пробиотика Бифилакт, подтвержденная актами из свиноводческих хозяйств. 7. Разработана и утверждена директором ВНИТИБП временная инструкция по применению пробиотического препарата Бифилакт для профилактики и лечения дисбактериозов молодняка свиней.

Апробация работы.

Основные результаты проведенных исследований изложены в 2-х научных отчетах («Разработка опытно-промышленной технологии культивирования и стабилизации лакто- и бифидобактерий в биоферментерах» 2005 г., «Испытание лечебно-профилактической эффективности разных лекарственных форм при желудочно-кишечных заболеваниях в условиях свиноводческих хозяйств» 2006 г. и доложены:

- на Международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (Санкт-Петербург, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Троицк, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 35-летию ВНИТИБП, (Щелково, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006).

Публикации. По теме диссертации и материалам проведенных исследований опубликовано 9 статей в сборниках Международных научно-практических конференций и симпозиумов, отечественных специализированных научных журналах.

Структура и объем диссертации. Материалы диссертации изложены на_страницах компьютерного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, практические предложения, список использованной литературы (211 источников, из которых 135 отечественных и 76 зарубежных исследователей). Работа содержит 27 таблиц, 11 рисунков и приложения.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанный технологический процесс глубинного культивирования бифидо- и лактобактерий в лабораторных и промышленных биоферментерах.

2. Разработанная жидкая питательная среда из недорогого отечественного сырья для культивирования пробиотических штаммов.

3. Разработанная технология производства жидкой и сухой форм пробиоти-ческого препарата Бифилакт. Определена аппаратурная технологическая схема производства пробиотика Бифилакт.

4. Разработанная временная технологическая и нормативно-техническая документация на пробиотик Бифилакт.

5. Приготовлены опытные образцы пробиотического препарата Бифилакт и изучены его биологические свойства.

6. Отработанные схемы применения разработанных пробиотических препаратов в условиях свиноводческого хозяйства.

7. Результаты изучения лечебно-профилактической эффективности жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Работа выполнена в период с 2004 по 2007 годы в отделе противобак-терийных препаратов ВНИТИБП, на бактерийном производстве ФГУП «Щелковский биокомбинат», кафедре клинической диагностики ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, Московской областной ветбаклаборатории, СПК «Новое Литвинове» Московской области.

Микроорганизмы

Штамм бактерий - Bifidobacterium adolescentis ВКПМ АС-1245 был получен из Всероссийской Коллекции Промышленных Микроорганизмов ФГУП ГосНИИГенетика с целью отработки- технологии глубинного культивирования в ферментерах и использования его как основного из компонентов пробиотика Бифилакт ветеринарного назначения.

Штамм лактобактерий - Lactobacillus acidophilus А-105 был получен из Всероссийской государственной коллекции штаммов, используемых в ветеринарии и животноводстве (ФГУ ВГНКИ).

Использованные штаммы с паспортами на каждый штамм, характеризующими морфологические, культуральные и биохимические свойства, характерные для данных видов микроорганизмов, обладают высокой антагони-

стической активностью по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, устойчивые к воздействию антибиотиков, использовались в наших исследованиях по разработке технологии производства пробиотиче-ского препарата Бифилакт.

Экспериментальные животные В экспериментах по изучению пробиотических культур и опытных образцов пробиотических препаратов были использованы 290 белых мышей массой 16-18 г, 53 поросят-сосунов и 189 поросят послеотьемного периода.

Материалы, питательные среды, растворы, реактивы При разработке технологии глубинного культивирования штаммов би-фидо- и лактобактерий — компонентов пробиотических препаратов использовали стандартные и модифицированные питательные среды, а также разработанные нами в ходе проведения исследований жидкие питательные среды из следующих основ: ферментативный гидролизат мяса по Хоттингеру, соляно-кислотный гидролизат казеина, ферментативный кислотно-дрожжевой гидролизат казеина (ФКДГ), панкреатический гидролизат обезжиренного коровьего молока с добавлением молочной (творожной) сыворотки.

В работе использовали сухое обезжиренное молоко Грязовецкого молочного комбината Вологодской области, панкреатин импортный (Германия), концентрированную соляную кислоту, воду дистиллированную, воду водопроводную, фосфатный буфер, физиологический раствор, МПА, МПБ, глюкозу и другие химические реактивы и растворы, необходимые для выполнения настоящей работы.

Использовали сырье, материалы и реактивы, отвечающие требованиям действующих нормативных документов.

Технологическое оборудование Культивирование B.adolescentis и L.acidophilus начинали с приготовления расплодок из лиофильно высушенных штаммов и проводили в бактериологических пробирках, флаконах объемом 0,1 дм3, 0,2 дм3 и 0,45 дм3 на шут-тель-аппаратах с амплитудой перемешивания 60 мм и скоростью 120 оборотов в минуту в термостате при температуре 37°С.

Культивирование опытных серий пробиотических моноштаммных культур проводили в ферментерах АНКУМ-2М, емкостью 10 дм3, ферментерах «Электролюкс» (Швеция), емкостью 100 дм3.

Оптическую плотность нативных культур бифидо- и лактобактерий определяли с помощью фотоэлектрического колориметра ФЭК-56 и КФК-2-

УХЛ 4.2, а рН - иономером универсальным ЭВ-74, рН-метром - милливольтметром рН-121.

Концентрирование нативных культур проводили на рефрижераторной центрифуге К-70Д (для малых объемов) и на осадительной проточной центрифуге 7-41 (фирмы «СЕРА», Германия) при скорости вращения 20000 оборотов в минуту и факторе разделения равным 12000 q для культур выращенных в АНКУМ-2М.

Для концентрирования культур, выращенных в ферментере «Электролюкс», использовали осветляющую центрифугу ОТР 101-К.

Для обезвоживания микробной массы бифидо- и лактобактерий использовали сублимационный аппарат ТГ-50 (ГДР).

Смешивание лиофилизированных монокультур бифидо- и лактобактерий проводили в барабанном смесителе (производства Чехословакии) с 1 кг стальных шариков диаметром от 6 до 14 мм.

Методы исследований

рН питательных сред и растворов определяли потенциометрическим методом.

Аминный азот - методом формольного титрования по Зеренсен-Гаврилову.

Для определения подлинности белковых гидролизатов использовали реакцию с биуретовым фосфатно-вольфрамовым реактивом.

Оценку эффективности жидких питательных сред проводили на ФЭК-56 и КФК-2- УХЛ 4.2 по изменению оптической плотности культур за период инкубации посевов.

Общую концентрацию микроорганизмов определяли методом последовательных десятикратных разведений испытуемого микробного материала в 0,85%-ном растворе хлорида натрия с последующим подсчетом количества микробных клеток в камере Горяева.

Концентрацию живых микроорганизмов определяли методом последовательных десятикратных разведений испытуемого микробного материала в 0,85%-ном растворе хлорида натрия с последующим его высевом на МПА в чашки Петри. После 24 ч инкубации при температуре 37°С проводили подсчет выросших колоний.

Влажность сухой формы препарата определяли по разности массы проб до и после высушивания при температуре 105±2°С.

Лечебно-профилактическую эффективность препарата Бифилакт оценивали в контрольных опытах на поросятах-сосунах и поросятах послеоть-

емного периода. Учитывали заболеваемость желудочно-кишечными болезнями в хозяйстве, общую сохранность, прирост живой массы (привесы) у опытных и контрольных животных. Результаты клинических испытаний подтверждали данными бактериологических исследований микрофлоры желудочно-кишечного тракта и лабораторными анализами крови и сыворотки крови по гематологическим, биохимическим и иммунологическим показателям.

Для определения дозы Бифилакта в жидкой и сухой формах, кратности и продолжительности его применения, обеспечивающих профилактический и терапевтический эффект при желудочно-кишечных болезнях поросят их содержали в одинаковых условиях и давали одинаковый рацион кормления.

Для определения лечебно-профилактической эффективности препарата Бифилакт при желудочно-кишечных болезнях поросят были сформированы опытные и контрольные группы поросят-сосунов в возрасте 2-3 недели (53 головы) и поросят-отьемышей в возрасте 60-65 дней (189 голов).

Препарат в сухой форме разводили теплой водой (а нативную форму -без разведения), в равных дозах выпаивали поросятам-сосунам опытных групп из резиновой пипетки, поросятам-отъемышам препарат давали, смешивая его с кормом.

От поросят опытных и контрольных групп брали кровь для проведения гематологических исследований. У всех животных изучали микробный пейзаж кишечника до и после постановки опыта, а затем на 3-й и 10-й дни с начала постановки опыта.

Ежемесячно проводили взвешивание поросят всех групп, определяли живую массу, среднесуточные привесы, учитывали заболеваемость и сохранность животных.

2.2. Результаты исследований 2.2.1. Технология получения пробиотического препарата из бифидо- и лактобактерий

Разработка технологии производства пробиотических препаратов, основанная на глубинном способе культивирования пробиотических штаммов в жидких питательных средах и последующим использованием современного лабораторного и промышленного технологического оборудования, позволяет существенно повысить производственные, экономические, экологические и другие возможности предприятий-производителей пробиотических препаратов.

Для получения бактериальных суспензий В.асМеБсепЙБ и Ь.аЫсЗорИПиБ в биоферментерах АНКУМ-2М исследования проводились в четыре этапа. Этап I. Разработка питательных сред

Для разработки технологии глубинного культивирования микроорганизмов-ком поненетов препарата Бифилакт представлялось целесообразным изучить основные закономерности создания оптимального состава питательных сред и определить условия глубинного культивирования пробиотиче-ских штаммов бифидо- и лактобактерий с целью получения качественных клеточных суспензий с высоким содержанием живых (активных) микроорганизмов.

Учитывая влияние содержания азотистых веществ на развитие и накопление глубинных культур микроорганизмов, были определены два принципиальных момента:

во-первых, желательный уровень содержания в питательной среде общего и аминного азота (как показатель степени расщепления белка);

во-вторых, характер влияния степени расщепления гидролизата на ростовые свойства питательной среды.

В процессе исследований определялся перечень компонентов, процентное и (или) весовое соотношения их из числа азотистых веществ, ростовых и витаминных добавок, отвечающих питательным потребностям В.асЫеБсепйв и Ь.аспс1орЫ1из.

Этап II. Отработка состава жидких питательных сред для

глубинного культивирования бифидо- и лактобактерий В процессе проведения исследований по разработке глубинного способа культивирования В.а<1о1езсепЙ8 была использована питательная среда на основе ферментативного казеиново-дрожжевого гидролизата (ФКДГ).

Для глубинного культивирования Ь.аЫ<1орЫ1и5 была использована питательная среда на основе панкреатического гидролизата обезжиренного молока (ГОМ), обезжиренного молока (ОМ) и молочной сыворотки (МС) в соотношении 0,05 :1,0 :0,3.

Первоначально провели ретроспективный анализ состава, физико-химических характеристик и особенностей приготовления различных серий питательных сред, использованных в экспериментах по глубинному культивированию В.асМеБсепйз и Ь.аа(1орЫ1и8 во флаконах и в ферментерах АН-КУМ-2М, с одной стороны, и ростовых свойств этих сред, с другой стороны.

Установлено, что одной из основных причин низких ростовых свойств питательных сред служила нестандартность исходного сырья. Был разрабо-

тан состав питательных сред следующим образом: во-первых, путем расчета содержания основных компонентов среды с учетом конечных величин амин-ного азота, во-вторых, путем проведения анализа характеристик используемого сырья (общего и аминного азота) и предварительной оценки ростовых свойств микроорганизмов, полученных на данных питательных средах.

С этой целью изучали изменение характеристик нативных культур би-фидо- и лактобактерий и морфологию клеток в процессе их роста при культивировании в течение 24 часов в 100 мл флаконах.

Анализ проб проводили через каждые 3 часа, начиная с 3-го ч культивирования. Было исследовано 16 проб нативных культур (таблица 1).

Таблица I

Характеристика нативных культур В.айоШсепШ и Ь.аыйорНИия

при выращивании во флаконах

Время культивирования, ч Количество микроорганизмов, млрд. м.к. /см3

В. adolescentis L. acidophilus

3 2,42 ± 0,24 2,58 ±0,14

6 4,40 ± 0,12 4,62 ±0,2

9 6,38 ± 0,2 6,46 ± 0,24

12 9,38 ± 0,24 9,34 ±0,12

15 11,12 ±0,26 11,20 ±0,22

18 13,62 ± 0,2 13,64 ±0,24

21 13,24 ± 0,3 14,85 ±0,1

24 12,55 ±0,12 13,40 ± 0,3

Анализ полученной информации сводится к следующему. Максимальные значения показателей концентрации для B.adolescentis были отмечены к 18-му часу культивирования. Максимальное накопление биомассы L.acidophilus было отмечено к 21-му часу культивирования.

Следовательно, B.adolescentis и L.acidophilus при глубинном культивировании в процессе роста достигает максимальной однородности ко времени, индивидуальному для конкретного вида микроорганизмов.

Этап III. Оптимизация условий приготовления и оценка качества посевных культур В. adolescentis и L. acidophilus Качество посевных материалов, включая порядок их приготовления и подготовки к работе, является существенным фактором выращивания микроорганизмов, независимо от способа и аппаратурного оформления процесса культивирования.

Следующая группа экспериментов была направлена на уточнение величины посевной дозы бифидо- и лактобактерий. Культивирование проводили в 100 мл флаконах заполненных по 50 мл питательной среды № 3 для B.adolescentis и питательной среды № 6 для L.acidophilus.

Посевную дозу варьировали от 0,5 до 2,0 млрд.м.к./см3. Результаты экспериментов по 4-м сериям посевных доз представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние посевной дозы па характеристики натиепых культур

В. adolescentis и L. acidophilus

Микроорганизм Посевная доза, млрд.м.к./см3 Биологическая концентрация (млрд.м.к./см ) в нашивной культуре через:

18 ч 24 ч

В. adolescentis 0,5 12,5 ± 0,2 11,12 ±0,3

1,0 14,8 ± 0,2 13,62± 0,2

1,5 13,62 ±0,15 13,24 ±0,4

2,0 13,2 ±0,1 12,55 ±0,2

L. acidophilus 0,5 9,4 ±0,2 13,2 ± 0,2

1,0 12,2 ± 0,2 14,85 ±0,3

1,5 11,4 ±0,2 13,4 ±0,1

2,0 11,8 ±0,3 13,6± 0,2

Этап IV. Культивирование В. adolescentis и L. acidophilus

в биоферментерах Первоначально предстояло оценить эффективность питательных сред применительно к культивированию в АНКУМ-2М, с использованием параметров процесса, рекомендованных для культивирования Salmonella holerae suis TS-177.

Как и при выращивании во флаконах на протяжении проверочных опытов было установлено сохранение всех основных закономерностей роста и развития бактерий, выращенных в ферментерах АНКУМ-2М. Испытанные режимы аэрации при культивировании бифидо- и лактобактерий не сопровождались заметными изменениями характеристик нативных культур. Принятые для АНКУМ-2М параметры культивирования Salmonella holerae suis TS-177 (коэффициент аэрации, продолжительность культивирования, а также число оборотов мешалки) были достаточными для обеспечения полноценного роста испытуемых бактерий, что явилось основанием для заключения о

правильности выбранных режимов культивирования и включения их в регламент производства пробиотика.

Посевной материал вносили в ферментеры из расчета 1 млн. живых бифидо- и лактобактерий на 1 см3 питательной среды. Параметры и режимы глубинного культивирования указанных бактерий представлены в таблице 3.

Таблица 3

Показатели процесса глубинного культивирования бифидо- и лактобактерий

Параметры роста В. adolescentis L. acidophilus

Тип ферментера АНКУМ-2М АНКУМ-2М

Коэффициент заполнения 0,7 0,7

ферментера

Температура, °С 37 ± 1 37±1

рН 7,5 ± 0,1 7,5 ± 0,1

Давление в ферментере, МПа 0,10 ±0,05 0,10 ± 0,05

Коэффициент аэрации, 0,38 ±0,10 0,7 ±0,1

q м3/мин

рО 2,% 15-25 15-25

Частота вращения мешалки, 320 320

об/ мин.

Продолжительность культи- 18 21

вирования, ч

Технологические параметры культивирования B.adolescentis и L.acidophilus и требования к полученным культурам включены во временную технологическую инструкцию производства препарата Бифилакт.

2.2.2. Методы концентрирования нашивных культур В. adolescentis и L. acidophilus Концентрирование бактериальных суспензий при производстве бак-препаратов является широко применяемым методом как в нашей стране, так и за рубежом.

В наших исследованиях при концентрировании пробиотических натив-ных культур B.adolescentis и L.acidophilus использовались проточная осветляющая центрифуга Z-41 (фирмы «СЕРА», Германия).

2.2.3. Приготовление ясидкой формы препарата Бифилакт В практике ветеринарной медицины пробиотические препараты из би-фидо- и лактобатерий используются в сухой форме. Однако жидкая лекарственная форма удобна в применении, так как не требует предварительной подготовки перед дачей животным, равномерно смешивается с сухим и жидким кормом, с водой, молоком, имеет низкую себестоимость по сравнению с сухими пробиотиками.

Учитывая опыт приготовления жидких лекарственных форм вакцинных препаратов на основе живых бактерий, были проведены исследования по изысканию стабилизирующих добавок, способствующих сохранению биологической активности Бифилакта. Как наиболее широко применяемые и доступные вещества использовали глицерин и фенол.

После концентрирования нативных культур бифидо- и лактобактерий были получены концентраты микробных суспензий В.асЫезсепйв - 51,1 ± 3,7 (млрд.м.к./см3) и Ь.асИорИПиз - 51,6 ± 4,5 (млрд.м.кУсм3), которые разводили фосфатным буфером с добавлением стабилизаторов до необходимой концентрации. Затем в одной емкости была составлена серия препарата, в которой было 3 объема суспензии В.асЫезсепНз и 1 объем Ь.ас!(1орЫ1и8. Общая концентрация живых бактерий в 1 мл суспензии составила (24 ± 3) млрд.м.кУсм3.

Экспериментальные серии препарата Бифилакт фасовали по 10 мл (10 доз) во флаконы объемом 10 см3 и хранили в холодильнике при температуре 4-8°С в течение 1 года. Один раз в месяц в течение срока хранения вскрывали по 3 флакона каждой серии и определяли соответствие предъявляемым требованиям.

В результате проведенных исследований к концу срока хранения (12 месяцев) все экспериментальные серии препарата Бифилакт не изменили ор-ганолептических свойств, не были контаминированы посторонней микрофлорой, оставались безвредными для белых мышей.

Жизнеспособность бифидо- и лактобактерий в процессе хранения при стабилизации фенолом и глицерином была более 90% только в первые 3 месяца хранения и исследования.

Таким образом, был определен оптимальный состав пробиотика Бифилакт в расчете на 1 мл (1 дозу):

В.аскЛезсепНв - (18 ± 3) млрд.м.к./см3

Ь.аас1орЫ1из - (6 ± 1) млрд.м.к./см3

Глицерин - (0,14 ±0,01) мл

Фенол, 50%-ный раствор - (0,01 ± 0,005) мл Фосфатный буфер - 0,85 мл

Результаты проведенных исследований позволяют заключить, что разработанная технология получения жидкой формы пробиотка Бифилакт является воспроизводимой и позволяет получить пробиотический препарат с сохранением основных физико-химических и биологических характеристик в течение первых 3-х месяцев, а в дальнейшем отмечено падение жизнеспособности до 35-40% к концу срока наблюдения.

2.2.4. Технология приготовления сухой формы препарата Бифилакт Для сохранения биологических свойств полученных нативных культур пробиотика Бифилакт необходимо было определить и отработать основные технологические параметры консервирования. Из известных способов обезвоживания культур остановились на лиофильном методе, как на одном из самых эффективных и широко применяемых методов консервирования биопрепаратов. При этом преследовали цель исследовать свойства сухой микробной массы бифидо- и лактобактерий и определить возможность приготовления на их основе сухой лекарственной формы пробиотика Бифилакт.

В работе использовали по 6 серий нативных культур, полученных глубинным методом культивирования в ферментерах АНКУМ-2М и Электролюкс (таблица 4).

Таблица 4

Показатели качества культур В. adolescentis и L. acidophilus

Штамм Кол-во се- Продолжительность Характеристика нативных культур (средние данные)

рий НК культивирования, ч рН Оптическая плотность млрдмкЛм3 Посторонняя микрофлора

B.adolescentis 6 18 7,5 ±0,1 5,1 ±0,2 13,6 ±0,3 отсутствует

L.acidophilus 6 21 7,5 ±0,1 6,2 ±0,2 14,8 ±2,0 отсутствует

Изучение свойств культур В. adolescentis и L. acidophilus, полученных методом сублимационного высушивания

Приготовленную сублимационным обезвоживанием сухую микробную массу получали из концентрированных центрифугированием нативных куль-

тур. Учитывая возможность инактивации микроорганизмов в процессе замораживания, высушивания и других операциях, концентрированные микробные суспензии раздельно стабилизировали сахарозо-желатиновой средой высушивания.

При этом учитывали, что в одной дозе (1 г) пробиотика должно содержаться В. adolescentis - (18 ± 3) млрд.м.к./см3; L. acidophilus - (6 ± 1) млрд.м.кУсм3; сахарозы- (0,020 ± 0,002) г; желатина - (0,0060 ± 0,0006) г; хлорида натрия - (0,0017 ± 0,0002) г.

В стерильные герметичные емкости с концентратом микробной суспензии вносили среду высушивания, тщательно перемешивали в течение 20 минут в боксе и разливали в стерильные кюветы, толщиной слоя до 10 мм. Затем проводили замораживание до температуры минус (52 ± 2)°С и выдерживали в течение 6-8 часов. Лиофилизацию проводили на сублимационной установке ТГ-50 в течение 58-62-часов.

Температурный режим высушивания поддерживали в пределах от минус 30 до плюс 30°С. Температуру биоматериала к 24-му часу сушки доводили до минус 21 ± 1°С, к 38-му часу - от минус 2 до плюс 2°С, к 50-му часу до 30±3°С. Досушивание проводили при температуре 30 ± 3°С в течение 10 ± 2 ч. Давление в сублиматоре на протяжении всего процесса не превышало 30 Па, максимальная температура конденсатора-вымораживателя при этом была минус 40°С.

Сухую микробную массу по окончании процесса высушивания собирали с кювет в герметичную стерильную тару, отбирали пробы высушенной биомассы и определяли: внешний вид, содержание влаги, растворимость, рН, биологическую концентрацию, безвредность, наличие посторонней микрофлоры.

Установлено, что сухая микробная масса представляет собой порошок от светло-серого до бежевого цвета, который растворяется в дистиллированной воде из расчета 1 г в 1 см3, с образованием гомогенной суспензии беловато-серого или бежевого цвета. Сухая микробная масса не содержала посторонней микрофлоры и была безвредна для белых мышей при пероральном введении им одной дозы.

2.2.5. Исследование стабильности лиофильно высушенного препарата Бифилакт в процессе хранения

При исследовании стабильности свойств сухого препарата Бифилакт в процессе хранения необходимо было изучить влияние газовой среды во флаконах с препаратом.

В экспериментальных исследованиях в первую очередь было изучено влияние газовой среды на выживаемость культур В.асМевсепйз и Ь.ааёорЬПив в лиофильно высушенном препарате Бифилакт при хранении. В качестве газовых сред использовали чистый азот и очищенный атмосферный воздух. Наполнение флаконов, вместимостью 20 мл, проводили азотом или воздухом при сбросе разрежения в сублимационной камере. Флаконы закрывали резиновыми пробками и завальцовывали алюминиевыми колпачками по ТУ 9467-003-05749470-94. На хранение в течение 1 года было отобрано по 20 флаконов от 6 серий препарата. Через каждые 3 месяца хранения от каждой серии отбирали по 5 флаконов и определяли выживаемость бифидо-и лактобактерий (таблица 5).

Таблица 5

Выживаемость высушенных бифидо- и лактобактерий в процессе хранения

Длительность хранения, мес. Вид микрофлоры Выживаемость бактерий, %

Азот Воздух

3 В.а<1о1е5сепЙ8 100 94 ±3

Ь.ас1с1орЫ1и8 100 97 ± 2

6 В.аёо1езсеп118 100 86 ±3

Ь.а^орИПиБ 100 90 ±5

9 В.асЫевсепйв 98 ±2 73 ±7

Ь.аас1орЫ1ш 100 82 ±6

12 В.асЫезсепНз 96 ±4 68 ±4

Ь.ас1с1ор1н1и5 97 ±3 80 ±3

Из данных таблицы 5 видно, что сохраняемость культур В.асЫезсепйв и Ь.аЫёорЬНив в азоте значительно выше, чем в атмосферном воздухе. Средние показатели выживаемости бактерий составили 96 ± 3,5 и 74 ± 6 %, соответственно, после гарантийного срока хранения. Следует отметить, что выживаемость Ь.аас1орЫ1и8 хотя и незначительно, но была выше чем В.асЫевсепйз.

Таким образом, срок хранения сухой формы препарата Бифилакт составляет не менее 1 года, при условии использования азота в качестве газовой среды во флаконах (срок наблюдения).

2.2.6. Контроль препарата Бифилакт С целью обеспечения безвредности, стандартности и биологической активности препарата Бифилакт, был проведен его контроль по следующим показателям: органолептическим, физико-химическим и биологическим (внешний вид; количество жизнеспособных бактерий в дозе; массовая доля влаги; растворимость сухой формы препарата; контаминация посторонними микроорганизмами; концентрация водородных ионов; безвредность).

Препарат Бифилакт представляет собой микробную массу живых антагонистически активных штаммов В.асЫезсепйз и Ь.ааскфЬИив по отношению к патогенным и условно-патогенным микроорганизмам, в соотношении 3:1, выпускаемый в сухой и жидкой формах (таблицы 6 и 7).

Таблица 6

Физико-химические и биологические показатели лиофильпо высушенного препарата Бифилакт

Наименование показателя Характеристика и норма

Внешний вид Аморфный порошок или в виде рыхлой таблетки, бежево-серого цвета

Количество жизнеспособных бактерий в 1 см3 (1 дозе), клеток (24 ± 3) х 109

Массовая доля влаги, % Не более 3,5

Контаминация посторонней микрофлорой, количество микробных клеток в поле зрения микроскопа Допускается не более 3 бактерий са-профитов. Не допускается наличие патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов

Растворимость При добавлении дистиллированной воды должен образовывать гомогенную взвесь в течение 2 минут

рН 6,5 ± 1,0

Безвредность В тест-дозе на белых мышах безвреден

Таблица 7

Физико-химические и биологические показатели жидкой формы препарата Бифилакт

Наименование показателя Характеристика и норма

Внешний вид Гомогенная взвесь от бежевого до темно-серого цвета

Количество жизнеспособных бактерий в 1 см3 (1 дозе), клеток (24 ± 3) х 109

Контаминация посторонней микрофлорой, количество микробных клеток в поле зрения микроскопа Не допускается

рн 6,5 ± 1,0

Безвредность В тест-дозе на белых мышах безвреден

2.2.7. Лечебно-профилактическая эффективность пробиотика

Бифилакт при желудочно-кишечных заболеваниях поросят При проведении испытаний профилактической и лечебной эффективности препарата Бифилакт в сухой и жидкой форме при ЖКБ поросят-сосунов и поросят-отъемышей перед нами стояли следующие задачи:

1. Проверить безвредность препарата Бифилакт.

2. Определить дозу препарата, кратность и длительность введения, обеспечивающих профилактический и терапевтический эффект при желудочно-кишечных болезнях поросят.

3. Определить профилактическую и терапевтическую эффективность сухой и жидкой форм препарата Бифилакт при ЖКБ поросят-сосунов и поросят-отьемышей.

Эксперименты на поросятах-сосунах и поросятах-отьемышах проводили на свиноводческой ферме СПК «Новое Литвиново» Щелковского района Московской области.

Определение эффективной профилактической дозы сухой формы Бифилакта при желудочно-кишечных заболеваниях поросят

Для эксперимента были отобраны клинически здоровые животные среди поросят-сосунов 2-3 недельного возраста (29 голов) и поросят-отъемышей на 3-й день после отъема (53 головы), из которых были сформированы опытные и контрольные группы. Сухой препарат Бифилакт растворяли в кипяченой воде 1:10 и давали животным опытных групп один раз в день в течение трех дней подряд: поросятам-сосунам - из резиновой пипетки; поросятам-отъемышам — с кормом. Поросятам контрольных групп никаких препаратов с профилактической целью не давали. За животными вели наблюдения в течение 3-х недель с момента постановки опыта (таблица 8).

Таблица 8

Профилактическая эффективность препарата

Бифилакт при желудочно-кишечных заболеваниях поросят

Группы животных Кол-во голов Профилактический курс, дни Ежедневная расчетная доза на 1 голову Заболело, голов Эффективность, %

млрд. м.к. г

Поросята-сосуны

1-я опытная 10 3 5,0 0,2 - 100

2-я опытная 10 3 2,5 0,1 2 80

контрольная 9 - - - 4 -

Поросята-отъемыши

1-я опытная 16 3 12,5 0,5 1 93,8

2-я опытная 19 3 6,25 0,25 2 89,5

контрольная 18 - - - 6 -

Как видно из таблицы 8, наибольшей профилактической эффективностью Бифилакт обладает при даче в дозе 0,2 г на голову поросят-сосунов (1 г препарата на 5 голов) и при даче в дозе 0,5 г на голову поросят-отъемышей (1 г препарата на 2 головы). Среди заболевших поросят опытных групп тяжело больных не наблюдали. У них отмечали выделение жидких каловых масс без гнилостного запаха и крови. Время заболевания приходилось на 2-3 сутки с начала постановки опыта, клинические признаки диареи наблюдали в течение 5-7 дней. Поросят-сосунов контрольной группы в течение 10-ти дней лечили тиланом (внутрь по 1,0 мл в день), а поросят-отъемышей - смесью фар-мазина с трихополом (внутрь по 3-4 мл в день) — 10 дней, приготовленной по прописи: на 1 л воды - 0,25 г трихопола и 15 г фармазина.

Таким образом, профилактическая эффективность препарата Бифилакт для поросят-сосунов составила 100% при даче препарата в дозе 0,2 г на голову 1 раз в день 3 дня подряд, а для поросят-отьемышей - 93,8 %, при даче препарата в дозе 0,5 г на голову 1 раз в день 3 дня подряд.

Профилактическая эффективность жидкой формы Бифилакта при ЖКБ поросят-отьемышей

Для определения профилактической эффективности жидкой формы Бифилакта при ЖКБ животных были сформированы 3 группы поросят-отьемышей в возрасте 2-х месяцев, по 32 головы в каждой. Животные получали одинаковый рацион кормления и содержались в одинаковых условиях.

Поросята 1-й и 2-й опытных групп получали с кормом жидкий Бифилакт в дозе 1 мл/гол. в сутки в течение 7 и 14 дней соответственно, поросята 3-ей группы являлись контролем.

Результаты учитывали в течение 90 дней. Ежемесячно проводили взвешивание поросят всех групп, определяли живую массу, привесы, заболеваемость и сохранность животных.

В результате проведенных исследований было установлено, что заболеваемость поросят-отьемышей ЖКБ, проявившимися симптомокомплексом диареи, составила: в 1-ой опытной группе - 6,8%; во 2-ой опытной группе -5,2 %; в контрольной группе - 27,9 %.

Профилактическая эффективность Бифилакта при ЖКБ поросят-отьемышей в 1-ой и 2-ой опытных группах составила 93,2 % и 94, 8 %, соответственно.

Наиболее выраженное действие препарат оказал на прирост массы животных. В конце первого месяца опыта масса поросят, получавших Бифилакт была выше на 5,0 кг, прирост - на 146,7 г в день больше, чем в контрольной группе. Такая тенденция сохранилась во второй месяц опыта (таблица 9).

В среднесуточном приросте массы у поросят разных групп наблюдались достоверные различия. В группе поросят, где жидкий Бифилакт применяли в течение 7 дней, средняя масса была выше на 7,7 %, а в группе, где препарат применяли в течение 14 дней - на 14,5 %, чем в контроле.

Среднесуточный прирост живой массы поросят I группы в первый месяц наблюдения был выше на 70 г, а у поросят II группы - был выше на 147г., по сравнению с контрольной группой животных.

Таблица 9

Масса поросят опытных и контрольной групп при испытании жидкой формы Бифилакта

Показатель Группы животных

контрольная 1-я опытная 2-я опытная

Масса 1 гол. перед постановкой опыта, кг 27,4 ±1,4 27,2 ±1,1 27,8 ±1,8

Масса 1 гол. через 30 дней, кг 37,9 ±2,4 40,8 ± 2,3 43,7 ± 2,8

Среднесуточный прирост массы, г 383,3 ±32,1 453,3 ± 27,2* 530,0 ±46,1*

Масса 1 гол. через 60 дней, кг 50,2 ±36,1 54,6 ± 2,7 60,3 ± 3,9

Среднесуточный прирост массы, г 396,8 ±36,1 445,2 ± 46,7 535,5 ± 42,4*

Масса 1 гол. через 90 дней, кг 64,0 ± 2,6 69,4 ± 2,9* 74,8 ± 3,8 *

Среднесуточный прирост массы, г 445,2 ±76,4 467,8 ± 66,2 477,4 ± 53,1

Примечание * - разность с контролем достоверна, Р □ 0,05

Определение эффективной терапевтической дозы сухой формы препарата Бифилакт при ЖКБ поросят Оценку терапевтического действия Бифилакта проводили на поросятах-сосунах 2-3-х недельного возраста (24 головы, из них 6 - контрольных) и поросятах-отьемышах в возрасте 2-3 месяцев (40 голов, из них 8 контрольных). Для этой цели были отобраны животные с признаками диареи.

Больные животные опытных групп получали Бифилакт в разных дозах 2 раза в день в течение 6-ти дней. Перед применением Бифилакт растворяли в теплой кипяченой воде и давали поросятам-сосунам из резиновой пипетки, а поросятам-отъемышам - смешав с кормом.

Поросят-сосунов контрольной группы лечили тиланом, а поросят-отьемышей - смесью фармазина с трихополом. За поросятами наблюдали в течение 60 дней с начала постановки опыта (таблица 10).

Таблица 10

Терапевтическая эффективность сухой формы Бифилакта при желудочно-кишечных болезнях поросят

Группы животных Кол-во голов Лечебный курс, дни Выздоровело, гол Пало, голов Эффективность, %

Поросята-сосун ы

1-я гр. 0,2 г на гол. 10 6 10 - 100

2-я гр. 0,1 г на гол. 8 6 8 - 100

Контрольная 6 4-5 5 1 83,3

Поросята-огьемыши

1-я гр. 0,5 г на гол. 15 6 15 - 100

2-я гр. 0,25 г на гол. 6 6 5 1 83,3

3-я гр. 1,0 г на гол. 11 6 11 - 100

Контрольная 8 4-5 6 2 75

Как видно из представленных данных, высокая терапевтическая эффективность Бифилакта (100 %) отмечена при даче препарата поросятам-сосунам как в дозе 0,2 г на голову, так и 0,1 г на голову 2 раза в день в течение 6-и дней подряд. У поросят-отъемышей 100 %-ная эффективность препарата отмечена в группе, где животных лечили Бифилактом из расчета 1 г и 0,5 г на одну голову два раза в день в течение 6-и дней. Продолжительность болезни у поросят опытных групп составила 5-7 дней, у поросят контрольных групп -7-10 дней.

Таким образом, дозы препарата 0,1 г - для поросят-сосунов и 0,5 г - для поросят-отъемышей два раза в день в течение 6-и дней являются достаточными для обеспечения 100 %-ного терапевтического эффекта при ЖКБ. На основании проведенных исследований было установлено

1. Основную роль в этиологии заболеваний ЖКБ у поросят-сосунов и по-росят-отьемышей играют ассоциации таких бактерий, как Е. coli, Р. vulgaris, P.mirabilis, К. pneumoniae, С. freundii, Salmonella, Staphylococcus, обладающие адгезивными, токсигенными и гемолитическими свойствами, которые, размножаясь в организме поросят, вытесняют лакто- и бифидобактерии.

2. Клинические, гематологические, бактериологические исследования поросят-сосунов и поросят-отьемышей опытных и контрольных групп при ЖКБ показали высокую лечебно-профилактическую эффективность

препарата Бифипакт в различных лекарственных формах: сухой и жидкой. Применение Бифилакта предотвращало интенсивное размножение условно-патогенных и патогенных микроорганизмов с последующим их вытеснением из ЖКТ животных и восстановлением нормобиоценоза.

3. Профилактическая эффективность сухой формы Бифилакта при ЖКБ поросят-сосунов составила 100 %, при даче препарата в дозе 0,2 г/гол. 1 раз в день 3 дня подряд, а для поросят-отьемышей - 93,8%, при даче препарата в дозе по 0,5 г/гол. 1 раз в день 3 дня подряд.

4. Жидкая форма Бифилакта в дозе 1 мл/гол. 1 раз в сутки в течение 7-ми дней обладает 93,2 %-ной, а в течение 14 дней — 94,8%-ной профилактической эффективностью при ЖКБ поросят-отьемышей.

5. Терапевтическая эффективность Бифилакта для поросят-сосунов составила 100 %, при даче препарата по 0,1-0,2 г/гол. 2 раза в день 6 дней подряд; для поросят-отьемышей - 100 %, при даче препарата по 0,5-1,0 г/гол. 2 раза в день 6 дней подряд.

6. Бактерии - компоненты препарата Бифилакт обладают высокой антагонистической активностью в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, способствуют повышению уровня лакто-и бифидобактерий и нормализации микробного пейзажа кишечника поросят.

7. Среднесуточный прирост живой массы поросят, получавших жидкую форму Бифилакта, был выше на 147 г, по сравнению с контролем.

8. Лечебно-профилактический эффект от применения Бифилакта при ЖКБ поросят сохранялся длительное время.

3. ВЫВОДЫ

1. Разработаны питательные среды из недефицитного отечественного сырья с пониженным содержанием аминного азота (117-122 мг%) для выращивания В.асЫезсепйз и Ь.аЫс1орЫ1и5 методом глубинного культивирования в биоферментере, включающие гидролизаты казеина, обезжиренного молока и дополнительные компоненты, позволяющие получать основной биотехнологический продукт.

2. Разработана технология глубинного культивирования микроорганизмов -компонентов Бифилакта, позволяющая по сравнению с аналогом, сократить трудозатраты в 1,9 раза продолжительность выращивания микроорганизмов - в 2 раза.

3. Разработаны оптимальные режимы концентрирования культур В.асЫеБсепйз и Ь.ас1с1орЫ1и$ с использованием осветляющих центрифуг Ъ - 41 и ОТР - 101К при скорости подачи суспензии 10±3 дм3/ч для Ъ- 41 и 30±5 дм3/ч для ОТР - 101К, время накопления биомассы в роторе центрифуг - от 25 до 130 мин.

4. При получении сухой формы Бифилакта наиболее эффективными является сублимационный метод высушивания, позволяющий получать препарат с концентрацией микроорганизмов 24±3 млрд.м.к. в 1 г вещества.

5. Разработана и апробирована с положительным результатом в условиях свиноводческого хозяйства схема применения пробиотика Бифилакт для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов и поросят-отьемышей.

6. Лечебно-профилактическая эффективность различных лекарственных форм Бифилакта составляет 93-100 %, при длительности применения препарата от 3 до 14 суток в рекомендуемых дозах.

7. Применение Бифилакта позволяет получать среднесуточный прирост живой массы поросят на 147 г. в день больше по сравнению с контрольными животными.

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработана технология промышленного производства пробиотического препарата Бифилакт на основе бифидо- и лактобактерий в жидкой и сухой лекарственных формах.

2. Разработаны временная инструкция и технические условия (ТУ) на производство пробиотического препарата Бифилакт, утвержденные директором ВНИТИБП.

3. Разработана временная инструкция по применению жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт для профилактики и лечения дис-бактериозов молодняка свиней.

4. На базе противобактерийного производства ФГУП «Щелковский биокомбинат» создана аппаратурно-технологическая линия промышленного производства жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт.

5. СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Самуйленко А.Я., Рахманин П.С., Панин А.Н., Малик Н.И. / Профилактика дисбактериозов животных и птиц. // Материалы третьего международного симпозиума «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии», май 2005 г., Санкт-Петербург, с.204-206.

2. Рахманин П.С., Самуйленко АЛ., Школьников Е.Э., Панин А.Н., Малик Н.И. / К вопросу разработки современной технологии производства про-биотических препаратов ветеринарного назначения. // Материалы третьего международного симпозиума «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии», май 2005 г., Санкт-Петербург, с.265-267.

3. Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Рахманин П.С. / Современное представление о роли кишечной микрофлоры непродуктивных домашних животных и коррекция ее пробиотиками ветеринарного назначения. // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 75-летию УГАВМ. «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных», май 2005 г., Троицк, с. 171-175.

4. Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Рахманин П.С. / Актуальные вопросы поддержания и коррекции микробиоценоза продуктивных и домашних животных с использованием пробиотиков нового поколения. // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 35-летию ВНИТИБП, «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», май 2005 г., г.Щелково, с.506-511.

5. Самуйленко А.Я., Школьников Е.Э., Рахманин П.С./ Биологические и технологические аспекты разработки и производства пробиотических препаратов ветеринарного назначения.// Межведомственный тематический научный сборник «Ветеринарная медицина», 85, том II, Харьков, 2005, с. 959-961.

6. Рахманин П.С. / Вопросы поддержания и коррекции микробиоценоза продуктивных домашних животных с использованием пробиотиков. // Материалы международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии животных», М, 2006, с.350-351.

7. Рахманин П.С. / К вопросу профилактики дисбактериозов продуктивных животных и птиц. // Материалы международной научно-практической конференции, посвященной 80-летию со дня рождения И.А.Хорькова,

«Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», Щелково, 2006 г., с. 176-178.

8. Самуйленко АЛ., Рахманин П.С. / Разработка современной технологии производства пробиотиков ветеринарного назначения. // Журнал «Ветеринария и кормление», М., №6,2006, с. 10.

9. Самуйленко А.Я., Рахманин П.С. Ибраева A.B. / К вопросу разработки технологии производства пробиотиков ветеринарного назначения. // Журнал «Ветеринарный врач», Казань, №4,2006 г., с.41.

Кисломолочные продукты употребляли еще до появления биотиков, однако пробиотическая концепция появилась в конце 19-го столетия благодаря работам И.И.Мечникова, проведенным в институте Луи Пастера в Париже.

В XX веке на основе работ И.И.Мечникова понятие пробиотики было принято учеными и практиками во всем мире. Желание усовершенствовать практику использования традиционных кисломолочных продуктов, заменив их препаратами, содержащими определенные микроорганизмы, овладело умами ученых многих стран, пытавшихся реализовать это на практике. Однако, несмотря на большие усилия, объяснить и определить влияние пробиоти-ков на организм человека, животных и птиц удалось немногим.

Существует несколько различных теорий воздействия пробиотиков, объясняющих устойчивость их к микробной инфекции. Недостаток данных о механизме воздействия пробиотиков на организм человека и животных означал, что большая часть разработок была эмпирической и не всегда основывалось на стандартных научных принципах. Одним из факторов, который использовался при выборе культур пробиотиков, была способность их срастаться с эпителиальными клетками кишечника животного, которую давали пробиотики.

Многочисленные препараты пробиотиков, имеющиеся в настоящее время на рынке, обладают различным действием, включая повышение устойчивости к инфекционным болезням, стрессовым воздействиям, неблагоприятным экологическим факторам, увеличению скорости роста и переваримости корма у домашних животных, повышению молочной продуктивности коров и яйценоскости домашней птицы.

Наиболее часто из имеющихся пробиотических групп используются молочнокислые бактерии - лактобациллы, стрептококки, энтерококки, бифидобактерии. Акцент на использование молочнокислых бактерий происходит частично от факта существования свидетельства, что молочнокислые бактерии играют главенствующую роль в кишечной флоре, влияя на ее состав благоприятным для хозяина образом.

Препараты пробиотиков постепенно изменяются, они могут быть в форме порошков, таблеток, паст или аэрозолей с различными наполнителями и/или сорбентами, чтобы сохранить препараты в активном состоянии. Вид препарата разработчики и производители определяют в зависимости от предполагаемого использования пробиотиков. Например, пасты используют для индивидуальной подкормки телятам и свиньям, тогда как аэрозоли можно применять для однодневных цыплят.

Способ приготовления пробиотика может повлиять на последующую эффективность препарата при использовании его по прямому назначению. Параметры культивирования пробиотических штаммов и стабилизация готового препарата оказывают существенное влияние на биологическую активность продукта в процессе хранения и практического применения.

Впоследствии условия хранения пробиотических препаратов влияют на жизнеспособность и срок годности продукта. Содержание минимального количества влаги в препарате имеет первостепенное значение для сохранения жизнеспособности пробиотических бактерий. К сожалению, предосторожности, сохраняющие жизнеспособность, часто не соблюдаются, и количество жизнеспособных клеток на момент применения оказываются ниже требуемого уровня.

Способ введения препарата должен также учитываться при оценке результатов испытания пробиотиков. Правильный выбор должен быть сделан между использованием порошка, добавляемого в корм или воду; пасты или таблетки для индивидуального введения; или аэрозоля для соответствующего применения.

Разработка и внедрение в практику ветеринарной медицины новых высокоэффективных препаратов отечественного производства для лечения и профилактики болезней животных и птицы представляет собой задачу, актуальность которой не вызывает сомнения.

Настоящее время многие ученые (163,169) называют «наступающей эпохой пробиотиков». Биопрепараты на основе живых микробных культур находят широкое применение в медицине и ветеринарии для коррекции микрофлоры желудочно-кишечного тракта.

До последнего времени использование пробиотиков сводилось к заместительной терапии при острых кишечных инфекциях молодняка животных и птицы и, в меньшей мере, санации желудочно-кишечного тракта от патогенных и условно-патогенных микроорганизмов (27, 36, 37, 40, 64, 117, 143, 194, 198).

Во всем мире ужесточение требований к экологической безопасности продукции животноводства и птицеводства заставило исследователей пересмотреть многие методологические подходы к вопросам оптимизации контроля над эпизоотическим процессом заболеваний, возбудителями которых является условно-патогенная микрофлора. Задача практической ветеринарии заключается в снижении потерь от желудочно-кишечных заболеваний, что в свою очередь неразрывно связано с изысканием способов нормализации кишечного биоценоза и снижения риска контаминации желудочно-кишечного тракта условно-патогенной микрофлорой с повышенными вирулентными свойствами (46, 57).

Это обстоятельство заставило признать необходимость получения нового поколения экологически безопасных препаратов, способных занять свое место в системе мероприятий по обеспечению биологической защиты животных (2, 45).

Технология производства пробиотических препаратов может быть осуществлена только при высоком содержании зрелых и активных форм пробиотических микроорганизмов в исходной субстанции и должна включать оптимальное количество стадий в процессе производства, оказывающих неблагоприятное воздействие на жизнеспособность и биологические свойства бактерий, содержащихся в препарате.

Поэтому проведение исследований по разработке и совершенствованию технологии производства пробиотиков, в частности, ветеринарного назначения, являются весьма важными и нужными для биопромышленного производства, ветеринарной науки и практики.

Цель и задачи исследований

Цель настоящих исследований - разработка промышленной технологии получения пробиотического препарата ветеринарного назначения Бифилакт и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1) Разработать жидкие питательные среды для культивирования пробиотиче-ских штаммов.

2) Разработать технологический процесс глубинного культивирования производственных штаммов лакто- и бифидобактерий в биоферментере.

3) Разработать технологию приготовления жидкой и сухой форм пробиотика.

4) Разработать временную технологическую и нормативно-техническую документацию на препарат.

5) Приготовить опытные образцы пробиотического препарата и изучить его биологические свойства.

6) Отработать схемы применения разработанных препаратов в реальных условиях свиноводческих хозяйств.

7) Изучить лечебно-профилактическую эффективность пробиотика Бифилакт, полученного по разработанной технологии, при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

Научная новизна

1. Разработана промышленная технология производства лакто- и бифидобак-терий в биоферментерах с использованием жидких питательных сред из недорогого, доступного отечественного сырья.

2. Разработана технология приготовления жидкой и сухой форм пробиотика Бифилакт.

3. Разработана временная нормативно-техническая и технологическая документация на пробиотик ветеринарного назначения Бифилакт.

4. Приготовлены опытные образцы пробиотика Бифилакт и изучены его биологические свойства. Показано, что разработанные препараты обладают высокими биологическими свойствами, отличающими их от других пробиотиков: подавление размножения патогенных и условно-патогенных бактерий (стафилококков, сальмонелл и др.), стимуляция роста лакто- и бифидобактерий in vitro и в желудочно-кишечном тракте молодняка свиней.

5. Проведены исследования по отработке схем применения разработанного пробиотика Бифилакт в свиноводческом хозяйстве репродукторного типа. Разработана временная инструкция по применению пробиотика Бифилакт при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

6. Рассчитана и показана лечебно-профилактическая эффективность применения разработанных препаратов при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка свиней.

Практическая значимость

1. Разработана рецептура питательных сред из недорогого, доступного отечественного сырья, отработана методика и техника их приготовления.

2. Разработана технология глубинного культивирования пробиотических штаммов бифидо- и лактобактерий.

3. Разработана и апробирована технологическая схема производства жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт.

4. Подготовлена временная технологическая инструкция и технические условия (ТУ), утвержденные директором ВНИТИБП.

5. Опытные образцы жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт прошли испытания с положительным результатом в лабораторных условиях и в свиноводческом хозяйстве репродукторного типа.

6. В опытах на поросятах-сосунах и поросятах-отъемышах определено влияние Бифилакта на микробиоценоз кишечника, обменные и иммунные процессы организма животных, показана высокая лечебно-профилактическая эффективность пробиотика Бифилакт, подтвержденная актами из свиноводческих хозяйств.

7. Разработана и утверждена директором ВНИТИБП временная инструкция по применению пробиотического препарата Бифилакт для профилактики и лечения дисбактериозов молодняка свиней.

Личный вклад соискателя

Автору принадлежат организация и непосредственное осуществление исследований по подбору, приобретению и оценке биологических свойств пробиотических штаммов лакто- и бифидобактерий; разработка технологии их глубинного культивирования; приготовление жидкой и сухой форм проби-тического препарата Бифилакт; испытание лечебно-профилактической эффективности опытных серий Бифилакта; анализ и теоретическое обобщение полученных данных; расчет экономической эффективности применения разработанных препаратов; разработка временной нормативно-технической и технологической документации на препарат и временной инструкции по его применению.

В работе использованы материалы, полученные лично автором, а также в соавторстве с сотрудниками отдела противобактерийных препаратов ВНИ-ТИБП (зав.отделом Е.Э. Школьников), сотрудниками противобактерийного производства ФГУП Щелковский биокомбинат (руководитель - B.C. Трой-нин), которым выражаю глубокую благодарность за помощь и поддержку.

Апробация результатов диссертации

Основные результаты проведенных исследований изложены в 2-х научных отчетах («Разработка опытно-промышленной технологии культивирования и стабилизации лакто- и бифидобактерий в биоферментерах» 2005 г., «Испытание лечебно-профилактической эффективности разных лекарственных форм при желудочно-кишечных заболеваниях в условиях свиноводческих хозяйств» 2006 г. и доложены:

- на Международном симпозиуме «Современные проблемы ветеринарной диетологии и нутрициологии» (Санкт-Петербург, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Ветеринарная медицина 2005: Современное состояние и актуальные проблемы обеспечения ветеринарного благополучия животноводства» (Ялта, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биологии и ветеринарной медицины мелких домашних животных» (Троицк, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Научные основы производства ветеринарных биологических препаратов», посвященной 35-летию ВНИТИБП, (Щелково, 2005);

- на Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы инфекционной патологии и иммунологии», посвященной 100-летию со дня рождения Я.Р.Коваленко (Москва, 2006).

Публикации

По теме диссертации и материалам проведенных исследований опубликовано 9 статей в сборниках Международных научно-практических конференций и симпозиумов, отечественных специализированных научных журналах.

Объем и структура диссертации

Материалы диссертации изложены на 145 страницах компьютерного текста и включают введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение полученных результатов, выводы, данные о практическом использовании результатов исследований, практические рекомендации по использованию научных выводов, список использованной литературы (211 источников, из которых 135 отечественных и 76 зарубежных исследователей). Работа содержит 27 таблиц, 11 рисунков и 3 страницы приложений.

4. ВЫВОДЫ

1. Разработаны питательные среды из недефицитного отечественного сырья с пониженным содержанием аминного азота (117-122 мг%) для выращивания B.adolescentis и L.acidophilus методом глубинного культивирования в биоферментере, включающие гидролизаты казеина, обезжиренного молока и дополнительные компоненты, позволяющие получать основной биотехнологический продукт.

2. Разработана технология глубинного культивирования микроорганизмов -компонентов Бифилакта, позволяющая по сравнению с аналогом, сократить трудозатраты в 1,9 раза продолжительность выращивания микроорганизмов - в 2 раза.

3. Разработаны оптимальные режимы концентрирования культур B.adolescentis и L.acidophilus с использованием осветляющих центрифуг Z - 41 и OTP - 101К при скорости подачи суспензии 10±3 дм /ч для Z - 41 и 30±5 дм /ч для OTP - 101К, время накопления биомассы в роторе центрифуг- от 25 до 65 мин.

4. При получении сухой формы Бифилакта наиболее эффективным является сублимационный метод высушивания, позволяющий получать препарат с концентрацией микроорганизмов 24±3 млрд.м.к. в 1 г вещества.

5. Разработана и апробирована с положительным результатом в условиях свиноводческого хозяйства схема применения пробиотика Бифилакт для лечения и профилактики желудочно-кишечных заболеваний поросят-сосунов и поросят-отъемышей.

6. Лечебно-профилактическая эффективность различных лекарственных форм Бифилакта составляет 93-100%, при длительности применения препарата от 3 до 14 суток в рекомендуемых дозах.

7. Применение Бифилакта позволяет получать среднесуточный прирост живой массы поросят на 147 г в день больше по сравнению с контрольными животными.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Разработана технология промышленного производства пробиотического препарата Бифилакт на основе бифидо- и лактобактерий в жидкой и сухой лекарственной формах.

2. Разработаны временная инструкция и технические условия (ТУ) на производство пробиотического препарата Бифилакт, утвержденные директором ВНИТИБП.

3. Разработана временная инструкция по применению жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт для профилактики и лечения дисбак-териозов молодняка свиней.

4. На базе противобактерийного производства ФГУП «Щелковский биокомбинат» создана аппаратурно-технологическая линия промышленного производства жидкой и сухой форм пробиотического препарата Бифилакт.