Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка средств и меотдов лабораторной диагностики эпизоотической геморрагической болезни оленей

■ '.II;

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ ВИРУСОЛОГИИ И МИКРОБИОЛОГИИ

ЛУНИЦЫН Андрей Владимирович УДК 619:616.98:578:833.3-078:636.294.

РАЗРАБОТКА СРЕДСТВ И МЕТОДОВ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ЭПИЗООТИЧЕСКОЙ ГЕМОРРАГИЧЕСКОЙ БОЛЕЗНИ ОЛЕНЕЙ

На правах рукописи

Аспирант

1H.00.0li — ветеринарная микробиология, вирусологи«, зпизоотоло! ии, микология и иммуиоло! ия

Автореферат

диссертации на соискание ученой стзпеки кандидата ветзринарных нау.<

ПОКРОВ 1993 г.

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной вирусологии и микробиологии,

Научный руководитель — член-корреспондент РАСХН, — Доктор ветеринарных наук, профессор Вишняков Иван Федорович

Официальные оппоненты — Доктор ветеринарных наук, профессор Черняев Юлий Александрович (ВНИИЗЖ) — Кандидат биологических наук, Новиков Борис Валентинович (ВНИИВВиМ)

Ведущее учреждение — Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии г. Москва

Защита состоится 28 апреля 1993 года в 10 часов на заседании специализированного совета Д 120.61.01 во Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной виру сологии и микробиологии по адресу: 601120, г. Покров, Владимирской области, ВНИИВВиМ.

С диссертацией межно ознакомиться в библиотеке ВНИИВВиМ.

Автореферат разослан

марта 1993 года.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат ветеринарных наук.

Федоров Г. П.

1. ОБШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей (ЭГБО) широко распространилась в странах Азии, Северной и Южной Америк, Австралии и вплотную приблизившись к границам Содружества. Болезни зарегистрирована в Турции и Японии; неблагополучие по ЭГБО в Турции создает потенциальную угрозу попадания вируса в Грузию и далее к налим границам. Наибольшая яе угроза существует со сторонч Турции, Японии и США.

Вирус ЭГБО, вызывающий это заболевание, по своим биологическим свойствам тлеет относительное сходство с вирусом блютанга (Campbell, 1985). Однако антитела, специфичные к вирусу ЭГБО, достаточно часто выявляют у КРС и овец; а антитела -специфичные к вирусу блютанга, обнаруживают у оленей CLuedke, 1970,1984, ЗастрЬеП, 1985).

. Между вирусами ЭГБО и блютанга существует антигенное родство,

поэтому положительный результаты определения антител к ним любым гсонвечциональным серологическим методом, за исключением реакции нейтрализации, не можзт служить однозначным доказательством инфи-нированиости животных именно тем или другим вирусом. Дополнительной трудностью является наличие 8 серотипов вируса ЭГБО и 24 се-эотипов вируса блютанга (Schultz, Frieder , .1987), что крайне усложняет проведение и интерпретацию ?Н, а,- с" другой стороны, практически полное сходство вирусов ЭГБО и блютанга по фиэико-хи-.мческим свойствам (In&ba, 1975), что исключает возможность их дифференциации физико-химическими методами, в том («еле методами электронной микроскопии.

Для лабораторной диагностики ЭГБО разработаны PK, РДП, РСН и т (Campbell,; 1978,1905,1986; Deila-Porta, 1982,1983,1985; kleiner, 1981; Fosterg, 1977,1982; Glbbs, 1977; Gonzoles, .988; ßuimt. 1984; Pearson. 1979; Thomas. 1970, 1971.1976). Оннаюэ

каждый из методов имеет недостатки в плане чувствительности, воспроизводимости, зкспрессности и технической простоты постановки. Разработка альтернативного метода исследования, лишенного хота № большинства таких недостатков, могла бы создать аффективный способ диагностики ЗГБО и эпизоотологического контроля за распространяем этих болезней.

Разрабатываем» в последние годы методы твердофазного иммуно-ферыеитяого анализа (ТФ ИФА) наели широкое применение в медицинской и ветеринарной практике, в теш числе при диагностике арбови-русных инфекций (Manntгче, 1880; Hubshle, 1981; С, Я Гайдамович, 1984), и оценены как наиболее перспективные в ближайшее десятилетие для практической лабораторной диагностики (А. А. Воробьёв, 1987).

Цель и вадаад исследования. Целью тщ исследований являлось разработка средств и методов лзбораторной диагностики эпизоотической гешрраГической болезни оленей я их сравнительная оценка.

Для достижения указанной цеди необходимо было решить следующие задачи:

- разработать технологию получения м стандартизации иммуноре-агевтов для диагностики ЭГВО методами РСК. РДП, РЗГА и ТФ ифа;

- определить оптимальные условия постановки рск, рдп, рга, РЗГА и ТФ Ш для обнаружения спедафических антигенов и антител при ЭГВО;

- дать сравнительную оценку разработанных вариантов ТФ ИФЛ с другими серологическими методами;

- получить моногашаяьш» антитела к антигенам вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей и оценить их эффективность для изготовления диагностикумов;

. - определить пригодность разработанных вариантов ТФ ИФА для дифференциальной диагностики ЭГБО и блвтанга;

- изучить антигенное родство вирусов серогрулл ЭГ£0 и блотан-

Научная новизна В результате проведённых исследований получи (¿ы данные о возможности получения сахарозо-ацетонолоео антигена дад реакций связывания комплемента и ТФ ИФА.а т^ле гуттурального антигена для реакции диффузионной преципитации, реакции ге-ыц-гдстияации и задержки гемагглотинации, иммуцоферме^тного анализа- с целью применения их при проведения = -лаборатории исследований по диагностике ЭГБО.

Научная новизна проведённых исследований состоит в том, -по:

- отработаны условия получения универсального культурального антигена вируса ЭГБО, пригодного для использования в РДП, РСК и ТФ Ш;

- разработан способ получения очищенного культурального антигена для применения его в РГА и РЗГА;

- установлено, что непрямой вариант ТФ ИФА с использованием специфического антигена из мозга мышат-сосунов, изготовленного методом сахарозо-ацетоновой экстракции и антивидовых иммуноперок-сидааных конъюгатов против оленя, крупного рогатого скота и овец, позволяет обнаруживать специфичные к вирусу анщ'ела в сыворотках' крови чувствлтельных видов животных и служить основным методом эпизоотологического мониторинга:

г получены моноклинальные антитела к антигенцм ЭГЕО, использование которых для сенсибилизации твердой фазу ц др^хов-лепия пероксидазных конгюгатов псзволилс достичь строгой специфичности ТФ йФА при ЭГБО: .

- разработан "Сэндвич"-вариант ИФА на основе мсноклональ-ных антител для обнаружения специфического антигена ЕИруса ЗГЮ:

- определены оптимальные условия, для постановку РГА и Р7ГЛ-для выявления специфических антигена и антител;-

О

• - показана возможность применения разработанных "Сэндвич"- и непрямого варианта ТФ ИФА, РГА и РЗГА для дифференциальной диагностики ЭГБО и блютанга.

Практическая значимость. На основании экспериментальных исследований разработаны и рекомендованы для диагностических целей чувствительные, специфичные, высокопроизводительные и экспрессные методы ТФ ИФА, РГА и РЗГА, предназначенные для выявления специфического антигена вируса ЭГБО в Еируссодержадих культуральных материалах, а также для обнаружения специфичных к вирусу ЭГБО антител в сыворотках крови переболевших оленей, крупного рогатого скота и о£ец.

Разработана нормативно-техническая документация на "Набор диагностических препаратов для выявления антител при ЭГБО непрямым вариантом твердофазного иммуноферментного анализа" и "Набор диагностических препаратов для для выявления антигена вируса ЭГБО "Сэндвич"-вариантом твердофазного иммуноферментного анализа" (Временная инструкция по изготовлению и контролю, Технические условия и Наставление по применению), и "Методические указания по обнаружению антител к вирусу ЭГБО непрямым вариантом твердофазным иммуноферментным анализом". "Мэтодичэские указания по обнаружению антигена вируса ЭГЕО "Сэндвич"-ьариантом твердофазным иммунофер-

I'

. ментным анализом", утвержденные директором ВНИИВВиМ.

Метод ТФ ИФА применён во ВНИИВВиМ. для широкого скрининга антител в сыворотках крови оленей, крупного рогатого скота и овец иа хозяйств различных регионов страны ( 628 проб ).

Предложены "Методические указания для лабораторной диагностики ЭГБО РГА и РЗГА".

Основные положения диссертационной работы, выдвигаемые на защиту: •

- результаты экспериментов по определению оптимальных условий получения специфических культуральных антигенов, пригодных для

применения в лабораторной диагностики ЭГБО методами ТФ ЙФА, РГА и РЗГА, РДП и РСК; _______________________________________________________

- непрямой вариант ТФ ЙФА, включающее использование специфического сах&розо-ацетоновых антигена, антивидовых иымуноперокси-дазных конъюгатов и казеин-мертиолятного буфера, обеспечивает уровень чувствительности и специфичности, достаточный для диагностики и зпизоотологического мониторинга ЭГБО;

- "сэидвич"-вэриант ТФ ИФА , разработанный на основе применения глслсклональных антэтел, позволяет выявлять антигены вируса ЭГБО и превосходит аналогичный метод, разработанный на основе использования поликлональных антител, выделенных из сывороток и ИАЖ;

- данные по изучению антигенного родства вирусов серогрупп ЭГБО и блютанга в серологических реакциях.

Апробация работы. Материалы диссертации додожгкы на научных конференциях ВНИИЬВиМ (1991, 1992) и на заседаниях ученого совета ЕНШВВиМ (1990-1992гг).

Публикации. По теме диссертации опубликовано И научных работ.

Объем работы. Диссертация изложена на 145 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования. обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы ( 244 источников, в том числе 29 отечественных). Работа иллюстрирована 26 таблицами и 12 рисунками я дополнена приложениями.

г. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы.

В работе использовали вирус ЭГБО 1 и 2 серотипов.

Для клинического воспроизведения ЭГБО, получения вирусеодер-жащего материала, специфических и антивидовых сывороток в опытах использовали: благородных оленей в возрасте 8-9 месяцев массой до 70 кг; овец мериносной породы в возрасте 5-6 месяцев кассой до

- б -

50 кг; кроликов породы "шиншилла", массой 2,5- 3 кг; телят чёрно-пёстрой порода в возрасте 2 месяца массой 60- 80 кг; крыс белых нелинейных массой 200-300 г; мшей белых нелинейных массой 20-30 г; мышей белых линии BALB/c, массой'18-20 г; крысят-сосунов нелинейных, 1-2 дневных; мышат-сосунов нелинейных, 1-2 дневных; мыШат -сосунов линии BALB/c, 1-2 дневных.

Животные получены кз научно-экспериментальной базы лабораторных животных, питомников "Светлые горы" и "Столбовая" АМН СССР,а так;.» хозяйств Владимирской области.

Для выделения, культивирования и титрования вирусов ЭГБО использовали двухсуточные культуры клеток: почки сайги (' ПС ); почки теленка ( НДВК ); почки эмбриона лося ( ШЛ );' почки сибирского горного козерога, линия С-85 (ПСГК) - суспензионный трофовари-ант и линия ПСГК-60, монослойный трофовариант; почки эмбриона африканской козы (ПЭАК); почки зелёной мартышки (CV-1); первичная культура клеток почки телёнка (БИТ).

Культуры клеток получали в лаборатории "Биологии и культивирования вирусов" и в лаборатории "Культуры клеток с музеем клеточных штаммов" ВНИИВВиМ.

При получении ЛАЯ мшей и крыс использовали клетки саркомы 180 - TG и спухоли яичников (ОЯ), соответственно, хранящиеся в жидком азоте.

для получения гибридом использовали культуру клеток миеломы мыши SP2/0-Agl4.1. :

' В работе по определению уровня накопления антител в сыворотках крови животных и ИАЯ мышей и крыс, активности специфических антигенов, а также для сравнения диагностической ценности ТФ ИФА с РДП, РСК и РН, использовали:

.- РДП. микросариант (Pearson, 1979); -■fCK, постановку которой осуществляли по общепринятой мето-

дике (Лярски, 1980);

- РЧ проводили по общепринятой методике с постоянной дозой

вируса ( равной 100 или 1000 ИД/50 ) - для определения титра сывороток и с постоянной дозой сыворотки ( разведение'Т: 20~)— - для определения индекса нейтрализации (Лярски, 1930).

Электронно-микроскопические исследования проводили, используя методы негативного контрастирования 61аи<?1^ (1982),

В качестве специфических антигенов вируса ЭГБО использовали лизаты инфицированных клеточных культур, очищенный и частично очищенный вирус и сахарозо-ацетоковый антиген иа мозга заразкенных мыпат-сосунов. Контролями служили антигены, приготовленные из не-заражйнных культур клеток и мозга мышат-сосунов.

Антигены гетерологичьых вирусов ЧКРС. блмтанга, болезней Иба-раки и Акабане использованные для контроля специфичности "Сэнд-вич"-варианта ТФ КФА, предоставлены сотрудниками лаборатории "Диагностики".

Антивидовые сыворотки получали, иммунизируя кроликов препаратом иммунохимически чистого по схеме, предложенной Фримель (1980).

Специфические сыворотки получали при заражении оленей, крупного рогатого скота и овец ВЭГБО, 1 и 2 серотипа, и последующей гипериммунизацией их тем же вирусом.

Б качестве контрольных сывороток использовали «¡воротки неза-раженных о.^ней. овец и КРС.

Для получения ИАЖ взрослых беспородных белых мышей иммунизировали 10%- кой суспензией мозга зараженных-мышат с активностью 7,7 1 ег ВДД50/мл. ИАЖ крыс получали аналогично путем иммунизации 10% -ной суспензией моз1а крысят. Количество вводимого материала увеличили в 5 раз. а в качестве опухолеродного агента использовали клетки крысиной саркомы опухоли яичников.

Сыворотки овец и крупного рогатого скота (КРС), специфичные к

вирусам ЧКРС, блютанга, болезней Ибараки, Акабане и Найроби использованные для контроля специфичности непрямого варианта ТФ ИФА, получены из лабораторий "Диагностика" и "Эпизоотология".

Для выделения из сывороток и ИАЖ использовали следующие хроматографичеекке методы: ионообменную хроматографию на ДЕ-АЕ-целлюлозе ДЕ-52 ( IrG из сыворотки овец;; гельпроникаюшую хроматографию на Ультрогеле АсА-34 (Igfi из сыворотки телят, оленей, ИАЖ мышей и крыс)*, и аффинную хроматографию на Protein А -Sepharose CL4B (igG из сывороток кролика).

Выделение маноклонпльных антител из ИАЖ мышей проводили аффинной хроматографией ка Protein А - Sepharose .CL-4B по методике Еу et al (1978).

Приготовление зероксидазных кснъюгатов с псликлональными IgG проводили по методу Wilson и Hakane (1978), а с моноклональными антителами - по методу Tijssen (1985).

Гибрадомы, сокретируюодае моноклональные антитела к антигенам ВЭГБО, получали по методу Kohler и Mi Istein (1975).

Селекцию гибридом вели на среде ГАТ ( гипоксантин-а.\ашоптерин - тимидин ).

Скрининг гибридом, секретируяаих МА к антигенам вируса ЭГБО, проводили трёх-четьфбхкратно с трёхдневным интервалом непрямым методом ТФ ИФА.

Клонирование гибридных -клеток проводили в полужидком агаре по методу Gooding (1980).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием персонального компьютера {ВЫ PC/AT 286 и пакета прикладных программ "Stattraf" и "Statsf".

2.2. Результаты исследований.

2.2.1. Изучение некоторых биологических свойств вируса ЭГВО Исследование чувствительности различных пзревиваешх культур

клеток к вирусу ЭГБО показало, что вирус размножается в культурах клеток ПСГК, ПЭАК, СУ-1, ПС, ЫДВК, ГОЛ и БИТ. Наиболее стабильные

результаты по накоплению вируса получены в_ культурах клеток ПСГК,--------

СТ-1, ПЭАК и ПС. Учитывая, что статистически достоверных различий в урожаях вируса в этих культурах не установлено, и с целью унификации использования культуральных систем, для приготовления специфических антигенов вируса ЭГБО были выбраны культуры клеток ПСГК и СУ-ж, в которых вирус накапливался в титрах от 6,25 до 7,80 1к ЦЩБО/мл. Достаточно высокое накопление вируса имело место в мозге мышат и- крысят, инфицированных интрацеребрально (до в,7о млдбо/г мозга).

Поскольку на начальных этапах работы отсутствовали специфические сыворотки или антительные препараты к ЮГВО , то для подтверждения вирусной природы ЦДЛ, наблюдаемого в июкулированных культурах, были проведены электронно-микроскопические исследования этого вируса. Вирионы в препаратах очищенного вируса, обработанные по методу негативного контрастирования, по морфологии и структуре соответствовали реовкрусам, а их, размеры - вирусам блю-танга И болезни Ибарэки, приведенным Но и сотр. (1973). Таким образом, было подтверждено, что имеющиеся в музее института штаммы с паспортными названиями "Нью-Джерси" и "Альберта" действительно относятся к реовирусам. Отличие яэ вируса ЭГБО от вируса Слютанга доказано отсутствием перекрёстной нейтрализации с сывороткам!! овец и КРС, содержащими нейтрализующие антитела к вирусу блютанга В результате проведенных исследование было установлено антигенное родство вирусов ЭГВО и болезни Ибарзки. Антигенная взаимосвязь, обнаруженная наиболее чувствительной серотипоспеци-Фической реакцией нейтрализации была сильнее (65Х) между сероти-пом 2 (пгг. Альберта) ВЭГБО я ВБИ, чем между серотипом 1 (шт. Ныо-Джярси) и ВБИ. Таким образом, между ВЭГБО и ВБИ судаствует перек-

рестная реактивность до данным РДП, РСК, РН и ТФ ИФА. Это позволяет утверждать, что эти два вируса антигенно родственны, и отнести ВВИ к серогруппе ЭГБО, как представителя 2 серотипа (шт. Альберта). Была воспроизведена подострая форма болезни на благородных оленях. Инокуляцию вируса проводили внутривенно. Объем частично очищенного вируса составил 2 мл, с активностью 10 1к ТЦД50/ыд и 1 мл для нативного, с активностью 7,7 1е ШЩ50/мл. На 8 сутки после инокуляции отмечено повышение температуры до 41,1 С у оленей, зараженных нативныы материалом. Кроме этого отмечали отдышку, гиперемию и набухание слизистых оболочек носовой и ротовой полости, конъюнктивы, отказ от корма, угнетение, плохую свертываемость крови. На 14 сутки наблюдали кровоизлияния и гиперемию на конъюнктиве и слизистых оболочках рта и носа. У оленей, зараженных частично очищенным вирусом, указанных выше отклонений от нормы не наблюдали. Лихорадочное состояние продолжалось с 8 по 30 сутки после введения вируса, с периодами ремиссии. Вирус из крови выделяли с 8 по 22 сутки после заражения в культуре клеток 1ЮГК-60. Вирус проявлял цитопатическое действие и накапливался от 3,5 до 4,75 ТЦД50/КД. После переболевания отмечали поражение кожи в виде синюшных пятен на коже в области холки и кресца, на месте которых затем образовались эрозии, что характерно для подаст рого течения болезни. Для получения активной специфической сыворотки благородных оленей провели гипериммунизацию этих оленей. Активность полученных сывороток в РН составила .1:128-1:1024, РДП 1: 2-1:4 и РСК 1:32-1:256.

Воспроизвести клинически выраженное заболевание у телят 2-:: месячного возраста при заражении вирусом ЭГБО не удалось. Однако после трех инъекций вируса в сыворотках телят выявлены нейтрализующие антитела в титрах 1:512-1:1024. Индекс нейтрализации ВЭГВО Оцл равен 5.25 1?, Вирус блхяанга этими сыворотками не нейтрали-

зоЕался.

2.2.2. Отработка и сравнительная оценка "Сзндвич"-варианта ' тф ИФА для выявления антигенов вируса 'сЦ'ВДГ

---------С- целью- определения оптимальной ~ культуральной системы для

приготовления специфических антигенов использовали следующие

культуры клеток: ПСГК, ПС и CV-1.

Наибольшей активностью (1:4-1:8 в РДП и 1:32-1:64 В PCR) обладали антигены, приготовленные с использованием культур клеток ПСГК (суспензионный трофовариант) и CV-1 (монослойный трофовари-ант). .......

Иммуноглобулины G, необходимые в качестве препаратов антител для сенсибилизации твёрдой фазы и приготовления конъюгатов, выделяли из специфических сывороток овец, оленей, КРС и ЛАЯ мышей. Из сывороток и ИАЖ мышей бь&о выделено по 2 серии IgG. Чистота полученных IgG подтверждена исследованием в иммуноэлектрофорезе.

Активность выделенных из сывороток-и ЛАЯ IgG составляла в РДП 1:4-1:8 и в РСК 1:2-1:32. однако удельная активность IgG, выделенных из ИАЖ, была в РДП в среднем в 2 раза выше, чем IgG, выделенных из сыворотки.

Йспсльзуя специфические IgG из сызоротки, приготовлено 10 серий пероксидазных конъюгатов-, 4 серии пероксидазных конъюгатов

-Vi '

изготовлено с использованием специфических IgG из ИАЖ.

Отработку "Сзндвич"-варианта - ТФ ИФА проводили ло принципу шахматного титрования. При постановке "Сэндвич"-варианта отрабатывали дозу IgG для сенсибилизации, оптимальные разведения специфических пероксидазных конъюгатов и оптимальный буферный раствор для разведения реагентов.

Для определения титра полученных специфических пероксияааных конъюгатов, проводили их шахматное титрование со специфическим и нормальным антигенами. Титром специфического конъюгата считали максимальное его развед&ние, которое выявляет минимальное коли-

Ст 12 -

чество специфического антигена. Полученные кокъюгаты имэли недостаточно высокую активность (1:100-1:200) при применения их в "Сэндвич"-варианте ТФ ИФА. Для постановки "Сэндвич"-варианта ТФ ИФА их использовали в рабочем разведении, равном удвоенному титРУ-

Дяя уменьшения связывания нормальных клеточных компонентов с препаратам;? антител, используемых для сенсибилизации лунок и приготовления конъюгатов.был применён буферный раствор, предложенный Кеппа (1985) и состоящий из 0,01 М трис-НС1 рН 7,6-7,8, содержащего О.ЗХ ИаС!, 0,5% казеина и 0,02% мертиолята (КМБ). На КМБ го-тоеили разведения как антигенов, так и конъюгата.

Использование-КМБ в качестве буферного раствора для разведения реагентов обеспечивало резкое уменьшение связывания нормальных, клеточных компонентов со специфическими 1еВ, вследствие чего 5-кратно, относительно, буферного раствора с 0,5% БСА. снижалась оптическая плотность субстрата в лунках с нормальным антигеьом при полном сохранении уровня взаимодействия специфических антигенов и антител. Однако, "Сэндвич"-вариант ТФ ИМ на основе полик-лональкых антител во всех исп.чтанных модификациях оказался непригодным, для выявления антигена ВЭГБО.

Полученные результаты свидетельствовали о необходимости применения иных методических подходов, при которых предполагалось бы использование по крайней мере одного иммунореагента, имеющего абсолютную или близкую к таковой моноспецифичность. Очевидно, что достичь такой специфичности к антигенам вируса ЭГВО можно было бы только с помощью моноклональкых антител..

Для получения моноклонадьных антител (МА) мышей иммунизировали частично очищенным вирусом ЭГБО. Активность сывороток в непрямом варианте ТФ ИФА составила 1:12300. Для гибридизации использовали клетки селезёнки мышей, иммунизированных частично очищенным

вирусом ЭГБО.

Гибридизацию спленоцитов иммунных мышей проводили с клетками - миеломы линии Зр2/0-Аг14.1, дефектной по гену ГТФРТ. При слиянии клеток селезёнки и миеломы соблюдали соотношение 10:1.

Скрининг специфических гибридом проводили трех-четырехкратно с трехдневным интервалом непрямым методом ГФ ИФА. Учитывая тог факт, что вирус ЭГБО антигенно родственен вирусам блютанга и болезни Ибараю, при тестировании гибридом в непрямом варианте ТФ ИФА использовали культуральныа антигены вирусов ЭГБО, болезни Ибараки и блкгганга

Клони, специфичные к антигенам вируса ЭГБО по результатам ТФ ИФА, и не дающие перекрёстных реакций с антигенами вирусов блютанга и болезни Ибараки, клонировали в полужидком агаре. Дня получения линии гибридом со стабильными свойствами было достаточно 2-3 клонирований, после чего их нарашивали и криоконсервировали в лэдком азоте или при -70 С. В результате проведённого опыта было получено 68 клонов гибридом, из них 3 специфичных к антигенам вируса ЭГБО, что составило 4,4% от общего количества клонов. Максима! ь и ш титры антител в культуральных и асцитических жидкостях наблюдали у клонов ЗРЮ и 2Р10 (изотип антител обоих клонов и 02а соответственно); активность в непрямом варианте ТФ ИФА 1:256000 и 1:512 ООО, соответственно. Специфичность антител проверяли я непрямом варианте ТФ ИФА с антигенами вирусов ЭГБО, болезни Ибараки и блютанга. Результаты исследованйй показали, что антитела ни одного из полученных клонов не взаимодействовали с антигенами вируса блютанга. МА клона 2ПО в "сэндвич"-варианте ТФ ИФА, позволяют дифференцировать вирус ЭГБО от вирусов блютанга и Ибараки. Однако, МА вышеназванного клона не вступали во взаимодействие и с антигеном ВЭГБО 2 серотипа (тт. Альберта), что, по-видимому, указывает на штаммоспецифическую принадлелиость мо-

ноклональных антител; но Ш клона 3010 реагировали как с первым серотипом ВЭГВО, так и со вторым.

Результаты исследований показали, что ОД только только двух клонов 2Я0 и 3010 проявляли активность в "сэндвич"-вариан?е ТФ ИФА. В последупдей работе использовали МА и перокоидазкые конъ-югаты на основе МА клонов 2П0 и 3010. Активность полученных конъюгатов в прямом методе ТФ ИФА составила 1:2000 и 1:4000, соответственно.

Установлено, что оптимальной концентрацией для сенсибилизации является концентрация 1 мкг/нл, что составляет 0,1 мкг/лунку.

Для определения чувствительности и специфичности метода исследовали антигены вируса ЭГБО, а также контрольные и гетерологич-ные антигены (кондавтркровеяные культуральныо антигены - вирусов Слотанга, болезни Ийараки, чумы КРС и болезни Акабане и вируссо-держшзде неконцентрированные культуральные жидкости). Положительные результаты в "Сэндайчн-варианте ТФ ИФА зарегистрированы только при внесении в лунки препаратов, содержащих антигены вируса ЭГБО, ва основании чего можно заключить, что "Сзндвич"-вариант ТФ ИФА на основе МА является специфичным методом выявления антигенов вируса ЭГБО.

"Сэндвич"-вариант ТФ ИФА позволяя выявлять специфические антигены вируса ЭГБО как в концентрированных препаратах (титр до 1:2187), и некоццентрированвых культуральных жидкостях (титр до 1:9). Чувствительность метода составляла 4,5 ЩЩбО/мл.

2.2.3. Отработка и сравнительная оценка непрямого варианта тф Ифа для выявления антител, специфичных к вирусу агш.

Для сенсибилизации пластин использовали антигены, приготовленные из мозга инфицированных мышат-сосунов методом сахаро-ао-ацетоновой экстракции с активностью в РСК 1:16-1:32 и клеток ПСТК и СТ-1. заражённых вирусом ЭГБО 1 и 2 серотипа с активностью в ' РДП 1:4-1:8, и контрольные антигены, приготовленные из неза-

ражённых культур клеток ПСГК и СУ-1 и мозга интактных мышат. Антигены были стандартизированы по концентрации белка (10 мг/мл). Определение оптимального- разведения антигена- для --сенсибилизации

лунок проведено шахматное титрование его со специфической и нормальной сыворотками. Из полученных результатов следует, что при всех разведениях специфической сыворотки оптическая плотность максимальна в лунках, сенсибилизированных специфическим антигеном в разведении 1:200, причем культуральные антигены оказались малопригодными для использования в непрямой варианте .ТФ ИФА. в виду их низкой чувствительности.

В работе использовали сыворотки крови оленей, КРС и овец, взятые в различные сроки после заражения с активностью в РДП 0-1:16 и в РСК - 1:16-1:128. Нормальные сыворотки получали из крови не-зараженных клинически здоровых оленей, КРС и овец.

Антивпловые выделяли из сыворотки кроликов, иммунизированных ¡ев оленя, КРС и сгцы. Активность антигидовых е РДП составляла 1:128-1:512.

На основе антивидосых приготовлено 12 серий иммуноперок-сидазных гснъюгатов. Титры конъюгатов составляли от 1:200 до 1:800. За рабочее иазведение конъюгата принимали его удвоенный титр.

В качестве буферного раствора для разведения реагентов использовали казеин-мертиолатный буфер рН 7,2-7,4.

Одним, если не главным вопросом в разработке непрямого варианта ТФ ИФА для выявления антител при ЭГБО, являлся вопрос о критериях "позитивности" результатов. По мнению Оипсап (1983) , единственным достоверным критерием является статистически достоверное отличие ОП опытного образца от ОП контрольного.

Кроме отработки оптимальных условий постановки непрямого варианта ТФ Ш. необходимо сило установить критерии ясзиткгдости

<Э - 16 -

тестируемых сывороток. Существует два способа учета результатов этого варианта: первый - сравнение оптических плотностей (ОН) в лунках, сенсибилизированных специфическим антигеном, в одни из которых вносят тестируемую сыворотку и в другие - пул контрольных сывороток. При этом сыворотка считается положительной, если ОП в лунках с ней в 2,1 раза больше ОП в.лунках с контрольной сывороткой. Второй - сравнение оптических плотностей в лунках, сенсибилизированных специфическим антигеном с ОП б лунках, сенсибилизированных 1юнтрол1ным антигеном, при внесении е эти лунки одной и той же сыворотки, критерий позитивности определяется на основании статистической обработки (Ъ-критерий Стыодента и критерий Фишера). .

Достоверные различия с контрольными сыворотками, соответствующие критерию позитивности, обнаружены, начиная с разведения 1:5 для сывороток, специфичных к ВЭГБО.

-При исследовании контрольных (нормальных) оленьих и овечьих сывороток было обнаружено еще одно неблагоприятное явление: часть сывороток в разведении 1:5 ..опосредовала сильное окрашивание раствора субстрата как в лунках с контрольным, так и специфичес-антигенами. ОП более, чем в 252-ах случаев превышала 0,£ еди-; ницы и в 302-ах - находилась на уровне 0,2- единиц, что не позволяло отличать низкоактивные сыворотки от контрольных. Поэтому необходимо было определить,- какое превышение ОП в лунках со специфическим антигеном над ОП в лунках с контрольным антигеном свидетельствует, о позитивности тестируемой сыворотки. Для этого в непрямом варианте ТФ ИФА при учете результатов по второму способу было исследовано 30 оленьих, 20 овечьих контрольных сывороток и 20 сывороток крупного рогатого скота в разведении 1:5. Установлено, что среднее значение превышения ОП составляло 0,204 +- 0,038. Стандартное (среднее квадратичное) отклонение (б) составило

0,028. Анализ распределения разницы ОЯ подчинялся закону нормального распределения. Шэтому 99% всех значений этого показателя

находилось в пределах +36, что составляло 0,167- единицы ОН- Это-------------

означает, что если ОП в лунках со специфическим антигеном превышает ОП в Лунках с контрольным антигеном на величину больше 0,157 ед. , то вероятность того, что эта сыворотка контрольна! по отношению к сыворотке, специфичной к ВЭГЕО, не превышает "Л. Разница ОП на 0,204 ед. соответствовала 99.9<?2-ной вероятности, что такая сыЕоротка не относится к совокупности контрольные сывороток. Шз- . тому в качестве критерия позитивности для сывороток в разведении 1:5 было принято следующее положение: сыворотка считается положительной на наличие антител к ВЭГБО, если при её исследовании в разведении 1:5 ОП в лунках со специфическим антигеном на 0,204 ед. больше ОП в лунках с контрольным антигеном. Для разведения сывороток 1:25 такой критерий составил С, 094 ед. ОП.

Непрямой вариант ТФ КФА применяли для выявления специфических антител в сыворотках крови переболевших оленей, крупного рогатого скота и овец, а также в пробах сывороток крови оленей, крупного рогатого скота и овец, доставленных из /озяйстб.

Для определения чувствительности и специфичности метода в опытах использовали сыворотки оленей, крупного рогатого скота и овец, зараженных вирусом ЭГБО, штаммы Нью-Джерси и Альберта (положительный контроль), сыворотки незаражзнных. клинически здоровых оленей, крупного рогатого скота и овец (отрицательный контроль) , а также сыворотки крови оленей, крупного рогатого скота и овец, инфицированных гетерологичными вирусами и бактериями.

Титры сывороток определяли по отношению оптической плотности (ОП) разЕедения специфических сывороток в лунках со специфическим антигеном к оптической плотности в лунках п нормальный« сыворот- ' ками. Если отношение ОН в лунках со специфическим сыворотками к

ОН в лунках с нормальными сыворотками больше или равно 2,1; то сыворотка считается положительной. Если меньше - то отрицательной.

Антитела, специфичнее к вирусу ЭГЕО, обнаружены в сыворотках оленей, крупного рогатого скота и овец, заражённых вирусом ЭГБО и не обнаружены в сыворотках здоровых свец, а также зараженных ге-терологичными вирусами и бактериями, что свидетельствует о высокой специфичности предложенного метода "Но данный метод выявляет еще и антитела к вирусу болезни Ибараки, так как этот вирус входит в серогруппу ЭГБО. Однако в лунках пластины с разведением сывороток 1:5 Скак специфических, так нормальных и гетерологичных), наблюдали фоновое окрашивание субстрата, что могло привести к ложноположительным результатам. Поэтому в последующем учёт результатов проводили, начиная с разведения 1:25.

Для определения возможности применения непрямЬго варианта ТФ ИФА с целью выявления антител у зараженных вирусом ЭГБО овец и крупного рогатого скота исследовали сыворотки крови, полученные в лаборатории эпизоотологии у ветврача экспедиции А. Л Чичичина.

фи изучении динамики появления специфических антигел в сыворотках зараженных«овец установлено, что антитела в непрямом варианте ТФ Шк можно выявить, начиная с 8-21. суток после заражения.

Специфичность метода подтверждали, используя гетерологичные (специфичные к вирусам болезни Ибараки, блюганга, болезни Найроби, чумы КРС, туберкулезу, пастереллезу, аденоматозу). ■

Результаты сравнительного изучения чувствительности непрямого варианта ТФ Шк с РДП и РСК показали, что титры специфических антител е сыворотках овец, выявляемые разрабатываемым методом, строго корреллируюг с титрами антител в РДП (г~0,96; р<0,05) и не корреллируюг с титрами антител в РСК (г-0,28; р>0,5). Следует отметить. что . титры антител в РДП также не корреллируюг с титрами

антител в РСК < г=0,48; р>0,2). Чувствительность непрямого варианта ТФ И1>А превышала чувствительность РДП более, чем в 100-500 раг, а РСК в ёО - 300 от.

В плане апробации "Набора.." и диагностической оценки метода ТФ И'ГА б период с 1389 по 1992 г. исследовано 623 проб сывороток к'оови оленей, КРО, коз и овец из различных регионов бывшего СССР. Выявлено 16 проб сывороток, пологштельно реагирующих со специфическим антигеном вируса ЭГБО.

2.-1. Обработка и сравнительная оценка реакции задержки гемагглюгинации для выявления антител, специфичных к вирусу 41 'БО.

Разработан способ получения специфического антигена, пригодного для постановки РЗГА. Отработаны ' условия постановки РГА и РЗГА. Вирус агглютинирует эритроциты морской свинки, барана, крупного рогатого скота, козы, курицы, цыпленка, кролика, человека, мыши. Активность антигена в РГА составила 1:64-1:512.

Антиген позволяет выявлять в РЗГА антитела вирусспецкфические антитела к вирусу ЭГБО и дифференцировать их от специфических антител к вирусу блютанга, а также от гетерологичных вирусов и бактерий.

3. выводы

1. Отработана технология изготовления универсального специфического культурального антигена вируса ЭГБО с активностью в РДП 1:4-1:8, В РСК 1:64-1:128, в ТФ ИФА 1:625-1:3125 и способ получения очищенного культурального антигена для постановки РГА и РЗГА: с активностью в РГА - 1:512 -1:2048.

2. Ра-.работая непрямой вариант ТФ ИФА, обеспечивающий выявление антител, специфичных к вирусу ЭГБО в сыворотках крови .тавотных с 10-15 суточ после заражения, в титрах от 1:25 до 1:1Ь625. Чувствительность метода превышает чувствительность ГДП более, чем в 100-21)0 раз, а РСК в 60 - 300 раз.

3. Получено 3 гибридомы, продуцирующие моноклонильные антитела к антигенным детерминантам вируса ЭГБО. Активность монокло-нальных антител из ИАЖ мышей, продуцируемых гибридомами клонов ЗОЮ и 2Р10 в ТФ ИФА составляла 1:256000-1:512000, а пероксидаз-ных конъюгатов, полученных на их основе - 1:200-1:4000.

4. Разработан метод ТФ ИФА на основе моноклинальных антител, для выявления специфических антигенов при ЭГБО и дифференциации их при блютанге. "Сэндвич"-вариант ТФ ИФА позволяет выявлять специфический антиген вируса ЭГВО з вируссодержаших культуральных материалах в титрах от 1:3 до 1:.729. Чувствительность метода составляет 4,54 0,5 1г ЦЦЦ50/мл.

5. В результате проведенных исследований было установлено антигенное родство вирусов ЭГБО и болезни Ибараки. Антигенная взаимосвязь, обнаруженная наиболее чувствительной серотилоспецифичес-кой реакцией нейтрализации была сильнее (65%) между серотипом 2 ВЭГБО и ВВИ, чем между серотипом 1 и ВБИ (ОХ). Это позволяет утверждать, что эти два вируса анткгенно родственны, и отнести ВБИ к серогруппе ЭГБО, как представителя 2 серотипа.

6. Отработаны оптимальные условия для постановки РТА и РОГА

для выявления антигенов и специфических антител к вирусу ЭГБО, заключающиеся в использовании альбумино-боратного буферного раствора, рН 9,0 для разведения антигена и сывороток и применении 0,252 эритроцитов барана.

7. Установлена пригодность разработанных методов ТФ ИФА, РТА и РЗГА для дифф». ренциальной диагностики ЭГБО и блютанга

4. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. В результате проведения экспериментальных исследований получены данные, позволяющие рекомендовать для диагностических целей чувствительные, специфичные, вЫсокопроиз водителы»« и экспрессные методы ТФ ИФА для выявления специфических антигенов и антител при ЭГБО, на который лодготовлэны "Методические указания по обнаружению антите к вирусу ЭГБО непрямым вариантом твердофазном иммунофернентным анализом", утвержденные директором ВНИИБВиЫ, а такте "Методические указания по обнаружению антигена вируса ЭГБО "сэндвич"-вариантом ТФ ИФА".

2. Предложены "Методические указания по лабораторной диагностике ЭГБО реакцией гемагглютинации и задержки гемагглютинацки".

3. Разработаны и предложены : "Набор диагностических препаратов для выявления антител при ЭГБО непрямым вариантом твердофазного иммуноферментного анализа", а так» "Набор диагностических препаратов для выявления антигена чируса ЭГБО "сэндвич"-вариантом твердофазным иммуноферментным анализом", на который составлена норматизно-техническая документация ( Временная инструкция по изготовлению и контролю, Технические условия и Наставление по применению) , утвержденные директором института.

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Валытева R И. .Жестерев В. И., Стрельцов А Ф., Хижинская ЕЕ, Олейник Да, Курносов А. А., Новикова М. Б., Луницын А. В. Перспективы использования культуры клеток ПСГК в вирусологической практике. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.-Шкров, 1992. -с. 290-291.

2. Луницын А. Е Эпизоотическая геморрагическая болезнь оленей (обзор литературы). // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.-Шкров, 1990. -с. 48-49.

3. Луницын А. В., Вишняков И. Ф. Чувствительность перевиваемых культур клеток к вирусу эпизоотической геморрагической болезни оленей. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -Шкров, 1990. -с. 49-50.

4. Луницын А. Е , Вишняков И. Ф. Отработка условий изготовления сахарозо-ацетонового антигена вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей. //В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.-Покров, 1990. -с. 116-117.

5. Луницын А. Е , Чичикин А. Ю., Стрижаков А. А., Вишняков И. Ф., Семенихин А.Л. Воспроизведение ЭГЕО на благородных оленях.// В сб. Вопросы ветеринаоной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -Покров, 1992. -с. 254.

6. Луницын А. Е , Вишняков iL Ф., Балышева R И., Витина С. А. Изучение некоторых свойств вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии И ЭПИЗООТОЛОГИИ. -Покров, 1992. -С. 255-255.

7. Луницын А. Е , Вишняков К Ф. Отработка условий получения •' специфического культуралъного антигена вируса эпизоотической геморрагической болезни оленей. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -Покров, 1992. -с. 256-257.

8. Луницын А.Е, Вишняков JL ф. Применение непрямого варианта твердофазного ИФА для выявления антител к вирусу эпизоотической геморрагической болезни оленей. // В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии.-шкров, 1992. -с. 257-258.

9. Луницын А. Е, Вишняков И. Ф. Получение иммуноасцитической жидкости, специфичной к вирусу эпизоотической геморрагической болезни оленей. //В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -Покров, 1992. -с.258.

10. Малоголовкин С.А., Луницын А.Е, Вишняков И.Ф. Характеристика моноклональных антител к вирусу эпизоотической геморрагической болезни оленей. //В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -Покров, 1992. -с. 338.

11. Чичикин А. й, Луницын А. Е , Книзе А. В Эпизоотическая ситуация по эпизоотической геморрагической болезни оленей. //В сб. Вопросы ветеринарной вирусологии, микробиологии и эпизоотологии. -Покров, 1992. -с. 259-260.