Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней

На правах рукописи

БАЯН ДУЛАНМСУРЕН

РАЗРАБОТКА ИНАКТИВИРОВАННОИ ЭМУЛЬСИОННОМ ВАКЦИНЫ ПРОТИВ ПАСТЕРЕЛЛЁЗА РОГАТОГО СКОТА, ЛОШАДЕЙ И СВИНКИ

16.00.03 "Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология".

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

Владимир - 2005

Работа выполнена в Федеральном государственном учреждении «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Научный руководитель: доктор ветеринарных наук, старший научный

сотрудник РУСАЛЕЕВ Владимир Сергеевич

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

МИЩЕНКО Владимир Александрович (ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г.Владимир);

кандидат биологических наук, старший научный сотрудник

СЕЛЯНИНОВ Юрий Олегович (ГНУ ВНИИВВиМ, г.Покров)

Ведущая организация: ФГУ Всероссийский государственный Центр качества

и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов (ФГУ ВГНКИ, г. Москва)

Защита диссертации состоится года в И) часов на

заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п/о Юрьевец, ФГУ Федеральный центр охраны здоровья животных».

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Автореферат разослан 2005 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета, канд.биол.наук ^/^¿¿¿-.ггЛ*/ Г.М. Семенова

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Пастереллёзы — различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, вызываемые бактериями рода Ра81еиге11а.

Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных принадлежит двум видам: Ра81еиге11а тиксклёа и Ра81еиге11а Ьаето1у11са (МапЬе1т1а Ьаето1у11са).

Р.гпикошёа является возбудителем геморрагической септицемии животных, а также легочных пастереллёзов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии.

Р.Ьаешо1у11са вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.

Кроме перечисленных заболеваний эти два вида пастсрелл могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров - при артритах, у телят и ягнят - при артритах и других локальных патологических процессах.

Одним из основных звеньев в системе мер борьбы с пастереллёзами является иммунопрофилактика.

В настоящее время ветеринария располагает значительным арсеналом вакцинных препаратов, различающихся по составу, технологии производства, способу применения и эффективности.

Большинство противопастереллёзных вакцин выпускается в виде инактивированных формалином, сорбированных или эмульсионных препаратов.

Эмульсионные вакцины, используемые в животноводстве превосходят по иммуногенности сорбированные, однако высокая вязкость и реактогенность таких препаратов являются основной причиной, препятствующей их широкому применению на практике.

Исходя из вышеизложенного, достаточно актуален вопрос разработки новой инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней, лишенной вышеуказанных недостатков.

Цель и задачи исследований. Основная цель данной работы состояла в разработке эффективной и удобной в применении вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить биологические свойства штаммов PasteureИa multocida и PasteureUa haemolytica;

- приготовить образцы антигенов пастерелл, инактивированных аминоэтилэтиленимином;

- изготовить экспериментальные образцы вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

количественно охарактеризовать на лабораторных животных зависимость между дозой антигена в составе вакцины и защитой от летальной дозы возбудителя;

- определить оптимальную иммунизирующую дозу, напряженность и продолжительность иммунитета после применения вакцины на крупном рогатом скоте и овцах.

Научная новизна работы. В результате проведённых исследований:

- установлена высокая антигенная и иммуногенная активность антигенов P.nutltocida и P.haemolytica инактивированных аминоэтилэтиленимином, в составе вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

на лабораторных животных количественно охарактеризована зависимость между дозами антигенов в составе вакцины, титрами антител и защитным эффектом препарата;

- установлена оптимальная концентрация антигенов P.multocida и P.haemolytica в прививной дозе вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- обоснована целесообразность использования белых мышей в качестве модели для оценки иммуногенности вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- разработаны методы контроля и применения вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке нормативно-технической документации па получение и применение «Вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной» (Утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 7 апреля 2004

г.).

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ 30 сентября. 2004 г. "Методические рекомендации по глубинному культивированию бактерий PasteureИa haemolytica" и «Методические рекомендации по инактивации бактерий PasteureИa haemolytica аминоэтилэтиленимином».

Основные положения, выносимые на защиту:

- инактивированная эмульсионная вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- оптимальная иммунизирующая доза антигенов в вакцине против пастсрсллсча рогатого скота, лошадей и свиней;

- результаты изучения физических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- результаты изучения иммунобиологических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.

Апробации работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:

- Международной научной конференции молодых ученых "Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных", Владимир, 24-26 марта 2004 г.

- Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных», Покров, 28-30 сентября 2004 г.

Публикации. По материалом диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список использованной литературы включает 190 источников, в том числе 106 работ зарубежных исследователей. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 19 таблицами. В приложении представлены копии документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

Исследования по диссертационной работе выполнены в 2002 — 2004 г.г. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы

Штаммы микроорганизмов. В экспериментальной работе использовали следующие контрольно-производственные штаммы пастерелл: PasteureИa multocida №115, №1231 (серогруппа А), №656 (серогруппа В), №9 (серогруппа Д); PasteureUa haemolytica (Mannheimia haemolytica) №169 тип А, полученные из музея бактериальных культур ФГУ «Всероссийский государственный Центр

качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ ВГНКИ), г.Москва.

Питательные среды. При проведении исследований в качестве питательных сред служили:

- мясо-пептонный бульон (МПБ);

- мясо-пептонный агар (МПА);

- бульон на основе мясного перевара по Хоттингеру (с содержанием 250300 мг% аминного азота);

- агар на основе мясного перевара по Хоттингеру;

- мясо-пептонный полужидкий агар (МППА), с содержанием 0,15-0,3% бактоагара фирмы 'та&с", США;

- сывороточный МПА, с содержанием 5-20% стерильной прозрачной сыворотки крови барана;

- кровяной МПА, с содержанием 5% дефибринированной крови барана;

- мясо-пептонный печеночный бульон (МППБ) под вазелиновым маслом;

- агар и бульон Сабуро;

- среды Гисса.

Подопытные животные. В экспериментальной работе использовали следующие виды и возрастные группы животных:

-белые мыши массой 16-18 г, для контроля реактогенности масляного адъюванта, токсичности инактивированной биомассы пастерелл, безвредности вакцины;

-белые мыши массой 18-20 г, для определения вирулентности пастерелл;

-белые мыши массой 20-22 г, для определения антигенных и иммуногенных свойств вакцины;

-кролики массой 1,5-2,0 кг, для контроля реактогенности масляного адъюванта, безвредности и реактогенности вакцины;

-кролики массой 2,5-3,0 кг, для определения вирулентности пастерелл, для оценки антигенной и иммуногенной активности вакцины;

-молодняк крупного рогатого скота в возрасте 8-9 мес. для оценки безвредности, иммуногенных и антигенных свойств вакцины;

-овцы в возрасте 2,5 года, для определения вирулентности пастерелл, оценки безвредности, иммуногенных и антигенных свойств вакцины.

Бактериологические краски. При изучении морфологии пастерелл использовали следующие краски:

- краска Романовского-Гимзы (азур-эозин);

- набор для окраски по Граму;

- набор для окраски по Бурри-Гинсу.

Растворы и реактивы. При изготовлении растворов использовали:

- реактивы квалификации "ч.д.а" или "х.ч" и бидистиллированную или деминерализованную воду.

- физиологический раствор NaCl 0,85-0,9%, рН 7,2-7,4, забуференный натрием фосфорнокислым двузамещённым (ГОСТ 4172-76) и калием фосфорнокислым однозамещённым (ГОСТ 4198-75), готовили по общепринятой технологии;

- аминоэтилэтиленимин с содержанием активного вещества не менее 15%, НПП Биохимресурс, г.Владимир;

- формалин технический с содержанием формальдегида не менее 36% (ГОСТ-1625-89);

- масляный адъювант Montanide ISA-70, производства фирмы "Seppic", Франция, (стандарт ИСО 9001);

- капсулышй (К) антиген бактерий P.multocida серогрупп А, В и Д, приготовленный по общепринятой технологии в лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ, для постановки РНГА;

- наборы для выявления антител к бактериям P.multocida в сыворотках кропи крупного рогатого скота иммуноферментным методом, производства ФГУ ВНИИЗЖ;

- системы индикаторные бумажные (СИБ), для идентификации энтеробактерий, производства Нижегородского предприятия бактерийных препаратов, Россия.

Оборудование. В работе использовали следующее оборудование: холодильник бытовой "Бирюса"; термостат лабораторный "MIM"; микроскоп световой МБИ-15 "Биолам"; аппараты для культивирования микроорганизмов АК-210, с объёмом ферментеров 10 дм3; иономер И-130; центрифугу проточную ОТР-102К-01; коллоидную мельницу DS-51P44; центрифугу клиническую ОПН-3; микроразмельчитель тканей РТ-2; весы лабораторные OHAUS; весы технические Т-2; вискозиметр капиллярный ВПЖ-2; оптический стандарт мутности на 5 и 10 единиц, производства ГИСК им. Л.А.Тарасевича; посуду лабораторную стеклянную (ГОСТ 25336-82Е); шприцы инъекционные многократного применения.

Методы

Методы изучения биологических свойств пастерелл Морфологию и тинкториальные свойства пастерелл изучали под микроскопом в фазовом контрасте и путем окраски клеток по Граму. Для определения штаммов, способных образовывать капсулу in vitro, культуры выращивали на кровяном МГЛА в течение 18-24 ч, а затем красили по Гинсу. Тела бактерий - красные. Капсула на темном фоне видна в виде светлого ореола вокруг бактерий. Подвижность бактерий определяли на МППА, производя посев уколом и инкубируя культуры 16-18 ч при 37°С. Рост пастерелл по уколу свидетельствовал о неподвижности бактерий.

Культуральные свойства пастерелл изучали по характеру роста на жидких и плотных питательных средах (МПБ и МПА).

Биохимические свойства. Гликолитическую активность пастерелл проверяли посевом на среды Гисса и тестами с СИБами с последующим

инкубированием в течение 24-48 ч при 37°С. О ферментации углеводов судили по изменению окраски среды.

Редукцию нитратов выявляли по росту культуры на бульоне с нитратами (KNO3) в течение 48 ч. В каждую пробирку с засеянным нитратным бульоном, прибавляли по 1 см3 реактива (равная смесь 10%-ной химически чистой H2SO4 и раствора из 1%-ного растворимого крахмала и 5%-ного Ю). О восстановлении нитратов в нитриты судили по темно-синему окрашиванию бульона.

Продукцию каталазы определяли путем смешивания на предметном стекле 1 капли 3%-ной перекиси водорода и одной "петли" суточной агаровой культуры испытуемого штамма. При наличии каталазы появляются пузырьки газа.

Вирулентность штаммов определяли по количеству живых микробных клеток в ЛД50 или ИД50 дозе, которую рассчитывали по формуле Кербера в модификации Ашмарина.

Белых мышей заражали подкожно, кроликов — внутримышечно или интраназально в объёме 0,5 см3 десятикратными разведениями (10-1-10-9) суточных бульонных культур пастерелл в забуференном физиологическом растворе. Концентрацию пастерелл в заражающих дозах определяли методом титрования на плотных питательных средах и выражали в колониеобразующих единицах (КОЕ/доза). Для этого по 0,5 см3 стандартизированных взвесей бактерий в разведениях 10-6-10-9 высевали на кровяной МГЛА. Через 48 ч инкубации при 37°С подсчитывали количество выросших колоний, эквивалентных числовому значению живых бактерий в заражающих дозах.

Определение количества живых микробных клеток

Количество живых бактериальных клеток в суспензии определяли путем подсчета КОЕ. Для определения КОЕ готовили 10-кратные разведения культуры в забуференном физиологическом растворе и высевали заданным объёмом на кровяной МПА в чашках Петри. Посевы инкубировали при 37°С в

течение 18-24 ч, подсчитывали количество выросших на чашках колоний и рассчитывали среднюю арифметическую величину для каждой серии чашек и каждого разведения.

Световая микроскопия

Световую микроскопию бактериальных клеток проводили под микроскопом марки МБИ-15 "Биолам" при увеличении х700 раз в мазках культур, фиксированных на предметном стекле и окрашенных различными методами.

Определение реактогенности масляного адъюванта

Определение реактогенности адъюванта проводили на лабораторных животных. Кроликам препарат вводили внутримышечно с внутренней стороны бедра в объёме 0,5 и 1,0 см3. Спустя две недели животных убивали, вскрывали и учитывали макроскопические изменения в месте инъекции.

На белых мышах адъювант оценивали по методу Гарцета в модификации Е.В. Гусевой и А.И. Дудникова.

Изготовление опытных образцов вакцины

Для изготовления опытных образцов вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней использовали суспензию пастерелл, инактивированную аминоэтилэтиленимином. (Культивирование и инактивацию проводили в лаборатории микробиологии ФГУ ВНИИЗЖ совместно со старшим научным сотрудником В.М.Гневашевым, согласно методическим рекомендациям).

Опытные образцы вакцины готовили путем смешивания очищенных, концентрированных и инактивированных антигенов с различными объёмами масляного адъюванта. Смесь перемешивали на микроразмельчителе тканей РТ-2 при 3000 об/мин в течение 5 мин.

Определение физических и иммунобиологических свойств опытных образцов вакцины

Стабильность вакцины оценивали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин, а также двухнедельной выдержкой в термостате при 37°С.

Кинематическую вязкость измеряли капиллярным вискозиметром ВПЖ-2.

Определение стерильности вакцины проводили в соответствии с ГОСТом 28085-90 "Препараты биологические. Методы бактериологического контроля стерильности".

Полноту инактивации пастерелл определяли по потере способности инактивированного возбудителя рости на искусственных питательных средах.

Безвредность вакцины определяли на лабораторных и естественно восприимчивых животных. Препарат вводили однократно в дозе в 3 раза превышающей рекомендуемую.

Реактогенность вакцины определяли на лабораторных животных и свиньях путем двукратной инъекции прививной дозы препарата с интервалом между введениями 20 сут. За животными наблюдали в течение 7 сут после первой и второй вакцинации, проводя ежедневный клинический осмотр животных с термометрией.

Иммуногенность вакцины изучали в опытах на лабораторных и естественно восприимчивых животных. Оценку проводили по величине минимальной дозы препарата, обеспечивающего 50%-ный защитный эффект в опыте (ИмД50).

Лаб'ораторных и естественно восприимчивых животных иммунизировали однократно вакциной в неразведённом виде и разведенными плацебо. Через 21 сут после вакцинации всех иммунизированных и контрольных животных заражали различными дозами гомологичных штаммов. Результаты опытов учитывали в течение 10 сут после заражения.

Антигенность вакцины оценивали по уровню образования специфических антител в крови иммунизированных животных. Постановку серологических реакций и учёт результатов проводили по общепринятым методикам (работу проводили совместно с ведущим научным сотрудником лаборатории микробиологии О.В. Прунтовой).

Статистическая обработка результатов

Для статистической обработки результатов пользовались методами, описанными в руководстве И.П. Ашмарина и А.А. Воробьева "Статистические методы в микробиологических исследованиях" (1962).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Основные биологические свойства контрольно - производственных

штаммов пастерелл

При изучении культурально-морфологических свойств контрольно-производственных штаммов пастерелл определяли типичность роста, морфологию, подвижность, способность к капсулообразованию.

Установлено, что рост в жидкой питательной среде в первые 16-18 ч культивирования при 37°С сопровождался слабым помутнением среды. Через 36 ч происходило просветление среды и выпадение осадка на дно пробирки, поднимающегося при встряхивании в виде косички.

На сывороточном агаре пастереллы росли в виде прозрачных, средней величины, округлых с ровными краями колоний слизистой консистенции, серого цвета, а на кровяном агаре - в виде мелких, выпуклых колоний, круглой формы. P.multocida гемолиза не вызывала, тогда как P.haemolytica формировала колонии с зоной гемолиза, которая лучше просматривалась после снятия колоний с кровяного агара.

На МППА рост наблюдали по уколу иглы в виде беловатого стержня. Окружающая среда при этом оставалась прозрачной.

В мазках из культур при окраске по Граму пастереллы имели вид грамотрицательных овоидов или коккобактерий, расположенных одиночно или попарно.

В мазках - отпечатках из паренхиматозных органов павших или вынужденно убитых животных бактерии имели вид биполяров (концевые участки микробных клеток интенсивно окрашены).

Все штаммы пастерелл формировали капсулу, выявляемую при окрашивании по Бури - Гинсу.

Изучение ферментативных свойств показало, что все штаммы пастерелл не свертывают молоко, не разжижают желатин, редуцируют нитраты, ферментируют глюкозу, маннозу, сахарозу с образованием кислоты без выделения газа.

Серовариантную принадлежность Р.тиксаёа определяли по капсульному антигену в РНГА и соматическому антигену в РА.

Патогенность пастерелл оценивали в опытах на лабораторных и естественно восприимчивых животных, определяя минимальные дозы микробных клеток, вызывающих гибель или заболевание 50% животных в опыте.

Установлено, что использованные в опытах штаммы пастерелл патогенны для лабораторных животных.

Кроме того, патогенные свойства Р.ти^алёа изучали в опытах на свиньях и овцах, доставленных из хозяйств, благополучных по пастереллезу.

Таблица 1

Определение ЛД50 P.multocida штамм №656 (В) для свиней _двух месячного возраста_

Кратность разведения Среднее количество Количество Количество лд50

суточной пастерелл в зараженных павших КОЕ/см3

бульонной заражающей животных животных М±ш

культуры дозе (КОЕ/см3) М±ш

10° 18000 4 4

КГ" 1800 4 4 56±12

10" 180±32 4 4

10° 16±4 4 0

Животных заражали внутримышечно в область бедра в объёме 1 см3. Наблюдение за животными вели в течение 10 сут после заражения (таблицы 1 и 2).

Таблица 2

Определение ЛД50 Р.тиИ;ос1^ штамм №656 (В) для овец 2.0*2.5 годовалого возраста

Кратность разведения суточной бульонной культуры

0 10"' Ю-2 Ю-3 Ю-4

ю-; кг5 ю-; 10"

Среднее количество пастерелл в заражающей дозе (КОЕ/см3),(М± т) 14x10* 14x10' 14x10*

14х 10' 14x10^ 14x1О3 14x10-176*24 16±4

Количество зараженных животных

Количество

павших животных

Сроки гибели после зараже ния (час)

18-26 20-28

23-27 22-29

24-49 24-56

45 92

ДДзо (КОЕ/см3), (М±т)

2624±367

Установлено, что для свиней ЛД50 составляет 56± 12 КОЕ/см3, а для овец -2624±36Т КОЕ/см3. Гибель животных наблюдали в течение 18-92 ч в зависимости от величины заражающей дозы.

Таким образом, использованные в работе штаммы P.multocida' и P.haemolytica имели характерные для видов пастерелл культурально -морфологические, биохимические и патогенные свойства.

Подбор режима глубинного культивирования пастерелл Ведущим звеном в технологии изготовления бактериальных вакцин является процесс получения микробной биомассы. Учитывая, что в состав разрабатываемой вакцины входят P.multocida и P.haemolytica, решено было вначале изучить некоторые кинетические закономерности роста этих двух видов пастерелл при глубинном культивировании на модели P.multocida штамм №1231 и P.haemolytica штамм №169 в аппаратах АК-210.

В процессе культивирования отбирали пробы выросших культур (с периодичностью 60 минут) и определяли в них концентрацию живых микробных клеток.

На основании полученных данных установили продолжительность лаг -фазы, которая составляла для P.multocida - 0,8 ч, а для P.haemolytica - 0,9 ч. Продолжительность экспоненциальной фазы роста составляла 3 и 3,5 ч соответственно. За это время концентрация пастерелл возросла с 8,8 ^ КОЕ/см3 до 10,4 ^ КОЕ/см3 для P.multocida и с 8,5 ^ КОЕ/см3 до 10,1 lg КОЕ/см3 для P.haemolytica. Экспоненциальная фаза роста в последующем перешла в стационарную, при которой увеличение количества живых пастерелл прекратилось.

Опираясь на экспериментальный материал, рассчитали удельную скорость роста, а затем время удвоения, которое составило для P.multocida 0,6 ч, а для P.haemolytica - 0,66 ч. Анализ закономерностей роста P.multocida и P.haemolytica показал, что они имели три характерные фазы: лаг - фазу, фазу логарифмического роста и стационарную фазу. Продолжительность этих периодов у испытанных видов пастерелл незначительно различалась. Однако у обоих исследованных видов пастерелл после 3,0-3,5 ч роста начиналась стационарная фаза роста, которая характеризовалась наибольшим количеством жизнеспособных клеток.

Изучая процесс культивирования пастерелл и рассмотрев количественные характеристики процесса размножения, был рассчитан возможный урожай клеток, то есть максимальная масса или максимальное число клеток, находящихся в культуре во время стационарной фазы.

Изучение инактивации P.multocida и P.haemolytica аминоэтнлэтиленимином и формалином

Целью данного этапа исследований было изучение инактивации P.multocicla на модели штамма №1231 и P.haemolytica на модели штамма №169

аминоэтилэтиленимином и формалином. Эксперименты начаты с определения концентрации инактиванта, обеспечивающего гибель 50% пастерелл.

Для определения К50 инактиванты вносили в концентрациях 0,0625%; 0,125%; 0,25%; 0,5%; 1%; 2% и 4%. Концентрация микробных клеток в бактериальной суспензии составляла 10 млрд.м.к./см3 по стандарту мутности. Через 1, 3, 6, 12 и 24 часа экспозиции в термостате исследуемые образцы в дозе 0,1 см3 высевали на пенициллиновые флаконы с 1 см3 кровяного агара. Результаты инактивации оценивали через 48 ч инкубирования посевов при 37°С по отсутствию характерного для пастерелл роста.

Проведённые исследования показали, что инактивация пастерелл формалином идёт быстрее, чем аминоэтилэтиленимином.

Инактивация Р.Ьаетс1у11са происходила при концентрации аминоэтилэтиленимина не ниже 0,25%, а при 0,125% наблюдался характерный рост Р.Ьаетс1у11са. Аналогичные результаты получены и для Р.тиИюаба штамм № 1231. Формалин вызывал гибель бактерий при концентрации 0,0625% в течение 1-3 ч.

Исходя из полученных данных с учетом времени инактивации рассчитали концентрации инактивантов (К50), обеспечивающих 50%-ную гибель бактерий Р.тиксшёа и Р.Ьаето1у11са.

Расчет показал, что 1%-ный аминоэтилэтиленимин обеспечивал гибель 50% клеток популяций Р.тиИюаба и Р.Ьаетс1у11са за 3 ч, а 0,35% АЭЭИ инактивировал такое же количество микробов за 6 ч. 0,48% формалина вызывал гибель бактерий Р.тиксшба и Р.Ьаетс1у11са за 1 ч.

Таким образом, проведенные исследования позволили количественно охарактеризовать процесс инактивации пастерелл аминоэтилэтиленимином и формалином, а также выявить различия между этими двумя инактивантами.

Определение К,0 позволило не только сравнить активность двух инактивантов, но и выбрать в последующем режим инактивации пастерелл аминоэтилэтиленимином. Опираясь на К50 установлена концентрация

аминоэтилэтиленимина, вызывающая 100%-ную гибель пастерелл за минимальный промежуток времени.

При отработке режима инактивации пастерелл было определено влияние температуры на скорость инактивации.

В результате проведенных исследований установлено, что повышение температуры в реакционной смеси с 26°С до 37°С увеличивало скорость инактивации и сокращало время инактивации пастерелл вдвое. Это послужило обоснованием выбора режима инактивации пастерелл 1% аминоэтилэтиленимином при 37°С.

Физические свойства опытных образцов вакцины

Вакцину против пастереллеза готовили путем смешивания инактивированного АЭЭИ антигена и добавления масляного адъюванта в различных соотношениях (20:80; 30:70; 40:60; 50:50).

При изготовлении инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза рогатого скота, лошадей и свиней эмульгирование осуществляли на микроразмельчителе тканей РТ-2 при скорости вращения 6000 об/мин в течение 5 мин при температуре 20±2°С.

После эмульгирования в образцах вакцины определяли вязкость при температуре (20±2)°С и стабильность эмульсий при температуре 2-8°С, 18-22°С и 37°С.

Эксперименты показали, что адъювант Montanide ISA-70 позволяет получать стабильные образцы эмульсионной вакцины (№1, №2) с относительно низкой вязкостью.

Образцы эмульсионной инактивированной вакцины №3 и №4 оказались нестабильными, они расслаивались на водную фазу и масляный адъювант. Быстрее всего (7-14 сут) этот процесс происходил при температуре хранения 37°С, а при хранении образцов при температуре 2 - 8°С этот процесс происходит через 1-3 мес.

При изучении безвредности вакцины на белых мышах препарат

вводили животным в объеме 0,5 см3 подкожно, в области спины. В течение 10 сут наблюдения мыши оставались живыми и клинически здоровыми.

При проверке безвредности вакцины на 25-дневных поросятах-сосунах препарат вводили внутримышечно за ухом в объеме 1,5 см3. В течение 10 сут наблюдения поросята оставались живы, угнетения общего состояния и пищевого рефлекса не наблюдали.

Безвредность средней пробы, составленной из двух серий вакцины, проверили на молодняке крупного рогатого скота 8-9-месячного возраста. Препарат вводили животным подкожно в верхнюю треть шеи - 3 см3 (трехкратная доза) - 2 головы, внутримышечно в верхнюю треть шеи - 3 см3 (трехкратная доза) - 2 головы и внутримышечно в подгрудок - 5 см3 (пятикратная доза) - 1 голова.

В течение 10 сут наблюдения отклонений со стороны общего состояния организма всех 5 голов молодняка крупного рогатого скота не наблюдали.

Кроме того, безвредность противопастереллёзной вакцины изучали на двух кобылах (6 и 8 лет), которым ввели по 3 см3 вакцины внутримышечно в области шеи.

При наблюдении за животными в течение 10 сут отклонений со стороны общего состояния не наблюдали. Видимых местных изменений в зоне инъекции препарата не установлено.

Реактогенность опытных образцов вакцины определяли на девяти поросятах 1,5-месячного возраста. Вакцину вводили внутримышечно за ухом двукратно по 0,5 см3 с интервалом между введениями 20 дней. В прививной дозе содержалось 5 млрд. м.к. с равным долевым содержанием всех серогрупп Р.ти^ошёа и одного биотипа Р.Ьаето1у11са. Температурная реакция у животных оставалась в пределах допустимых границ, средняя величина её у животных до вакцинации составила 39,6°С, на второй день после вакцинации -

39,9°С, на второй день после ревакцинации - 40,7°С, на четвертый день после ревакцинации - 39,6°С.

Через 1 месяц после второй вакцинации свиней убили и провели патологоанатомическое вскрытие. В толще мышечного слоя у всех животных нашли слабозаметные соединительнотканные уплотнения (олеогранулемы) не больше размера лесного ореха.

Оценка антигенных и иммуногенных свойств вакцины на лабораторных

животных

Опыты по оценке иммуногенности разработанного препарата проводили на белых мышах и кроликах. Вакцину разводили в плацебо трехкратным шагом до разведения 1:243. Белым мышам препарат вводили подкожно в область спины, а кроликам внутримышечно в область бедра в объеме 0,2 см3 и 0,5см3 соответственно из расчета 10 животных на разведение. Через 21 сут вакцинированных и контрольных (невакцинированных) животных заражали 18-часовыми бульонными культурами соответствующих штаммов пастерелл.

Белых мышей заражали подкожно (P.multocida) и внутрибрюшинно (P.haemolytica) в дозе 2-8 ЛД50 в объеме 0,5 см3, кроликов внутримышечно в дозе 4,8 ЛД50 (серовары А и В) или интраназально (серовар Д) из расчета 10 животных на заражающую дозу.

Количество живых бактерий в заражающих дозах контролировали методом титрования на кровяном агаре. За животными вели наблюдение в течение 10 сут после заражения.

Установлено, что вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней защищает лабораторных животных против контрольного заражения P.multocida серогрупп А, В, Д, и P.haemolytica биотип А.

Результаты изучения антигенной активности противопастереллёзной вакцины показывают, что пятидесятипроцентной зашите белых мышей при заражающей дозе 4 ЛД50 соответствует уровень специфических антител в РИГА, для P.multocida: 2,55 лог2- штамм №1231, 2,43 лог2 - штамм №115, 2,46

лог2 - штамм №656, 2,80 лог2 - штамм №9, и для Р.Ьаето1у11са штамм №169 -2,89 лог2- Фоновый уровень антител составлял 1,5 лог2.

Изучение антигенных и иммуногенных свойств вакцины на естественно восприимчивых животных

Изучение антигенной и иммуногенной активности вакцины на мелком рогатом скоте проводили на 20 головах овец 2,0-2,5-годовалого возраста путём однократной иммунизации с последующим исследованием сывороток крови на наличие специфических антител и контрольным заражением. Овец иммунизировали внутримышечно с внутренней поверхности бедра в объеме 0,5 см3 цельной вакциной и разведениями в плацебо 1:3, 1:9,1:27.

У овец, иммунизированных разведениями вакцины (0 - 1:9), в сыворотках крови установлен высокий уровень специфических антител на пастереллёзные антигены. При исследовании сывороток крови овец, иммунизированных разведением 1:27, получены отрицательные результаты.

Через 21 сутки после вакцинации иммунизированных и контрольных (неиммунизированных) животных заражали суточной бульонной культурой Р.тиИошёа штамм №656 в дозе 100 ЛД50. Овец заражали внутримышечно в область бедра в объёме 1 см3. Наблюдение за животными осуществляли в течение 10 сут после заражения.

Результаты экспериментальных данных по изучению иммуногенности представлены в таблице 3.

Таблица 3

Иммуногенная активность P.multocida штамм №656 в составе противопастереллёзной вакцины на овцах_

Разведение вакцины

Доза вакцины

(см3)

Количество животных в группе

Количество выживших животных после заражения

ИмД50

(см3)

0

0,500

4

4

1:3

0,166

4

1:9

0,055

0,042

1:27

0,018

контроль

4

4

3

4

0

0

4

0

Из данных таблицы видно, что заражающая доза 100 ЛД50 не вызывала гибели животных, иммунизированных цельной вакциной и в разведении 1:3. При этом значение ИмД50 составило 0.042 см3 (8,4х107 м.к.). Одна прививная доза вакцины (0,5 см3) содержит 12 ИмД50 антигена Р.ти^ошёа штамм №656. Контрольные животные пали в течение 24 ч.

Проведенные опыты показали, что вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированная эмульсионная обладает высокой протективной активностью для овец.

Изучение антигенной и иммуногенной активности

противопастереллёзной вакцины проводили на 15 поросятах 2,5 месячного возраста путём однократной иммунизации с последующим исследованием сывороток крови на наличие специфических антител и контрольным заражением. Животных имунизировали внутримышечно, в области шеи цельной вакциной и разведениями в плацебо 1:3; 1:9; 1:27; 1:81; 1:243 в объёме 0,5 см3. Кровь от подопытных поросят отбирали до и через 20 суток после иммунизации. Сыворотки исследовали в ИФА.

У поросят, иммунизированных разведениями вакцины (0 - 1:9), в сыворотках крови выявляли высокий уровень противопастереллёзных антител.

Через 21 сутки иммунизированных и контрольных (неиммунизированных) свиней заражали суточной бульонной культурой Р.тиЬсшёа штамм №656. Животных заражали внутримышечно в область бедра дозой 1000 ЛД50 в объёме 1,0 см3. Наблюдение за животными вели в течение 10 сут после заражения.

Установлено, что ИмД50 для свиней составляет 7,5х106 микробных клеток. Контрольные подсвинки пали от заражающей дозы 1000 ЛД50 в течение 24-36 ч. Экспериментальные данные свидетельствуют, что вакцина обладает высокой протективной активностью для свиней - доза 0,5 см3 цельной вакцины содержит 66,6 ИмД50 данного антигена пастерелл.

Для определения продолжительности иммунитета использовали 15 поросят 25 суточного возраста, которых однократно иммунизировали цельной вакциной в объёме 0,5 см3 (одна прививная доза), затем каждые два месяца у животных исследовали сыворотку крови в ИФА для определения уровня противопастереллёзных антител и проводили контрольное заражение штаммом № 656 возбудителя пастереллёза внутримышечно в области бедра в дозе 1000 ЛД50, используя каждый раз 3 опытных и одно контрольное животное.

При исследовании в ИФА сывороток крови свиней, взятых в разные сроки после иммунизации, было установлено, что после достижения максимального уровня титр противопастереллёзных антител в течение 10 мес почти не изменялся.

Заражение вакцинированных животных через 2, 4 и 6 мес после иммунизации показало их устойчивость. Свиньи оставались клинически здоровыми в течение всего срока наблюдения (10 сут.), а контрольные заболели и пали от пастереллёза на 2-3 сут.

В связи с невозможностью проведения контрольного заражения свиней Р.тикошба штамм № 656 через 8 и 10 мес. после иммунизации нами были проведены только серологические исследования. Титр противопастереллёзных антител у привитых животных в эти сроки оставался на высоком уровне.

Эксперименты по изучению иммуногенных свойств вакцины на крупном рогатом скоте проводили на 3 телятах 3-месячного возраста, которых иммунизировали внутримышечно в верхнюю треть шеи, однократно в объёме 0,5 см3 вакцины. Через 21 сутки трех вакцинированных и одного контрольного (неиммунизированного) теленка заразили суточной бульонной культурой Р.тикошёа штамм № 656 в дозе 1000 мышиных ЛД50 в объеме 0,5 см3. Способ заражения - внутримышечно в бедренную группу мышц.

Иммунизированные телята оставались клинически здоровыми в течение 15 сут после заражения вирулентным штаммом. Контрольное животное пало через трое сут после инъекции культуры пастерелл.

Таким образом, проведенные исследования показали, что противопастереллезная вакцина обладает выраженными протективными свойствами.

Результаты серологических исследований свидетельствуют, что у привитых животных индуцируется полноценной иммунный ответ.

Изготовление экспериментальных серий вакцины

При изготовлении экспериментальных серий противопастереллёзной вакцины культивирование пастерелл осуществляли на аппаратах марки АК-210, затем биомассу инактивировали аминоэтилэтиленимином в концентрации 1% по АДВ и проводили центрифугирование. Осадок ресуспендировали в забуференном физрастворе до необходимой концентрации и использовали для изготовления эмульсии. Эмульгирование проводили на коллоидной мельнице в соотношении антиген-адъювант 30:70. Всего нами было изготовлено две экспериментальные серии инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза рогатого скота, лошадей и свиней, каждая по 10 тыс. доз.

Анализ результатов исследований по изучению антигенных свойств вакцины и по определению ИмД50, проведенных на лабораторных и естественно восприимчивых животных, а также по определению напряженности и продолжительности поствакцинального иммунитета у животных к пастереллёзу показывает, что оптимальная иммунизирующая доза антигена составляет 12 ИмД50.

Исходя из этого, расчитали оптимальное количество антигенов всех сероваров P.multocida и P.haemolytica в составе вакцины.

Таким образом установлено, что общее содержание антигенов в 1 см3 вакцины составляет 10x109 м.к. В прививном объёме для молодняка равном 0,5 см3 должно содержаться соответственно 5x109 м.к.

Контроль качества вакцины

Контроль качества двух экспериментальных серий

противопастереллёзной вакцины осуществляли по ряду физических и иммунобиологических свойств препарата.

Контроль стерильности вакцины осуществляли по ГОСТу 28085 - 90. В посевах препарата на питательные среды рост бактериальной и грибковой микрофлоры отсутствовал.

Стабильность разработанного и изготовленного препарата определяли центрифугированием при 3000 об/мин в течение 30 мин. По окончании центрифугирования испытуемые образцы вакцины не расслаивались. Вязкость препарата определяли согласно методике, изложенной в разделе 2.2.6. Вязкость образцов вакцины находилась в диапазоне 68,5 мм /сек.

Безвредность противопастереллёзной вакцины оценивали на 10 белых мышах массой 16-18 г. Препарат вводили животным подкожно в область спины в объёме 0,5 см3. Наблюдение за животным вели в течение 10 сут. При исследовании образцов двух экспериментальных серий вакцины все животные, взятые в опыт, оставались клинически здоровыми в течение всего срока наблюдения.

Иммуногенную активность противопастереллёзной вакцины оценивали на белых мышах, используя качественную пробу. С этой целью препарат вводили внутримышечно с внутренней поверхности бедра 50 животным массой 20-22 г, в объёме 0,2 см3. Через 21 сут после иммунизации мышей заражали (по 10 вакцинированных и 10 контрольных) на каждый серовар пастерелл. Заражение осуществляли подкожно, используя минимальную летальную дозу соответствующего штамма пастерелл в объёме 0,5 см3. Результаты оценивали, учитывая количество защищенных и павших мышей. Обе испытуемые серии вакцины были иммуногенны, так как каждая из них предохраняла от гибели 8 из 10 вакцинированных животных по каждому серовару пастерелл в течение 10 сут после гибели 50% контрольных животных.

Определение активности антигенов P.multocida и lMiaemolytica в сое шве вакцины в процессе её хранении Основное требование, предъявляемое к инактивированным эмульсионным вакцинам, - это сохранность физических и иммунобиологических свойств препарата в процессе хранения.

Опыты по изучению иммуногенности проводили на белых мышах массой 20-22 г, которых вакцинировали подкожно цельным препаратом и разведениями вакцины в «плацебо» с шагом 3 в объеме 0,2 см3. Через 21 сутки опытных и контрольных животных заражали минимальной летальной дозой пастерелл соответсвующего штамма. Результаты испытаний представлены в таблице 4.

Таблица 4

Иммуногенная активность противопастереллёзной вакцины _на белых мышах через 6 и 12 месяцев хранения (п=3)

№

Антигены

Имд50 (м.к.) при сроках храпения накипим (мес)_

0 6 12

1 Р.тиИюшдя №1231 (А) 9,4x1с6 9,6х106 1,02х107

2 P.multocida №115 (А) 1,48x1с7 1,12х107 1,18х107

3 P.multocida №656 (В) 1,48х107 1,22х107 1,12х107

4 P.multocida №9 (Д) 1,64х107 9,4х106 8,6х106

5 P.haemolytica № 169 (А) 1,18х107 1,92х107 1,26х107

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о статистически достоверном сохранении иммуногенной активности вакцины на протяжении 12 мес хранения при температуре 2-8 С, что послужило основанием для установления срока годности вакцины — 12 мес.

Изучение эффективности применения противонастереллезной вакцины в

условиях хозяйств Производственные испытания вакцины были проведены на поголовье крупного рогатого скoтa и свиней в хозяйствах Ивановской, Нижегородской и Ульяновской обласкай РФ. Вакцину применяли согласно "Временному

наставлению по применению вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной".

Всего экспериментальной вакциной было привито - 120 голов свиней и -1551 голова крупного рогатого скота.

Привитые животные оставались клинически здоровыми, поствакцинальных осложнений не наблюдалось. Через 4-5 мес после иммунизации выборочно у 10 животных из каждого из двух хозяйств были взяты пробы сыворотки крови для исследования в ИФА (Р.тиксклба) и в РНГА (Р.Ьаето1у11са). Результаты исследовании показали, что у всех привитых животных в крови присутствуют специфические противопастереллёзные антитела. Среди привитых животных случаев заболевания пастереллёзом не наблюдалось.

Таким образом, разработанная вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированная эмульсионная прошла апробацию и нолевых условиях на крупном рогатом скоте и свиньях и может быть рекомендована для широких производственных испытаний в ветеринарной практике.

ВЫВОДЫ

1. Разработана инактивированная эмульсионная вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней на основе штаммов Р.тикоаба и Р.Ьаето1у11са при оптимальном соотношении антигенов Р.тикоаба различных серотипов и Р.Ьаето1у11са как 4 к 1.

2. Установлено, что аминоэтилэтиленимин в концентрации не ниже 0,25% полностью инактивирует Р.тикоаба и Р.Ьаето1у11са и обеспечивает получение безвредных препаратов против пастереллёза, обладающих исходной иммуногенностью.

3. Показано, что изготовленные образцы противопастереллезной вакцины в процессе хранения при температуре 2-8°С сохраняют исходную иммуногенную активность, стерильность и безвредность.

4. Установлено, что при изготовлении эмульсионной вакцины против пастереллеза лучшие результаты получены при смешивании 30% антигена и 70% адъюванта Montanide ISA-70. При этом образуется стойкая эмульсия «вола-масло» с кинематической вязкостью 68,5 мм2/сек при температуре 20°С.

5. Экспериментально показано, что иммунизирующая доза (ИмД50) инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза (P.multocida, серогруппа В) составляет для овец 0,042 см3, а для свиней 0,0075 см3.

6. Установлена возможность использования взрослых белых мышей для оценки иммуногенной активности противопастереллезной инактивированной вакцины и определена на рогатом скоте прямая зависимость между дозами антигена в вакцине, уровнем специфических антител в сыворотке крови и защитным эффектом вакцины при прямом заражении животных.

7. Показано, что в прививной дозе инактивированной эмульсионной вакцины, обеспечивающей 99%-ную защиту животных от прямого заражения пастереллезом, должно содержаться не менее 20 мышиных ИмД50.

8. При проверке антигенных свойств инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза на крупном рогатом скоте и свиньях установлено, что на 20 день после вакцинации титры специфических антител были в пределах 1:16 в РИГА для КРС, а для свиней от 1:800 до 1:6400 в ИФА.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются следующие методические рекомендации, которые составлены в результате экспериментальных исследований, одобрены ученым советом и утверждены директором 30 сентября 2004 года:

1. "Методические рекомендации по глубинному культивированию бактерий Pasteurella haemolytica"

2. "Методические рекомендации по инактивации бактерий Pasteurella haemolytica аминоэтилэтиленимином ".

Список научных работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Баян Д., Русалеев B.C. Разработка инактивированной эмульсионной вакцины против геморрагической септицемии и легочного пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер.междунар.науч. конф.молодых ученых. — Владимир, 2004. — С. 17-21.

2. Баян Д., Потехин Л.В., Шадрова Ы.Б., Ручнова О.И. Количественная оценка иммуногенной и антигенной активности инактивированной эмульсионной вакцины против геморрагической септицемии и легочного пастереллеза крупного и мелкого рогатого скота // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер.междунар.науч. конф.молодых ученых. - Владимир, 2004. - С.21 -23.

3. Баян Д. Требования к штаммам Pastenrella multocida, используемым для изготовления инактивированных вакцин // Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных: Матер.междунар.науч. конф.молодых ученых. - Владимир, 2004. - С.43-45.

4. Баян Д., Русалеев B.C., Прунтова О.В., Гневашев В.М. Инактивация Pastenrella haemolytica димером этиленимина и формалином // Болезни диких животных: Тр. Междунар.науч.-практич.конф. - Покров, 2004. - С. 172-174.

Отпечатено на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны

здоровья животных» Тираж 90 экз, февраль 2005 г.

\ V = I / 2 2 MAP 2005

181?

Актуальность темы. Пастереллёзы — различные по локализации и характеру течения инфекционные болезни сельскохозяйственных, домашних и диких животных, вызываемые бактериями рода Pasteurella (7).

Ведущее этиологическое значение в инфекционной патологии животных принадлежит двум видам: Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica (Mannheimia haemolytica) (29, 46, 59, 65, 125, 155).

P.multocida является возбудителем геморрагической септицемии животных, а также легочных пастереллёзов, осложняющих респираторные инфекции вирусной и микоплазменной этиологии (120, 163).

P.haemolytica вызывает у крупного рогатого скота и овец всех возрастов ♦ пневмонии, а также септицемию новорожденных ягнят.

Эти два вида пастерелл могут выделяться у коров и свиноматок при абортах, у овец и коров - при артритах, у телят и ягнят - при артритах и других локальных патологических процессах (83, 187).

Одним из основных звеньев в системе мер борьбы с пастереллёзами является иммунопрофилактика.

В настоящее время ветеринария располагает значительным арсеналом вакцинных препаратов, различающихся по составу, технологии производства, способу применения и эффективности (13, 20, 31, 38, 42, 51, 116, 147).

Большинство противопастереллёзных вакцин выпускается в виде инактивированных формалином, сорбированных или эмульсионных препаратов.

Эмульсионные вакцины, используемые в животноводстве, превосходят по иммуногенности сорбированные, однако высокая вязкость и реактогеппость таких препаратов являются основной причиной, препятствующей их широкому применению на практике (3, 24, 32, 35, 71, 90, 94).

Исходя из вышеизложенного, достаточно актуален вопрос разработки новой инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней, лишенной вышеуказанных недостатков.

Цель и задачи исследований. Основная цель данной работы состояла в разработке эффективной и удобной в применении вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- изучить биологические свойства штаммов Pasteurella multocida и Pasteurella haemolytica;

- приготовить образцы антигенов пастерелл, инактивированных аминоэтилэтиленимином;

- изготовить экспериментальные образцы вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней; количественно охарактеризовать на лабораторных животных зависимость между дозой антигена в составе вакцины и защитой от летальной дозы возбудителя; определить оптимальную иммунизирующую дозу, напряженность и продолжительность иммунитета после применения вакцины на крупном рогатом скоте и овцах. V

Научная новизна работы. В результате проведённых исследований:

- установлена высокая антигенная и иммуногенная активность антигенов P.multocida и P.haemolytica, инактивированных аминоэтилэтелепимпном, и составе вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней; на лабораторных животных количественно охарактеризована зависимость между дозами антигенов в составе вакцины, титрами антител и защитным эффектом препарата;

- установлена оптимальная концентрация антигенов P.mullocula п IMiacmolytica в прививной дозе вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- обоснована целесообразность использования белых мышей в качестве модели для оценки иммуногенности вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней; разработаны методы контроля и применения вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке нормативно-технической документации на получение и применение «Вакцины против пастереллёза рогатого" скота, лошадей и свиней инактивированной эмульсионной» (Утверждена Департаментом ветеринарии Минсельхоза России 7 апреля 2004 г.).

Разработаны, одобрены ученым советом и утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ 30 сентября.2004 г. "Методические рекомендации но глубинному культивированию бактерий Pasteurella haemolytica" и «Методические рекомендации по инактивации бактерий Pasteurella haemolytica ампноэтилэтиленимином».

Основные положения, выносимые на защиту:

- инактивированная эмульсионная вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- оптимальная иммунизирующая доза антигена в вакцине против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- результаты изучения физических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней;

- результаты изучения иммунобиологических свойств вакцины против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней.

Апробация работы. Основные материалы исследований по диссертационной работе доложены и обсуждены на:

- Международной научной конференции молодых ученых "Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных",

Владимир, 24-26 марта 2004 г. »

- Международной научно-практической конференции «Болезни диких животных», Покров, 28-30 сентября 2004 г.

Публикации. По материалом диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 113 страницах машинописного текста и включает следующие разделы: введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение результатов исследований, выводы, практические предложения и приложения. Список использованной литературы включает 190 источников, в том числе 106 работ зарубежных исследователей. Работа иллюстрирована 1 рисунком и 19 таблицами. В приложении представлены копии документов, подтверждающих результаты отдельных этапов работы, их научную новизну и практическую значимость.

5. ВЫВОДЫ

1. ' Разработана инактивированная эмульсионная вакцина против пастереллёза рогатого скота, лошадей и свиней на основе штаммов P.multocida и P.haemolytica при оптимальном соотношении антигенов P.multocida различных серотипов и P.haemolytica как 4 к 1.

2. Установлено, что аминоэтилэтиленимин в концентрации не ниже 0,25% полностью инактивирует P.multocida и P.haemolytica и обеспечивает получение безвредных препаратов против пастереллеза, обладающих исходной и м му н огенностью.

3. Показано, что изготовленные образцы противопастереллезпой вакцины "в процессе хранения при температуре 2-8°С сохраняют исходную иммуногенную активность, стерильность и безвредность.

4. Установлено, что при изготовлении эмульсионной вакцины против пастереллеза лучшие результаты получены при смешивании 30% антигена и 70% адъюванта Montanide ISA-70. При этом образуется стойкая эмульсия «вода-масло» с кинематической вязкостью 68,5 мм2/сек при температуре 20°С.

5. Экспериментально показано, что иммунизирующая доза (ИмЛзи) пнактнвированной эмульсионной вакцины против пастереллеза (P.multocida, 3 серогруппа В) составляет для овец 0,042 см , а для свиней 0,0075 см .

6. * Установлена возможность использования взрослых белых мышей для оценки иммуногенной активности противопастереллезпой инактивированной вакцины и определена на рогатом скоте прямая зависимость между дозами антигена в вакцине, уровнем специфических антител в сыворотке крови и защитным эффектом вакцины при прямом заражении животных.

7. Показано, что в прививной дозе инактивированной эмульсионной вакцины, обеспечивающей 99%-ную защиту животных от прямого заражения пастереллезом должно содержаться не менее 20 мышиных ИмД^о.

8. При проверке антигенных свойств инактивированной эмульсионной вакцины против пастереллеза на крупном рогатом скоте и свиньях установлено, что на 20 день после вакцинации титры специфических антител определялись в пределах 1:16 в РИГА для КРС и от 1:800 до 1:6400 в ИФА для свиней.

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются следующие методические рекомендации, которые получены в результате экспериментальных исследований, одобрены ученым советом и утверждены директором 30 сентября 2004 года:

1. "Методические рекомендации по глубинному культивированию бактерий Pasteurella haemolytica"

2. "Методические рекомендации по инактивации бактерий Pasteurella haemolytica аминоэтилэтиленимином