Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Разработка и совершенствование средств, методов диагностики и системы мероприятий по борьбе с инфекционным эпидидимитом баранов и бруцеллезом животных

российская академия сельскохозяйственных наук

ВСЕРОССИИСКИП НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЙ ВЕТЕРИНАРИИ имени Я. Р. КОВАЛЕНКО

На правах рукописи

Р О М А X О В Вадим Александрович

РАЗРАБОТКА И СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ СРЕДСТВ,

МЕТОДОВ ДИАГНОСТИКИ И СИСТЕМЫ МЕРОПРИЯТИЙ ПО БОРЬБЕ С ИНФЕКЦИОННЫМ ЭПИДИДИМИТОМ БАРАНОВ И БРУЦЕЛЛЕЗОМ ЖИВОТНЫХ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

Диссертация

на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук в форме научного доклада

Москва — 1992

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательской институте экспериментальной ветеринарии имени Я.Р.Коваленко, во Всероссийском государственном научно-исследовательском институте контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных.препаратов, в хозяйствах Липецкой, Белгородской, Рязанской, Воронежской, Тверской, Архангельской областей России, Казахстане, Кыргызстане, Таджикистане, Узбекистане, Грузии, Латвии.

Научный консультант - доктор. ветеринарных наук, профессор

А.Н.Касьянов.

Официальные оппоненты:

1. Доктор ветеринарных наук, профессор Ведершков В.А.

2. Доктор ветеринарных надо, профессор Артемов Б.Т.

3. Доктор биологических наук, профессор Драновская Е.А.

I

Ведущая организация: Всероссийский научнонасслздовательсяпЕ

институт бруцеллеза и туберкулеза зшвотных.

Защита состоится " Э1992 г. в

часов на заседании специализированного Совета Д 020.28.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук при Всероссийском научно-исследовательском институте экспериментальной ветеринарии имени ЯЛ'.Коваленко по адресу: 109472 г.Москва, Куэьшшш, ВИЭВ.

С дисс^ртецией в форме научного доклада и опубликованными рабогаш ткно озн^гомиться в библиотеке ШЭЗ.

Диссертация в форме научного доклада разослана 9сД? " .£/¿/77^5/7^2. 1992, г;

Ученый секретарь специализированного Совета кандидат ветеринарных наук

Ф.Г.Терешков

..... • -i

' ■ г

I. ОЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

В настоящей диссертационной работе, представленной в форме научного доклада, обобщены результаты 20-летних исследовании по созданию новых и совершенствованию существующих средств и методов диагностики, специфической профилактики, научно обосноплн • ной системы мер борьбы с инфекционным эпидидимитом баранов и бруцеллезом животных, выполненных в соответствии с Государствен-ныш и Межведомственными программами 0.51.425 (I97I-I975 гг.),

0.51.09 и О.сх.61 (1976-1980 гг.), 0.51.09 и 0.сх.97 (I98I-1985 гг.), 0.51.09 и О.сх.61 (1966-1990 гг.), Д10 ГКНТ СССР

№ 189, ГНГП "Высокоэффективные процессы производства продовольствия" (I99I-I992 гг.), Международный проект (I99I-I992 гг.) и 1Ш1 "Фундаментальных и прикладных исследований (I99I-I992 гг.).

I.I. Актуальность проблемы. С учетом измеюния форм ведения сельского хозяйства повышается значение рекомендаций, направленных на профилактику и. ликвидацию таких опасных инфекционных болезней как инфекционный эпидидимит баранов (ИЭ),' вызываемый возбудителем Bruaella dYi« , и бруцеллез животных, вызываемый бруцеллами видов abortus, nelitsnaio и aula . В связи с этим разработка новых и усовершенствование существуодих средств я методов диагностики и специфической профилактики ИЭ баранов и бруцеллеза животных остается актуальной задачей ветеринарной пауки.

В решение этих вопросов крупный вклад внесли такие известие ученые нашей страны как С.Н.Вышелесский, П.З.Здродовский, (.К.Бсковец, П. А. Верши лова, Е.С.Орлов, П.С.Уласевич, Ы. М.Иванов,

1.И.Притулин, К.П.Студенцов, П.А.Триленко, А.В.Селиванов, П.Н. £ованик, Б.Т.Артемов, В.А.Забродин, Н.П.Иванов, И.А.Косилов, С.В.Щумилов, А.Н.Касьянов, К.И.Салиаков, О.Ю.Юсупов', Р.Б.Вашке-' яч, А.А.Новицкий,У.Э.Ниязов и др.,изучавшие эпизоотологию и па-огенез болезни, разработавшие и успешно решившие ряд проблем иашостики и специфической профилактики бруцеллеза. ИЭ баранов -

нашей стране впервые установлен профессором Триленко П.А. 1967).

По данным Международного Эпизоотического Бяро (МЭБ) ИЭ ба-анов и бруцеллез регистрируют более чем в 100 странах мира. 0с-овными методами диагностики ИЭ баранов до последнего времени зтавались клинический и серологический (РСК ига РДСЮ.

В комплексе мер борьбы с бруцеллезом крупного рогатого скота в большинстве стран применяют вакцину из штамма В.аЪоПдю 19 (за исключением Саудовской Аравии, где крупный рогатый скот иммунизируют вакциной из штамма в.лЬох*ив 45/20). Во Франщи, Австралии и Эфиопии вакцицу из шт.45/20 используют наряду с вакциной из шт.19.

Для устранения длительной циркуляции антител в крови поело иммушзацйи животных в ряде стран (США, Канада, Новая Зеландия) вакцину из шт.19 используют в пониженных дозах - 3 х 10 -3 х 10® живых бруцелл. В последнее время перспективным является коньшктивалышй метод иммунизации, при котором.синтез гуморальных антител сводится до минимума. В докладе экспертов ЙАО/ВОЗ по бруцеллезу (19Я6 г.) поставлена задача создания экологически безопасных химических или синтетических противобруцеллезных вакцин.

Во всех странах пира, где регистрируется бруцеллез мелкого рогатого скота (за исключением Кипра), для профилактической иммунизации применяют живую вакцину из шташа В.»о11Лбяа1в Рев-1, создащую высокий иммунитет при бруцеллезе и ИЭ баранов.

В неблагополучных хозяйствах Российской Федерации в комплексе мер борьбы с бруцеллезом крупного рогатого скота, в зави-С1П.ЮСГИ от сиепеш! поралешости стад,, широко используют две вакцины: из шт.82 в.сЪоПлиа >г пр;г сложной эпизоотической ситуации - вакцину из шт.19 в сочетании с вакциной из шт.82 или юлько в&кцину из т. 19. •

Однако, как показали дальнейшие исследования, многократная иШушзациЯ животных зшвыш! вакцинами создает новую проблему -дифференциацию поствакцинальных реакций от реакций у больного бруцеллезом скота.

Важной проблемой остается диагностика бруцеллеза и особенно ИЭ баранов, в связи о тем, что единственным серологическим методом является РДСК.

Это обстоятельство обусловило необходимость проведения исследований, направленных на разработку новых и совершенствование существущих средств и методов диагностики и специфической профилактики ИЭ баранов и бруцеллеза ашхтшх, оптимизацию использования отих методов и средств в системе борьбы с указанными болезням!;, создание препаратов на основе современной биотехнологии.

1.2. Цель работы. Отработать оптимальные методы создания >вых средств диагностики ИЭ баранов, отработать технологию про->водства инактивированной вакцины для профилактики этой болез-

I овец, усовершенствовать и научно обосновать систему меропри-гий по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных.

1.3. Основные задачи исследований:

- отработать технологию изготовления стойкого эритрофтар->го диагностикума из обладающего выраженными антигенными свой-;вами штамма В.oviaj

- отработать в экспериментальных и производственных усло-1ях методы постановки и критерии учета реакции непрямой гемаг-иотинации (РИГА) для выявления спещфических антител в сыворот-I крови баранов, инфицированных в.ovia , и реакции неПтрализа-1И антител (РНАт) - для выявления антигена в.ovia в экстрак-

IX из биологического материала от подозреваемых в заражении |вЦ»

- изготовить и испытать опытно-промытленныь серии набора юпаратов для РИГА и РНАт в производственных условиях;

- провести широкое производственное испытание опытной пари "Набора препаратов для диагностики ИЭ баранов в РИГА и РНАт", .зработать НГД на промышленное производство набора;

- разработать методику изготовления антигена из в.ovia и основать возможность применения пластинчатой реакции агглютн-ции (пл.РА) для диагностики ИЭ, оптимизировать условия поставки и учета результатов реакции;

- изготовить набор компонентов для диагностики ИЭ баранов тором иммуноферментного анализа (ИФА), испытать специфичность чувствительность реакции;

- изучить проявление реакции гиперчувстпитольности замод-нного типа (ГЗТ) у экспериментально зараженных культурой в.

La яивотных и естественно больных ИЭ баранов, провести срашщ-льную оценку эффективности аллергенов, изготовленных из разных налов бруцеял по различным методикам;

- теоретически обосновать возможность конструирования икак-вированной адыовант-вакцлкы из шт. в.ovia , изготовить нес-иько опытных серий вакцины и испытать ее иммунологическую ^тивнооть на морских свинках и баранах в лаМар*тор1нк условтт;';

- определить оптимальный режим инахтивирования сыворотки крови крупного рогатого скота при исследовании на бруцеллез и разработать методики постановки РА, РСК (РДСК) в микрообъемах;

- дать научное обоснование и разработать методику дифференциации неспецифических серологических реакций (РА) при исследовании сывороток крови животных из благополучных по бруцеллезу хозяйств;

- теоретически и практически обосновать перспективность изготовления диагностических и вакцинных препаратов на основе достижений современной биотехнологии;

- разработать систему профилактических и оздоровительных мероприятий при бруцеллезе мелкого рогатого скота и ИЭ баранов с применением вакцины из штамма Рев-I (в т.ч. в уменьшенных дозах) для стран СНГ': Таджикистана, Казахстана и Туркменистана.

1.4. Научная новизна. На основе анализа статистических данных и результатов собственных исследований доказано широкое распространение ИЭ баранов во многих овцеводческих (в т.ч. и племенных) хозяйствах, станциях и пунктах искусственного осеменения животных: Воронежская, Рязанская, Тамбовская, Тверская и многие другие области(Россия), ОПХ "Будагово" (Белоруссия) и ряд других стран СНГ, Латгальская опытная станция животноводства и овцеферма совхоза "Дрицени" (Латвия)»

Впервые разработана технология промышленного, изготовления зритроцитарного диагностикума для РИГА и РНАт при И& баранов, обладамцего высокой чувствительностью и специфичностью.

Впервые показана возможность создания цветного антигена, для пластинчатой РА и использования его для выявления антител 2gU класса к B.ovie в сыворотках крови овец на ранней стадии развития инфекционного процесса.

Экспериментально доказана специфичность и высокая диагностическая чувствительность метода ИЗБА при ИЭ баранов. Подобрана и оттитрована оптимальная доза компонентов реакции.

Установлена высокая чувствительность аллергического метода •^следования при диагностике ИЭ. Установлено, что наиболее активны аллергены, приготовленные из культур бруцелл видоспецифичес-ких шаымов ( B.ovie ).

Принята в практику вакцина из высокоиммуногенного штамма Ji.aeliteMio Реп-I для иммунизации баранчиков против ИЭ. Получе-

ш обнадеживающие результаты по созданию инактивированной адыо-вант-вшсцины из B.ovie для использования ее в зонах, свободных от бруцеллеза овец.

Доказана необходимость при постановке РСК инактивирования сывороток крови крупного рогатого скота при более высокой температуре (64°С), чем это было принято ранее (58-59°С).

Разработана и принята в практику оригинальная методика, позволяющая дифференцировать неспецифическив результаты РА при исследовании сывороток крови на бруцеллез и сохранять значительное количество животных.

Предложены оптимальные схемы иммунизации крупного рогатого и мелкого рогатого скота вакцинами из штаммов в.abortus 19 и B.nolit&nsio Рев-I, использование пониженных доз этих вакцин для реиммунизации, а в некоторых случаях - и для первичной иммунизации животных.

Использование полученных моноклональных антител к поли-Б антигену бруцедл подтвердило перспективность создания экологически безопасных высокоспецифических диагностических и вакцинных препаратов нового поколения.

С учетом накопленного многолетнего опыта разработана научно обоснованная система мероприятий по оздоровлению поголовья животных от бруцеллеза и ИЭ баранов, основные положения которой использованы при составлении новых инструкций по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных и инфекционного эпидидимита.

1.5. Практическая значимость. Разработан, освоен (по разработанной нами НГД) биологической промышленностью л внедрен в ветеринарную практику новый диагноотикум на основе эритроцитов барана, сенсибилизированных антигеном из в.oris.

Разработаны и приняты в практику для стран СНГ: "Наставление по диагностике бруцеллеза животных", "Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза животных", "Наставление по диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой в.ovia (ИЭ баранов)",. "Инструкция о мероприятиях, по профилактике и ликвидации инфекционной-болезни овец,-, вшиваемой Bruoella orlo ¡ИЭ баранов)">. . .. v.,^ ': .v.- ;

Пре,а)1рлсвйа-н'принята" в; праоти'иу'-модифицированная методика тйстанрякй;РА для' Д11<Йеревд1ацш!'-неспе1щфическиХ' показаний При [^следовании животных • в благополучных ■хозяйствах.' Экономический -

б

эффект от внедрения этой разработки на I голову крупного рогато го скота составляет 6-8 тыс.руб. в ценах 1992 г.

Внедрены в практику новые методы диагностики ИЭ баранов (РИГА, РНАт, ИЗА) и бруцеллеза животных (РСК 64°С, микрометод постановки РА, РСК, РДСК). Вакцина иэ шт.19 и вакцина из шт^. Рев-I (в т.ч. в пониженных дозах).

Одобрены, утверждены соответствугацими директивными органа, ми и успешно внедряются в практику разработанные совместно с Та, жикским НИШ, Казахским НИШ и Туркменским ШИКиВ Системы мероприятий по оздоровлению хозяйств указанных стран СНГ от бруцеллеза мелкого рогатого екота и инфекционного эпидидимита баранов с использованием в комплексе мер вакцины- из шт.Рев-I, в том числе и в пониженных дозах.

На основе результатов исследований, проведенных в комплексе с сотрудниками других ШУ России и стран СНГ', ГУВ МСХ СССР, ГУВ Г АПК СССР, ГУВ ГКПЗ СМ СССР, ГУВ МСХ и продовольствия СССР, ГУВ МСХ России и других стран СНГ, приняты в ветеринарную практику 30 новых или переработанных существующих нормативно-технических документов по вопросам диагностики, профилактики и мер борьбы с бруцеллезом животных и ИЭ баранов.

Нами, под методическим руководством профессора Уласевича П.С., разработаны, утверждены соответствующими директивными органам;! и внедрены в практику "Правила по охране работников мясной промышленности от заражения бруцеллезом", .

Селекционированные штаммы гибридом Пив eusoulus L. , проду цирущие моноклональные антитела (МКА) к бактериям рода Вгво«11а (авторские названия "БИМА" - бруцелла-иерсиния МКА и "БАМА" -бруцелла «bortus МКА). зарегистрированы в Госреестре изобретений СССР 00.07.90 г. с приоритетом от 30.12.88 г. Получены автор ские свидетельства № JP -46OiM

1.6. Апробация. Основные материалы диссертации доложены и одобрены на Конференции молодых ученых ШЭВ (Москва, 1975), Научно-производственной конференции по улучшению борьбы с бруцеллезом и туберкулезом с.-х. животных в>Казахстане .(Кустанай, 1977), на Межведомственной научно-методической комиссии по борьбе с бруцеллезом при Минздраве СССР и Минсельхозе СССР.(Москва, 1977), Всесокэной конференции "Состояние и перспективы научных

следований по диагностике и профилактика туберкулеза и бруцел-за и мерам борьбы.с этими болезнями с.-х. животных" (Омск, 80), на Ш-ей Республиканской научно-практической конференции овременные проблемы профилактики зоонозных болезней и пути их нения" (Гродно, 1987), ХП-ой Всесоюзной конференции по природ-й очаговости болезней (Новосибирск, 1989), Всесоюзной мезкве-мственной.конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцел-за и организации медицинской помощи больным" (Новосибирск, 89), Ш-ей Всесоюзной конференции по эпизоотологии (Новосибирск, 91), на Всесоюзной научной конференции по с.-х. биотехнологии елиноград, 1991), Всесоюзной научной конференции "Совершенст-вание методов государственного контроля ветеринарных препара-в (Москва, 1991), на Координащокных совещаниях по итогам на-ных исследований НИУ, занимающихся проблемой бруцеллеза (Моск, 1971-1986; Омск, 1987; Кустанай, 1988; Новочеркасск, 1989; хачкала, 1990; Новосибирск, 1991, 1992), на заседании секции рофилактика туберкулеза и бруцеллеза животных" Отделения вето-парной медицины ВАСХНИЛ (Москва, 1991), заседаниях научно-проб-мной методической комиссии и Координационного совета ВГШИ осква, 1984, 1986, 1990), на заседаниях Ученого ..Совета ВИЭВ осква, 1972-1991), заседаниях методической комиссии ВИЭВ (Моск, 1976-1992).

Основные положения диссертации доложены и одобрены на мек-бораторно'м совещании сотрудников ВИЭВ (Москва, 1992). ,

1.7. Публикации результатов исследований. По теме диссерта-и опубликованы 43 научные работы в сборниках научных трудов ЭВ, ВГННИ, журналах "Ветеринария',' "Сельское хозяйство за рубе-

"Вестник-сельскохозяйственной науки Казахстана", изданиях ЯХ, материалах всесоюзных и республиканских научных и научно-эиэводственних конференций и других научно-произподственных из-даях.

На защиту выносятся:

- результаты изучения и практического реаения проблемы се-иогической, бактериологической, аллергической диагностики и спе-(ической профилактики ИЭ баранов;

- результаты совершенствования средств.и методов диагностн-и специфической профилактики бруцеллеза животных;

- о сношала полокения научно обоснованной системы про лак-

тики и ликвидации ИЭ баранов и бруцеллеза животных с учетом региональных особенностей эпизоотической обстановки и новых форм ведения животноводства;

- теоретическое и экспериментальное обоснование перспективности разработки диагностических средств и вакцинных препаратов нового поколения.

1.8. Объем и структура научного доклада. Материалы диссертации изложены на 50 страницах машинописи и включают следующие , разделы: общая характеристика работы, материалы и методы исследований, II разделов результатов проведенных исследований, выводы, практические предложения (перечень нормативно-технических документов, разработанных на основании проведенных исследований) и перечень научных ¿абот, опубликованных по тема диссертации.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнялась в 1971-1992 гг. в лаборатории эпизоотологии, диагностики и профилактики бруцеллеза ВИЭВ, в Вышневолоцком отделе ВИЭВ (с опытной базой), лаборатории контроля и стандартизации препаратов против бруцеллеза, кампилобактсриоза и иер-сшшозов ВГННИ, Таджикском ШВИ, Казахском НИВИ, Латвийском ШИЖиВ, Узбекском НИШ, Грузинском ЗВУИИ, ИЭЗСиДВ, Биотехнологическом центре Целиноградского 0(И, Институте биоорганической химии А Н РФ, Алма-Атинском биокомбинате, Всероссийском биологическом центре "Биоиндустрия" (г.Омск), республиканских и .областных ветеринарных лабораториях, овцеводческих хозяйствах и станциях по искусственному осеменению с.-х. животных различных областей СНГ и Республики Латвия.

Соисполнителями некоторых разделов работы являлись сотрудники указанных выше ШУ и хозяйств.

Апробацию новых средств и методов диагностики ИЭ баранов и бруцеллеза животных, производственные испытания предложенных схем иммунизации животных проводили комиссионно в установленном порядке при участии сотрудников БГНКИ, ЦВЛ, а также ветеринарных специалистов научных и практических учреждений по программам, с разрешения ГУВ МСХ СССР или ГУВ (УВ) республик под методическим руководством и при непосредственном участии автора. Основная часть работы, связанная с разработкой, испытанием средств диагностики и профилактики ИЭ баранов и бруцеллеза животных, обобщение и ана-

лиз полученных результатов исследований проведены автором самостоятельно.

В разработке директивных документов принимали участие сотрудники БИЭВ, ВГНКИ, ВНИИЕШ и специалисты Главного управления ветеринарии МСХ СССР, Госагропрома СОСР, Госкомиссии Oí СССР, Главного управления ветеринарии Российской Федерации.

Изучение биологических свойств штаммов бруцелл, использованных для изготовления диагностикумов и вакцинных препаратов, проводили по методикам, рекомендованным ФА0/В03, а также по степени усвоения изотопа серы 3 входящей в состав неорганичес- • кого соединения - сульфата натрия и аминокислоты - мегионина.

В процессе отработки оптимальных режимов получения эритро-цитарного диагностикума были изучены: значение антигенности и агглютинабельности штаммов В.orlo , условия обработки эритроцитов барана формалином и танином, методы экстрагирования антигена из клеток В.ovio , оптимальная концентрация антигена и режимы сенсибилизации, эритроцитов. .

Контроль специфичности эритроцитарного диагностикума осуществляли в РИГА на негатийных и гетерологичных сыворотках крови, активность препарата устанавливали н реакции с позитивной антн-сывороткой производства Алма-Атинского биокоыбината и специфическим полиглобулином ВГНКИ (У.Э.Ниязов и др.).

Опытно-промышленные серии диагностикума готовили на Алма-Атинском 'биокомбинате, "в ВДЭВ и ВГННИ. Комиссионную-проверку спо-цифпчности и активности препарата в РИГА и РНАт провели с участием представителей ВГНКИ и ЦВЛ Госагропрома СССР по плану, утверл-регтому директором ВГНКИ. Шло исследовано 1964 пробы сыворотки крови от овец из благополучных по ИЭ хозяйств и 16256 проб - из неблагополучных хозяйств. Сыворотки крови исследовали параллельно а РДСК и испытуемой РНГА. В РНА? з сравнении е бактериологическим методом быя исследован биоматериаж от ,29 баранов*

Постановку РНГА осуществляли как з макрообъем&х (0,55 мл), тал и в никровариакте (0,1 ил) по разработанной калм методике.

При отработке методики постановки РА с антигеном в» oris подбирали красители» буферный раствор{ рН антигена, концентрацию микробных клеток. Реакцию считали положительной при налн'щи агглютинации в смеси капли сыворотки (0,03 мл) и антигена (0,СЗ мл) с оценкой не менее, чем на 2 креста.

Разрабатывая методику постановки ИФА для диагностики ИЭ баранов в первую очередь оптимизировали способ приготовления антигена из В.ovio , обеспечивающий наибольшую способность его адсорбции на поверхности лунок полистироловых планшетов. В качестве коньюгата использовали сухой коммерческий препарат ИЭМ им.Н.Й. Гамалеи. Субстратную смесь готовили на основе ортсфенилендиами-на (ОФД) или 5-аминосалицнловой кислоты (5-АСК). Все компоненты использовали в рабочем оттитрованном разведении и вносили в лунки по 0,1 мл. Результаты реакции учитывали визуально или инструментально на спектрофотометре.

При изучении аллергического метода диагностики ИЭ баранов вначале испытали 5 различных препаратов: бруцеллоовин, приготовленный по методике ВИЭВ из штамма ¿«ovio 64 с содержанием актив' ного белка, в конечном продукте в пределах 35 мг$; коммерческие препараты - бруцеллизат и бруцеллин ВДЭВ, аллергены из штаммов B.abortuu 19 и B.nelitonaio 56, изготовленные в ШЭВ. В дальнейших исследованиях использовали только два аллергена - бруцелло-овин ШЭВ и бруцеллин ШЭВ, показавшие в предварительных опытах наибольшую диагностическую активность. Эффективность всех испытуемых аллергенов проверяли параллельно во внутрикогшой (по 0,2 мл) и пальпебральной (по 0,5 мл) пробах. Реакцию учитывали, через 48 часов и оценивали в крестах по .4-х балльной системе.

При разработке инактивированной гщъювант-вакцнны против ИЭ баранов в качестве антигена использовали взвось убитой формалином культуры штамма-B.ovio 64 , эмульгированную в масляно-лано-линовом адьюванте ВШИЯИ. Отработку дозы вакцины и проверку ее иммунологической эффективности проводили в опытах на морских спинках и баранчиках. В качестве контроля использовали коммерческую вакцину из шг.В.nolitansie Рев-I. Иммунизированных животных • заражали культурой вирулентного штамма B.otíb 8406, минимальная инфицирующая доза которого, вызывающая заражение всех интактных морских свинок или овец (ИДэдд), была оттитрована нами в предварительных опытах.

При оптимизации режима инактивирования сывороток крови крупного рогатого скота каждую из 540 исследованных сывороток разводили в одной пробирке, затем делили на 3 порции по 1,5 мл и инак-ппшропали отдельно при 58-59°С, 64°С и 70°С в течение 30 мин. i !'!-;пвромошо инактивацию проводили при этих ке режимах сывороток ••»г, чр'тиалнвчсндарс для титрования дозы комплемента.

При разработке методик постановки РА, РСК и РДСК в микро-объеиах в РА использовали цветной антиген для КР с молоком (с обязательной родтитровкой рабочей дозы каждой серии антигена), в РСК и РДСК - единый бруцеллезный антиген биофабричного производства. Использовали ручной микротитратор типа "Такачи" и полуавтоматическую систему для постановки серологических реакций а шкрообъемах типа "Титортек".

Разрабатывая методику дифференциации неспецифических серологических реакций при исследовании сывороток крови животных из благополучных хозяйств, использовали единый бруцеллезный антиген для РА, РСК (РДСК) биофабричного производства с добавлением к нему детергента ("Трилон-Б") из расчета 10 мкмоль на I л рабочего разведения антигена. Результаты РА в обычной постановке и РА с антигеном, обработанным детергентом, сравнивали и при получении отрицательного результата или снижении титра более чем на 2 разведения реакцию считали неспецифической, а животное признавали здоровым. • ,

Для получения ыоноклональных антител к поли-Б антигену бру-целл штамма В.аа1:ивпа18 115 иммунизировали по короткой схеме мышей линии ВАЫЗ/с: в 1-й день вводили антиген внутрибрюшинно в доза 30 мкг в 0,1 ыл неполного адыованта Зрейнда, затем на 7, II, 12 и 13-й дни - по 15 мкг в забуференном физиологическом раствора хлорида натрия. Через 4 дня после последней иммунизации опленоциты селезенки от этих.мышей гибридизовали с клетками шеломы X 63 Аз 81-6.5.З. Полученные гибридомы культивировали на слое перитонеальных макрофагов мыши в специальной среде при 37,5°С в атмосфере, содержащей б% углекислого газа. Селекцию гибридом проводили на ореде с ГАТ, а тестирование - в твердофазном И5А. Клетки, продуцирупцие МКА к поли-Б антигену, клонировали методом лимитирующих разведений^ Для получения МКА 1п у!уо сингенным мышам, обработанным пристаном, вводили внутрибрюшинно I х 10^ гибридных клеток и через 12-14 дней после имплантации гибридом от мышей получали асцитнув жидкость для тестирования в ИФА.

Для определения иммунологической эффективности пониженных доз вакщны из шт. 19 при подкожном и коныонктивальном методах введения и вакцины из шт.Рев-1 был проведен ряд экспериментов на интактных в отношении бруцеллеза животных. Изучали в динаедке содержание антител в сыворотке крови после- первичной ими/шзацга и

последующих реиммунизациях. Периодически животных исследовали на бруцеллез аллергическим методом, используя бруцеллин ШЭВ. Молоко от лактирупцих коров исследовали в КР.

Производственное испытание новых схем иммунизации проводили в хозяйствах Кустанайской и Джамбулской областей Казахстана, Панфиловского района Кыргызстана, Нарпайского района Самаркандской области Узбекистана, в хозяйствах Дагестана (пониженные дозы вакцины из штамма 19) и в 14 хозяйствах Кустанайской и Алма-Атинской областей Казахстана, в хозяйствах 14 районов Дагестана, в 2-х хозяйствах Таджикистана и в Туркмении (пониженные дозы вакцины из шт.Рев-1).

Испытание коньюнктивального метода -имкунизации крупного рогатого скота-на опытной базе Вышневолоцкого отдела ВИЭВ (эксперимент) ив хозяйствах Дкамбулской области Казахстана, Самаркандской и Хорезмской областей Узбекистана и в Дагестане.

Результаты проведенных исследований подвергали тщательному анализу и статистической обработке для установления достоверности полученных данных.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ ' •

3.1. Совершенствование мер борьбы с иифекционной болезнью овец, вызываемой возбудителем ВгиовИл от!в (ИЭ баранов)

3.1.1. Конструирование эритроцитарного диагностикума и разработка методик постановки и учета РИГА и РНАт. До последнего времени единственным методом серологической диагностики ИЭ баранов за рубежом оставалась РСК, предложенная С1арр К.Н.(1953), а в нашей стране - РДСК по П.А.Триленко (1970).

Бактериологическая диагностика ИЭ баранов основана на традиционной методике высева исследуемого материала из органов и ■ лимфатических узлов животных на питательные среды с целью -вьще-ления культуры возбудителя с последующей ее идентификацией.

3.1.1.1. Разработка способа изготовления эритроцитарного диагностикума и его испытание в РИГА и РНАт. Недостаточная диагностическая чувствительность РДСК, определенные трудности, продолжительность и весьма низкая эффективность бактериологической диагностики ИЭ баранов с учетом значительных материальных затрат послужили основанием к созданию более эффективного препарата -эритроцитарного диагностикума.

В результата проведенных исследований был разработан стой-гай (срок годности не менее 18 мес.), специфичный (достоверность 5олее 95%) диагностикум, представляющий собой 2,5$-ную взвесь 5ритроцитов барана, фиксированных формалином, обработанных тани-1он и сенсибилизированных антигеном, полученным путем дезинтеграции B.oyiíi ультразвуковыми волнами низкой частоты.

Были отработаны оптимальные рекимы и условия изготовления шагностикума, включавдие:

- отбор штамма В.ovio для получения антигена высокой активности. Первые серии готовили из шт.}? 64, но впоследствии от-1али предпочтение комплексному антигену из двух производствен-ак шташов В.ovia !? 10/2 и № 424/2, селекционированных в ВГНКИ !У.Э.Ниязов);

- подбор метода получения активного антигена, способного [дсорбироваться на эритроцитах. Установлено, что только антиген, юдученный из клеток В,ovio , дез!штегрированных ультразвуком мзкой частоты при пониженной (+4°С - +6°С) температуре, отвечал тому требованию;

- определение концентрации формалина (5%) и экспозиции об-аботки (16-18 час.), обеспечивающие длительную.сохранность эрит-юцитов (более 4-х. лет) без признаков лизиса и агломерации;

- опредегвнма концентрации (1:20 - 1:50 тыс. в зависимости i активности серии) и оптимального времени обработки раствором шшна (15 i:tn.), обеспечиЕащнх стабильность взвеси эритроцитов

фосфатко-буфзрном 0,0555-ом раствора хлорида натрия при pH 7,2,4 и тюкую адсорбщшщую способность (в отношении антигена) ормавиазированных эритроцитов барана;

- определение концентрации антигена, продолжительности 32-14 час.) и температуры (+37°С) сенсибилизации, а также кон-ентрации эритроцитов,^ диагностикуме (2,5$). '

Специфичность и высокая диагностическая эффективность опытах серий препарата в РНГА Л РНАт была доказана нами при исследо-ании сывороток крови и экстрактов из биологического материала г экспериментально зараженных животных и от овец из неблагопо-угчшх по ИЭ хозяйств, в т.ч. и от баранов, имеющих клинические эиэната болезни (таблЛ, 2 и 3).

Таблица I

Результаты изучения специфичности и чувствительности РНГА в сравнении с РДСК

Группы животных

•Исследовано

сыво- р____! в т.ч. Совпали Только

!Всего!----------РДСК и РНГА

Реагировало положительно Т

I роток I ! !

I РДСК! РНГА!

I

РНГА

Здоровые, вакцинированные против бруцеллеза или зараженные возбудителями бруцеллеза, кампилобактериоза, сальмонеллеза, хламидиоза

Искусственно зараженные культурами В.от±в (в раз. личные сроки после заражения)

Бараны и овцематки из неблагополучных по ИЭ хозяйств

3607

803 . 659 ' 520 659 520 139

% 82,1 64,8 82,1 100,0 17,3

3409 777 501 777 601 276

% 22,8 14,7 22,8 100,0 8,1

' Таблица 2

Результаты исследования по РДСК и РНГА сывороток крови баранов с клиническими признаками эпидидимита

Область

.Иссле-' Выявлено ¡Из чиЬла клинически больных Iдовано;клинически{реагировало положительно по: больных ----

бара- .

}нов 1гол.1 ! 1 I

-!

% |

РДСК

1

рсолич. |

%

|к0и1ч.{

РНГА

%

Белгородская Липецкая Всего

606 475 1081

74 33 107

12,2 7,0 9,9

42 19 61

56,8 57,6 57,0

72 25 97

97,3 75,8 90,7

В экспериментах на 60 баранах, овцематках, ярках и 60 морских свинках установлено, что при исследовании в РНГА антитела к В.от1о в сыворотке крови животных выявляли в более ранние сроки или одновременно с РДСК. При этом положительные показания РНГА сохранялись длительнее и в высоких титрах (разведение сыворотки 1:100 - 1:800 и выше).

Результаты исследования большого количества культур бруцелл разных видов и форм, стафилококков, стрептококков, кишечной палочки и экстрактов из биоматориала от здоровых, искусственно за-

раженных В.ovia животных, от баранов из неблагополучных по ИЭ ¡I бруцеллезу хозяйств, а таете от овец, иммунизированных вакцинами из штаммов B.abortua 19 и B.neli-tenais Рев-I, подтвердили специфичность и высокую чувствительность РНАт и ее преимущества в сравнении с бактериологическим методом.

Таблица 3

Результаты исследования бактериологическим методом и в РНАт патологического материала от инфицированных В.ovia животных

¡Исследовано1

¡ных материала

Положительный результат

бактериологического ¡ PUA" исследования_I__

животных ! проб ! мтотних ! проб

трс ___

| 1-е------ ! | ri ~1 1 "а i ! ! ! р'

I | |ГОЛ.| % jIC-BO % |ГОЛ.i Ъ |к—БО j %

Искусствен- 66 1476 ' 37 56,1 189 12,8 44 66,7 392 26,6 но зараженные бараны, овцематки и ярки

Искусствен- 34 160 17 50,0 24 14,3 32 94,1 04 50,0. но зараженные морские сшшси

Больные ба- 30 125 20 66,7 34 27,2 30 100,0 67 53,6

раны из не-

олагополуч-

ных по ИЭ

хозяйств

Итого 130 1769 74 56,9 247 14,0 106 81,5 543 30,7

Изготовление последующих 6-ти опытных серий диагностикума, отработку методов его стандартизации и контроль осуществляли совместно с ВГНКИ.?{ ,

Специфичность опытных серий препарата подтверждена при исследовании в РИГА 2039 проб сыворотки крови овец из 59 благополучных по ИЭ овцеводческих хозяйств различных зон страны и гете-рологичных сывороток крови, содержащих антитела к бруцеллаи (308 проб), сальмонеллам (47 проб), хламидилм (12 проб), кампи-лобаитершл (22), возбудителю сапа (2) и туляремии (I). Во всех этих случаях показания РИГА были отрицательными.

Исследования выполнены совместно с У.Э.Ннязовш и К.В.Цу

Цунило^им.

Специфичность диагностикума в РНАт проверена путем исследования 126 экстрактов из суспензий бруцелл (S -форма), стафилококков, г.coli , стрептококков и 319 экстрактов из органов инфицированных бруцеллами (S -форма) животных. Результаты РНАт во всех случаях также были отрицательными.

Чувствительность диагностикума подтверждена при постановке РИГА в сравнении с РДСК и РНАт - с бактериологическим методом. В РИГА исследовали 853 пробы сыворотки крови от искусственно зараженных В.ovio животных (в динамике) и 2889 проб сыворотки крови от овец из неблагополучных по ИЭ хозяйств. В 4-х опытах на экспериментально зараженных культурами В.ovia баранах, овцематках, ярках и морских свинках установлено, что РИГА не уступает, а в рдпе случаев и превосходит по чувствительности РДСК о антигеном биофабричного производства. Антитела в сыворотке крови зараженных животных выявляли в РИГА в более ранние сроки, в высоких титрах и продолжительнее, чем в РДСК, что подтвердило полученные ранее данные. С помощью РИГА дополнительно были выявлены в первом опыте 3 ярки, во втором - 3 овцематки и в опыте на морских свинках 5 животных, инфицированных в.ovia , что подтверждено вцпелением культуры возбудителя B.ovie.

Из числа исследованных 2889 сывороток крови в РИГА дополнительно к РДСК было выявлено 16,6$ положительно реагирующих проб. При бактериологическом исследовании патологического материала от 10 баранов, с сыворотками крови которых получена только положительная РИГА, в 9-ти случаях выделена культура в.orle.

Таким образом, было подтверждено, что РИГА превосходит по чувствительности используемую в практике РДСК. Реакция проста по методике исполнения и пгэномичнее РДСК.

При исследовании в РНАт 1557 проб биологического материала от 76 искусственно зараженных баранов, овцематок и ярок положительный результат реакции получен с экстрактами из 428 проб материала (27,5$) от 53 животных (69,7%), в то время как при бактериологическом исследовании,культуру, Bkovie вьщелили из 287 проб (18,4$) от 43 животных (56,6$). При исследовании 105 проб патологического материала от 20 баранов Из неблагополучных•по ИЭ хозяйств культуры B.ovie выделили, из объектов , (24,8^) 0т'16 Vi животных. (8Ó,0/j), а РНАт была- положительной,'с экстрактами. :Из '47.': объектов (44,8^) от'всех 20- ба$адов«; 'Свдовм ^Чъм'.слу-»

чае подтверждена более высокая чувствительность РНАт в сравнении с бактериологическим методом диагностики. Если на получение результатов бактериологического исследования, включая идентификацию «ультур, требовалось от 30 до 45 суток, то на постановку РНЛт затрачивали всего 5-6 часов.

Положительные результаты испытания эритроцитарного диагностикума в РИГА и РНАт в лабораторных и производственных условиях послужили основанием для представления обобщенных материалов исследований в ГУВ МСХ ССОР с целью проведения проверки препарата л новых методов диагностики комиссией ВГНКИ и ЦВЛ.

3.1.1.2. Комиссионная проверка диагностикума в РИГА и РНАт. Цля проведения испытания были представлены в ВГНКИ две серии эритроцитарного диагностикума. Постановку и учет результатов 3НГА и РНАт проводили в.соответствии с проектами временных методических указаний» Комиссионная проверка была проведена в 3 этапа.

Первый этап. Специфичность препарата определяли путем ис-злвдования в РНГА двух 3 -бруцеллезных сывороток и трех заиедомо зтрицательных сывороток крови овец. Активность диагностику?®, оп-эеделяли в реакции с двумя серит® специфического овиского по™-:-?лобулина ВГНКИ (У.Э.Ниязов к др.), с ре$еренянйГ. овкской сыво-юткой и сывороткой крови барана, больного инфехционным эппдир*?-атом. Предельным титром полиглобулика или позитивной сызорэ^к"! •.читали их наибольшее разведениеР з котором получена полоягитель-1ая РНГА с оценкой не ниже чем на 4 кресте, (табл.4),

Таблица 4

Результаты комиссионной проверки специфичности и активности з РНГА двух серий этмтроциташого диагностикума

м]_ ¡Предельный титр сыворо?:« ¡5

I Скворсучи ¡РИГА с диаг'нос'гигт'.ом ссрии

1 ! Р 5 ; ?? 7

. Полиглобулин ВГНШ, сер.3-1280 г,. 1:6400 I:12900

1. Полиглобулин ВГНКИ,сор.4-1980 г. 1:040С ♦. Г ОРЛ^

. Рофзрентная овисная ВГНКИ I:25600 Т.: 25000

. От больного ИЗ барана I? 3 1:25600 1:25600

. &-бруцелдозная ВГНКИ, сер. I о?рица?- отр

. !3-алти-бруцелла абортус отрицат. о; гниз/?.

. Негативная, сер,5 отрнцат. О'Грчпа?»

. Негативная, сер.6 отрпцат. отр-.и^ау.

. Негативная, соп.23

Второй этап. Определение специфичности и чувствительности РИГА в сравнении с РДСК.

Специфичность РИГА с эритроцитарным диагностикумом была проверена путем исследования 34 проб сыворотки крови от больных бруцеллезом овец, 2-х проб сальмонеллезных сывороток, 6 - каыпи-лобактериозньгх, 10 - хламидиГшого аборта овец и 10 проб сывороток крови от здоровых животных. В результате проверки установлено, что со всеми пробами сыворотки крови от здоровых животных и сыворотками, содержащими гетерологичные антитола, показания РИГА были отрицательными.

Чувствительность РНГА определяли путем исследования 96 проС ■сыворотки крови овец из 5-ти неблагополучных по ИЭ хозяйств. В качестве контролей использовали заведомо известные овисную, 3 -' бруцеллезную и негативную сыворотки крови. В РДСК применяли овис-ный антиген, изготовленный Алма-Атинским биокомбинатом, и единый бруцеллезный антиген для РА, РСК и РДСК производства Херсонской биофабрики. В РНГА реагировало полокительно 34 (35,4%) и сомги-тельно - 28 (29,23), а в РДСК с ошсныг.1 антигеном - соответственно 15 (I5,6/t) и 22 (22,

Третий этап. Определение специфичности и чувствительности сзритроцитарного диагноетикума в РНАт.

Были исследованы в РНАт экстракты из биологического ите-риала от здоровых овец (3 пробы), экстракты и взвеси клеток бру-целл видов abortuo, uolitonoia и tiuin (3 дроби), экстракт но 'взпеси сальмонелл (I проба). Во всех случаях РНАт оказалась, отрицательной, что свидетельствует о высокой специфичности диагностикума.

Чувствительность диагностикума в РНАт проверяли путем исследования 7 экстрактов из проб_биоматериала от больных ИЭ баранов, 6 экстрактов и взвесей клеток В.ovio и 2-х серий биофабрич-Иого овисного антигена для РДСК. В качестве нейтрализующей в РНАт использовали референтную овисную сыворотку ВГНКИ в рабочем разведении 1:3200 или 8 сывороточных единиц (предельный титр в РНГА -1:25600 с оценкой 4 креста) и полиглобулин ВГНКИ в, рабочем разведении 1:3200 или 2 сывороточные единицы (предельный титр в РНГА -1:6400). Результаты исследований показали, что РНАт с проверяемых! эритроцитарным диагностикумом специфична и выявляет антиген Б,ovio в экстрактах из патологического материала от инфицированных животных в разведениях от 1:4 до 1:32, а в экстрактах из кле-

ток бруцэлл пила ovio и в биофабричных овисннх антигенах - в разведениях выше 1:32, что подтверждает высокую чувствительность реакции .

• Таким образом в результате комиссионной проверки установлено, что эритроцитаркый диагностику ВИЭВ-ВГНКИ является стабильный препаратом и не обладает свойством спонтанной агглютинации. Препарат активен: титр полиглобулина в РНГА с риагностикумом серии !> 5 составил 1:6400 и серии № 7 - 1:12800 с оценкой реакции в 4 креста. Эритроцитарный диагностику«.высокоспецифичен. При проверка препарата в РНГА с бруцеллезными, сальмонеллезными, кам-пилобактериозныш, хлашдийными сыворотками, а также с сыворотка-¡,3i крови от здоровых животных и в РНАт с экстрактами из биологического материала от здоровых животных, экстрактами и взвесями бруцелл видов abortua,. nelitensia и eulo ни в одном случае не било положительных реакций. РНГА с эритроцитарным диагностикумом по чувствительности превосходит РДСК, а по технике постановки значительно проще последней.

РНАт с эритроцитарным диагностикумом ВИЭВ-ВГНйИ является высокочувствительной и может быть рекомендована взамен бактериологического метода диагностики ИЗ баранов. Для -подтверждения диагноза на инфекционный эпидидимит с помощью РНАт достаточно обнаружения антигена В.ovia (возбудителя или продуктов его распада) в неразведанном экстракте из патологического материала, в то же время высокая чувствительность реакции с эритроцитарным диагностикумом позволяет выявлять антиген возбудителя ИЭ при разведении исследуемых проб в 16-32 и более раз.

Таким образомj комиссионное испытание эритроцитарного диаг-ностшсума подтвердило его активность, специфичность и высокую чувствительность в РНГА и РНАт. В связи с изложенным комиссия рекомендовала изготовить на одном из предприятий биологической промышленности 3-5 серий эритроцитарного диагностику™ и испытать их в производственных условиях' в РНГА и РНАт в соответствии с пред-лоиентли методическими указаниями по постановке и учету этих реакций.

3.1.1.3. Результаты широкого производственного испытания набора препаратов для диагностики ИЭ баранов п РНГА и РНАт. Материалы по разработке и лабораторноцу испытанию эритроцитарного диагностикума и НГД на "Набор препаратов для диагностики í¡0 баронов

в РНГА и РНАт" в 1984 г. были рассмотрены и одобрены методическими комиссиями ШЭВ и ВПВД, а результаты комиссионной проверки - в 1936 г. на заседании Координационного совета ВГНКИ.

В связи с указанным Главное управление ветеринарии Госаг-ропрома СССР 26.06.86 г. утвердило нормативно-техническую документацию (Инструкцию по изготовлению и контролю набора препаратов, ТУ 10-19-248-86 на опытную партию набора, Карту технического уровня к Наставление по постановке и учету РНГА и РНАт), а также издало приказ за ДО 51 от 31.07,86 г. о проведении широкого производственного опыта и утвердило Программу испытания комплекса средств и методов диагностики ИЭ баранов.

На Алма-Атинском биокомбинате и в ШЭВ-ВГНКИ в соответствии с НТД были изготовлены две опытно-промышленные партии (100 наборов или 20 тыс.доз) эритроцитарного диагностикума. Производственное испытание изготовленных опытных серий проведено в 1986-1989 г в ветеринарных лабораториях республик, определенных приказом ГУВ ГШК СССР.

Диагностическую эффективность РНГА с использованием компонентов, входящих в набор, определяли в сравнении-с РДСК. В РНГА • исследовано 1984 пробы сыворотки крови от овец разного возраста и пола (баранчики, ярки, овцематки, бараны-производители, бараны-пробники) из благополучных и 16256 проб из неблагополучных по ИЭ хозяйств (табл.5).

Анализ первичных документов и заключений специалистов с мост показал» что испытуемый эритроцитарный диагностикум для. РНГА к РНАг специфичен и более чувствителен по сравнению с биофабрич-антигеном для РДСК. В благополучных хозяйствах при исследовании в РНГА 1984 проб сыгоротки крови овец положительных реакций не отмечено. В хозяйствах, неблагополучных по ИЭ, РДСК выявляла в среднем 3,7$ реагирующих животных, а РНГА с испытуемым препаратов - 8,0%. Положительные результаты РДСК в среднем подтвердились в 31,4$ положительными результатами в РНГА. Из общего количества реагирущих положительных проб 10,2$ выявлены только в РДСК и 58,4$ - только в РНГА.

.Важное эпизоотическое значение/животных, 'с сывороткаш крови которых были. получены пбложиФельвда' йбк&зания .РНГА и: РДСК одновременно или 'только РНГ.Агрри/о^рицёт^

зуяьтаташ бадтериолоЬического.;исбледов&Ния биоматериала^ При и с-:'

Результаты производственного испытания "Набора препаратов для диагностики инфекционного эшдидигата баранов в РИГА и РНАт" (числитель - абсолютное число, знаменатель - процент)

¡Иссле- • Выявлено положительно оеапгоупцих '

государства ,доЕано ¡хивот-(КЬТХ Всего ' • ' ! ! РДСК ! РИГА ! ! ¡Совпали (Только поло-результаты !жительная 1РЛСК и РНГА'РДСК -¡Только поло-!яительная 1РНГА

Россия 2113 > 247 120 210 83 37 127

И,7 5,7 9,9 33,6 15,0 51,4

»сГ:гсахстгш 728 117 65 НО 58 7 • 52

■ 16,1 8,9 15,1 49,6 6,0 44,4

Ззлорусскя 3633 506 82 424 нет данных 82 424

13,9 2,3 II.7 16,2 . 83,8

"лтгия 1114 78 24 76 22 2 54

7,0 2,2 ■ 6,8 28,2 2,6 69,2

Гтркмекия 421 68 39 53 24 15 29

16,2 9,3 12,5 35,3 22,1 42,6

'■-"гизстан 8247 443 279 442 273 6 169

• 5,4 3,4 5,4 60,9 1,4 37,7

ЯТОГС ' 15256 1464 609 1315 460 149 855

9,0 3,7 8,0 31,4 10,2 58,4

следовании 18 баранов (Липецкая обл., Новосибирская обл., Кыргызстан, Латвия) в 10 случаях культура В.от1о вцпелена от животных, реагировавших только в РИГА, и в 5 случаях - от реагировавших одновременно в РИГА и в РДСК.

Патологический материал от II баранов, с сыворотками крови которых были получены положительные результаты в РИГА и РДСК (Липецкая обл., Кыргызстан), параллельно исследовали в РНАт и бактериологическим методом. Культуру В.от1в выделили от 6 баранов (54,6?$), а РНАт была положительной у 9 (84,8%). В .заключениях лабораторий отмечается, что исследование патологического материала в РНАт значительно проще и эффективнее, чем бактериоло-• гическая диагностика.

На основании результатов производственного испытания набор препаратов для диагностики ИЗ баранов в РНГА и РНАт был принят к использованию в ветеринарной практике. Утверждены'Инструкция по изготовлению и контролю препаратов, входящих в набор, Технические условия на препарат, Наставление по его применению и Методические указания по постановке и учету РНГА и РНАт. Серийное производство набора поручено организовать Всероссийскому научно-производственному биологическому центру "Биоиндустрия" (г.Омск).

К настоящему времени изготовлена I тыс.доз препарата для РНГА, что соответствует 2 тысуюз для РНАт.

3.1.2. Разработка антигена и методики постановки пластин-. чатой РА при диагностике ИЗ баранов. При разработке антигенов для РА очень важно обеспечить условия, предупреждающие спонтанную агглютинацию микробных клеток. Это особенно значимо, если культура возбудителя диссоциирована (Н -форма, цукоидная и т.п.).

Известно, что клетки В.от1а представляют собой стойко дис-оциированцую Е -форму, в связи с чем на стабильность микробной пензии возбудителя влияют различные факторы и, в первур оче->, рН раствора, концентрация солей, тип красителя и концент-!Я микробных клеток в антигене. При отработке режима получо-.1 стойкого препарата, пригодного для использования в пдастин->той РА, изготовили и испытали 39 образцов антигена. Было установлено, что использование в качестве разбавителя буферных растворов рН 8,5 - 9,5 позволило получить стойкую суспензию клеток в.от1п , не обладающую спонтанной агглютинацией. Для прокрашва-ния клеток пригодны только щелочные краски. В частности, из испы-

тайных 14 анилиновых красок наиболее пригодным оказался краситель бенгальский розовый типа "Б", который при подборе оптимального объема полностью поглощался микробными клетками, хорошо окрашивая их,.и на отходил в разбавитель. Примерно такими же свойствами обладал и бенгальский розовый, типа "А", но в процессе хранения часть краски переходила в разбавитель, что затрудняло в дальнейшем объективно оценивать результаты реакции. Из четырех испытанных штаммов В.ovia получение наиболее стойкой суспензии и хорошую агглютинабельность обеспечивал штамм № 64. Оптимальная концентрация микробных клеток в препарате составила 60 млрд/мл.

Специфичность окрашенного антигена в пл.РА проверили путем исследования 160 сывороток крови от баранов из благополучных по ИЭ хозяйств и 210 проб сыворотки крови здоровых морских свинок. Во всех случаях неспецифических показателей реакции не отмечено.

Диагностическую эффективность реакции изучали путем исследования (в динамике) сывороток крови от 36 баранов и овец ч 210 морских свинок, экспериментально зараженных культурой вирулентного штамма B.oria № II0645. При сравнении пластинчатой РА, РДСК и РИГА установлено, что ранее всего (на 5-й день после заражения) в сыворотке крови животных выявлялись агглютинины в пластинчатой РА. Максимум положительно реагирующих (100$ опытных животных) достигал к 18 дню. Затем число реагирующих постепенно снижалось и к 70 дню после заражения показания пластинчатой РА стали отрицательными.

Таким образом, исследования показали, что пластинчатая РА о приготовленным по-нашей методике антигеном специфична и может быть использована при диагностике ИЭ баранов, главным образом, для выявления зараженных животных на ранней стадии развития инфекционного процесса.,»

3.1.3. Создание набора для диагностики ИЗ баранов методом ША и разработка оптимальных условий постановки и учета редкими.,г В последние годы за рубежом и в нашей стране разрабатываете:;! ио-зпе, простые, специфичные и высокочувствительные методп диагностики ИЭ баранов. Наиболее перспективен в этом- отношении иммуко-фермептшШ анализ (ИЗА). Используя различные антигена (ссисити-ны), с помощью ИЗА можно выявлять-.иммуноглобулин!! (аилг.-ана)

1! НсследоЕЭиия выполнены совместно с У.Э.Нилзош.'м, Л.П.Мильннч1.:!-г.о, З.О.Богаутдиногнм, Е.А.Тягуникой, В.И.Иоеьничи«о. А.Г,

личных классов, антигены микроорганизмов, а также циркулирующие иммунные комплексы.

Нами, совместно с сотрудниками БГНКЙ, в I986-I99I гг. разработана методика изготовления, стандартизации и контроля компонентов для ША с использованием специфического антигена из b.oyí определены оптимальные условия постановки реакции., критерии учета и диагностической оценки ее результатов.

Установлено, что наиболее специфичен и активен в ВДА антиген, полученный путем дезинтеграции клеток B.oyío (штаммы $ 10/2 и № 424/2 ЯГНКИ) ультразвуковыми волна?® низкой частоты при интенсивности колебаний 22 кгц и мощности 100 вт/см*\ Рабочее разведение такого антигена в ША составляло -от 1:500 до 1:700, в то время как антигены, изготовленные путем мягкого уксусно-кис-лого гидролиза с последующим осаждением липополисахаридного комплекса этанолом (метод Буавена-Мееробиану в модификации Гелева И., 1973), экстракцией горячим вйдным раствором фенола по методике Коникова в модификации Лакман и антиген Алма-Атинского биокомбината, приготовленный методом криолиэа по Триленко, при достаточно высокой специфичности проявляли значительно меньшую активность в ША (разведения от 1:100 до 1:300). Кроме того, антиген, полученный путем ультразвуковой дезинтеграции клеток В.crio, хорошо сорбировался на поверхности лукоп полистироловых планшет. Соответственно в последующем мы использовали только антиген, наготовленный по этой методике Всероссийским научно-производствен-"' шм биологическим центром "Еиоиндустрия" (г.Омск).

Проведенными исследованиями установлено, чяо диагностическим титром 1Ш как при визуальном, так и при инструментально« (на спектрофотометре) улете этой реакции следует считать разведение 1:400 с оценкой не менее_чем на 3 креста. При более низких разведениях сывороток крови от заведома здоровых животных в р*ще ' случаев получали неспецифическое фоновое окрашивание продукта реакции.

^вствительность И2А в сравнении с РДСК на первом этапе определяли путем исследования (в динамике) сывороток крот Б-ти кроликов, гипериммунизированных культурами В.ovio штаммов $ 10/2 и 424/2, и 22 баранов, иммуииэированных инактивированной адью-вапх-вакциной из штамма -B.ovie 64 (экспериментальная серия). При исследовании сывороток крови кроликов положительные результаты .

ЗА отмечены одновременно с положительными показаниями РДСК на Э-е оутки после иммунизации животных. Максимальный уровень анти-зл, выявляемых в И$А, установлен через 25 суток. Показания реак-га оставались у всех животных положительными до 80 суток (срок аблкрения). РДСК к этому сроку осталась положительной только у оного кролика в разведении сыворотки 1:10 с оценкой в 2 креста.

Аналогичная закономерность появления и угасания антител зтановлена при исследовании сывороток крови от 22-х вакциниро-шных баранов (табл.б).

Таблица 6

Динамика выявления антител в ИФА и РДСК в сыворотке крови бараков, иммунизированных инактишрованной адьювант-вакцинои из в.ovia

зтод |Дни исследования после вакцинации и % реагирущих

¡еле- i ■ " i i-т-f-Ii- •" i--

>вания{ Б ■).. 10 •} 30 , 60. j 90 j 120 j 150

Ш о 45,5 100,0 100,0 77,7 59,0 50,0

•ДСК о 45,5 100,0 72,7 63,2 45,5 31,8

■впали 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0 100,0

\к и

ÍCK

С сыворотками крови контрольных (не вакцинированных) житных (6 голов) во все сроки исследования получили отрицатель-:е результаты ИЗА и РДСК.

Таким образом, метод И&А с разработанным нами набором пре-ратов показал высокую специфичность. При исследовании животных ранние сроки после иммунизации животных новый метод не уступал чувствительности РДСК и превосходил последнюю в более отданные сроки'после прививки.

На втором этапе диагностическую эффективность ИФА в сравнил с РДСК определяли путем параллельного исследования 2094 эб сыворотки крови от баранов и овцематок из неблагополучных ИЗ хозяйств Рязанской области и Красноярского края. При этом А была положительной с сыворотками крови от 179 животных (8,5¿), 3ДСК - от 74 (3,5%), т.е. ЩА превосходила по чуаствительнос-РДСК з 2,4 раза. Опасность животных, при исследовании сыворо-с крови которых получен только положительный результат в ИЗА, сазана пццелешем культуры В.ovia из патологического материала 5 тагах баранов из 8 исследованных.

На основе проверенных исследований разработат и утверждена в установленном порядке нормативно-техническая документация ки набор компонентов для диагностики ИЭ баранов методом ИФА. После комиссионного испытания с участием представителей ВГННИ, ВДЭВ и Республиканской ветеринарной лаборатории метод ИФА для диагностики ИЭ баранов принят в ветеринарную практику.

3.1.4. Оценка диагностической эффективности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) при ИЭ барановРазвитие у инфицированных В.ovia овец ГЗГ и высокую чувствительность аллергической пробы впервые отметил Hall W.I.K. (1955).

Основанием для изучения возможности использования аллергической пробы для выявления овец, инфицированных В.ovio , послужило то обстоятельство, что в ряде заведомо благополучных по бруцеллезу хозяйств различных регионов страны при исследовании баранов и овцематок бруцеллином ВИЭВ были выявлены положительно реагирующие животные при отрицательных результатах исследований сывороток крови в РА и РСК (РДСК) с бруцеллезным антигеном. Проведенными нами в таких хозяйствах дополнительными исследованиями (клинический осмотр баранов, патоморфологическое, бактериологи-' ческое и серологическое - РДСК с антигеном из в.от1висследова-ния)установлено заболевание овец, вызываемое B.otLs . В связи с указанным были изучены следующие вопросы:

- сравнение диагностической эффективности бруцеллизата, бруцеллина ВИЭВ и опытных диагностикуыов - бруцеллаовина ВИЭВ из шташа В.ovio 64, аллергенов из штамма B.obortuo 19 и из диссоциированного штамма B.nelltenaio 56;

' - динамика аллергических реакций у экспериментально инфицированных В.ovio баранов и овцематок;

- диагностическая эффективность аллергического метода исследования при ИЭ баранов.

В первом опыте на 8 инфицированных В.ovio баранах и овцематках установлено, что через 25 дней после заражения наибольшее количество реагирующих (по 4 головы) и более выраженные аллерги-т _ ческие реакции отмечали при введении бруцеллоовина ВИЭВ и-.бруцеллина ВИЭВ. ■ Л' •

Во втором опыте на 18 баранах и 18 овцематках изучали динамку циркулирующих антитёл в РДСК с сывороткой крови-и реакцию

* Работа выполнена совместно с А.Н.Касьяновьм.

ГЗТ путем постановки аллергической пробы с бруцаллэовином и бруцеллином ШЭВ. Установлено, что РДСК становилась положительной несколько раньше, но сохранялась, особенно у овцематок, менео продолжительно, чем аллергические реакции. Реакцш на бруцелло-овин ШЭВ (препарат с повышенным в сравнении с бруцеллином ШЭВ содержанием бактерийного белка;отме"ены у отдельных хивотных (33,3^) через 33 дня после заражения, а к 70 днь и позднео положительные реакции возникали у всех животных на оба аллергена и сохранялись до 160 дней (срок наблюдения). При бактериологическом исследовании патологическо'го материала от животных через 33,70, 97 и 160 дней после заражения животных культура В.о-И.в б^ча вцаелена от всех баранов и овцематок, реагировавших на аллергены, независимо от показаний РДСК с овисным антигеном, особенно п отдалегаше сроки после заражения животных.

Таким образом, установлсно.что у искусственно зараженных культура)л 1 в.от1в баранов и овец, начиная с 25 дня, проявляется ГЗТ, устанавливаемая внутрикожной пробой с гомологичным аллергеном - бруцеллоовином или пальпебральной пробой с бруцеллином ШЗЗ, . изготовленным из -диссоциированного штамма В.аЪог1газ I. Аллерги-'чоскал реакция сохраняется более длительно, чем комплементсвязы-ващие антитела з сыгоротке крови. 50$' из исследованных инфицированных В. от!о животных были выявлены в отдаленные сроки после заражения дополнительно к РДСК.

Сравнительное испытание диагностической эффективности бру-целлоовпна, бруцоллина ШЭВ и бруцоллизата при внутрикожном и пальпебральном введении провелг на 1050 баранах из неблагополучных по.ИЗ хозяйств. Установлено, .что бруцеллоовин более эффективен во' внутрикожной пробе (71$ роагирупрх при"пальпебральной и . 85$ - при-внутрикожной пробе), а бруцеллин ШЭВ был более акти-- ден при.пальпебральнон введении (27$ реагирущих прЬтив Ш', при .'■.внутрикожной пробе). Активность бруцеллина ШЭВ и бруцеллизата :.'прн внутрикожном введении оказалась примерно равной (реагировали .'соответственно 5,5^ и 5,9^ гивотных). В то время как в пальпебральной пробе активность бруцеллина превышала активность бруцел-Л1зата при внутрикожном введенш! в 3 раза и практически не отличалась от активности бруцеллоовина.

Учитывая, что бруцеллин ШЭВ внедрен в практику для диагностики бруцеллеза животных, последущее изучение диагностичес-

кой ценности аллергического метода при ИЭ баранов в хозяйствах с различной эпизоотической обстановкой было сочтено целесообразным проводить с использованием этого стандартизированного препарата. В 13 неблагополучных хозяйствах провели комплексное клиническое, серологическое (РДСК) и аллергическое (пальпебральная проба с бруцеллином ВИЭВ) исследование 3169 баранов. При этом было выявлено в среднем 18,Щ> животных, положительно реагирующих на аллерген (2,4 - 41,'<Ш. Во всех этих хозяйствах (за исключением одного) клинические признаки болезни установили у 0,5 - 16,9$ баранов, а при исследовании сывороток крови в РДСК выявляли в среднем Г7,9% положительно реагирующих (0,66 - 52,4$). Следует отметить, что в 7 из 13 хозяйств аллергическим методом дополнительно выявляли от 3,2 до 17,8$ больных животных, в то же время в 4-х хозяйствах число серопозитивных животных превысило число реагирующих на аллерген животных на 7,5 - 50$ случаев и в 2-х количество реагирующих на аллерген и при исследовании в РДСК было равным.

В 10 отарах из шести неблагополучных по ИЭ хозяйств исследовали аллергическим методом и РДСК 7283 овцематки. В двух отарах реагирующих по РДСК но выявили, а в остальных реагировали положительно единичные животные (0,4 - 2,5$), тогда как на аллерген во всех отарах реагировали положительно 0,3 - 21,9$ овцематок. Следовательно, аллергические реакции у инфицированных В.от1а овцематок сохраняются чаще и более длительно, чем'комплементсвязывание антитела.

Таким образом, в экспериментах и в производственных условиях доказана целесообразность использования аллергического метода диагностики ИЭ баранов в качестве дополнительного к официально 'принятому серологическому методу. В качестве аллергенов оказалось целесообразным применение препаратов, изготовленных из гомологичных штаммов бруцелл ( в.от1в ) или бруцеллина ВИЭВ.

Необходимость использования комплекса диагностических сродств и методов объясняется тем, что на различных этапах инфекционного процесса в сыворотке крови животных выявляются специфические иммуноглобулины разных классов и подклассов и изменяется, степень проявления ГЗТ. Только на основе использования комплексной диагностики (РДСК, РИГА, аллергический и клинический методы) удалось в короткие сроки оздоровить от ИЭ баранов Латгальокую опытную отанцию животноводства и овцеферму совхоза "Дрицени" Ре-зекненского района (Латвия) и значительно улучшить эпизоотическую

ситуацию в племсовхозе' "КолыбельскиЙ" и Головном племпредприятии Воронежской области и в совхозе "Новая жизнь" Рязанской области России.

3.1.5. Специфическая профилактика ИЗ баранов. Как известно, введение вакцинных препаратов из бруцелл разных видов обеспечч::л-ет развитие у привитых животных перекрестного иммунитета. Проя'.-денныо нами исследования показали, что живая вакцина из штамма B.nolitenaio Рев-I создает у овец достаточно напряженный имцуни-тет против ИЭ баранов.Объединенный комитет экспертов 9А0/В03 по бруцеллезу (1974, 1986) рекомендовал использование данной вакцина в комплексе мер борьбы с ИЭ баранов. В настоящее время эти вакцина применяется в 27 странах мира.

Анализ эффективности мероприятий по борьбе с ИЭ баранов при использовании только серологической диагностики (РДСК)с удалением реагирущнх гзшогных показал, что такие меры не позволяет добиться оздоровления хозяйств в течение длительного времени и связаны с больший экономическими затрат«;:!. В'общем комплексе профилактических и оздоровительных мероприятий необходимо использование средств специфической профилактики. Данная проблема может быть реяена путем ннцунпэации животных mi сой противобруцел--лозной вакциной (из пгшмов B.abcrtuo 19 или 104 II, B.a«xitetiaia Рев-I нет К-24) или применением инактивировангой адьювант-вакци-Ш из видоспещфического штаг:» B.cvio.

Каши исследования п практический опыт применения вакцины из шт.Рсв-1 для 1ГТ"?.гу1пзоцга опцепоголовья против бруцеллеза показал!, что одновременно обеспечивается высокая степень защиты шзотных против заражения возбудителем В.orlo . Как в экспериментальных, так и в производственных условиях после иммунизации овец вакциной из пг.Реп-1 стойкий гшмунитет возникал у 70f! живот-пах. При этом подкожное введение овцам ваяцянн из пт.Рев-I не препятствовало проведешю серологического исследования на ИЭ в любые сроки после ишугшзации.

й Исследования выполнены совместно о П.С.Уласевлчем, А.Н.Касьяновым, Р.Г.Ягудинку п о сотрудника":! ВГНЙИ, ИЭВСиДВ, ВШКЕШ, Казахского НИШ, Таджикского НИШ, Туркменского ШИНиВ, При— каспийского ЗШН1.

На основании результатов экспериментальной и производственной проверки безвредности и иммуногенности в последнюю редакцию Наставления по применению вакцины из шт.Рев-I включено указание о ее использовании для иммунизации овцепоголовья против ИЭ. Применение этой вакцины ограничивается только зонаки, где регистрируется бруцеллез, вызываемый B.aeliteaaie.

Однако, анализ статистических данных и результатов наших наблюдений свидетельствует, что ИЭ баранов регистрируется во многих регионах, благополучных по бруцеллезу овец, где согласно наставлению применение живой вакцины из шт.Рев-I не допускается. Для специфической профилактики болезни в этих зонах необходимы вакцины, не вызывающие в сыворотке крови овец синтеза антител, выявляемых в серол- 'ических реакциях с бруцеллезным антигеном.

По нашему мнению, совпадающему с данными зарубежных исследователей, в этом плане перспективна экологически безопасная вакцина из инактивиреванных бруцелл вида ovio в сочетании с адыовои-тами.

Результаты экспериментов* показали, что препараты из убитых клеток. В.ovie без адьюванта вызывали у привитых животных (морские свинки, баранчики) непродолжительны«'и низки" по напряженности иммунитет. Из 4-х испытанных штаммов наименьшей антиген-ностью и максимальной иммуногенной шстивностью обладал шташ B.oyíe 64. •

В целях создания вакцины,•обеспечивающей у привитых животных напряженный и продолжительный (не менее I го,па) иммунитет,был испытан ряд адьювантов, предложенных ВНИИШ, из которых наиболее эффективным оказался масляно-ланолиновый едъювант № 3210. С использованием этого адьюванта было изготовлено 7 опытных серий-эмульсин-вакцины с содержанием I мл 25 тыс., 250 тыс., 2,5 млн., 25 млн., 250 млн., I млрд. и 2,5 млрд. инактивированных микробных клеток штамма B.ovis 64. Проверка на морских свинках показала, что оптимальной дозой вакцины, обеспечивающей длительную устойчивость (срок наблюдения 6 мес.) к экспериментальному заражению V) ИД100 вирулентной культуры B.o^io В406, ыокно считать 250 млн. ,м.к. инактивировадаого штамма В.ovia 64 в шеляно-ланолиновом адьюваите. Аналогичные результаты получены кг:.:;: к в опытах на баранчиках. Оптимальной оказалась доза I млрд. м.к.

Данные исследования выполнены совмзсгно с аеппрштоы Г.Ш.Лбул-хаирош«!.

О

Наряду с положительными качества!® опытной эмульсин-вакцины (высокая иммуногенность, отсутствие серологических реакций с а -антигенами бруцелл) выявлены ее недостатки - высокая реакто-генность и продолжительная серопозитивность при исследовании животных РДСК и друтиш реакциями с овисннш антигенами. В связи с этим рекомендовано применять эту вакцину только в товарных хозяйствах. Разработаны лабораторный регламент на изготовление вакццны и наставление по ее применении.

Обобщая результаты проведенных исследований следует подчеркнуть, что эффективная профилактика и ликвидация ИЭ баранов, • наряду с обязательны.» выполнением общих ветеринарно-санитарных мероприятий, предусмотренных инструкцией, обеспечивается только при применении всего комплекса диагностических исследований (РА, РДСК, РИГА, И9А, РНАт), предусмотренных наставлением, и использовании средств специфической профилактики,

3.2. Усовершенствование средств и методов диагностики и специфической профилактики бруцеллеза "животных! Система мер борьбы с бруцеллезом включает охрану животноводческих хозяйств, ферм и населенных пунктов от заноса возбудителей болезни, оздоровло-ше неблагополучных пунктов, предотвращение распространения возбудителя за пределы эпизоотических очагов и профилактику заражения лкрей. Поскольку эффективность профилактической и оздоровительной работы во ыцогои зависит от своеврсуенной, точной- и полной диагностики болезни, особенно ее скрытых форм, разработке и совершенствованию средств п методов диагностики болезни постоянно уделялось большое внимание. Актуальна эта проблема и в настоящее время.

3.2.1. Совершенствование методики постановки РСК при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота.Принятые в настоящее время ыатоды серологической диагностики бруцеллеза (РЕП, РА, РСК (РДСК) позволяют с большой степенью достоверности выявлять специфические антитела в сыворотке крови инфицированных или вакцинированных против бруцеллеза яивотных. В то же врем, как -показали проведенные нами исследования, диагностическая чувствительность отдельных реакций и, в частности, РСК зависит от определенных режимов ее постановки. РСК, предложенная Борде и йангу

к Данные исследования проведены совместно с К.В.Щумиловым.

(I9GI), относится к непрямым двухсистемным гетерологичным 5-ком-понентныы реакциям. На ее конечный результат в значительной мере влияет количество вносимого комплемента и, как показали наш исследования, полнота его инактивации в исследуемой сыворотке, что зависит от температуры и времени прогревания.

По методике Alton O.a. и Joe« L.M. (1964) сыворотки крови следует инактивировать при температуре 5б-58°С в течение I часа. Ко в нашей стране была принята инактивация при 58 С в течение 30 мин., что, видимо, не обеспечивает полного разрушения комплемента.

Мы провели сравнительные исследования по термической обработке сывороток крови крупного рогатого скота при 58-59 С, 64 С

И 70°С в течение Т мин.

При проверке 12 проб сыворотки крови от животных из благополучных по бруцеллезу хозяйств отрицательные результаты РСК получены при всех режимах инактивации. Но при исследовании (в динамике) сывороток крови от 53 иммунизированных против бруцеллеза телок установлено, что через 10 дней после вакцинации в РСК 58-59°С у всех животных получен отрицательный результат, а в РСК 64°С положительно реагировали 11,3%. Чсроз 15 дней пологи-• тельные реакции, установлены соответственно у 32 и 41,5%, через 30 дней - у 49,0 и 69,^. Преимущества инактивации сывороток крови при 64°С отмечали до конца срока наблюдения (150 дней). Эти преимущества подтверждены при исследовании 69 животных после, экспериментального заражения вирулентной культурой штамма B.ubar-■ tun 54 (соответственно 47,8% и 63,8% положительно реагирующих), 50 животных из бруцеллезного изолятора и 27 голов крупного рогатого скота из эпизоотического очага с острым течением бруцеллеза (соответственно 36 и 44%; 37,0 и 59,2%).

На основе материалов экспериментальной и производственной проверки внесено и принято предложение о инактивировании сывороток крови крупного рогатого скота при температуре 64°С в течение 30 мии. -при постановке РСК (РДСК) в микрообъемах.

3.2.2. Унификация и автоматизация постановки РА, РСК и РДСК в микрообъемах!? Б последние годы в ряде стран широко используют ручные, полуавтоматические и автоматические системы для постановки и учета серологических реакций в шкрообъемах, что позволяет ускорить и упростить постановку реакций, значительно снизить рас-й Работа выполнена совместно о П.С.Уласеаичо:;. /..11 .-Кпи^о-ш?

А.А.Клочковым, И.В.Вочэротюй, O.O.lb.o-nr:; -л. • •

ход компонентов и общие затраты на проведение исследований. Предложенная та)о^зу о. (1955) ручная постановка реакций в микрообъемах впоследствии была автоматизирована (внесение компонентов, титрование, учет результатов).

Нами в 1975-1977 гг. разработаны методики постановки РА, РСК и РДСК в микрообъемах при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез. В реакциях использовали отечественные компоненты, в том числе стандартизованный нами цветной антиген для КР (при постановке РА). Были подобраны оптимальные ротимы инактивации сывороток крови для РСК и РДСК и отработаны другие пара- ■ метры постановки реакций. Для получения объективных результатов параллельно все сыворотки исследовали по общепринятой методике постановки РА, РСК и РДСК.

На основании положительных результатов исследований утверждены Наставления по постановке и учету РА, РСК и РДСК в микрообъемах при исследовании сывороток крови животных на бруцеллез

3.2.3. Разработка методики дифференциации неспецифических серологических реакций (РА) при исследовании сывороток крови на бруцеллез в благополучных хозяйствах." При контрольных проверках благополучных стад, особенно в весенний период, с сыворотками крови отдельных животных могут возникать неспеци<£ические серологические реакции на бруцеллез: у овец РА в титрах 25-100 МЕ/мл, у крупного рогатого скоза и лошадей 50-200 МЕ/мл. Такие реакции в 1988-1991 гг. мы отмечали в длительно благополучных по бруцеллезу хозяйствах Московской, Архангельской, Курской, Ивановской, Липецкой, ^льскбй и Тверской областей.

Возникновение неспецифических реакций может обусловливаться глубокой стельностью (суягностью), прививками против других болезней или носительством микроорганизмов, антигеннородственных с бруцеллами, и, возможно, рядом других причин. Обычно реагирующих животных сдают на убой, а в хозяйстве через 15-20 дней проводят дополнительные исследования.

Нами разработан простой метод исключения неспецифических реакций (РА) путей предварительной обработш бруцеллезного антигена хелаторои - двунатриевой солью этилендиамин-тетрауксусной кислоты (Тршгон "Б") в концентрации 10 мкмоль/л рабочего разведения антигена. При исследовании 1460. проб от вакцинированного ско-

.. Работа -выполнена .совместно; с-.В;С.Бфремовым; • А..Н,Касьяновым и 'Е.А'.Тягуниной* ' ....

та и животных из неблагополучных по бруцеллезу хозяйств показания РА в обычной постановке и с антигенам, обработанным трилоном "Б", оказались идентичными.

При исследовании поголовья из 9 благополучных по бруцеллезу ферм выявили 49 коров, с сыворотками крови которых получили положительные или сомнительные результаты РА в титре 25-200 ЦЕ/ыл. При переисследовании этих сывороток в РА с антигеном, обработанным трилоном "Б", результаты реакции во воех случаях оказались отрицательными. Реагировавшие животные были возвращены в стада, благополучие которых по бруцеллезу в дальнейшем сохранилось.

Предложенная методика была апробирована в установленном пороке. На основании материалов апробации утверждены "Методические рекомендации по дифференциации неспецифических серологических реакций (РА) при бруцеллезе животных в благополучных хозяйствах".

Внедрение методики в практику позволяет предотвращать неоправданные потери от сдачи продуктивных животных на убой и затраты на проведение ограничительных мероприятий.

3.2.4. Перспективность использования методов биотехнологии в целях совершенствования диагностики бруцеллеза животныхТрадиционные методы диагностики (РШ, PA, PGK (РДСК) не позволяют выявлять всех больных животных. Кроме того, с помощью этих методов обычно трудно определить истшиый эпизоотический статус стад в случае иммунизации животных противобруцеллезными вакцинами, поскольку в сыворотке крови длительное время сохраняются поствакцинальные антитела. Это препятствует оздоровлению вследствие невозможности точной дифференциации спонтанно ищЕшциро ванных и здоровых вакцинированных животных.

Учитывая сказанное, представляют особый интерес диагностические методы, основанные на обнаружении возбудителя в патологическом материале. Однако известные в этих целях иммунологические тесты (Салмаков K.M., Сахарова Р.Б., 1970; Иванов Н.П., Бельчен-ко В.В., 1977; Linet J.H. et al. , 1987, и др.) не совершенны и не вышли за рамки лабораторных испытаний. Это объясняется тем, что поликлональные антитела, используемые для выявления антиге-г нов бруцелл, неоднородны, не стандартизованы и, как уже отмечено, могут взаимодействовать с антигенами других бактерий. .Соот-

к Исследования по данному разделу выполнены совместно с Г.Й.Ко-роыысловым, А.К.Булашевым, С.Н.Боровиковым и В.А.Несмеяновым.

bgtctbehho необходима разработка и внедрение принципиально ноной технолопш получения диагностических препаратов, в частности на основе моноклональных антител.

Для разработки диагностических тест-систем, обеспсчиващих шявление специфических антигенов и антител, признана перспективно й гибрндомная техника. Это объясняется тем, что только с помощью этой техники становится возможным получение пнсокоспецифмч-ных антител к отделы мл антигенным детерминантам бактериальной клетки. Кроне того, моноклональные антитела (ШÍA), продуциру/змыэ изолированным клеточным клопом, однородны и, в отличие от поли-, клоналышх антител, обладают неизменной аффинностью. МКА взаимодействуют со строго определенным эпитопом патогена, вследствие чего их можно использовать для создания высокоспецифичоских и чувстпнтелышх бруцеллезных диагностикуиов. Математические модели (Марчук Г.И., 19-30) доказывают, что хронические инфекщш являются устойчивой формой иммунного реагирования организма, при которой ко1щентрация антигена чецо всего проявляет стационарную тенденцию к концентрации антител. IIa связывание и нейтрализацию антигенов затрагивается определенное количество антител, которыо непрерывно воспроизводятся иммунной системой. Устанавливается равновесие между приростом и злипшацией антигена. Есть основания предположить, что при латентном бруцеллезе в организме гивот-ного поддергивается популяция прочно заблокированных антител, которые вообще или почти tob взаимодействуют с антигеном в реакциях in Titro.

Соответственно, разработка окспсрсс-методов дифференциально'! диагностики, основанных на тцзикы?!« антигенов бруцолл пял продуктов их метаболизма в крога, молоко, т.!очэ и послеубойном биологическом .материале, представляется весьма актуальной задачей. Использование тшотх методов позволит выявлять инфицированных ."31ЕОТ1ШХ на разных этапах инфекционного процесса. Сам же факт наличия антигенов возбудителя в сыворотке (плазмо) крови или другом'биоматериало ис-оспорлмэ доказывает наличие инфекции. Таной подход к диагностике бруцеллеза ткпет ресить проблему неспецифических показаний рутшпшх методов и дифференциации спонтанно инфицированных от эдорогых, иидушзированных против бруцеллеза животных.

В последите годы стали известны работы зарубежных исследователей, направленные на получешге моноклональных антител к бак-

териям рода BruoelU и разработку на их основе методов диагностики бруцеллеза (eutherlane 8.8. . 1934; Chin J.C. et el.t 1989, и др.).

Нами, совместно с сотрудниками биотехнологического центра Целиноградского CX1Í и Института биоорганической химии им.Шемякина АН Рй, проведены исследования, направленные на получение МКА к антигенам бруцелл. Результаты этих исследований показали, что короткая схема' иммунизации мышей линии BALB/c поли-Б антигеном бруцелл вполне пригодна для получения значительного количества антителопродуцирущих гибридом. 25 (I2,2$) из полученных 205 гибридных клеток продуцировали антитела к детерминантам поли-Б антигена. По специфичности вырабатываемых антител полученные гибридо-ш условно разделиг■ на две группы. К первой группе отнесли клоны, синтезирующие антитела, в равной степени взаимодействуйте с антигенами бруцелл и иерсиний сероварианта 0:9 (22 клона), а ко второй - продуценты антител, специфичных только к антигенам бруцелл (3 клона). Из каждой группы отобрали по одной, наиболее активной и стабильной гибридоме (авторское наименование "ВША" и "БАМА")» продуцирующие антитела Ig G 2а класса, которые и использовали в дальнейшей работе. Для получения МКА'в препаративных количествах указанные гибридомы культивировали ta vivo в брюшной полости майей линии ВАШ/с,

Полученные МКА использовали прк разработке- экспресс-метода постановка "сэкдвич"-варианте, точечного твердофазного яммунофер-ментного анализа на- китроцеллюлозной бумаге (TRISA) и реакции латекс-агглютинации (микрометодом) для выявления антигеноЕ бруцелл т. экстрактах из лимфатических узлов к органов исследуемых животных. С этой целью бактериологически к методом TRISA исследовали 35 проб материала от пяти коров, экспериментально зараженных культурой зирулентного штамма бруцелл.'Культура бруцелл была выделена иг 20 объектов (28,6$) биологического материала от воех коров, е положительные результаты ТП1ФА (титр 1:64) получены с 17 экстрактам-; из этих объектов (48,6$). Антиген бруцелл выявлен ; >тодом ТПШ. э 9 пробах материала с отрицательным;: результатами бактериологического исследования к только 2 двух объектах при положительном результате бактериологического анализа выявить антиген бруцелл методом ТШФА не удалось,

При исследовании патологического материала в реакции латекс-агглютинации положительный результат получен с 28 пробош

из 55 (50,9/5), в то время как культура бруцелл была вцпелена только из 13 объектов (23,55о). В результате проведенных исследований разработаны экспресс-методы выявления бруцеллезного антигена в биоматериале, изготовлены и с положительным результатом испытаны в лабораторных условиях опытные партии наборов компонентов для диагностики бруцеллеза методом ТГОЭА и в реакции ла-токс-агглютинации на основе моноклональных антител. Однако полученные нами МКА не позволяют дифференцировать бруцэллы до вида, в связи с чем весьма перспективно получение штаммов гибридом, продуцирующих ША к каждому из трех основных видов бруцелл (аЬог-Ша, пвИЛвпо1о, ви1о ) и их 3-, 3-, Ь-формач. Использование таких НКА позволит значительно повысить надежность иммунофермен-тного и других методов определения антигена бруцелл и специфических антител при исследовании биологического материала на бруцеллез, на различных стадиях инфекционного процесса, и также п целях дифференциации больных от иммунизированных противобруцеллеэными вакцинами животных.

3.2.5. Противоэпизоотическая эффективность иммунизации крупного рогатого скота вакциной из штамма 19 в пониженных дозах." Для профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота в странах СНГ и за рубежом широко применяют вакцину из штамма В.аЬог*чз 19 в дозе 80-100 млрд. м.к. При этом в сыворотке крови животных длительное время сохраняются поствакцинальные антитела, препятствур-щие проведению диагностических исследований. По сообщениям зарубежных и отечественных авторов, установлено, что применение этой вакцины (подкожно' или на конъюнктиву) в пониженных дозах создает у животных иммунитет, не уступащий по эффекту полной дозе, но значительно сокращает сроки поствакцинальной серопозитивности.

С 1903 г. мы проводили экспериментальную проверку эффективности вакцины из шт.19 в дозе 3 млрд. м.к. при подкожном введении крупному рогато^ скоту. Положительные результаты проверки позволили перейти к производственному испытанию, которое проводилось в 1967-1991 гг. Испытание осуществлялось под нашим методическим руководством и при непосредственном участии в 57 хозяйствах Казахстана, Узбекистана, Кыргызстана и Дагестана, из кото-

{ Работ.а выполнена'Совместно с П.С.Уласевичем, М.П.Альбертяном, ' А.Н.Касьяновым; Р.Г.ЯгуМ^ыМ,. с" сотрудниками Казахского ШЭД, 'Узбекского ШВИ,>Киргизского *Ш0 по ветеринарии, Прикаспийского. ЖШ..''/' ' ' •' " " ' ' " ; ; ' ' " - '

ршс 43 хозяйства официально считались благополучными и 14 - неблагополучными по бруцеллезу. В этих хозяйствах за указанный период было вакцинировано более 158 тис.голов крупного рогатого скота, в т.ч. первично иммунизировано вакциной в полной (80 млрд. м.к.) дозе 61100 телок 4-5-месячного возраста и вакцинировано или ревакцинировано с использованием пониженной (3 млрд. м.к.) дозы 97700 телок перед случкой и коров.

Установлено, что применение вакцины в пониженных дозах для иммунизации и реиммунизации скота в неблагополучных стадах позволяет значительно снизить частоту клинических проявлений болезни» улучшить эпизоотическую обстановку и добиться оздоровления от бруцеллеза. За период испытания оздоровлено II хозяйств из 14 неблагополучных (7"',6%).

У первотелок, иммунизированных'первично (в возрасте 3-5 мае.) вакциной из шт.19 в полной дозе и ровакцинированнпх перед случкой пониженной дозой, поствакцннальные антитела в сыворотке крови не выявляются уже спустя 3 мес. после отела. При последующих ревакцинациях коров с использованием пониженной дозы вакци-поствакцинальные серологические реакции у отдельных животных сохраняются более длительно (до '¿-к и более лет), что затрудняет дифференциальную диагностику.

Наиболее перспективной представляется •ежегодная реиммушза-ция крупного рогатого скота вакциной из шт.19 в1пониженной дозе после предварительного исследования на бруцеллез и удаления .реагирующих.

Иммунизация 3-5-месячных телок вакциной из шт.19 в полной дозе с последующим (через 15-20 дней) исследованием сыворотки крови в РА или РШ позволяет выявлять и удалять из стада иммуно-толерантных и иммунодефицитных животных, как потенциально опасных носителей возбудителя бруцеллеза.

Полученные данные позволяют рекомендовать вакцицу из шт.19 в полной дозе для первичной иммунизации молодняка в возрасте 3-5 мес. и в пониженной дозе - для иммунизации и реиммунизации телок •тарших возрастов и коров.

Учитывая, что многократное подкожное введение вакцины из шт.19 даже в поганенных дозах обусловливает у отдельных животных длительное сохранение поствакцинальных серологических реакций, нами в экспериментах и ограниченных производственных опытах показана перспективность коньюнктивального метода введения вакцины в

юза 5 млрп. м.к. как для первичной прививки, так и для реиммуш-эации крупного рогатого скота.

Предварительные результаты.испытаний свидетельствуют, что юкьшктивальный метод иммунизации и реиммунизации значительно знижает проявление реактогенных свойств вакцины, обеспечивает :равнительно низкий уровень антител в сыворотке крови и быстрое угасание серологических реакций, создает иммунитет, не уступающий по напряженности иммунитету, возникалцему при подкожном молодо введения этой вакцины. Таким образом, перспективно и цело-¡ообразно проведение широкого производственного испытания кот- . зттивального спвсоба введения вакцины из шт. 19.

3.2.6. Усовершенствование схемы иммунизации мелкого рогатого скота против бруцеллеза и инфекционного эпидидимита вакци-юй из штамма Рев-1.н В системе мер борьбы с бруцеллезом овец и [Э баранов за рубежом и в большинство стран СНГ применяют вакци-iy из штамма B.solltendio Рев-*1. Однако при иммунизации и реим-[у1шзации этой вакциной в сыворотке крови взрослых животных дли-'олыюе время (дй 2-х п более лет) сохраняются поствакциналышз штнтела, препятствующие гфоведетю диагностических исследований, [о нашим данша и данным ряда других исследователей (Султанов I.A., 1985, 1992; Юсупов O.D., 1986; Касьянов А.Н. и др., 1989, : др.) этот недостаток можно устранить, если использовать вакця-у в пониженной дозе (2 млн. м.к.), что по данным экспериментов э снижает напряженность иммунитета. Эффективность иммунизации и жегодноЯ рснммунизоции пониженной дозой вакцины из пт.Рев-I с 587 г. пспытывалась в ряде областей, краев п республик СНГ. Так, хозяйствах 14 районов Дагестана ревакцинировано более I млн. вцсиаток, в 0 районах различных областей Казахстана - также боев I млн. животных, в т.ч. 422,4 йта. голов овец, находящихся в ичнои пользовании населения, в хозяйствах Таджикистана и Турк-егеш - более чем по 100 тко. голов овец.

Результаты испытаний показали, что в неблагополучных хозяй-rßax, где проводился производственный опыт, прекратились аборты руцеллозной этиологии, значительно снизилась заболеваемость и явственно улучшилась эпизоотическая обстановка.

Данные исследования выполнены совместно с П.С.Уласевичем, А.Н.Касьяновым, Р.Г.Ягудиным, с сотрудниками ШЭВ, ВНИИБШ, ВГНКИ, ИЭВСиДВ, Казахского НИШ, Прикаспийского ЗНИВИ, Таджикского НИШ, Туркменского ШИЖиВ.

Дэстигцуто оздоровление от бруцеллеза овец многих ранее неблагополучных хозяйств, в том числе 3-х хозяйств Таджикистана, где проводились строго контролируемые опыты.

Сохранилось благополучие во всех хозяйствах, угрожаемых по заносу возбудителя болезни. Снизилась заболеваемость лцпей бруцеллезом, что особенно заметно в Каскеленском районе Алма-Атинской области Казахстана, где все поголовье овец, принадлежащих населению было' иммунизировано вакциной из шт.Рев-I в пониженной розе.

Результаты исследований позволили разработать системы по профилактике и ликвидации бруцеллеза овец и ИЗ баранов с применением вакцины из шт.Рев-I в пониженных дозах. Эти системы внедрены в хозяйствах .захстана, Таджикистана и Туркменистана.

Применение вакцины из пгг .Рев-I в пониженных дозах обеспечивает поддержание напряженного иммунитета у взрослого поголовья аа счет ежегодных ревакцинаций.

Поствакцинальные серологические реакции у овцематок утрачивающей через б ыес. после реиммунизации» что позволяет серологически контролировать эпизоотическое состояние и озроравяивать отары путей удалбшя выявляемх больных ¡¡згботкых. Крсмо того, проводить профилактическую иммунизацию поголовья мелкого рогатого скота, принадлежащего населению.

4. ВШОДр

1. & системе мероприятий, по профилактике и.борьбе о ИЭ баранов необходимо использовать комплекс диагностических средств

и методов: серологические исследования (РА, РДСК, РИГА, ИЗА), аллергические пробы (внутрикожная или пальпебральная) с бруцел-' лоовином или бруцеллиноы БИЭ0, бактериологический метод (РНАт), клиническое обследова1ше (пальпация семенников и придатков ое-.' манников) и патологоанатомические данные.

2. В экспериментах и широком производственном опыте установлены специфичность и высокая диагностическая эффективность

гHPА и РНАт при ИЭ баранов. Разработан и внедрен в производств? набор препаратов для постановки указанных реакций,

3. Доказана целесообразность '¡замены' трудоемкого традиционно™ бактериологического исследования более чувствительным, простым по постановке экспресс-методом индикации возбудителя или

антигена в.orla в биологическом материале - реакцией нейтрализации антител (РНАт).

4. Выявление зараженных возбудителем ИЭ животных на ранней стадии инфекционного процесса обеспечивает пластинчатая реакция агглютинации с разработанным нами диагностикумом из B.orio.

5. Показаны специфичность и высокая чувствительность метода иммуноферментного анализа (ША) при диагностике инфекционного эпидидимита баранов. Внедрен в практику набор компонентов для постановки реакции.

6. Установлена целесообразность использования аллергического метода диагностики ИЗ баранов в качестве дополнительного к официально принятым серологическим методам. В качестве аллергенов рекомецпованы видоспецифический препарат - бруцеллоовин или. аллерген из инагглютиногенного штамма В.abortan I - бруцеллин ЕИЭВ.

7. Обоснована эффективность использования живой вакцины из штамма B.nelitenoio Рев-I в качестве средства специфической профилактики инфекционного эпидидимита баранов. Вакцина внедрена в практику в зонах неблагополучия по бруцеллезу овец.

8. Экспериментально Доказана высокая имцуногенность убитой адьювант-вакцины из штамма B.otío 64, рекомендованной для проиэ-_-водствегаюй апробации в целях иммунизации овец прртив ИЭ в хозяйствах, благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота.

9. Установлен оптимальный режим инактивации сывороток крови крупного рогатого скота при постановке РСК на бруцеллез -температура 64°С в течение 30 юга.

10. Разработана и внедрена в практику диагностики бруцеллеза животных унифицированная методика постановки серологических реакций в микрообьемах, позволяющая за счет автоматизации сократить затраты труда и в 10 раз расход компонентов.

11. Разработана и внедрена в практику методикй дифференциации неспецифических показаний РА, возникающих при исследовании сыворотки крови животных из благополучных по бруцеллезу хозяйств, что позволяет сохранить продуктивное поголовье и предотвратить ущерб, связанный с проведением карантинно-ограничительных мероприятий.

12. Получены два птамма гибридом, продуцирующих моноклональ-ные антитела к поли-Б антигену бруцелл. Штаммы депонированы во ВНИИ генетики (г.С.-Петербург) и защищены авторскими свидетельствами.

13. Разработаны специфичные и высокочувствительные методы выявления антигена бруцелл в патологическом материале от животных - точечный вариант твердофазного имыунофермэнтного анализа (ГПШ) и реакция латекс-агглютинации (РЛА) с использованием ыо-ноклональных антител. Эффективность ТИФА и РЛА значительно выше, чей при бактериологическом исследовании.

14. Разработана система иммунизации и реиммукиэации крупного рогатого 'скота против бруцеллеза, предусматривающая первичную иммунизацию 3-5-ыесячных телок вакциной из шт.19 в полной дозе (80 млрд. м.к.) и последующую ежегодную реиммунизацию этой жевакииной в пониженной дозе,(3 млрд. м.к.) или первичную имму-низацрш телок старше 5 мес. и коров вакциной в пониженной дозе. Использование вакц ш из шт.19 в пониженной дозе особенно эффективно для иммунизации и реиммунизации скота мясного направления в зонах неблагополучия, а также иммунизации животных, завезенных из благополучных регионов.-

15. В прямых экспериментах и ограниченных опытах, проведенных в благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах, показана целесообразность и иммунологическая эффективность конь-юннтивального метода иммуниэа^и крупного рогатого скота вакциной, из штамма 19 в дозе 5 млрд. м.к. в объеме 0,1 мл.

16. Разработаны и внедрены в хозяйствах Казахстана, Таджикистана и Туркменистана системы мероприятий по профилактике и ликвидации бруцеллеза мелкого рогатого скота и ИЭ баранов с применением вакщны из штамма Рев-1. Системы предусматривают ежегодную реиммунизацию поголовья вакциной в пониженной дозе и иммунизацию мелкого рогатого скота, принадлежащего населению.

17. В содружестве с сотрудниками других ветеринарных НИУ,

с учетом предложений специалистов практической ветеринарной службы, научно обоснована, разработана и внедрена комплексная Государственная система мероприятий по профилактике и оздоровлению поголовья сельскохозяйственных животных от бруцеллеза.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

По результатам проведенных исследований вновь разработано или пересмотрено 30 директивных и нормативных документов, .утвержденных ГУВ МСХ СССР, ГУВ Госагропрома СССР, ГУВ МСХ и продовольствия СССР, Минздравом СССР, Главветупром МСХ РФ или другим директивными органами в установленном порядке.

1. Инструкция о 'мероприятиях по профилактике и ликвидации бруцеллеза'животных (Утв.ГУВ МСХ СССР 30.12.82 г. и ГУВ Госагропрома СССР 10.11.88 г.).

2. Наставление по диагностике бруцеллеза животных (Утв.П'И МСХ СССР 30.12.82 г.).

3. Правила по охране рабочих.предприятий мясной промышленности от заражения бруцеллезом (Утв.ГУВ МСХ СССР 01.10.84 г., ГУКИ !13 СССР 20.08.84 г., ЦК профсоюзов рабочие пищевой промни-ленности 22.08.84 г. и Минмясомолпромом СССР 02.10.84 г.). •

4. Наставление по постановке и учету РА в кикрообгемах при диагностике бруцеллеза у животных (Утв.ГУВ МСХ СССР 22.11.77 г.).

5. Наставление по постановке и учету РСК п РДСК в мнкрообъ-смах при диагностике бруцеллеза у животных (Утв.ГУВ НСХ СССР 22.11.77 г.).

6. Наставление по применению вакцинц живой сухой из стаи ¡а 19 бруцелла абортус в малых дозад против бруцеллеза крупного рогатого скота (в порядке производственного испытания) (Утв.ГУВ Госагропрома СССР 21.II.86 г.).

7. Наставление по прйиоиепт ващпт живой сухой из пташа эев~1 бруцелла мелитензис в шшк дозах против бруцеллеза мелкого рогатого скота -(в пордпкэ производственного нсгщтшшя) (Утв. [ТВ Госагропрома СССР 21.11.86 г.).

8. Правила карантина на фор''ах, в хозяйствах, населешшх тунктах, районах, неблагополучных по заболеванию сельскохозяЛст-зешаи животных бруцоллеэоя и туберкулезом (Утв.ГУВ Госагропрогл ;ССР 30.01.87 г. К

9. Кошлексныо мероприятия ло оздоровлению животноводства :траш от- бруцеллеза п туберкулеза (НТС Госагропрома СССР, 1988 г.).

10. Наставление по применению вакцины живой сухой из гто'^м [9 бруцелла абортус против бруцеллеза крупного рогатого скота Утв.ГУВ Госагропрома СССР 10.11.88 г.).

11. Наставление по применению вакцины живой сухой из и? а) га ев-1 бруцелла меяитензнс для гп?!унизац1П1 овец и коз против бру-еллеэа и баранов против инфекционного зпидидтлиа (Утв.ГУВ Гос-гропро»«а СССР 10.11.08 г.).

12. Научно обоснованная система мероприятий по профилактике оздоровлению поголовья сельскохозяйственных кивотннх от бруизлела (Утв.ВАСХИШ 19Ю р.).

13. Иммунизация против бруцеллеза нетелей и половозрелых телок (Методические рекомендации) (Одобрены рабочей комиссией "Профилактика бруцеллеза и туберкулеза животных" Отделения ветеринарной медицины ВАСХНИЛ 28.06.90 г.).

14. Инструкция по изготовлению и контролю набора препаратов для диагностики инфекционного эпидидимита баранов в РИГА и РНАт (Утв.ГУВ ГКПЗ СМ СССР 01.11.90 г.).

15. Технические условия (ТУ 10.07.59-90) "Набор препаратоЕ для диагностики инфекционного эпидидимита баранов в РИГА и РНАтг (Утв.ГУВ ГКПЗ СМ СССР 01.11.90 г.).

16. Наставление по применению набора препаратов для диагностики инфекционного эпидидимита баранов в РНГА и РНАт (Утв. ГУВ ГКПЗ СМ СССР 01.11.90 г.).

17. Методические указания по постановке РНГА и РНАт для выявления антител в сыворотке крови и антигена бруцелла овис в биологическом материале (Утв.ГУВ ГКПЗ СМ СССР 01.11.90 г.).

18. Система профилактических и оздоровительных мероприятий от бруцеллеза мелкого рогатого скота и инфекционного эпидидимита баранов с применением закцины из штамма Рев-I в хозяйствах Таджикской ССР (Утв.ГУВ Г/ПК Тадж.ССР 23.04.90 г.).

19. Инструкция о мероприятиях по борьбе с бруцеллезом овей и коз (Утв.ГУВ ГКПЗ СМ СССР 23.05.91 г.).

20. Система профилактических и оздоровительных мероприятий от бруцеллеза мелкого рогатого скота и инфекционного эпидидимита баранов с применением вакцины из штамма Рев-I в хозяйствах Туркменской ССР (Утв.УВ МСХ ТССР 30.05.91 г.).

21. Система профилактических и оздоровительных мероприятий от бруцеллеза мелкого рогатого скота и инфекционного эпидидимита баранов с применением вакцины из штамма Рев-I бруцелла мелитензи в хозяйствах Казахской ССР (Утв.ГУВ МСХ и продовольствия Каз.ССР 12.II.91 г.).

22. Методические рекомендации по дифференциации неспецифических серологических реакций (РА) при бруцеллезе животных в бла гополучных хозяйствах (Утв.ГУВ МСХ и продовольствия С(ХР. 22.10.91 г.).

23. Наставление по диагностике инфекционной болезни овец, шпнпаемой Brucella ovia (инфекционный эпидидимит баранов) (Утв. ГУВ МСХ к продовольствия СССР 13.11.91 г.).

24. Инструкция по применению набора для диагностики бруцел-еза методом И$А на основе моноклональных антител (эксперимен-альная серия) (Утв.директорами ВИЭВ, ЦСХИ и ИБХ, 1991 г.).

• 25. Инструкция по изготовлению и контролю набора компонен-ов для диагностики инфекционного эпидидимита баранов методом им-уноферментного анализа (Утв.директорами ВИЭВ и ВГНКИ 06.11.91 г.).

26. Технические условия (ТУ 10.07.268-91) "Набор компонен-ов для диагностики инфекционного эпидидимита баранов методом им-уиоферментного анализа" (Утв.ГУВ МСХ и.продовольствия СССР

3.12.91 г.).

27. Инструкция по изготовлению и контролю вакцины живой су-эй против бруцеллеза мелкого рогатого скота из штамма бруцелла элитензис Рев-I (Утв.ГУВ МСХ и продовольствия СССР 15.II.91 г.),

28. Технические условия (ТУ 10-09-158-91) "Вакцина живая /хая против бруцеллеза.мелкого рогатого скота из штамма бруцел-

а мелитензис Рев-I" (Утв.ГУВ IJCX и продовольствия СССР 15.II.91 г.).

29. Наставление по применению набора компонентов для диаг-эстики инфекционного эпидидимита баранов методом иммунофермент-зго анализа (ИФА) (Утв.ГУВ МСХ Р35 03.06.92 г.).

30. Инструкция о мероприятиях по профилактике и ликвидации Секционной болезни, вызываемой Bruoella ovia (инфекционный эпи-1димит баранов) (Утв.ГУВ МСХ РФ 03.07.92 г.).

б. СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ■

1. Шумилов К.В., Ромахов В.А. Значение режима инактивации ¿вороток при постановке РСК на бруцеллез//Ветеринария. )? 6.

т. с.ni—112.

2. Орлов E.O.-, Клочков A.A., Круглов В.Т., Корьиков И.П., »махов В.А. Дальнейшей изучение особенностей ассимиляции бруцел-ши радиоактивного изотопа S35 сульфата натрия в целях возмож->сти дифференциации видов/УБюлл.ВИЭВ по спецтематике. Вып.1.

,, 1975. С.21-30.

3. Ромахов В.А. Изучение пластинчатой реакции агглютинации реакции непрямой гемагглютинации для диагностики инфекционного |идидимита баранов//Бюлл.ВИЭВ. Вып.26. М.,' 1976. С.80.

4. Орлов Е.С., Уласевич П.С., Щумилов К.В.| Касьччов А.Н., ючков A.A., Ромахов В.А. Усовершенствование средств"и методов

диагностики и специфической профилактики бруцеллеза//Тр.ВИЭВ. Т.44. BunЛ. И., 1976. С.40-50.

5. Орлов Е.С., Касьянов А.Н., Клочков A.A., Роыахов В.А.

О стабильности свойств возбудителя инфекционного эпидидимита ба-р&новУ/Гр.ВИЭЗ. Т.44. Вып.1. М., 1976. С.55-59.

6. Ромахов В.А., Аманжолов Е.А. Определение вирулентных свойств культур Бр.овис на морских сринках//Балл.ВИЭВ. Вып.28. Ii.,. 1977. С.26-31.

7. Роыахов В. А. Реакция непрямой гемагглютинации и реакция ' нейтрализации антител для диагностики инфекционного эпидидишта О'аранов//В сб. "Материалы научн.-произв.конф. по улучшению борьбы .с бруцеллезом и туберкулезом с.-х. животных в Казахстане", Кустала«, 1977. С.71-73.

.8. Роыахов В.я. Реакция непрямой гемагглютинации и реакщя нейтрализации антител при диагностике инфекционного эпидидимита баранов//Тр.ЕИЭВ. (Г.47. 1978. С.76-83.

9. Ниязов 7.Э., Ромахов В. А. Сравнительная оценка серологических методов диагностики инфекционного эпидидимита барановУ/Гр. ВПШИ. Т.30. Ы., 1980. C.I84-I9I.

10. Ромахов В.А. Метод .изготовления стойкого эритроцитарного диагностикума для РИГА цри 'инфекционном эпидидиыито баранов/УТр. ШЭВ. Т.51. П., 1980. С.40-44.

11. Касьянов А.Н., Ромахов В.А. Результаты изучения эпизоотологии, диагностики и специфической профилактики инфекционного эпидцпимита баранов//В сб. "Материалы Всесоюзной научной конференции", Омск, 1980. С.290-292. '

12. Уласевич П.С., Касьянов А.Н., Клочков A.A., Шумилов К.В. Роыахов В.А., Бочарова И.В. Методика постановки серологических реакций в микрообъемах при исследовании животных на бруцеллез/'/' Бюлл.ВИЭВ. Вып.42. М., 1981. С.58-63.

13. Уласевич П.С., Ромахов В,А. Перспективы вакцинации крупного рогатого скота малыми дозами штамма Бруцелла абортус 19П Сельское хозяйство за рубежом. № 6. Ы., 1983. С.47-50.

14. Ниязов У.Э.,. Ромахов В.А., Косилов И.А., Дегтяренко Л.В., Пианов Н.П., Руденко А.Ф. Испытание активности и специфичности ' антигенов для РДСК при диагностике инфекционного эпидидимита баране вУ/Тр.ШЭВ. Т.58. М., 1983. С.72-79. .

15. Ниязов У.Э., Щумилов K.B., Ромахов В.А., Косилов И.А., Иванов Н.П. Состояние и перспективы диагностики инфекционного эпидидимита баранов//Бюлл.ВИЭВ. Вып.51. М., 1983. С.56-60.

16. Шумилов К.В., Альбертян М.П., Клочков A.A., Ромахов В.А. Вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скотаУ/Ветеринарин.

I? 12. 1984. С.26-28.

17. Ромахов В.А., Ниязов У.Э., Шумилов К.В., Кириллов Л.В., Шаров А.Н., Борисович Ю.Ф., Борисова В.В. Эффективность сухого эритроцитарного диагностикума ВИЭВ-ВГНКИ для РИГА и РНАт при- диагностике инфекционного эпидидимита бараноз//Гр.ВДЭВ. Т.61. М., ■ IS84. С.30-37.

18. Щумилов К.В., Альбертян М.П., Клочков A.A., Ромахов В.А. Специфическая профилактика бруцеллеза крупного рогатого скота// Тр.ВГНКИ. М., 1984. С.8-14.

19. Плотников Э.С., Касьянов А.Н., Ромахов Б.А. Оздоровление крупного рогатого скота от бруцеллеза//1УВ МСХ СССР, листовка ВДНХ. И., "Агропрсиздат", 1985.

20. Касьянов А.Н., Маматова З.Б., Лим A.A., Ромахов В.Л. Выявление антител в крови Иммунизированных против бруцеллеза те-лок//Ветеринария. №7. М., 1986. C.29-3I.

21. Ниязов У.Э., Мельниченко Л.П., Шумилов К.В., Ромахов В.А. Иммунофлуоресценция при диагностике инфекционного эпидидимита баранов//Тр.ВГННИ. М., IS86. С.20-23.

22. Ромахов В.'А.,' Ниязов У.Э. Эффективность РНГА и РДГС при диагностике инфекционной болезни овец, вызываемой возбудителем бруцелла овис (инфекционный эпидидимит баранов)//В сб. "Современные проблемы профилактики зоонозцых болезней и пути их решения". Минск , 1987. C.I09-II0.

23. Касьянов А.Н., Ягудин Р.Г., Искандеров М.И., Ромахов В.А. Реактивность крупного рогатого скота при иммунизации против бруцеллеза малой дозой вакцины из штамма 19//Бюлл.ВИЭВ. Вып.64. М., 1987. С.59-65.

24. Ягудин Р.Г., Ромахов В.А., Мельниченко В.И., Минжасов К.И., Агафонкин Б.М., Куков П.Д., Шрамы D.O. Производственное испытание малой дозы вакцины из штамма 19 против бруцеллеза крупного рогатого скота в Кустанайской области//Магериалы Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация медицинской помощи больным". М., 1989. С.181-183.

25. Касьянов Л.H., Ромахов В.А. Проблема взаимосвязи бруцеллеза домашних и диких животных//Материалы ХП Всесоюзной, конференции по природной очаговости (тезисы докладов). Новосибирск, 1969. С.8Ь-вб.

26. Ниязов У.Э., Мельниченко Л.П., Ромахов В.А., Тягунина S.A., Хлыстунов А.Г. Перспективы применения иммуноферментного анализа при диагностике инфекционного эпидидимита баранов//Мате-риалы Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация медицинской помощи больным"..11., 1989. C.I4I-I42.

27. Мельниченко Л.П., Ниязов У.Э., Ромахов В.А. Сравнительная оценка серологических тестов для диагностики инфекционного эпидидимита баранов//Материалы Всесоюзной конференции "Актуальные вопросы профилактики бруцеллеза и организация медицинской помощи больным". Ы., 1989. С.142-144.

28. Андерсонс З.Э., Ромахов В.А., Ниязов У.Э., Дедзиньш А.®, Сравнительная эффективность различных методов диагностики инфекционной болезни овец, вызываемой BruoeHa от1в//В сб. "Профилактика и лечение молодняка в промышленном животноводстве". Рига, "Зинатне", 1989. C.97-I03.

29. Ромахов В.А., Альбертян М.П., Родионов C.B., Гринько

B.К., ЯраевР.Г., Назарова С.А., Данияров А.Д. Эпизоотологичес-кая эффективность вакцины из штамма 19 в малой дозе против бруцеллеза крупного рогатого скота в хозяйствах Самаркандской области Узбекской ССР//Материалы Всесоюзной конференции "Актуальные вопроси профилактики бруцеллеза и организация медицинской помощи больным". M., 1989. С.167-168.

30. Ромахов В.А., Ефремов B.C., Касьянов А.Н., Тягунина Е.А, Применение антигена, обработанного ЭДГА, при исследовании на бру-целлез//Ветеринария. № 3. M., 1990. С.25-27.

31. Ромахов В.А., Касьянов А.Н. Аллергическая диагностика инфекционного эпидидимита баранов//Бюлл.ШЭВ. Вып.73-74. П., 1990. С. 118-128. . . .;■;• . :

32. Булашев А.К., Ескендирова Ci3., Ромахов В.А.Касьянов A.U., Несмеянов В.А. Использование, мойоклональных антител в диагностике бруцеллеза животньйУ/Бюлл.ВИЭВ;.Вып.73-74. U,, 1990. •

C.{34-89. :.. ■ . •-.''-' ; .. : -V, , ' ' -' S3.- 'Альбертян. H.H., Ромахов Ъ'.к., Касьянов A.H.t Тягунина

Е.'А.. Ягудпн Р.Г., Слепцов Е.С., йумилов К.В. Иммуногенность вак-

из штаммов Br.abortus 19, 104 М к 82 для крупного рогатого кота при различных схемах применения//Еюлл.ИИЭВ. Вып.73-74. М,, 990. С.97-103.

• 34. Ромахов В.А., Касьянов А.Н., Альбертян U.U., Нгудин Р.Г., ягунина Е.А., Слепцов Е.С. Иммунологическая реактивность телят, олученных от коров, реиммуниэированных вакцинами из штампов Вг. bortuo 19, 104 Н и 82//Бюлл.ВИЭВ. Вып.73-74. М., 1990. C.I04-I08.

35. A.C. № 1604848 от 08.07.90 г. "Штамм гибридных культи-ируемых клеток животных Ыаа Huaoulue L. - продуцент моноклоналъ-ых антител к бактериям рода Brucella" (Целиноградский СХИ, ИБХ м.М.М.Шемякина, ВНИИ экспериментальной ветеринарии, авт.изобр. улашев А.К., Несмеянов В.А., Дмитриев А.З., Цуканов К.К., БаПту-аев Т.Т., Ромахов В.А., Касьянов А.Н., приоритет от 30.12.88 г.).

36. A.C. № 1604849 от 08.07.90 г. "Штамм гибридных культи-лруемых клеток животных Uuo Muaculuo ъ. , продуцируиций моникло-алыше антитела к бактериям рода'Brucella" (Целиноградский СХИ, ЗХ им.М.М.Шемякина, ВШИ экспериментальной ветеринарии, авт. зобр. Булашев А.К., Несмеянов В.А., Дмитриев A.Ö., Муканов К.К., айтубаев Т.Г., Ромахов, В.А., Касьянов А.Н., приоритет от 3.12.88 г.).

37. Ромахов В.А., Андерсонс З.Э. Совершенствование мер борь-1 с инфекционным эпидидимитом баранов в Латвийской республике// хтериалы Ш-eil Всесоюзной конференции по эпизоотологии (тезисы «ладов), Новосибирск, 1991., C.I78-I79.

38. Абулхаиров Г.Ш., Ромахов В.А. Антигенные и иимушгеннце юйства вакцинных препаратов бруцелл овечьего типа//Материалы ¡есоюэной научной конференции "Совершенствование методов госудщ:-■венного контроля ветеринарных препаратов" (тезисы доклидов).

, 1991. C.II6-II8,

39. Ниязов У.Э., Ромахов В.А., Шумилов К.В. Э^сктийи сть ¡итроцитарного диагноСтикуиа для РНГА и РНАт при ит'екциош идидимите баранов/Д1атериалы Всесоюзной научной Kuiijapi:iur.;; Ьвероенствование методов государственного коптела мсТь-ринар^п ■enapaTOD" (тезисы докладов). Ü., 1991. C.I2o-I2ö.

40. Булашев А.К., Боровиков СЛ., Лукин Ю.В., L</üc.j j.il., омеянов В.А., Ромахов В.А. Латексшй бруцвлиоэн^Н длясь.<.v;i.-£yM

ионоклоналышх антител//Вестник сельскохоэпйстn»m г.Я iv-ymt дл-хстана. № 4. А-Ата, 1991. С.76-79.

41. Ромахов В.А., Касьянов А.Н., Ягудин Р.Г., Ефремов B.C., Щумилов К.В., Иванов Н.П., Султанов A.A., Юсупов O.D., Хасанов Н.Х., Муминов A.M. Применение вакцины из штамма Рев-I в системе мер борьбы с бруцеллезом овец и инфекционным эпидидимитом баранов//Материалы Всесоюзной научной конференции "Совершенствование методов государственного контроля ветеринарных препаратов" (тезисы докладов). М., 1991. С.130-131.

42. Ромахов В.А., Тягунина Е.А., Мельниченко В.И., Абулхаи-ров Г.Ш., Ниязов У.Э., Мельниченко Л.П. Иммуноферментный анализ при диагностике инфекционного эпидидимита баранов//Материалы Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии (тезисы выступлений). Целиноград, 1991. С.131-132.

43. Булашев А.К., Боровиков С.Н., Ромахов В.А., Несмеянов В.А. Набор для диагностики бруцеллеза у крупного рогатого скота// Новости науки Казахстана. Экспресс-информация, приложение "Биотехнология". А-Ата, 1991. С.103-104.