Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.06) на тему:Разработка автоматизированных методов ДНК-диагностики эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного надзора

од

На правах рукописи

КВЯТКОВСКАЯ АЛЛА ЮРЬЕВНА

РАЗРАБОТКА АВТОМАТИЗИРОВАННЫХ МЕТОДОВ ДНК - ДИАГНОСТИКИ ЭШЕРИХИЙ И САЛЬМОНЕЛЛ В ОБЪЕКТАХ ВЕТЕРИНАРНО - САНИТАРНОГО НАДЗОРА

16. 00. 06 - Ветеринарная санитария и экология

16. 00. 08 - Гигиена животных, продуктов животноводства и ветеринарно - санитарная экспертиза.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва -1998

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском инсттуте ветеринарной санитарии, гигены и экологии.

Научные руководители доктор ветеринарных наук

В. А. Долгов, кандидат биологических наук В.В.Светличкин.

Официальные оппоненты доктор биологических наук Ю.А.Семилетов

(НИИ вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН),

кандидат биологических наук А.Б.Кононенко (ВНИИ ветеринарной санитарии, гигиены и экологии)

Ведущая организация - Московский государственный университет прикладной биотехнологии.

Защита состоится ""¿Р " .е^а^_ 1998г. в час на заседании

диссертационного совета Д.020.50.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте ветеринарной санитарии, гигиены и экологии. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной санитарии, гигиены и экологии (123022, Москва, Звенигородское шоссе, 5).

Автореферат разослан " " е^*Л- 1998г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук

Л.П.Пименова.

Показана возможность автоматизации разработанных методов ДНК-диагностики эшерихий и сальмонелл и созданы соответствующие тест-наборы для практического использования.

Практическая ценность и реализация результатов. На основании проведенных исследований разработаны "Методические рекомендации по ускоренному определению и идентификации жизнеспособных микроорганизмов в продуктах питания и кормах на основе ДНК - диагностики" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН, 1997г.).

Разработаны экспериментальные образцы тест - систем для определения E.coli с помощью ДНК - зондов, предназначенные для практического использования.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены на • Международной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственных продуктов" (Москва, 1997), на межлабораторном совещании научных сотрудников ВНИИВСГЭ (1998 г.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано три научные статьи.

Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, списка литературы и приложений.

Работа изложена на страницах машинописного текста,

иллюстрирована & таблицами и & рисунками. Список литературы включает •2-сэ источников отечественных и зарубежных авторов.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Материалы и методы исследований.

Работа проводилась в период с 1994 по 1997 год в лаборатории ветеринарно - санитарной экспертизы мяса, рыбы и других пищевых продуктов ВНИИВСГЭ, Институте микробиологии РАН, МГУ, а также в ГосНИИ Биологического Приборостроения.

Исследуемым материалом служили различные объекты ветеринарно -санитарного контроля (мясо, мясопродукты, корм, вода и воздух).

ДНК - зонды метили тритием по методу ник-трансляции (Маниатис Т. и др., 1984 г.), или биотином в процессе фотобиотинилирования (Сингатулина Э.Н., 1992 г.).

Полимеразную цепную реакцию проводили с использованием диагностического набора для выделения возбудителя сальмонелеза (Salmonella typhimurium) (НИИ экспериментальной микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи).

Микробиологический анализ исследуемых объектов проводили по общепринятым методам, изложенным в соответствующих ГОСТах.

В работе использовали устройство автоматизированного анализа биологических проб (Светличкин В.В и др., 1988 г.), а также переносной портативный жидкостной сцинтилляционный бета-счетчик производства ГосНИИБП.

Результаты исследований обрабатывали статистически с определением средней арифметической, среднего квадратичного отклонения и критерия достоверности.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода ускоренного обнаружения жизнеспособных бактерий на основе меченых предшественников синтеза ДНК in vivo.

В качестве экспериментального подхода при разработке метода нами использовались известные данные специфичности включения меченых предшественников синтеза ДНК in vivo и in vitro.

Неповрежденные-жизнеспособные клетки прокариот в качестве предшественников синтеза ДНК используют нуклеотиды и нуклеозиды, которые превращаются в непосредственные предшественники синтеза -нуклеозидтрифосфаты при наличии компартментированных ферментных систем. Вследствие этого при разрушении клеток и потери ими жизнеспособности при синтезе ДНК в качестве предшественников могут использоваться только дезоксинуклеозидтрифосфаты.

В свою очередь трифосфорилированные предшественники не проникают в клетку через мембрану бактерий.

На основании изложенного нами разработана следующая методика определения жизнеспособных клеток эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного и экологического контроля (рис. 1).

Аликвоты проб вносили в дифференциальные жидкие питательные среды, содержащие 3Н-тимидин и дезоксиаденозин. После инкубации в соответствующих условиях в течение 3-5 часов отбирали аликвоты проб и количественно переносили на мембранные фильтры с диаметром пор 0,45 мкм. Фильтры промывали по одной минуте четырехкратно 5%-раствором ТХУ и один раз этанолом, высушивали и определяли радиоактивность в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

В качестве отрицательного контроля использовали систему, содержащую

Объект исследования

Отбор проб .

в жидких дифференциальных -тимидином

Ускоренное выделение 3Н-ДНК

Идентификация живых микроорганизмов гибридизацией 3Н-ДНК исследуемой _пробы с иммобилизованными эталонными ДНК

Рис. 1. Схема ускоренного обнаружения и идентификации жизнеспособных бактерий.

Инкубация микроорганизмов средах с 3Н-

Обнаружение жизнеспособных клеток по уровню включения 3Н-тимидина в ТХУ-осадках

■ компоненты синтеза ДНК in vivo, в которую добавляли ТХУ перед внесением пробы с бактериями.

Радиоактивность фильтров за вычетом отрицательного контроля свидетельствовала о наличии жизнеспособных клеток.

Данный подход позволяет определять общую обсемененность объектов жизнеспособными бактериями.

В этом случае специфичность обусловлена только используемыми дифференциальными-питательными средами.

Для идентификации бактерий нами применялась методика гибридизации полученной в результате включения меченой 3Н-ДНК с предварительно иммобилизованными на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах эталонными ДНК бактерий.

При этом в качестве эталонных ДНК использовались как тотальные ДНК, так и специфичные нуклеотидные последовательности.

Меченая 3Н-ДНК выделялась по ускоренной схеме (Доля Е.А, 1997)иперед гибридизацией фрагментировалась ультразвуком или ДНКазой (Антонов A.C., 1980).

Гибридизацию на фильтрах проводили в течение трех часов в присутствии декстрансульфата.

Результаты, представленные в таблице 1, подтверждают известные данные об уровне гомологии ДНК внутри рода и между представителями разных с емейств (Медников Б.Н., 1978; Леванова Г.Ф., 1980) и свидетельствуют о возможности применения метода для идентификации жизнеспособных клеток сальмонелл и эшерихий.

Общее время анализа'составляло 8-10 часов. При использовании специфичных иммобилизованных нуклеотидных последовательностей метод позволяет проводить идентификацию в смесях без предварительного обогащения.

Таблица 1.

Степень гибридизации меченых реперных ДНК, выделенных из контаминированных объектов с тотальными эталонными ДНК (в%).

Иммобилизованные эталонные тотальные ДНК Степень гибридизации меченых реперных ДНК, в %

3Н-Е. coli 3H-Sal. typhimurium

Е. coli 100,0 32,5 ± 2,5

Sal. typhimurium 31,5 ± 2,0 100,0

Sal. dublin 30,5 ±2,5 91,0±3,0

Вас. subtilis 1,0±0,2 0

Ps. aerugenosa 0 0

Разработка фотометрического метода обнаружения эшерихий и сальмонелл на основе ДНК-гибридизации на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах.

С целью автоматизации анализа микробной обсемененности исследуемых объектов ветерииарно-санитарного надзора нами разработана методика фотометрического обнаружения эшерихий и сальмонелл на основе ДНК-гибридизации на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах.

Из объектов исследования выделялись бактериальные ДНК, их иммобилизовали на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах с диаметром пор 0,45 мкм в виде точек и проводили реакцию с биотинилированными ДНК-зондами.

После реакции с коньюгатом, субстратом и красителем фильтры осветляли и интенсивность окрашивания пятен измеряли на фотометре в проходящем свете.

В качестве контроля использовали ДНК, выделенные аналогичным способом из гомологичных и гетерологичных микроорганизмов, взятых в различных концентрациях.

По экстинкции точек контрольных и исследуемых проб определяли концентрацию микроорганизмов в исследуемых объектах.

Полученные данные о зависимости степени гибридизации от концентрации клеток в исследуемых объектах свидетельствуют о возможности количественной оценки микробных контаминации (рис. 2,3).

Разработка метода индикации сальмонелл на основе полимеразной цепной реакции с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами.

Классическая схема обнаружения возбудителей инфекций с помощью ПЦР включает выделение матричной ДНК, ее тщательную очистку, проведение ПЦР и разделение амплифицированных нуклеотидных последовательностей с помощью электрофореза.

С целью ускорения анализа и определения возможности количественной оценки нами разработана методика, включающая ускоренное выделение матричной ДНК из объектов исследования и проведение ПЦР в присутствии меченых тритием или биотином дезоксинуклеозидтрифосфатов.

Общая схема анализа представлена на рис. 4.

Из объектов исследований выделяли микроорганизмы и матричную ДНК.

В случае использования тритиевой метки амплификат исследовали по трем вариантам. В первом варианте осаждали амплификат на мембранных нитроцеллюлозных фильтрах 5% ТХУ кислотой с пирофосфатом натрия. Фильтры отмывали этим же раствором 5 раз по 1 минуте и определяли радиоактивность в жидкостном сцинтшшяционном счетчике.

Во втором варианте очистку амплификата от меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов осуществляли на колонках с сефадексом 0-25 (Маниатис, 1984) и определяли радиоактивность в тритон-толуоловом сцинтилляторе в жидкостном сцинтилляционном счетчике.

Е 500нм

-----Г""" 1 —Т-——1-Г—------Т~-——ч-—-г

1 г а * » б 7 Log концентрации клеток

Рис. 2. Зависимость гибридизации амплификационного биотилированного ДНК-зонда Sal. typhimurium от концентрации Sal. typhimurium в исследуемых объектах.

Е 500нм

В Контроль сорбции

88 Эталонные бактерии

□ Объекты твердой консистенции

□ Вода

В 8 оэ дух

234 5 6 7 L0g концентрации клеток

Рис. 3. Зависимость гибридизации биотилированного ДНК-зонда

Е.соН от концентрации E.coli в исследуемых объектах.

и

Рис. 4. Схема определения Sal. typhimurium амплификацией с 'Н или биотиншшрованными дезоксинуклеозидтрифосфатами.

В третьем варианте очищенный после сефадекса амплификат использовали в гибридизации с иммобилизованными эталонными ДНК.

При использовании биотиновой метки амплификат ДНК очищали на сефадексе и проводили гибридизацию с иммобилизованной эталонной ДНК с последующей реакцией с коньюгатом (вариант 4). Конечный результат определяли фотометрически.

Во всех вариантах показана специфичная реакция амплификации в гомологичной системе матричной ДНК и праймеров 8а1дурЫшигшт, и не наблюдалась реакция в гетерологичных системах матричных ДНК Е.соН или Вас.эиЫШз с праймерами 8а1.1урЫпшгшт.

Таким образом, нами разработано 4 варианта метода индикации микроорганизмов с использованием ПЦР меченых дезоксинуклеозидтрифосфатов.

Как показали исследования, данная методика позволяет проводить индикацию бактерий в смеси микроорганизмов (табл. 2). Чувствительность анализа составляла 102 клеток в пробе. Однако четких данных о зависимости чувствительности обнаружения бактерий указанным способом от концентрации клеток и, соответственно, концентрации матричной ДНК, позволяющей проводить количественную оценку, получено не было.

Автоматизация методов

Разработанные методы ДНК-диагностики эщерихий и сальмонелл включают в себя сходные операции предварительной обработки проб, дозирование ингредиентов тест-систем, термостатированной инкубации, иммобилизации на фильтрах, отмывки неспецифического связывания и детектирования конечного результата с помощью фотометра или жидкостного сцинтилляционного счетчика.

Таблица 2.

Обнаружение БаЫурЬтшпит в исследуемых объектах на основе ПЦР с использованием 3Н дезоксинуклеозидтрифосфатов (вариант 1).

Активность фильтров, имп.мин'1

№ Микроорганизмы V Исследуемые объекты

Модельная система Объекты твердой консистенции Вода Воздух

I 5а1.1урЫтилит 550.0+27.0 530.0+25.0 555.0+27.0 490.0+33.0

2 Е.соЬ 92.0±110 89.0+9.0 93.0+7.0 91.0+10.0

3 Вас.яиЬпШз 80.0+11.0 84.0±10.0 82.0+9.0 81.0+11.0

4 Полная смесь 570.0+32.0 525.0+29.0 565.0+31.0 500.0±32.0

5 • Смесь без 5г1.ЦрЫтипх]т 90.0±7.0 92.0+6.0 87.0+8.0 93.0±9.0

6 Контроль сорбции 85.0±5.О 87.0+7.0 85.0+6.0 86.0+8.0

Вследствие этого автоматизация методов может осуществляться при использовании общих приборов.

Для автоматизации ДНК-диагностики с применением тритиевой метки использовали экспериментальное устройство автоматического анализа. Устройство состоит из блока предварительной подготовки проб и блока детектирования.

Блок подготовки проб выполнен в виде термостатируемой камеры, внутри которой находятся сменные модули для твердых подложек (мембранных фильтров) или емкостей с растворами.

В сменных модулях проводятся операции предварительной обработки проб: фильтрация, термостатируемая инкубация, иммобилизация или фиксация на фильтрах.

В блок предварительной обработки проб входит система фильтрации и вакуумный насос. Все ингредиенты подаются с помощью автоматического дозатора с программным обеспечением.

После проведения всех операций в кюветы с фильтрами дозируется сцинтиллятор, и фильтры анализируются автоматическим фотоумножителем.

На приборе проводились операции очистки проб от дебриса, примесей и концентрирование бактерий с помощью фильтрации.

Автоматизация методов ускоренного обнаружения жизнеспособных бактерий на основе предшественников синтеза ДНК in vivo с помощью описанного устройства осуществлялась на стадиях инкубации клеток с меткой в термостатируемой камере, отмывки от неспецифической сорбции и регистрацию! конечного результата. Этот вариант метода определения общей обсемененности автоматизируется практически полностью.

В варианте идентификации жизнеспособных бактерий автоматизировали стадии гибридизации, отмывки непрореагировавших ДНК и регистрации конечного результата.

Для индикации сальмонелл и эшерихий с помощью специфичных 3Н ДНК зондов нами разработана модификация ускоренного метода ДНК гибридизации. Бактерии выделяли из объектов различной консистенции в жидкую среду и вносили в емкости блока предварительной обработки проб с помещенными на дно мембранными нитроцеллюлозными фильтрами.

Проводили лизис клеток, депротеинизацию и денатурацию ДНК по заданной программе, путем фильтрации иммобилизовали исследуемые ДНК на мембранные фильтры. Добавляли гибридизационный раствор и 3Н ДНК зонды. После гибридизации в заданных режимах проводили отмывку от неспецифичной сорбции путем фильтрации соответствующими растворами. Запорный клапан закрывали, фильтры подсушивали, в емкости добавляли сцинтиллятор и каждую ячейку анализировали с помощью фотоумножителей. Инкубация с соответствующими ингридиентами и их удаление регулировались с помощью запорных клапанов. Данная методика позволяла полностью автоматизировать индикацию бактерий.

Показана возможность проведения количественного анализа бактерий.

При использовании метода индикации сальмонелл на основе ПЦР с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами после проведения реакции в термоциклере амплификат переносили в сменные модули устройства, содержащие в качестве твердой подложки ватман 3 ММ, проводили отмывку от невключившихся дезоксинуклеозидтрифосфатов путем фильтрации ТХУ с пирофосфатом и определяли радиоактивность фильтров с помощью фотоумножителей.

Автоматизации подвержены все стадии варианта метода гибридизации амплификата с иммобилизованными эталонными ДНК.

При использовании биотинилированной метки с помощью данного устройства автоматизировалось незначительное число операций: инкубация с мечеными предшественниками, гибридизация ДНК и отмывка

неспецифического связывания. Этап регистрации конечного результата всех методов был автоматизирован фотометрией осветленных нитроцеллюлозных фильтров.

Автоматизация методов ДНК-диагностики показала возможность ускорить обнаружение и идентификацию сальмонелл и эшерихий в объектах ветеринарно -санитарного надзора, а также проводить количественную оценку и осуществлять архивацию данных.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что использование меченых предшественников синтеза ДНК in vivo дает возможность определять общую обсемененность жизнеспособными бактериями объектов ветеринарно-санитарного надзора в течение 3 - б часов.

2. Последующая гибридизация меченой in vivo 3Н ДНК с иммобилизованными эталонными ДНК позволяет проводить идентификацию эшерихий и сальмонелл до вида в течение 8-10 часов..

3. На основе точечной гибридизации с биотинилированными ДНК-зондами и осветления нитроцеллюлозных фильтров разработана методика фотометрического определения эшерихий и сальмонелл.

4. Разработана ускоренная модификация метода гибридизации на фильтрах с 3Н ДНК-зондами, пригодная для полной автоматизации, и созданы экспериментальные образцы тест - систем.

5. Показана возможность разработанных методов гибридизации с мечеными ДНК-зондами для количественного определения эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного надзора без предварительного обогащения и выделения чистых культур.

6. На основе полимеразной цепной реакции' с мечеными дезоксинуклеозидтрифосфатами разработаны четыре модификации метода

обнаружения Sal. typhimurium, позволяющие проводить автоматическую регистрацию конечного результата с помощью фотометра или жидкостного сцшггилляционного счетчика.

7. Сравнительная оценка результатов анализа, проведенного как с помощью разработанных нами ускоренных методов обнаружения эшерихий и сальмонелл на основе ДНК - диагностики, так и при'помощи общепринятых методов, показала высокую степень их корреляции.

8. Установлена возможность использования экспериментального устройства автоматического анализа проб для частичной или полной автоматизации разработанных нами методов ДНК-диагностики эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного надзора, что позволяет существенно облегчить проведение исследований и повысить их производительность.

ПРЕДЛОЖЕНИЯ ДЛЯ ПРАКТИКИ.

Материалы диссертации вошли в "Методические рекомендации по ускоренному определению и идентификации жизнеспособных микроорганизмов на основе ДНК - диагностики" (утверждены Отделением ветеринарной медицины РАСХН 15.04.97г.).

Для использования" в практике работы научно-исследовательских и научно-производственных учреждений и лабораторий могут быть рекомендованы разработанные нами методы и тест-наборы для ускоренной индикации эшерихий и сальмонелл в объектах ветеринарно-санитарного и экологического надзора.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ, 1. Долгов В.А., Светличкин В.В., Доля Е.А., Квятковская А.Ю.. К вопросу

создания и применения тест-систем на основе генного зондирования I практике ветеринарно-санитарной экспертизы.// Сб. н. трудов ВНИИВСГЭ. 1996, т.2, стр. 112-115.

2. Светличкин В.В., Долгов В.А., Хафизов Д.Ф., Доля Е.А., Квятковская А.Ю., Ускоренная индикация живых микроорганизмов на основе меченых предшественников синтеза нуклеиновых кислот и ДНК гибридизации.// Сб. н. Трудов ВНИИВСГЭ, 1997, т. 103, стр. 19-21.

3. Квятковская А.Ю. Индикация и идентификация микроорганизмов в продуктах питания, кормах и объектах окружающей среды методами ДНК- диагностики./Шатериалы 2-ой Международной конференции "Актуальные проблемы ветеринарной медицины и ветеринарно-санитарного контроля сельскохозяйственных продуктов", Москва. 1997.

ВНИИВСГЭ, 1998 г., г. Москва,

Звенигородское шоссе, 5. Заказ № ^^сР/'-С 80 экз.