Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Получение и оценка биологических свойств колицина E2

На правахрукописи

Тихонов ГЕОРГИЙ ИГОРЕВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ И ОЦЕНКА БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ КОЛ И ЦИ НА Е2

16.00.03. - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунологам 16.00.23 - биотехнология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2004

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К И. Скрябина».

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Девришов Давудай Абдулсемедович; кандидат ветеринарных наук Азямов Михаил Андреевич.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Интизаров Михаил Михайлович; доктор биологических наук, профессор Рубан Евгений Александрович.

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко (ВИЭВ).

Защита состоится 12 мая 2004 г. в 15.30 часов на заседании диссертационного совета Д 220.042.01 в Московской государственной академии ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина (109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23. Тел. (095) 377-93-83).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГАВМиБ

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Разработка эффективных и безопасных препаратов, предназначенных для животных при желудочно-кишечных болезнях, остается в настоящее время одной из актуальных проблем ветеринарной медицины. Широко применяемые с этой целью антибиотики вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикорезистент-ных штаммов микроорганизмов, развитие дисбиотических состояний кишечника, аллергические реакции, иммунодепрессию и др.

В связи с этим интерес представляет разработка новых антибактериальных препаратов, которые могли бы составить конкуренцию антибиотикам по эффективности, безопасности, отсутствию, побочного действия.

Такими препаратами, по сообщениям Гловера Д (1988), Харди.К (1990), Мейнелла Г. (1992) и др. являются колицины - антимикробные соединения, продуцируемые Е coli и родственными бактериями и активные против патогенных и условно-патогенных бактерий Почти все изученные до сих пор колицины представляют собой полипептиды с молекулярной массой от 90 до 1,5 кДа

Известно четыре механизма действия колицинов: образование каналов в плазматической мембране, через которые могут проходить ионы калия, водорода, что приводит к уменьшению мембранного потенциала и блокирует поглощение аминокислот; эндонуклеазная деградация ДНК; специфическое расщепление рибосомальной РНК, приводящее к подавлению белкового синтеза; подавление синтеза муреина, которое приводит к лизису клетки

Клетки, продуцирующие колицин, устойчивы к его летальному действию, благодаря синтезу низкомолекулярного белка иммунности, кодируемого Col-плазмидой. Эти белки иммунности секретируются из клеток-продуцентов в виде комплекса с колицином.

Учитывая полезные свойства колицинов, мы пришли к выводу, что при лечении и профилактике желудочно-кишечных болезней животных целесообразно применять препараты биологического происхождения, обладающие комбинированным антиоксидантным, антимикробным и иммуностимулирующим действием-

Цель и задачи исследований.

Целью настоящей работы являлось усовершенствование методов получения и очистки колицина Е2 и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных болезнях телят.

Для решения были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы получения и очистки колицина Е2.

2. Определить биологические свойства колицина Е2 in vivo и in vitro.

3. Изучить антибактериальную активность кол шипа П2 и и-^шении^ I патогенных и условно-патогенных микроорганизмо i.f0<~|

СП

о»

4. Оценить лечебно-профилактическую эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят.

5. Разработать рекомендации по применению колицина Е2.

Научная новизна..

Получен рекомбинантный штамм В subtills pBcolE2 - продуцент гибридного колицина Е2.

В результате проведенных исследований была изучена трансформация структурного гена Е. coli K12 в клетке бактерии В. subtilis Было установлено, что миниклетки, которые образуются при асимметричном делении мутантов Е. colt K12, не содержат геномную ДНК, но могут содержать плазмидную ДНК родительской клетки. При этом Col-плазмиды транслируются с образованием полипептидов

Установлено, что колицин Е2 состоит из двух полипептидных субъединиц *- собственно бактериоцина с молекулярной массой 68 кДа и белка иммуности с молекулярной массой 10 кДа. Колицин Е2 проникает через клеточные мембраны бактерий матричного штамма Е. coli K12, а также штаммов Pseudomonas, Salmonella, Haemophifus, Streptoccus, вызывает эндонуклеазную деградацию бактериальной ДНК, т е. не отличался видовой специфичностью при общей высокой бактерицидности.

Исследовано действие гибридного колицина Е2 на процесс инфицирования клеток культуры ПЭК герпес вируса третьего типа (штамм Румын) возбудителя инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Впервые проведена комплексная оценка возможности использования колицина Е2 в ветеринарной практике в качестве профилактического и терапевтического средства при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят.

Учитывая, что колицин Е2 является эффективным антибактериальным препаратом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, предложено применение колицина Е2 в комплексе с симптоматическими средствами лечения.

Практическая и теоретическая значимость работы.

Сконструирован гибридный штамм Bacillus subtilis pBColE2 - продуцент колицина Е2, обладающего антибактериальными и антиоксидант-ными свойствами. Штамм депонирован и зарегистрирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ГУ Зонального НИИСХ Северо-Востока им, Н В. Рудницкого под номером В-771.

Показано, что колицин Е2 обладает высокой лечебно-профилактической эффективностью» при острых желудочно-кишечных болезнях молодняка крупного рогатого скота

Установлено, что эффективной профилактической дозой колицина Е2 для телят является 20 мг на 10 кг живой массы при внутримышечном его применении в течение 4-6 дней. Терапевтический эффект для брльных новорожденных телят проявляется в дозе 20 мг на 10 кг веса при внутримышечном его применении в течение 6-8 дней.

4

Полученный колицин Е2 зарегистрирован Ветфармбиосоветом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ (протокол №3 от 06.06.2000 г. 001157-ОП).

Разработана схема применения препарата при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях сельскохозяйственных и домашних животных.

Составлено и утверждено временное наставление по применению колицина Е2 в ветеринарии (в порядке широких производственных испытаний 2001-2004 гг): Одобрено Ветфармбиосоветом Департ. ветеринарии Минсельхоза РФ (протокол №3 от 06.06.2000 г.) 001157-ОП. Утв. Департ. ветеринарии Минсельхоза России 12.03.2001 за № 13-403/0039.

Внедрена в производство схема применения колицина Е2 с профилактической и терапевтической целью.

Результаты изучения используются практическими ветеринарными врачами Российской Федерации при лечении и профилактике болезней животных.

Подготовлен и утвержден комплект нормативно-технической документации на препарат колицин Е2.

Разработаны практические рекомендации по использованию колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят.

Апробация работы: основные положения диссертации были доложены и обсуждены на IX и XI Международных ветеринарных конгрессах (Москва, 2001,2003); Международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтцфелда - Якоба и другие прионные болезни; листе-риоз, болезнь Ауэсжк болезнь Тешена» (Покров, 2001); Международной научной конференции «Актуальные проблемы развития животноводства» (Львов, 2003); научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования генетической цепи по конструированию штамма-продуцента колицина Е2, синтеза и очистки колицина Е2.

2. Результаты изучения биологических свойств препарата.

3. Результаты изучения лечебно-профилактического действия коли-цина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят.

Объек и структура диссертации. Основной текст работы изложен на 129 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, библиографического списка (103 отечественных и 35 зарубежных авторов), приложений. Диссертация иллюстрирована 21 таблицей и 12 рисунками.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Работа выполнена на базе НИЛИПиБ при МГАВМиБ им. К.И. Скрябина, лаборатории ветеринарной иммунологии ГУ Зональный НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого (г. Киров), а также хозяйств Московской, Воронежской и Кировской обл.

Рекомбинантный штамм В subtillis pBcolE2 получали по методу Youngman P с соавт. (1985). Донором плазмиды рСо!Е2-Р9, детерминирующей синтез колицина Е2, являлся штамм Е coll BZB 2125 Плаз-мида pBR322 использовалась в качестве основы для конструирования новых векторов.

В работе использовали колицин Е2, производства ГУ Зональный НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого, который представляет собой жидкий препарат белково-полипептидной природы с молекулярной массой 78 кДа

Опыты по определению острой токсичности колицина Е2 проводили на 300 беспородных белых мышах массой 18-20 г. Препарат вводили животным внутримышечно, в дозах от 500 до 34000 мг/кг ЛД50 вычисляли по методу Ашмарина И Пи Воробьева А А (1962)

Исследование кумулятивных свойств препарата проводили на 120 белых мышах по методу Улановой И.П (1970). Коэффициент кумуляции вычисляли по методу Каган Ю.С. и Станкевич В В. (1968).

Для выявления отдаленных последствий влияния колицина Е2 на организм животных исследовали эмбриотоксичность и тератогенность препарата на 160 беспородных белых мышах массой 18 -20 г

Мутагенную активность колицина Е2 определяли по методу Форда и Хамертона (1956) на 50 белых мышах линии С 57 .В 1/6

Определение влияния колицина Е2 на микроорганизмы проводили по методу Ковалева В. Ф. с соавт. (1988).

Лизоцимную активность колицина определяли по методу Дорофей-чук А Г. (1972), бактерицидную - по методу Чернушенко Е.Ф (1978).

Антиоксидантную активность колицина определяли в опытах на 80 телятах по содержанию продуктов окисления липидов по методу Коро-бейникова Э Н (1989) Активность супероксиддисмутазы определяли по методике С. Чевари с соавт. (1985).

Изучение действия колицина Е2 на организм здоровых телят провели на 100 животных 1-2-х месячного возраста. У телят брали кровь для исследования фагоцитарной, бактерицидной активности Сыворотки крови и гематологических показателей.

Изучение лечебно-профилактической эффективности колицина Е2 провели на 105 новорожденных телятах.

На первом этапе исследований сформировали 4 группы клинически ослабленных телят-аналогов 1-3-дневного возраста - по 10 голов в опытных группах, и 15 голов - в контрольной. Животным первой группы

колицин Е2 вводили по 20 мг/10 кг живой массы 1 раз в день в течение 4 дней, внутримышечно; животным второй группы - 20 мг/10 кг 1 раз в день внутримышечно в течение 5 дней; животным третьей группы - 20 мг/10 кг 1 раз в день внутримышечно в течение 6 дней. Телятам контрольной группы вводили физраствор.

Срок наблюдения за клиническим состоянием телят составлял 20 дней. Профилактическая эффективность колицина Е2 оценивалось по общему состоянию телят, отсутствию или наличию и характеру диареи, характеру температурной реакции.

На втором этапе исследований было создано 2 группы телят-аналогов - опытная и контрольная, по 25 и 15 голов, соответственно. -

Телятам опытной группы с профилактической целью внутримышечно вводили колицин Е2 шестикратно, 1 раз в день .(через 2 часа после рождения, а затем 5 дней подряд), из расчета 20 мг препарата на 10 кг живой массы. Телятам контрольной группы с профилактической целью никаких препаратов.не применяли.

Для оценки терапевтической эффективности колицина было сформировано 2 группы телят, по 25 голов в каждой, у которых отмечали диарею, повышение температуры тела, угнетение, отказ от корма. Телята опытной группы получали колицин Е2 в дозе 20 мг/10 кг живой массы внутримышечно 1 раз в день в течение 6 суток.

У телят опытных и контрольных групп определяли гематологические показатели по общепринятой методике и проводили количественный и качественный учет микроорганизмов фекалий в соответствии с методическими рекомендациями по выделению и идентификации условно-патогенных энтеробактерий и сальмонелл при острых кишечных заболеваниях молодняка сельскохозяйственных животных (1990).

Действие колицина на бактериальные клетки патогенных и условно-патогенных микроорганизмов изучали с помощью методов электронной микроскопии.

Антибиотикочувствительность и колициночувствительность выделенных микроорганизмов определяли диско - диффузионным методом.

Статистическая обработка полученных данных проведена с помощью стандартных программ на ПЭВМ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Получение рекомбинантного штамма B.subtilis pBcolE2 -продуцента гибридного колицина Е2

С помощью генно-инженерных методов нами сконструирован штамм ВасШиэ виЬШв, продуцирующий колицин Е2.

На первом этапе была сконструирована гибридная плазмида рВСо1Е2. Хозяином исходной плазмиды рСо!Е2-Р9 являлся штамм Е.соН ВгВ 2125.

Рестрикцию сайта РБ^, детерминирующего устойчивость к ампициллину, проводили ферментом ЕсоЯ1.

7

В результате была получена неконъюгативная и немобилизуемая плазмида рВСо1Е2, детерминирующая синтез колицина Е2 штаммом В. subtilis.

На втором этапе осуществляли получение плазмидного клона В^МНв, который содержит участок геномной ДНК Е. coli K12. Для этого осуществляли лигирование продуктов расщепления при низкой концентрации ДНК Е. coli для перевода фрагментов в кольцевую форму и дальнейшей трансформации в штамм Bacillus subtilis.

Рекомбинационную интеграцию последовательностей pBR322 в геномную вставку Тп 917 В; subtilis проводили по методике Youngman P., ZuberP., Perkins J.B.

На рис. 1 показана схема получения плазмидного клона в В. subtilis, который содержит участок геномной ДНК E.coli.

-I pBR322 Г

ШШ&

EcoRI EcoRI

___ _JT \

Геномная Геномная

ДНК ДНК

Расщепление EcoRI Лигирование в разбавленном растворе Трансформация Bacillus subtilis .Отбор колоний Арг

' г

Рис.1. Получение плазмидного клона B.subtilis, содержащего участок геномной ДНК E.coli К12

В результате проведенных исследований был получен рекомби-нантный штамм B.subtilis pBcolE2, по морфологическим и биохимическим свойствам не отличающийся от исходного, устойчивый к ампициллину в концентрациях до 120 мкг/мл, тетрациклину - до 170 мкг/мл и бриллиантовой зелени - до 70 мг/мл, соответственно.

В процессе культивирования B.subtilis pBcolE2 гибридные белки высвобождаются в среду, облегчая быструю очистку больших количеств колицина Е2. Выход гибридного колицина составляет до 10 мг/мл.

Гибридный колицин Е2 имеет молекулярную массу 78 кДа и состоит из двух полипептидных субъединиц - собственно бактериоцина с молекулярной массой 68 кДа и белка иммунности с молекулярной массой 10 кДа.

Для выделения колицина Е2 матричный штамм культуры выращивали на специально подобранной питательной среде в течение 24 часов при 37°С при отработанных режимах аэрации и соответствующей скорости вращения мешалки.

В результате проведенных исследований было установлено, что гибридный колицин содержит активные и неактивные фракции. Актив-

ные фракции колицина Е2 с белком иммунности молекулярным весом 78 кДа обладают высокой р-галактозидазной и бактерицидной активностью.

Оценка биологических свойств колицина Е2

Определение острой токсичности колицина Е2.

Для определения острой токсичности колицина Е2 препарат вводили мышам внутримышечно, в нарастающих дозах - от 500 до 34000 мг/кг(табл. 1)

1. Результаты исследования острой токсичности колицина Е2

№ Количество Доза, Выжило Погибло

группы животных (мг/кг) Гол % Гол %

1 30 500 30 100 0 0

2 30 1000 30 100 0 0

3 30 4000 30 100 0 0

4 30 8000 18 60 12 40

5 30 12000 15 50 15 50

6 30 16000 10 33,3 20 66,7

7 • 30 22000 9 30 21 70

8 30 28000 1 3.3 29 96

9 30 34000 0 0- 30 100

Контроль 30 - 30 100 0 0

Было установлено, что в группах животных, которым вводили коли-цин Е2 в дозах от 500 до 4000 мг/мл, гибель их не отмечалась. Отказ от корма и воды, угнетение, снижение двигательной активности, нарушение функции желудочно-кишечного тракта выявлены в группах, где животные получали 8000-34000 мг/кг колицина Е2, гибель животных наступала через 72 часа. При вскрытии павших животных отмечали катаральное воспаление слизистой оболочки кишечника, кровенаполнение печени, почек, органов дыхания, пищеварения и сердца.

Таким образом, колицин Е2 в дозах до 4000 мг/кг не вызывает отклонений в поведении и клиническом состоянии животных.

При исследовании состояния внутренних органов на семи поперечных разрезах плода, как и при исследовании скелета, не выявлено отклонений от нормы (табл. 2).

2. Влияние колицина Е2 на состояние плодов в ходе беременности белых мышей

Доза пре-па-рата, мг/кг Тератогенное действие

Состояние внутренних органов Внешний осмотр

Количество плодов Токсическая дистрофия печени Количество плодов Аномалии

Абс. кол-во % Абс кол-во %

1276 71 1 1,40 105 1 0,95

638 87 1 1,15 107 1 0,93

127 70 1 1,42 99 2 2,02

Контроль 69 1 1,44 93 2 2,15

Показателем тератогенности служило число плодов с уродствами (в процентах по отношению к общему числу живых плодов). Количество случаев аномалий развития плодов как в опыте, так и в контроле не превышало физиологической нормы.

Второй этап - исследование влияния колицина Е2 на постнатальное развитие мышат. В результате проведенных исследований было установлено, что общая эмбриональная смертность мышей в опытных группах была в 2 раза ниже, чем в контрольной.

Исследование фармакологической активности колицина Е2.

Данные, полученные при введении колицина Е2 в разных дозах белым мышам показали, что все исследуемые дозы способствуют повышению бактерицидной активности сыворотки крови (табл. 3).

Наилучшие показатели были в группе животных, которым вводили колицин Е2 в дозе 10,0 мг/кг. Эта доза обеспечивала наибольший процент увеличения бактерицидной и фагоцитарной активности.

3. Влияние колицина Е2 на бактерицидную и фагоцитарную активность сыворотки крови и лейкоцитов белых мышей -

Препарат Доза, мг/кг Бактерицидная активность, % Фагоцитарная активность после окончания опыта

до начала опыта после окончания опыта Фагоцитарный индекс Фагоцитирующие лейкоциты, %

Колицин Е2 5,0 17,5±4,4 18,5±1,6 2,21±0,31 30,3±1,27

Колицин Е2 10,0 24,7+2,1 2,73±0,34 37,4±1,51

Колицин Е2 15,0 23,5±0,8 2,76±0 37 35,8±0,98

Цилудин 2,0 21,7+2,2 2,79±0,4 37,0±1,10

Контроль - 18,0±1,6 2,4±0,23 30,5±1,2

Аналогичные результаты получены и при исследовании лизоцимной активности сыворотки крови (табл. 4).

4. Влияние колицина Е2 на лизоцимную активность сыворотки крови белых мышей

Препарат Доза, мг/кг Лизоцимная активность, %

до постановки опыта после постановки опыта

Колицин Е2 5,0 22,7±2,1 27,6±2,2

Колицин Е2 10,0 24,0±1,5 30,5±2,0

Колицин Е2 15,0 22,6,1 ±2,0 25,3±0,9

Цилудин 2,0 21,4±3,1 24,3±2,0

Контроль - 23,1±1,2 23,8±2,3

Лизоцимная активность сыворотки крови была достоверно выше у мышей, которым вводили колицин Е2 в дозе 10,0 мг/кг.

Действие колицина Е2 на бактериальные клетки изучали методом негативного контрастирования в электронном микроскопе марки IEM-

10

100СХ, при увеличении 50000 (рис 2)

При исследовании антибактериальной активности препарата установили, что минимальная подавляющая концентрация колицина находится в пределах 5,8 -10,2 мкг/мл для тест-культуры Р aeroginosa Habs 01 и 2,44 - 3,91 мкг/мл - для тест-культуры Е coll АТСС 25922.

Рис 2. Действие колицина Е2 на проницаемость клеточной

стенки Pseudomonas aeruginosa. Заметно разрушение клеточной стенки бактерии и нарушение ее проницаемости

Активность колицина в отношении тест-штаммов бактерий представлена на рис 3

Рис.3 Активность колицина Е2 in vitro в отношении тест-штаммов микроорганизмов

После внутримышечного введения колицина Е2 пятидневным телятам в дозе 20,0 мг/кг уровень гемоглобина повысился на 18,0 ±2,0 «7л, бактерицидная активность повысилась на 5,2% активность (J-лизинов увеличилась на 2%, по сравнению с контролем (табл 5)

11

5. Профилактическая эффективность колицина Е2 при смешанных инфекциях

Группа, количество голов Заболело ОРЗ Заболело ЖКИ Дин неспецис амика показателей зической резистентности

голов г? ГОЛОВ г? Бактерицидная активность, % Процент фагоцитоза Лизоцимная активность, %

до начала после окончания до начала после окончания до начала после окончания

Опыт, 50 1 2,0 0 0 см со" -н ю см 33,5+3,4 57,3±5,5 71,5±6,6 23,8±2,1 со +1 (N1 со

Контроль, 50 7 14,0 8 16,0 26,7±2,0 22,5±5,0 59,0±6,1 В3,7±6,2 23,0±2,2 24,3±3,0

У 25-дневных телят после введения препарата содержание Т-лимфоцитов увеличилось на 9%, а общая фагоцитарная активность - на 1,9%, соответственно, по сравнению с контролем. При этом сохранность телят повысилась на 45%.

Профилактическая эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят составила 100%, при острых респираторных заболеваниях - 98 %.

В опытной группе заболеваемость животных снизилась, в целом, на 28%, бактерицидная активность сыворотки крови у телят опытной группы увеличилась на 6 %, фагоцитарная - на 14,2%, лизоцимная - на 8,5%

Процент фагоцитирующих лейкоцитов у телят опытной группы после окончания опыта возрос до 70,Ш7-,5 % (Р £ 0,05). В контрольной группе эти показатели составляли, соответственно, 59,2±5,3 и 62,7±6,0 %. Лизоцимная активность у телят опытной группы после окончания эксперимента возросла на 35,7 %, количество гемоглобина - на 11,8 и 6,41 %, соответственно, по сравнению с контролем.

У телят опытной группы прирост живой массы увеличился на 5,7%, по сравнению с контролем. После четырёхкратного введения колицина телятам в дозе 20,0 мг/кг, через 30 суток животные достигали физиологического развития возрастных аналогов.

При анализе гематологических показателей экспериментальных животных следует отметить, что количество гемоглобина у телят опытной группы при ЖКИ увеличивалось на 12,3%, при ОРЗ содержание гемоглобина увеличивалось на 12,6%, по сравнению с контролем.-

Результаты опыта по определению зависимости динамики состояния организма ослабленных телят от кратности применения колицина Е2 представлены на рис. 4.

Продолжительность болезни, сут.

Среди телят, получавших колицин Е2 в течение 5 дней, наблюдалось кратковременное расстройство пищеварения в первые 1-2 дня после окончания применения препарата.

У телят третьей группы, получавших колицин Е2 в течение 6 дней, профилактическая эффективность составила 100 %, в то время как в контрольной группе наблюдалось развитие диареи средней и тяжелой степени тяжести в ЮО-% случаев. На 2-5 сутки жизни развивалась дна рея с клиническими признаками интоксикации и длилась 5-7 суток, один теленок пал.

У телят контрольной группы продолжительность болезни, в среднем, составила около 6 сут.

При последующем наблюдении в течение месяца во всех случаях дисфункций кишечника у телят опытных групп не отмечалось.

Таким образом, колицин Е2 обладает высокой профилактической и терапевтической эффективностью при ЖКИ и ОРЗ.

Антиоксидантная активность колицина Е2 in vitro.

Антиоксидантная активность колицина Е2 изучалась в опытах по влиянию препарата на процесс инфицирования клеток в культуре почек эмбриона коровы (ПЭК) герпес-вирусом штамма "Румын" - возбудителя инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Было установлено, что колицин в концентрациях 5, 10, 15 и 20 мкг на 1 мл значительно замедлял и ослаблял процесс дегенерации зараженной культуры клеток и не вызывал процесса отслоения клеточной культуры, что свидетельствовало о способности исследуемого антиок-

сиданта тормозить процесс вирусного инфицирования в культуре. Оптимальными концентрациями колицина по его способности тормозить процесс инфицирования зараженной герпес-вирусом культуры клеток ПЭК являлись 15 и 20 мкг.

В контроле наблюдали дегенерацию клеток ПЭК, зараженных герпес-вирусом, которая начиналась с периферии клеточного пласта и характеризовалась поражением вирусом клеток на 3 сутки. Клетки принимали звездообразную форму и группировались в виде плоских синцитий, содержащих по 10-25 ядер. На 4 сутки после заражения дегене-рированный клеточный пласт отслаивался в виде крупных хлопьев.

Следовательно, колицин Е2 является активным ингибитором процесса инфицирования клеток ПЭК вирусом. Наблюдалось возрастание ТЦДбо для клеток, обработанных колицином в разных концентрациях, по сравнению с контрольными зараженными культурами, соответственно, в 100, 300, 450 и 520 раз.

Полученные данные представляют интерес для изучения возможности применения колицина в качестве препарата для борьбы с вирусными заболеваниями животных.

При исследовании 150 проб сывороток крови крупного рогатого скота хемилюминесцентным способом было установлено, что при температуре 39,0°С проявляется минимальный антиоксидантный эффект колицина, который увеличивается пропорционально повышению температуры, а при достижении концентрации 20 мг максимальное антиокислительное действие начинает проявляться уже при 37,0°С.

Было установлено, что колицин Е2 в дозе 20 мкг/мл значительно повышал количество перекиси водорода в лейкоцитах, подавлял образование внеклеточных и стимулировал образование внутриклеточных активных форм кислорода, от которых зависит гибель бактерий в лейкоцитах, что указывает на положительный эффект колицина Е2, т. к. повышение уровня перекиси водорода в клетках крови ведет к образованию "лерекисного взрыва" в лейкоцитах, что влечет за собой быструю гибель фагоцитированных бактерий различных видов

Таким образом, мы установили, что механизм действия колицина Е2, в отличие от обычных колицинов, состоит не только в разрушении оболочки бактериальных клеток и эндонуклеазной деградации нуклеиновых кислот микроорганизмов, но и в образовании "перекисного взрыва" в лейкоцитах организма животных, что вызывает гибель как нефа-гоцитированных, так и фагоцитированных бактерий. Кроме того, под действием колицина Е2, образование внутриклеточных активных форм кислорода лежит в основе повышения бактерицидной активности лейкоцитов здоровых животных.

Антиоксидантная и иммуногенная активность колицина Е2 в производственном опыте.

Для определения антиоксидантной и иммуногенной активности колицина были сформированы 2 группы телят разного возраста - опыт-

ная (87 голов) и контрольная (56 голов), у которых наблюдались признаки респираторных и желудочно-кишечных болезней

Телят контрольной группы лечили симптоматически орально растворами Лерса и Стартина, сердечно-сосудистыми средствами (кокар-боксилазой, кофеином), применяли гентамицин и линкоспектин, а также сыворотку против колибактериоза, в соответствии с наставлениями Телятам опытной группы вводили колицин в дозе 20 мг на 10 кг веса внутримышечно 1 раз в сутки в течение 3-5 суток, и сыворотку против колибактериоза

В контрольной группе на 5 сутки пало 12 телят, в опытной - 1 теленок. Средняя продолжительность заболевания в контрольной группе составила 14,5 дней, в опытной - 3,8 дней. На 20-е сутки после лечения в контрольной группе наблюдались рецидивы болезни у 5 животных.

У телят контрольной группы уровень альбумина был 28 %, а в опытной группе - 47 %, количество супероксиддисмутазы в сыворотке крови телят опытной группы составило 184 ЕД, в контрольной группе - всего лишь 32 ЕД, что указывает на серьезные нарушения антиоксидантной системы организма Применение колицина не снижало титров антител против Е coli и ротовируса телят

У телят опытной группы уровень Ig класса G1 в сыворотке крови, в среднем, повысился на 1,6 г/л, Ig G2- на 2,0 г/л (Р<0,05) Количество гемоглобина у телят опытной группы увеличивалось, в среднем, на 12,3 %, по сравнению с контролем.

На основании полученных результатов нами было сделано закгю-чение, что колицин обладает антиоксидантным и иммуностимулирующим действием на организм телят и сокращает сроки лечения животных.

Определение профилактической эффективности колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят

Для определения профилактической эффективности колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят были сформированы 2 группы телят-аналогов - опытная и контрольная, по 25 и 15 голов, соответственно Телятам опытной группы внутримышечно вводили колицин Е2 шестикратно, 1 раз в день, из расчета 20 мг препарата на 10 кг живой массы Телятам контрольной группы с профилактической целью никаких препаратов не применяли

В результате проведенных исследований было установлено, что использование колицина Е2 обеспечивало 100%-ный профилактический эффект при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят (табл 6)

6. Профилактическая эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят-

Na ¡Группа пп Ькивотных Кол-во животных, гол Доза (мг/10 кг) ¡Продолжительность курса, сут Заболело Профилактическая эффективность, %

голов %

1 Опытная 25 20 6 - - 100

- Контрольная 15 - - 7 46,7 -

Телята опытной группы хорошо развивались, имели блестящий шерстный покров, были более активными в поведении и приеме корма, что подтверждается результатами контрольного взвешивания телят. У телят опытной группы привесы составили от 310,0 до 450,0 г в сутки, тогда как у телят контрольной группы привесы не превышали 230,0 г (от 180,0 до 230,0).

Из 15 телят контрольной группы заболело 7 голов на 2-3 сутки по^е начала постановки опыта. У больных телят отмечалась диарея, обезвоживание организма, угнетение, отсутствие аппетита. Заболеваемость телят контрольной группы составила 46, 7 %.

У телят опытной группы на 3 день с начала постановки опыта обнаруживали P.vulgaris в концентрации 106 м.к., однако к 14 дню исследований эти бактерии элиминировали из кишечника, а количество лакто- и бифидобактерий возрастало до 109.-1010 м к./г фекалий. У телят контрольной группы обнаруживали энтеропатогенные штаммы Е. coli в концентрации 107 м.к, P.vulgaris, К pneumonia, C.freundii на фоне дефицита лакто- и бифидобактерий.

Таким образом, профилактическая эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят составила 100%, при введении его в дозе 20 мг/10 кг 1 раз в день в течение 6 дней подряд. Препарат способствует элиминации из желудочно-кишечного тракта телят патогенных и условно-патогенных микроорганизмов и не инги-бирует рост и размножение полезных бактерий.

Оценка терапевтической эффективности колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят

Для определения терапевтической эффективности колицина Е2 были сформированы 2 группы телят-аналогов - опытная и контрольная, по 25 голов в каждой.

В опытную и контрольную группы отбирались телята 2-5-дневного возраста, у которых отмечались признаки диареи.

Телятам опытной группы внутримышечно вводили колицин Е2 из расчета 20 мг препарата на 10 кг живой массы, 1 раз в день 6 дней подряд. Телятам контрольной группы с лечебной целью применяли гента-мицин, согласно наставлению (табл. 7).

7. Терапевтическая эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят

№ пп Группа животных Кол-во животных, гол Выздоровело Длительность болезни, сут. Терап. эффективность, %

голов %

1. Опытная 25 23 92,0 5 92

2. Контрольная 25 17 68,0 8 68

Было установлено, что терапевтическая эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят составила 92 %. Из 25 телят опытной группы у 23 животных выздоровление наступило на 5 день после начала применения препарата. За весь период наблюдений у 2 телят отмечались жидкие фекалии, однако падежа в опытной группе животных не было. Заболевание у телят опытной группы протекало в более легкой форме, чем у контрольных животных.

В контрольной группе терапевтическая эффективность гентамицина составила 68 %, а продолжительность болезни была на 3 дня больше, чем у телят опытной группы. После окончания эксперимента телята были вялыми, плохо поедали и усваивали корм, имели тусклый шерстный покров и отставали в росте. У 7 телят отмечались клинические признаки болезни и после окончания опыта 2 теленка пали на 9 и 10 сутки с начала постановки опыта.

У телят опытной группы на 3 день с начала постановки рпыта в фекалиях обнаруживали повышенное содержание P vulgaris, уровень которого снижался до допустимой концентрации на 14 день исследований. Количество лакто- и бифидобактерий возрастало во все дни исследований и на 14 день с начала постановки опыта достигало 108-109 м. кл/r фекалий.

Из фекалий телят контрольной группы были выделены Е. coll, P.vulgaris, P.mirabihs, К pneumonia, C.freundi, S. aureus, P.aerogenosa. Ha 3 день с начала постановки опыта в фекалиях не обнаруживали лакто-и бифидобактерий, в то время как количество патогенной и условно-патогенной микрофлоры было выше допустимых норм Выделенные от 5 телят на 3, 7 и 14 дни Е. coli дали положительную РА с антиадгезивной сывороткой К99 и обладали гемолитическими свойствами. Выделенные от 2 телят S.aureus дали положительный результат в реакции с плазмо-коагулазой. На 14 день исследований нормализации состава кишечной микрофлоры у телят контрольной группы не наблюдалось.

Анализируя полученные результаты, можно заключить, что применение колицина Е2 с лечебной целью ведет к восстановлению нормального биоценоза пищеварительного тракта телят за счет подавления размножения и элиминации из организма патогенных и условно-патогенных бактерий и повышения концентрации лакто- и бифидобактерий.

Терапевтическая эффективность колицина составила 92 %, при даче препарата в дозе 20 мг на 10 кг живой массы, 1 раз в день 6 дней подряд

Сравнительная оценка эффективности колицина Е2 с другими биопрепаратами

Сравнительная оценка антибактериальных свойств колицина Е2 и различных антибиотиков, проведенная in vitro, показала его высокую активность в отношении бактерий, вызывающих развитие дисбактерио-зов (рис. 5).

G

Рис 5 Активность колицина Е2 в отношении Salmonella choleraesuis и Enterobacter

(диск с колицином а центре чашки Летри, 1-офлоксацин, 2-полимиксин, 3-неомицин, 4-гентамицин, 5-хлорамфеникол, 6-тетрациклин)

Было установлено, что колицин Е2 по активности превышал офлок-сацин и др антибиотики широкого спектра действия и был наиболее эффективным в отношении S pneumoniae, Ecoli 010, S aureus, S choleraesuis, Enterobacter, P. mirabilis, S. haemohticus

По действию на E. coll 026, E coll K99, S tiphymunum, P.vulgans ко-лицин E2 соответствовал активности офлоксацина.

Таким образом, активность колицина Е2 in vitro в отношении перечисленных грамотрицательных бактерий полностью коррелирует с высокой эффективностью препарата in vivo, что подтверждается данными микробиологических исследований материала от больных телят.

ВЫВОДЫ

1. Разработан усовершенствованный метод получения и очистки ко-лицина Е2 из гибридного штамма Bacillus subtilis pBcolE2, представляющий собой полипептид с молекулярной массой 78 кДа

2. Колицин Е2 безвреден для животных, не обладает эмбриотоксич-ностью и тератогенностью, обладает антиоксидантными свойствами и

антимикробной активностью-в отношении Pseudomonas aeroginosa в концентрации >3,9 мкг/мл, Esherihia coli - в концентрации >1,9 мкг/мл, повышает бактерицидную и лизоцимную активность сыворотки крови на 20-30 %, а также способствует возрастанию в 2 раза фагоцитарной активности лейкоцитов.

3. Колицин Е2 угнетает рост и размножение возбудителей желудочно-кишечных болезней телят из семейства Enterobacteriaceae - Е. coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Enterobacter, Citrobacter, а так же - S. aureus, S. pneumoniae, способствует их элиминации, стимулирует развитие лакто- и бифидобактерий.

4. Лечебно-профилактическая эффективность" колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят, составила 92-100-% при внутримышечном введении в дозе 20 мг/10 кг массы тела, 1 раз в день в течение 6 дней.

5. Экономический эффект от использования колицина Е2 составил 28,8 руб. на теленка, что в 8 раз дешевле базовой схемы лечения.

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛУЧЕННЫХ НАУЧНЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ

1. Сконструирован гибридный штамм, Bacillus subtilis pBColE2 -продуцент колицина Е2, обладающего антибактериальными и антиок-сидантными свойствами, который депонирован и зарегистрирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ГУ Зонального НИИСХ Северо-Востока им. Н В. Рудницкого под номером В-771.

2. Составлено Временное наставление по применению-колицина Е2 в ветеринарии (в порядке широких производственных испытаний 2001-2004 гг), утв. Департ. ветеринарии Минсельхоза России 12.03 2001 за № 13-4-03/0039.

3. Внедрена в производство схема применения колицина Е2. С целью профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят препарат лрименяют сразу после рождения в дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 4-6 дней. С лечебной целью при желудочно-кишечных болезнях телят колицин Е2 применяют при первых проявлениях клинических признаков заболевания в, дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 6 дней. Схема применения внедрена в хозяйствах Мое-, ковской, Кировской, Воронежской и др. областях.

4. Разработана нормативно-техническая документация на колици-нЕ2. Промышленный регламент на производство колицина Е2. Утв. 18.01.2002г. Директором ГУ зональный НИИ сельского хозяйства Северо-Востока им.Н.В.Рудницкого. Технические условия на препарат-коли-цин Е2. ТУ 9337-010-00008064-01. - 2001 .-11 с. Согласованы с Департаментом ветеринарии Минсельхоза РФ.

5. Составлены акты производственных испытаний колицина Е2 в хозяйствах (приложение).

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИЮ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. В связи с антибиотикоустойчивостью выделяемых от новорожденных телят микроорганизмов для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней животных следует применять препарат колицин Е2.

2. С целью профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят рекомендован колицин Е2 в дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно сразу после рождения, 1 раз в сутки в течение 4-6 дней.

3. С лечебной целью при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят колицин Е2 рекомендуется применять при первых появлениях клинических признаков заболевания в дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 6 дней.

4. Учитывая, что колицин Е2 является эффективным антибактериальным препаратом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, рекомендуется применять колицин Е2 в комплексе с симптоматическими средствами лечения.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1.Маслов С.А., Азямов М.А., Тихонов ПИ. Разработка питательной среды из непищевого сырья для получения ветеринарного препарата на основе гибридного колицина Е2 /Материалы Международной научно-практической конференции «Нейроинфекции: бешенство, губко-образная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтцфелда - Якоба и другие прионные болезни; листбриоз, болезнь Ауэски, болезнь Тешена».- Покров.- ВНИИИВВиМ,- 2001. - 0.226-227.

2. Тихонов Г.И., Азямов М.А, Получение гибридного колицина Е2 (сообщение I) /Сборник матерйалов научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы».- Киров.-2001.-С.70-72.

3. Азямов М.А., Тихонов Г.И. Антиоксидантный препарат нового поколения - колицин Е2 /Сборник материалов научно-практической конференции «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы».- Киров.- ВГТУ.- 2001.- С. 4-5.

4. Тихонов Г.И. Влияние колицина Е2 на остеорепарацию при переломах длинных трубчатых костей у собак / Материалы IX Московского Международного ветеринарного конгресса. - М.: Ассоциация практикующих ветеринарных врачей. - 2001,- С. 146-147.

5. Азямов М.А., Тихонов Г.И., Девришов Д.А. Получение гибридного колицина Е2 (сообщение II) /Ветеринарная медицина.- ООО «Аг-ровет».-2002.-№1.-С 13-14.

6. Тихонов Г.И., Слесаренко Н.А. Оценка эффективности колицина Е2 при переломах длинных трубчатых костей у собак /Ветеринарная медицина.- ООО «Агровет».- 2002.- № 1. - С. 17-19.

7. Тихонов ПИ., Акимочкин А.И., Остренская М.Е., Заболоцкая Т.В. Оценка лечебной эффективности препарата колицинЕ2 при кишечных заболеваниях телят, вызванных-ассоциацией энтеропатоген-ной микрофлоры /Ветеринарная медицина,- ООО «Агровет».- 2002.- № 2.-С. 20-21.

8. Тихонов ПИ. Результаты применения колицина Е2 при кишечных заболеваниях телят, вызванных ассоциацией энтеропатогенной микрофлоры /Материалы Международной научной конференции «Актуальные проблемы развития животноводства».- Львов.-Науковий вюник Льв1всько1 академи ветеринарно1 медицини ¡МеН С.З. Гжицького.- 2003. - С.63-69.

Сдано в производство 5 04 2004 г. Ризограф. Тираж 100 Заказ 149

Издательско-полиграфический отдел ФГОУ ВПО МГАВМиБ им. К.И. Скрябина.

109472, Москва, ул. Академика Скрябина, 23

И 7 8

Острые кишечные заболевания молодняка по широте распространения и охвату поголовья занимают ведущее место в патологии сельскохозяйственных животных. Отход молодняка в первые месяцы жизни (падеж, санитарный брак) в зависимости от уровня ведения животноводства достигает в среднем 10 - 30 % и более.

Практически повсеместно регистрируемая заболеваемость молодняка свидетельствует о том, что эти заболевания не случайны и возникают как следствие постоянно присутствующих в среде обитания животных неблагоприятных факторов, закономерно вызывающих патологические изменения в организме.

ОКЗ являются основными причинами гибели молодняка в первый месяц после рождения. Устойчивость телят к ОКЗ зависит от уровня факторов естественной резистентности организма новорожденных животных, активности колострального иммунитета, который находится в прямой зависимости от качества молозива и его своевременного получения новорожденным молодняком.

Исследованиями Воронина Е.С. с соавт. (1991) установлено, что молодняк крупного рогатого скота, в большинстве случаев, рождается с низкой резистентностью организма. У новорожденных животных с пониженой неспецифической реактивностью на фоне высокой обсемененности условно - патогенными микроорганизмами внешней среды, а зачастую и молозива, происходит инфицирование и опережающее заселение кишечника, условно -патогенными и патогенными микроорганизмами и, как следствие, возникают ОКЗ, в этиопатогенезе которых активно участвуют энтеробактерии.

Имеющиеся и широко используемые в настоящее время моновакцины против колибактериоза и сальмонеллеза для иммунизации животных не всегда эффективны, поскольку в этиологии диарей в большинстве случаев участвует ассоциация 3 - 5, а иногда и большего количества возбудителей, преимущественно из семейства энтеробактерий.

Существенную роль в лечении и предупреждении ОКЗ играют препараты, способствующие восстановлению нормальной микробной среды в кишечнике. К ним относятся пробиотики, изготовленные на основе лактоба-цилл и бифидобактерий, которые наряду с антогонистическим действием благоприятно влияют на пищеварение, способствуют лучшему усвоению корма, участвуют в биосинтезе витаминов группы В, ряда незаменимых аминокислот, бактериоцинов и др. (30, 38).

Переболевание в раннем возрасте ОКЗ, содержание в помещении животных с разным иммунологическим фоном, воздействие различных стрессов, приводит к развитию иммунодефицитного состояния, способствующего повышенной восприимчивости молодняка к различным ауто- и экзопатогенам, и в итоге к массовым респираторным болезням. В настоящее время известно 10-15 различных вирусных и бактериальных агентов и их ассоциаций, способных вызывать кишечные и респираторные болезни телят (25, 26).

Лечение желудочно-кишечных болезней молодняка сельскохозяйственных животных остается в настоящее время одной из актуальных проблем ветеринарной медицины. Широко применяемые с этой целью антибактериальные препараты, наряду с положительным воздействием на течение и форму заболевания, вызывают побочные эффекты: возникновение антибиотикоре-зистентных штаммов микроорганизмов, развитие дисбиотических состояний кишечника, аллергические реакции и др.

Одним из способов предупреждения развития антибиотикоустойчивых форм микроорганизмов является периодическая замена широко применяющихся антибиотиков новыми или редко применяющимися.

Однако получение новых групп антибактериальных препаратов на основе усложненных способов синтеза и новых технологий влечет за собой значительное повышение затрат на лечение.

В связи с этим интерес представляет разработка дешевых антибактериальных средств, не приводящих к развитию дисбиотических изменений в желудочно-кишечном тракте и не требующих коррекции нарушений микрофлоры кишечника биопрепаратами.

Новые возможности в реализации этого подхода открылись благодаря созданию полифункциональпого биопрепарата нового поколения - колицина Е2, обладающего антибактериальными, антиоксидантными и иммуномоду-лирующими свойствами (4, 7, 8).

В научных публикациях последних лет, по проблеме создания препаратов методами генной инженерии, появляется большое количество информации, касающейся получения препаратов, имеющих бактериальную и вирусную природу и способных воздействовать благотворно одновременно на несколько систем организма.

Нормальная жизнедеятельность организма невозможна без развитой многоступенчатой системы регуляции и координации различных его функций, осуществляемых специальными веществами - биорегуляторами. Это осуществляется с помощью витаминов, гормонов, нейромедиаторов, которые способны повышать защитно-приспособительные возможности организма. Среди них видное место занимают противоокислительные вещества или антиок-сиданты.

Антиоксиданты обеспечивают необходимую активность антиокислительной системы - универсальной регулирующей системы организма, контролирующей уровень свободнорадикальных реакций окисления и препятствующей накоплению продуктов окисления (42, 71,91, 104, 126, 128).

Многочисленные работы последних лет показывают, что состояние анти-оксидантной недостаточности (так называемая, свободнорадикальная патология или синдром пероксидации) как неспецифическая патофизиологическая реакция способствует развитию различных заболеваний (52, 114, 120, 123).

В настоящее время в связи с распространением в животноводстве индустриальных технологий наблюдается повышенная потребность в антиокси-дантах. Это обусловлено целым рядом причин:

- инфекционные, желудочно-кишечные, респираторные заболевания;

- вакцинации животных против вирусных заболеваний;

- недостаток и плохое качество кормов, наличие в них нитритов, нитратов, солей тяжелых металлов;

- низкое содержание в кормах в весенний период естественных антиоксидантов - каротина, витаминов А, Е, С и др.;

- низкая температура, повышенная влажность, недостаток света в помещениях;

- гиподинамия в зимний период;

- физиологические и технологические стрессы - роды, перемещения, перестановки и др.

В настоящее время наибольшее распространение в животноводстве получили обладающие антиоксидантпыми свойствами витамины А, Е, С, микроэлемент селен, органические соединения деполен, селенопиран и другие (10, 11, 49, 91). Из новых препаратов хорошо себя зарекомендовал амбиол (41).

Бурное развитие биологии в последние годы привело к раскрытию новых закономерностей окислительно-восстановительных реакций в организме млекопитающих, роли антиоксидантов в этих процессах, созданию новых антиоксидантов широкого спектра действия, полученных методом генной инженерии.

На базе лаборатории ветеринарной иммунологии ГУ Зональный НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого (г. Киров) в 2000 г. был сконструирован генно-инженерными методами гибридный штамм Bacillus subtilis pBColE2 -продуцент гибридного колицина Е2, патент РФ на изобретение №2188233 получен 27 августа 2002 года (5).

Ряд авторов (3, 4, 6, 7, 8) в своих исследованиях показали, что гибридный колицин Е2 обладает оригинальными биологическиими свойствами.

Таким образом, изучение биологических свойств гибридного колицина Е2 показало возможность применения его как ветеринарного препарата, для профилактики и лечения инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных. Тем не менее, возникла настоятельная необходимость более детального изучения механизма действия колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят и широкого применения его в ветеринарной практике.

Цель и задачи исследований

Целью настоящей работы являлось усовершенствование методов получения и очистки колицина Е2 и оценка его лечебно-профилактической эффективности при желудочно-кишечных болезнях телят.

Для решения были поставлены следующие задачи:

1. Разработать методы получения и очистки колицина Е2.

2. Определить биологические свойства колицина Е2 in vivo и in vitro.

3. Изучить антибактериальную активность колицина Е2 в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов.

4. Оценить лечебно-профилактическую эффективность колицина Е2 при желудочно-кишечных болезнях телят.

5. Разработать рекомендации по применению колицина Е2.

Научная новизна.

Получен рекомбинантный штамм B.subtilis pBcoIE2 - продуцент гибридного колицина Е2.

В результате проведенных исследований была изучена трансформация структурного гена Е. coli К12 в клетки бактерии В. subtilis. Выло установлено, что миниклетки, которые образуются при асимметричном делении мутантов Е. coli К12, не содержат геномную ДНК, но могут содержать плазмидную ДНК родительской клетки. При этом Col-плазмиды транслируются с образованием полипептидов.

Установлено, что колицин Е2 состоит из двух полипептидных субъединиц - собственно бактериоцина с молекулярной массой 68 кДа и белка иммуно-сти с молекулярной массой 10 кДа. Колицин Е2 проникал через клеточные мембраны бактерий матричного штамма Е. coli К12, а также штаммов Pseu-domonas, Salmonella, Haemophilus, Streptoccus и вызывал эндонуклеазную деградацию бактериальной ДНК, т.е. не отличался видовой специфичностью, при общей высокой бактерицидности.

Исследовано действие гибридного колицина Е2 на процесс инфицирования клеток культуры ПЭК герпес вируса третьего типа (штамм Румын) возбудителя инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота.

Впервые проведена комплексная оценка возможности использования колицина Е2 в ветеринарной практике в качестве профилактического и терапевтического средства при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят.

Учитывая, что Колицин Е2 является эффективным антибактериальным препаратом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов, предложено применение Колицина Е2 в комплексе с симптоматическими средствами лечения.

Практическая и теоретическая значимость работы.

Сконструирован гибридный штамм Bacillus subtilis pBColE2 - продуцент колицина Е2, обладающего антибактериальными и антиоксидантными свойствами, который депонирован и зарегистрирован во Всероссийской коллекции микроорганизмов ГУ Зонального НИИСХ Северо-Востока им. Н.В. Рудницкого под номером В-771.

Показано, что колицин Е2 обладает высокой лечебно-профилактической эффективностью при острых желудочно-кишечных болезнях молодняка крупного рогатого скота.

Установлено, что эффективной профилактической дозой колицина Е2 для телят является 20 мг на 10 кг живой массы при внутримышечном его применении в течение 4-6 дней. Терапевтический эффект для больных новорожденных телят проявляется в дозе 20 мг на 10 кг веса при внутримышечном его применении в течение 6 дней.

Полученный колицин Е2 зарегистрирован Ветфармбиосоветом Департамента ветеринарии Минсельхозпрода РФ (протокол №3 от 06.06.2000 г. 001157-ОП).

Разработана схема применения препарата при желудочно-кишечных и респираторных заболеваниях сельскохозяйственных и домашних животных.

Составлено и утверждено временное наставление по применению коли-цина Е2 в ветеринарии (в порядке широких производственных испытаний 2001-2004 гг): Одобрено Ветфармбиосоветом Департ. ветеринарии Минсель-хоза РФ (протокол №3 от 06.06.2000 г.) ООП57-ОП. Утв. Департ. ветеринарии Минсельхоза России 12.03.2001 за№ 13-4-03/0039(35).

Внедрена в производство схема применения колицина Е2 с профилактической и терапевтической целью.

Результаты изучения используются практическими ветеринарными врачами Российской Федерации при лечении и профилактике болезней животных.

Подготовлен и утвержден комплект нормативно-технической документации на препарат колицин Е2.

Разработаны практические рекомендации на Колицин Е2.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты исследования генетической цепи по конструированию штамма-продуцента колицина Е2, синтеза и очистки колицина Е2.

2. Результаты изучения биологических свойств препарата.

3. Результаты изучения лечебно-профилактического действия колицина Е2 при желудочно-кишечных заболеваниях телят.

Апробация работы: основные положения диссертации были доложены и обсуждены: на международных конгрессах:

-IX международный ветеринарный конгресс (Москва, 2001);

- XI международный ветеринарный конгресса (Москва, 2003); на международных конференциях:

- международная научно-практическая конференция «Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия крупного рогатого скота, Крейтц-фелда - Якоба и другие прионные болезни; листериоз, болезнь Ауэски, болезнь Тешена» (Покров, 2001).

- международная научная конференция «Актуальные проблемы развития животноводства» (Львов, 2003); на научно-практических конференциях:

- научно-практическая конференция «Биотехнология на рубеже веков: проблемы и перспективы» (Киров, 2001).

Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 научных работ в сборниках международных и научно-практических конференций и конгрессов и в научных журналах.

Объем и структура диссертации. Основной текст работы изложен на 128 страницах машинописного текста. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических предложений, библиографического списка (103 отечественных и 35 зарубежных авторов), приложений. Диссертация иллюстрирована 33 таблицами и рисунками.

ВЫВОДОВ

1. В связи с высокой антибиотикорезистентностью выделяемых от новорожденных телят микроорганизмов для лечения и профилактики желудочно-кишечных болезней животных необходимо применять препарат колицин Е2.

2. С целыо профилактики желудочно-кишечных болезней новорожденных телят колицин Е2 применять сразу после рождения в дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 4-6 дней.

3. С лечебной целью при желудочно-кишечных болезнях новорожденных телят колицин Е2 необходимо применять при первых появлениях клинических признаков заболевания в дозе 20 мг на 10 кг живой массы телят внутримышечно, 1 раз в сутки в течение 6 дней.

4. Учитывая, что колицин Е2 является эффективным антибактериальным препаратом в отношении патогенных и условно-патогенных микроорганизмов рекомендуется применять колицин Е2 в комплексе с симптоматическими средствами лечения.