Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Оценка иммунобиологического состояния новорожденных животных неблагополучных по бруцеллезу ферм

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РЕСПУБЛИКИ КАЗАХСТАН

ЛЛМЛТИНСКИП ЗООВЕТКРШ1Л1ЧШП ИНСТИТУТ

На планах рукопч.м

ШЕНЖЛ110В

Канат Толгабаенич

■ОЦЕНКА ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКОГО ШОИШ НОВОРОЖДЕННЫХ ЖИВОТНЫХ НЕБЛАГОПОЛУЧНЫХ ПО БРУЦЕЛЛЕЗУ ФЕРМ

16.00.03 — ветеринарная микробиология, иммунология,

ЭПИЗООТОЛОГИЯ и инфекционные болегши животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

АЛМАТЫ, 1993

Работа выполнена в лаборатории иммунодиагностики бруцеллеза биотехнологического центра Акмолинского сельскохозяйственного института.

Научные руководители: доктор биологических наук, профессор А. Ф. Дмитриев,

кандидат ветеринарных наук, доцент А. К. Булашев.

Ведущая организация: Кустанайский сельскохозяйственный институт.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Г. II. Лопатников, кандидат медицинских наук В. К. Студенцова.

Защита состоится «/V »> ^ре-^г.М.1993 г. в часов на заседании специализированного Совета Д 18.01.02 при Алматинском зооветеринарном институте по адресу: 480013, г. Алматы, пр. Абая, 28.

С диссертацией молено ознакомиться в библиотеке Алматинскогв зооветеринарного института.

// »

Автореферат разослан « // ,> ¿-^^сууЬЛ*- 1993 г.

Ученый секретарь специализированного Совета, кандидат ветеринарных наук доцент

Н. II. АХМЕТСАДЫКОВ

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТУ

Актуальность темы. Эпизоотическая ситуация по бруцеллезу крупного и мелкого рогатого скота в Республике Казахстан, особенно в

его северном регионе, продолжает оставаться напряженной. В поддержании и распространении бруцеллезной инфекции среди животных определенную роль играет молодняк, зараженный в утробе матери, который до наступления физиологической зрелости в большинстве случаев является латентным носителем бруцелл V.A. А.Новицкий и соавт., 1983; C.J.Nossal, i-jti'j; J.Cattlin and J.Edwards^.966; А.А.Хоч, 1969; А.К.Бронников, 1990; Н.П.Иванов и соавт., 1991; и др.).

взаимоотношения организмов матери и плода при бруцеллезной инфекции недостаточно изучены, хотя известно, что патология беременности, вызванная бруцеллами, отмечается в основном у первотелок. Одна и таже корова обычно абортирует один раз и последующая стельность, за редким исключением, протекает благополучно и заканчивается рождением клинически здоровых, жизнеспособных телят (П.Н. Жованик и соавт., 1975; К.П.Студенцов, 1975; Н.П.Иванов, I98I;f.m. Enright and J.W. Knox, 1984; и др.;.

В этой связи изучение иммунобиологического состояния молодняка, полученного от животных неблагополучных по бруцеллезу ферм, и разработка методов диагностики внутриутробного инфицирования новорожденных имеют большое научное и практическое значение.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось изучение иммунобиологического состояния новорожденных животных в зависимости от специфической реактивности материнского организма.

В соответствии с целью были определены следующие задачи:

I. Провести серологические исследования коров и овцематок благополучных и неблагополучных по бруцеллезу хозяйств сразу после родов.

'¿. Установить возможность обнаружения противобруцеллезных

антител в щ-'околостральной сыворотке крови новорожденных неблагополучного стада и отары с помощью классических серологических реакций (РА, РСК, ?БП) и твердофазного иммуноферментного анализа (.ТИФА) •

3. Разработать способ диагностики внутриутробного инфицирования новорожденных животных при бруцеллезной инфекции.

4. Изучить зависимость мевду состоянием иммунологической реактивности материнского организма и его потомства.

Научная новизна. Изучена зависимость мевду специфической реактивностью материнского организма и иммунным состоянием новорожденных животных.

Установлена возможность оценки плацентарных условий развития и жизнеспособности потомства на основе определения противобруцел-лезных антител в преколостральной сыворотке крови.

Впервые доказана возможность обнаружения бруцелл (.или их антигенов) в первородном кале Смеконий) новорожденных животных с помощью моноклональных антител в иммуноферментном анализе.

Предложен способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом (.Положительное решение ВНИИГПЭ на изобретение от 08.06.1991 г. по заявке 4862905/I3C093364) от 06.09.1990 г.).

Практическая ценность работы. Использование разработанного нами способа диагностики внутриутробного инфицирования позволит прогнозировать хозяйственную ценность новорожденных животных и повысить эффективность протиЕоэпизоотических мероприятий.

Разработан способ определения жизнеспособности новорожденных животных (.заявка на предпологаемое изобретение 50^3633/15(015268), Приоритет от 31.03.1992 г.).

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L - продуцент моноклональных антител к бактериям рода Brucella

полученный нами методом гибридомной технологии (Ав. св. №1752764, Опубл. в Бюл.№29 от 07.08.1992 г.) депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной (ныне Всероссийской) коллекции клеточных культур (г. Санкт-Петербург) и может быть использован для совершенствования методов диагностики бруцеллеза животных.

Внедрение. Материалы диссертационной работы используются в научно-исследовательской работе лаборатории иммунодиагностики бруцеллеза Акмолинского сельскохозяйственного биотехнологического центра, в учебном поцессе на кафедрах "Зоогигиены и микробиологии" Акмолинского СХИ и "Эпизоотологии и микробиологии" Ставропольского СХИ, а также включены в раздел "Инфекция и иммунитет" учебного пособия по микробиологии на казахском языке для высших учебных заведений по специальности "Ветеринария".

Основные положения исследований.выносимые на защиту;

-Иммунобиологическое состояние новорожденных животных до приема молозива зависит от специфической реактивности материнского организма.

-Способ диагностики внутриутробного инфицирования бруцеллезом основанный на обнаружении противобруцеллезных антител в преко-лостральной сыворотке крови и антигенов возбудителя й первородном кале новорожденных.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-производственных конференциях профессорско-преподавательского состава и аспирантов Целиноградского (ныне Акмолинского) СХИ (1989 - 1992 гг.), научной конференции молодых ученых и специалистов Троицкого ветеринарного института (г.Троицк, 1989), научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященной 60-летию Ставропольского СХИ (г.Ставрополь, 1990;1991),

республиканской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов (г.Семипалатинск, 1991), Всесоюзной конференции по сельскохозяйственное биотехнологии (г.Целиноград, 1991). Научно-техническая продукция б виде "Набора для диагностики бруцеллеза методом МгА на основе моноклональных антител" экспонировалась на выставке "От фундаментальных исследований до практического внедрения" павильона "Народное образование" ВДНХ СССР и удостоена се-ребрянной медали (1991 г.).

Публикации. Но теме диссертации опубликовано одиннадцать научных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений, списка литературы и приложений. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 2 рисунками. Список использованной литературы включает 323 источника, в том числе 81 иностранных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

Работа выполнена в 1988 - 1991 гг. в лаборатории иммунодиагностики бруцеллеза биотехнологического центра Целиноградского (ныне Акмолинского) сельскохозяйственного института и хозяйствах Целиноградской (ныне Акмолинской) области в соответствии с программой НИР по теме:"Разработать методы и средства диагностики наиболее распространенных болезней животных в Казахстане на основе достижений современной биотехнологии"Ш1осрегистрации 01900066920).

В исследованиях использовано 55 коров неблагополучной по бруцеллезу фермы и полученные от них 51 теленок и 4 аборт-плода, 184 овцематок и 188 новорожденных ягнят (в том числе 6 аборт-плодов) из двух неблагополучных отар, а также 102 овцематки и их приплод

в количестве XIO голов благополучной отары.

У коров или овцематок после родов и их новорожденных до приема молозиЕа брали образцы крови из яремной вены. Б предмолозив-ный период у телят и ягнят были взяты также пробы мекония из прямой кишки.

Из гематологических и биохимических показателей крови определяли: количество эритроцитов и лейкоцитов - в счетной камере Горя-ева, гемоглобина - гемометром Сали, скорость сседания эритроцитов (.СО'о) - в аппарате Т.Н.ПанченкоЕа, лейкоцитарную формулу - в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзы, общий белок - рефрактометрически, белковые фракции - электрофорезом на агаровом геле.

Нротивобруцеллезные антитела в сыворотках крови коров или овцематок и их новорожденных определяли с помощью РА, РСК, РБП по общепринятым методикам, исследования сывороток крови телят и ягнят до приема молозива в РА и РСК проводили в разведении 1:2 и выше. РА,ставили в микроварианте (РМА) в объеме 0,1 мл. Постановку ТИФА проводили с использованием единого бруцеллезного антигена для РА, РСК и РДСК. Образцы сыворотки крови коров или овцематок исследовались в твердофазном иммуно^ерментном анализе, начиная с разЕеде-ния I:iUO, а новорожденных - 1:4 и выше. Сыворотки крови коров дополнительно исследовались на наличие антител против поли-Б антигена Br. melitensis Ы15 в РИД по R.Dlaz et al (.1981).Классы иммуноглобулинов е преколостральной сыворотке крови телят и ягнят определяли в РИД по O.Ouchterlony (.1948) .Моноспецифические сыворотки к иммуноглобулинам M и G крупного рогатого скота и оецы были предоставлены нам доктором биологических наук,профессором ¡О.Н.Федоровым (..Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. ri.Р.Коваленко,).

Меконий новоровденных животных исследовали на наличие бруцелл

или их антигенов с помощью "Набора для диагностики бруцеллеза методом И$А на основе моноклональных антител"(ТУ0ПЮ.05.4000.326-92 на "Набор..." утвержден Главным управлением ветеринарии с ветеринарной инспекцией МСХ Республики Казахстан от 8 декабря 1992г.).

За состоянием .здоровья молодняка в течение первого месяца его жизни вели клинические наблюдения,учитывали заболеваемость и падеж.

Статистический анализ результатов исследований проводили по Г.Ф.Лакину (1990). Данные серологических реакций обрабатывали по методике, описанной 'Г.С.Сайдулдиным (1981). Разницу считали достовер-

V

ной при Р40,05.

• РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Результаты оценки иммунологической реактивности коров и овцематок при бруцеллезной инфекции

При серологическом исследовании 51 отелившихся и 4-х абортировавших коров неолагополучной по бруцеллезу фермы было установлено, что среди них у 48 голов (87,3$) в сыворотке крови содержатся антитела против бруцелл, обнаруживаемые в диагностических титрах по РА у 32 (58.2J0.jPCK у 35 (63,650 и по ТИФА у 41 коров (74,5*). По результатам РБП и РИД на бруцеллез реагировало соответственно 31(56,4%

и 21 (38,2$) животных. У 17 коров, в том числе у четырех абортиро-

/

вавших, противобруцеллезные антитела в сыворотке крови обнаружены по всем серологическим реакциям. Наибольшее количество реагирующих на бруцеллез животных выявлено с помощью твердофазного иммунофер-ментного анализа. При этом показания ТИ.ФА подтвердили положительные результаты РА в 96,6$ случаях, РСК - в 85,7 %, ЕБП - в 96,8 % и РИД - в 90,4$ случаях. Кроме того, в твердоыазном иммунофермент-ном анализе антитела против бруцелл выявлялись в более высоких титрах чем в РА и РСК. Так, средний титр антител обнаруживаемых в ТИМ составил 1:6500 + 0,24, тогда как в РА - 1:160 + 0,12 и РСК -

1:30,5+0,24. Совпадение результатов РА с РСК и РБП отмечены соответственно в 63,4$ и 63,2$, а РСК с РБП в 59,5? случаях. Результаты РИД были подтверждены в РА, РСК и РБП в 85,7$ случаях. С поли-Б антигеном Brucella melitensis BII5 в РИД реагировали в основном те животные, у которых противобруцеллезные антитела в сыворотке крови содержались в высокой концентрации и обнаруживались одновременно в РА, РСК, РБП и ТМА (.17 голов или 30,9%). Например, средние титры антител у коров, реагировавших на поли-Б антиген, составили в РА-1:230+0,19, РСК - 1:60,5+0,32 и в ТИ#А - 1:16000+0,43, тогда как у животных,с отрицательными результатами РИД, средние титры антител равнялись соответственно: 1:105+0,07 (Р< 0,001), 1:15+0,27 (Р< 0,001) и 1:2800+0,27 (,Р< 0,001).

Результаты исследований сывороток крови овцематок приведены в таблице I.

Таблица I»

Результаты исследования сывороток крови овцематок на бруцеллез

Номер¡Иссле-отары!довано ¡(.гол.)

^Г?>агиРовало (^/средний титр антител)

-стояние ! ! ! !

по бруцел-! -лезу !

РА

РСК

РБП

' ТИ$А

Всего

1. 81 НБП

2. 103 НБП

3. 102 БП

....' •f . , 95+0,09 18,5+0,16

67,9 53,4

85+0,07 10,5+0,11

26,5 31,4

55+0,09 9,5+0,12

37,0 76,7 24,5

41,9

800+0,30

93,2 2500+0,08

49,0 420+0,09

51,8 96,1 66,6

Примечание: НБП - неблагополучная отара БП - благополучная отара

Данные таблицы I показывают, что при комплексном серологическом исследовании овцематок первой отары на бруцеллез реагировало 42 (51,8$) животных. Из них в РА реагировало 28 маток (34,5*). РСК - 34 (41,9$), РБП - 30 (37,0$) и в ТИФА - 34 (41,9$). Средний титр антител выявляемых в РА составил 1:95+0,09, РОК -1:18,5+0,16 и в ТИМ - 1:800+0,20. В данной отаре у 6 овцематок были зарегистрированы аборты, причем у одной абортировавшей матки наличие противобруцеллезных антител в сыворотке крови не выявлено. Остальное поголовье абортировавших животных реагировало на бруцеллез как по РА, РсК, х'БП, так и по ТИФА.

Во второй отаре количество животных, реагировавших на бруцеллез, было значительно выше, чем в первой. Всего по комплексу серологических тестов реагировало на бруцеллез 99 (96,1$) овцематок, из них по РА - 70 голов (67,9$), РСК - 55 (53,4$), РБП - 79 (76,7$) и по ТИФА - 96 голов (93,2$). Средний титр противобруцеллезных антител обнаруживаемых в РА составил 1:85+0,07, РСК - 1:10,5+0,11 и в ТИФА - 1:2500+0,08.

Высокая серопозитивность наблюдалось и у овцематок благополучной по бруцеллезу отары. При исследовании сывороток крови 102 окотившихся маток наличие антител против бруцелл установлено у 68 животных (66,6$), в том числе по РА у 27 голов (26,5$), РСК - 32(31, 4$), РБП - 25 (24,5$) и по ТИФА у 50 голов (49,0$).

Таким образом, значительный процент коров и овцематок после родов реагировал на бруцеллез. Сравнительный анализ результатов серологических реакций, использованных нами для определения противобруцеллезных антител в сыворотке криви животных, показал, что твердофазный иммуноферментный анализ обладает наиболее высокой чувствительностью, чем общепринятые иммунологические тесты (РА, РСК и РБП).

Серологические и гематологические исследования новорожденных телят

Серологические исследования новорожденных телят, полученных от коров неблагополучной по бруцеллезу фермы, показали, что у 13 голов или 25,Ь% животных в сыворотке крови до приема молозива по результатам твердофазного иммуно^ерментного анализа содержались антитела против бруцелд, среднии титр которых был равен 1:40,7+0,28. Присутствие противобруцеллезных антител в преколостральной сыворотке крови у отдельных новорожденных было выявлено также с помощью РИА у 7 (13,7/0» а в РСК и РБП у 3 телят (5,9$). Средний титр антител обнаруживаемых в сыворотке крови телят до приема молозива составил в РМА - 1:17,02+0,27, в РСК - 1:31,7+0,26. Следует отметить, что у 3 новорожденных, давших положительные результаты по РСК и РБП, наличие антител было выявлено как в РМА, так и в ТИФА, причем они имели наиболее высокие титры по сравнению с остальными телятами С в РМА от 1:64 до 1:200 и в ТИФА от 1:2046 до 1:6400). Положительные результаты РМА, РСК и РБП были полностью подтверждены в ТИФА. Последний тест позволил выявить дополнительно 6 телят в крови которых содержались антитела, не обнаруживаемые другими серологическими реакциями. При исследовании сывороток крови 4 абортированных плодов наличие антител против бруцелл было установлено по

»

результатам ТИМ только в двух случаях в титре 1:4. Результаты остальных иммунологических реакций были отрицательными. Противобру-целлезные антитела обнаруживаемые в преколостральной сыворотке крови у 5 телят принадлежали к иммуноглобулинам класса g , у 2-х kigm, а у 8 голов какк^вй, так. и к IgM. Последние классы иммуноглобулинов оонаружены и в крови двух аборт-плодов.

Анализ картины крови новорожденных животных показал, что телята, имевшие в крови до приема молозива противобруцеллезные анти-

тела (первая группа), по сравнению со сверстниками без специфических иммуноглобулинов (вторая группа), содержат меньше сегменто-ядерных нейтрофилов - соответственно: 26,07 + 2,61% и 33,86 + 1,45$ (Р4 0,05). Установлено достоверное различие и по процентному содержанию лимфоцитов. Число последних в крови телят первой группы было выше (51,0 + 3,31%), чем у их сверстников из второй группы (42,38 + 1,85$; Р< 0,05). При ¡анализе лейкоцитарной формулы отмечено, что в первой группе телят процентное содержание лимфоцитов (51,0$) было значительно выше, чем нейтрофилов (44,6$), тогда как картина белой крови новорожденных второй группы имела нейтро^иль-ный характер (42,38$ против 53,9$). Как и следовало ожидать, у телят, в преколостральной сыворотке крови которых обнаружены проти-вобруцеллезные антитела, установлено повышенное содержание общего белка (59,63 + 1,92г/л), бета-глобулинов (10,59 + 1,36г/л) и гамма-глобулинов (9,34 + 1,62г/л) по сравнению с новорозденными, не имевшими иммуноглобулины специфичные к бруцеллам: соответственно 51,76 + 1,25г/л (Р<0,01), 7,16 + 0,52г/л (Р40.001). Фракция гамма-глобулинов у'последних не выявлена. По количеству альфа-глобулинов, наоборот, телята второй группы превосходили своих сверстников из первой (12,14 + 0,54г/л и 7,31 + 0,54г/л; РАО,01). Содержание альбуминов в крови новорожденных обеих групп было примерно однинако-вым (32,04 + 1,81г/л и 32,06 + 1,17г/л).

Между показателями иммунологических реакций и белковой картиной крови новорожденных телят установлена корреляционная связь. Наиболее высокая степень связи выявлена между титрами антител обнаруживаемых в РМА, РСК, ТМА и концентрацией гамма-глобулинов в сыворотке крови новорожденных. Значения коэффициентов корреляции (г) составили соответственно 0.90, 0,73 и 0,91 при Р<0,01. Количество альбуминов в крови телят находилось в обратной связи с по-

казателями ТИФА (г =-0,52; Р<0,05).

Таким образом, результаты исследований по определению иммунобиологического состояния новорожденных, полученных от коров неблагополучной по бруцеллезу фермы, свидетельствуют о том, что у отдельный телят (¿5,5$) в сыворотке крови до приема молозива по результатам серологических реакций обнаруживаются антитела против бруцелл. Наиболее чувствительным тестом из числа использованных иммунологических реакций для выявления специфических антител в преколостраль-ной сыворотке крови новорожденных оказался твердофазный иммунофер-ментныи анализ, у которого случаев обнаружения противобруцеллезных антител было выше по сравнению с PMA, РСК и РБП.

Оценка иммунологической реактивности новорожденных ягнят

N

Результаты серологических исследований преколостральных сывороток крови ягнят благополучных и неблагополучных по бруцеллезу

итар приведены в таблице с.

Таблица 2.

Результаты серологических исследований новорожденных ягнят

Номер;Иссле-!ц™;?°°™~! Обнаружено антител против бруцелл в отары!довано;-стояние ¡' î^-)jno gpgg'j

! РМА ! РСК i РБП ■i— 1 '! ТИФА i

18,1$ ОТ По1 С. 1 , I/o 34,9$

8,47+0,16 3,35+0,11 4,8$ 224,9+0,16

20,0$ 15,2$ 8 6$ 29,5$

6,56+0,09 5,4+0,09 74,6+0,18

4,5$ 9,1$

1.

2. 3.

83 НБП

105 НБП НО БП

10,0+0,18 4,58+0,11

нв

73,4+0,30

Примечание: в числителе указано количество ягнят в

0.2

процентах у которых обнаружены антитела; в знаменате-ле-средний титр антител; нв- не выявлено.

Как видно из таблицы 2 у 34,9$ новорожденных ягнят (29 гол.) первои отары, неблагополучной по бруцеллезу, в сыворотке крови до приема молозива по твердофазному иммуношерментномуанализу обнаружены антитела против бруцелл. Наличие противобруцеллезных антител у этих ягнят, установленное в 'ГИФА, подтвердилось и результатами РМА, РОК и РБП соответственно в 18,1$, 21,7% и 4,Ь% случаях. У 4 новорожденных ягнят присутствие специфических антител к бруцеллам в преколостральной сыворотке крови выявлено одновременно в РМА, РСК, РБП и ТИФА, у 6 голов в комплексе РМА+РСК+ТИФА, у 5 в РМА+ ТИФА и у 8 голов в РСК+ТИФА. Средний титр антител обнаруживаемых в сыворотке крови ягнят составил в РМА -1:8,47+0,16, РСК -1:3,35 +0,11 и в ТИФА -1:224,9+0,16. Интересно отметить, что из двух пар ягнят-двоен, в первой из них содержание противобруцеллезных антител в преколостральной сыворотке крови установлено по результатам ТИФА у обоих ягнят в титре 1:1024 и 1:512, у второй пары - антитела обнаружены только у одного ягненка в титре 1:512.

Среди ягнят второй отары, неблагополучной по бруцеллезу, присутствие противобруцеллезных антител в сыворотке крови до приема молозива было установлено у 29,5$ новорожденных (31 гол.). При этом в РМА реагировало 20,0$ ягнят (21 гол.) со средним титром агглютининов 1:6,56+0,09. Положительные результаты РСК отмечены у 15,2$ новорожденных (16 гол.) со средним титром комплементсвязы-Еающих антител 1:5,4+0,09. Б РБП антитела к бруцеллам установлены в 8,6$ (9гол.) случаях. ТИФА полностью подтвердил положительные результаты РМА, РСК, РБП и дополнительно выявил 10 ягнят в сыво -ротке крови которых содержались противобруцеллезные антитела.Среднии титр антител обнаруживаемых по ТИФА составил 1:74,6+0,18.

Б третьей отаре, благополучной по бруцеллезу, всего 5,5$ ягнят (.6 гол.) имели положительные результаты в РМА со средним титром агглютининов 1:10,0 + 0,18. Комплементсвязывающие антитела выяв-явлены у 4,5$ ягнят (5 гол.), средний титр которых был равен 1:4,58 + 0,11. При этом присутствие противобруцеллезных антител в сыворотке крови ягнят до приема молозива, установленное в РМА и хСК, были полностью подтверждены позитивными показаниями ТИФА, всего по результатам твердофазного иммуноферментного анализа выявлено 9,1$ ягнят СЮ гол.), в преколостральной сыворотке крови которых содержались антитела против бруцелл. Показания РБП во всех случаях были отрицательными.

При определении классов иммуноглобулинов в преколостральной сыворотке крови ягнят установлено, что у 22 новорожденных из первой отары противобруцеллезные антитела принадлежали к IgG, у 3-х к IgM и у 4-х как к IgG , так и к IgM - антителам. Среди ягнят вто -рой отары у 18 новорожденных идентифицированы иммуноглобулины класса G , у 2-х -IgM и у II - IgG и IgM . У ягнят благополучной по бруцеллезу отары противобруцеллезные антитела, содержащиеся в сыворотке крови до приема молозива, принадлежали только к IgG.

Анализ белковой картины крови показал, что ягнята, в преколостральной сыворотке которых присутствуют противобруцеллезные антитела, существенно превосходят своих сверстников без иммуноглобулинов по содержанию общего белка (69,41 + 2,79 г/л притив 60,93 + 1,40 г/л; Р<0,01), причем за счет гамма-глобулиновой фракции (со-ответственно:11,75 + 2,11 г/л и 0,00 г/л).

Установлена корреляционная связь между результатами серологических реакций и белковым составом крови новорожденных ягнят. Так, концентрация общего белка положительно коррелировала с показателями РМА ( г=0,42), РСК ( г=о,57), РБП ( г=0,53) и ТИФА ( г=0,84).

Лелду содержанием комплементсвязывающих антител и альфа-глобулинов ь сыворотке криви новорожденных выявлена отрицательная связь (г = -\j,bd). Аналогичная связь отмечена также мезду содержанием бета-глобулинов и показателями РСК С г =-0,63) и ТИФА (г =-0,40). Высокие коэффициенты корреляционной связи выявлены между концентра -цией гамма-глобулинов и титрами специфических антител обнаруживаемых в РМА ( г=0,67), РОК- (г =0,7*), РБП (г =0,73) и ТИФА (г=0,73). Значения коэффициентов корреляции между приведенными показателями были достоверны при Р<0,01.

Таким образом, результаты исследований показывают, что наибольшее количество ягнят, в преколостральной сыворотке крови кото -рых содержались поотивобруцеллезные антитела, выявлены в неблагополучных по бруцеллезу отарах (34,9$ и '¿9,5%). Среди новорожденных ягнят благополучной отары антитела против бруцелл обнаружены у 9,1%. Наличие положительной коррелятивной связи между содержанием гамма-глобулинов и результатами серологических реакций свидетельствуют о том, что данная фракция общего белка состоит в основном из про-тивобруцеллезных антител.

Диагностика внутриутробного инфицирования бруцеллезом новорожденных животных

Внутриутробную инфицированность новорожденных животных определяли путем исследования их первородного кала (мекония) на наличие бруцелл или их антигенов с помощью "Набора для диагностики бруцеллеза методом ИМ на основе мококлональных антител".

При исследовании образцов мекония новорожденных телят (55 гол.) неблагополучной фермы наличие бруцеллезного антигена по результатам ИМ выявлено в 19 пробах (34,5$), в том числе и у одного аоорт-плода из четырех исследованных (табл.3).

Таблица 3.

Анализ мекония телят и ягнят в иммуноферментном анализе (И$А)

Но во рож-; Благополучие ¡Иссле- ¡Количество животных в меконий кото-

¡фермы или отары¡довано;рых выявлен бруцеллезный антиген дениыв . по бруцеллезу ^гол.,); год> ,_^

Телята неблагополучная 55 19 34,5

лгнята неблагоплучная 188 37 19,7

Нгнята благополучная НО О О

Среди ягнят (.188 гол.) , из неблагополучных по бруцеллезу отар, присутствие бруцеллезного антигена в мекониях установлено у 37 новорожденных (.19,7$). При анализе образцов мекония новоровденннх ягнят, полученных от овцематок благополучной отары, бруцеллезный антиген ни в одном случав не был обнаружен.

Сравнительный анализ результатов исследований преколостраль-ной сыворотки крови и мекония новорожденных телят показал, что у 9 из 19 телят в организме обнаруживались как антитела против бру -целл, так и антигены возбудителя. Среди остальных 10 телят, давших положительные реакции на бруцеллезный антиген противобруцеллезные антитела в сыворотке крови до приема молозива не обнаружены. У новорожденных ягнят неблагополучных отар все 37 голов (100$), в образцах мекония которых выявлен бруцеллезный антиген, содержали антитела против бруцелл в преколостральной сыворотке крови. Наличие антигенов бруцелл в образцах мекония у 23 ягнят, имевшие противо -бруцеллезные антитела в сыворотке крови до приема молозива, не установлено .

В большинстве случаев бруцеллезный антиген обнаруживался в мекониях тех новорожденных,которые имели высокие титры противобруцел -лезных антител в преколостральной сыворотке крови. Например, у

телят, в мекониях которых обнаружен оруцеллезный антиген средний титр антител выявляемый в сыворотке крови по ТИФА составил 1:44,3 +0,43, тогда как у их аналогов, не имевших специфический антиген в пробах первородного кала, этот показатель был достоверно ниже - 1:31,3+0,41 (Р< 0,001). Аналогичные различия установлены и у новорожденных ягнят - соответственно 222,2+0,15 и 1:45,92+0,23 (Р< 0,001). Между содержанием противобруцеллезных антител в сыворотке крови до приема молозива и антигенов бруцелл в первородном кале новорожденных животных установлена прямая связь.. Коэффициенты корреляции были равны у телят - 0,35+0,12 (Р<0,01) и ягнят - 0,72 +0,05 О3 <0,01).

Таким образом, нами установлена возможность определения бруцеллезного антигена в мекониях новорожденных телят и ягнят с помощью иммуноферментного анализа на основе моноклональных антител. Выявление антигенов бруцелл в мекониях новорожденных животных до приема молозива, видимо, свидетельствует о ин^ицированности организма в период внутриутробного развития.

Зависимость состояния потомства от иммунологической реактивности материнского организма

Наши исследования показали, что из 51 новорожденного теленка и 4-х аборт-плодов, полученных от коров неблагополучной по бруцеллезу фермы, у 13 (25,5$) телят и 2-х аборт-плодов в сыворотке крови до приема молозива обнаруживаются антитела против бруцелл. При сравнительном анализе титров противобруцеллезных антител матерей и их новорожденных установлено, что из 15 коров, у потомства которых обнаружены антитела, 2 головы не реагировали на бруцеллез по всем использованным серологическим реакциям. Новорожденные утих коров до приема молозива в крови имели антитела против бруцелл, выявляемые по ТИФА в титре 1:4 и 1:128. Обнаруживаемые антитела принадлежали

к иммуноглобулинам класса м и g . В другом случае мать реагировала на бруцеллез только по РА в титре I:IOO++, а у её новорожденного антитела против бруцелл выявлены в более высоких титрах как в РМА,-так и по РОК и ТИФА соответственно 1:256++; 1:80++; иЬбВДО. Кроме того у данного теленка по результатам иммуноферментного анализа обнаружен и бруцеллезный антиген в первородном кале. У остальных телят урогень противобруцеллезных антител обнаруживаемых в преколостральной сыворотке крови был ниже, чем у матерей.

Установлено наличие определенной корреляционной связи мевду показателями серологических реакций коров и их новорожденных телят. Так, достоверная корреляционная связь выявлена между концентрацией комплементсвязывающих антител в крови коров и специфических агглютининов в преколостральной сыворотке телят С г=0,87;Р<. 0,01). Высокая степень связи установлена между титрами противобруцеллезных антител, выявляемых по ТИФА в сыворотке крови у коров, и PMA у телят (, г =0,90; Р<. 0,01). Средняя связь имелась между показателями твердофазного иммуноферментного анализа матери и новорожденного ( г=0,53;Р£ 0,05). Важно отметить, что антигены бруцелл в мекониях обнаруживались чаще у новорожденных, полученных от коров с высокими титрами агглютининов и комплементсвязывающих антител. Коэффициенты корреляции между показателями ИФА телят и РА, РСК материнского организма составили соответственно 0,84 (Р< 0,05) и 0,89 (Р<. 0,01).

Изучение взаимосвязи мевду иммунологической реактивностью организмов овцематок и их новорожденных показало, что некоторые ягнята по титрам противобруцеллезных антител выявляемых в РМА, РСК и ТИФА превосходят своих матерей. Количество таких случаев составило в РМА - 5,1%, РСК -8, % и в ТИФА - 22,8$. Причем в 3-х случаях титры противобруцеллезных антител в преколостральной сыворот-

ке крови ягнят превышали над материнскими одновременно в РИА,РОК и ТИМ. Например, если у овцематки титры противобруцеллезных антител, обнаруживаемые в РА составили 1:50++; РОК - 1:40++; и в ТИФА - 1:1600, то у её новорожденного показатели указанных серологических тестов были намного выше - соответственно 1:256++; 1:64++; и 1:4096.

Результаты корреляционного анализа показали, что содержание противобруцеллезных антител и антигенов возбудителя в организме новорожденных ягнят находится в прямой зависимости от специфической реактивности материнского организма. Так-, коэффициенты корреляции (.г ) между показателями РА, РОК, РБ11, ТИФА овцематок и РМА ягнят были равны от 0,34 до 0,42, РОК - 0,39-0,54, РБП - 0,34-0,47 и ИМ от 0,65 до 0,98. Значения приведенных коэффициентов корреляции статистически достоверны при Р< 0,01.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют о том, что между показателями характеризующими иммунологическое состояние материнского организма и новорожденного существует тесная взаимосвязь. 1

Анализ заболеваемости и падежа новорожденных животных

Наибольшая заболеваемость и летальность среди новорожденных животных отмечалось у телят и ягнят, имевшие в преколостральной сыворотке крови противобруцеллезные антитела и антигены бруцелл в ме-кониях (первая группа) по сравнению с молодняком, не содержавших в крови до приема молозива специфические иммуноглобулины и антигены возбудителя в первородном кале (вторая группа). Всего за период наблюдения (30 сут.) среди телят первой группы заболело 9 (39,1$) и пало 8 голов (34,8$), тогда как эти показатели у телят второй группы были значительно ниже:соответственно 6 (21,4$) и 2 головы (7,14$). Подобное различие по заболеваемости и падежу наблюдались

между группами ягнят.Среди ягнят первой группы заболело 28(32,9$) и пало 15 голов (21,4$), что намного выше заболеваемости и летальности регистрированных у ягнят второй группы:соответственно II (4,97$) и 6 голов (2,71$).

Таким образом, анализ заболеваемости и падежа животных показал, что новорозденные, содержавшие в сыворотке крови до приема молозива противобруцеллезные антитела и антигены бруцелл в мекониях, проявляли слабую устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, о которой свидетельствуют их высокая заболеваемость и значительный отход в процессе постнатальной жизни.

ВЫВОДЫ

1. У коров,содержащихся в неблагополучной ферме,после отела наблюдается выраженное проявление иммунологических реакций на бру-целлез.Положительные результаты РА,РСК,РБП,ТИ§А и РИД установлены у 87,3$ коров.

2. В неблагополучных отарах в период окота процент овцематок, реагирующих на бруцеллез,был в среднем равен 76,6$ (51,8$ - в первой отаре; 96,1$ - во второй отаре).Высокая серопозитивность установлена также у овцематок благополучной по бруцеллезу отары(66,6$).

j

3. По результатам ТИФА у 25,5$ телят неблагополучной фермы в сыворотке крови до приема молозива определяются противобруцеллезные антитела,причем последние обнаруживались в диагностических титрах одновременно в PMA, РСК и РБП у 5,9$ новорожденных.

4. Среди новоровденных ягнят благополучной и неблагополучной по бруцеллезу отар присутствие противобруцеллезных антител в сыворотке крови до приема молозива установлено в ТИФА соответственно

у 9,1$ и 31,9$(34,9$-в первой отаре; 29,5$-во второй отаре) живот- . ных. Из числа ягнят, полученных от овцематок неблагополучной отары, 6,9$ имели антитела против бруцелл как по результатам ТИФА, так и Р MA,РСК,РБП.

э. Новорожденные телята и ягнята, в преколостральной сыворотке которых обнаружены противобруцеллезные антитела, существенно превосходили своих сверстников по содержанию общего белка и глобулинов. У молодняка, рожденного без антител против бруцелл, отсутствует фракция гамма-глобулинов.

6. У телят и ягнят неблагополучных по бруцеллезу ферм в пробах мекония с помощью иммуноферментного анализа на основе моноклональ-ных антител установлено наличие бруцеллезного антигена, что свидетельствует о внутриутробном инфицировании. Антигены возбудителя бруцеллеза обнаружены у 34,5$ телят и 19,7% ягнят.

■7. Между уровнем антител в преколостральной сыворотке крови новорожденных телят, ягнят и случаями обнаружения бруцеллезного антигена в первородном кале отмечается взаимосвязь с коэффициента-тами корреляции соответственно: 0,35+0,12 и 0,72+0,05 (Р<0,01).

8. Антитела против бруцелл в сыворотке крови до приема молозива и антигены возбудителя в мекониях обнаруживаются преимущественно у новорожденных, полученных от маток с высоким уровнем про-тивобруцеллезцых антител, что свидетельствует о зависимости иммунобиологического состояния потомства от специфической реактивности матери.

9. Новорожденные телята и ягнята, содержащие в преколостральной сыворотке крови противобруцеллезные антитела и антигены возбудителя в мекониях, характеризуются низкой жизнеспособностью. Среди этих животных заболеваемость и летальность в течение первого месяца постнатальной жизни была высокой (соответственно у телят - 39,1$ и 34,8$, у ягнят - 32,9$ и ¿1,4$

10. Твердофазный иммуноферментный анализ, использованный нами для серологического исследования коров и овцематок.а также их новорожденных на бруцеллез, оказался найболее чувствительным тестом,

чем классические серологические реакции - РА, РСК и РБП.

II. Комплексное определение противобруцвллезных антител в пре-

колоотральной сыворотке крови и антигенов возбудителя в пробах ме-кония может использоваться для диагностики внутриутробного инфицирования и прогнозирования жизнеспособности новорожденных животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. а неблагополучных по бруцеллезу хозяйствах предлагается осуществлять диагностику внутриутробного инфицирования новорожденных животных с помощью разработанного нами способа, путем серологических исследований преколостральной сыворотки крови и определения антигенов бруцелл в мекониях.

2. Наставление по постановке и учету ИФА для экспресс-обнаружения антигенов бруцелл в патологическом материале (утвержденно Главным управлением ветеринарии с ветеринарной инспекцией МСХ Республики Казахстан от 8 декабря 1992 года).

3. штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L - продуцент моноклональных антител к бактериям рода Brucella (Ab. св. №1752764; Опубл. в Бюл.№29 от 07.08.92 г.) депонирован в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Бсесоюзной (ныне Всероссийской) коллекции клеточных культур ^г. Санкт-Петербург).

СПИСОК ОПУБЛИКОВАНШХ РАБОТ

1. Вулашев А.К..Дмитриев А.Ф., ¿енжанов К.Т., Кскендирова С.3. Оценка состояния плацентарного барьера больных бруцеллезом коров //Деп. в ВНИИТЭИ 14.02.89, №177 ВС-89, PS. Сер.-ЗО "Инфекционные болезни животных" - 1989. - jf-o. - 0.16.

2. Булашев А.К., шенжанов К.Т., Кскендирова 0.3., Боровиков G.H. Иммунологическая реактивность новорожденных телят в бруцеллезном стаде //Актуальные проблемы интенсификации животноводства в ис-

следованиях молодых ученых Южного Урала: Тез. докл. - Троицк,1989-С.20 - 21.

3. Шенжанов К.Т., Дмитриев А.Ф., Булашев А.К. Оценка функциональной системы мать-новорожденных при бруцеллезной инфекции//Вест. с.-х. науки Казахстана. - 1990. - №8. - С.74 - 76,

4. Шенжанов К.Т. Иммуноферментный анализ для обнаружения про-тивобруцеллезных антител в сыворотке крови новорожденных животных //Вклад молодых ученых и специалистов в научно-технический прогресс сельскохозяйственного производства: Тезд докл. - Ставрополь, 1991.-С.219 - 220.

5. Шенжанов К.Т. Эффективность И$А при диагностике бруцеллеза овец //Научные достижения молодых ученых и специалистов-животновод-ству:Тез. докл. - Семипалатинск, 1991. - С.32.

6. Шенжанов К.Т., Дмитриев А.Ф., Булашев А.К., Боровиков С.Н. Диагностика бруцеллеза у новорожденных животных //Материалы научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии: Тез. докл.- . Целиноград, 1991. - С.133.

7. Шенжанов К.Т., Булашев А.К. Изучение проницаемости плаценты , . //Веат. с.-х. науки Казахстна - 1991. - К9. - С.97 - 98.

8. Ескендирова С.З., Булашев А.К., Шенжанов К.Т. Новое диагностическое средство при бруцеллезе животных //Биотехнология.Приложение к экспресс-информации "Новости науки Казахстна . - Алма-Ата, 1991 - С.107 - 108.

9. Шенжанов К.Т., Дмитриев А.К., Булашев А.К. Иммунологическая реактивность овцематок и ягнят при бруцеллезной инфекции/Диагностика, лечение, профилактика инвазионных и инфекционных заболеваний сельскохозяйственных животных: Сб. науч. тр. - Ставрополь,1991.-

■ С. 41 - 48.

10. Булашев А.К., Дмитриев А.Ф., Еенжанов К.Т., Боровиков 0. Н., Ескендирова С.З. Способ диагностики внутриутробного инфицирования ягнят бруцеллезом //Положительное решение БНИИГПЬ от Ob.06. 1У91 г. на выдачу авторского свидетельства по заявке S4862905/I3

С093364) от U6.09. ±990 г.

11. Булашев А.К., Ескендирива С.о., Дмитриев А.ф., Боровиков С.П., шанжанов К.Т. штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus Musculus L -продуцент моноклональных антител к бактериям рода Brucella //Авторское свидетельство № 1752764 от 08.04.1992 г.

Опубл. в Бал. Л-29 от 07.08. 1У92 г.

РЕЗЮМЕ

Диссертациялык жумыстыц максаты - бруцеллез ауруына шалдык -кан табындардагы /отарлардагы/ жаца тузган бузаулар мен козылардыц иммундык .чуйiн зерттеу жэне аналыктар мен олардщ уыз cyt eMin улгермеген телдерхнщ арасындагы серологиялык тургыдан алгандыгы карым - катынасын аныктау.

Kefiöip телдердщ, атап айтканда 25,5$ бузаулардыц жэне 31,9 J козылардыц , уыз сутпен коректенер алдында алынган кан селдер!нде иммундык фермент тес1лхн1Ц / ИФТ / кемегхмен бруцеллез ауруныц коздырушысына карсы багытталган антиденелер табылган. ИФТ - нщ сеэгмталдыга баска серологиялын; реакцияларга / агглютинация реак-цяясына , комплементтх байланыстыру реакциясына жэне роз - бенгйл сьшауына / Караганда бхршама жогары болган. Осы телдердхн кейбхреу-лерхнщ алгашкы нэж1С1нщ улгхлерхнде бруцелла антигендер1нщ кездесеттндбгх ек1турл1 моноклональдык антиденелердщ кемегхмен койылган ИФТ - îmôh дэлелдеген. Зерттеу нэтижелерх мал дэр1гер -Л1К практикасына усынылган жаца тэС1Лдщ , ягни курсак хаинде бруцеллез коздырушысымен жуктырылган тедцердх аныктау тэс{л!нщ HeriaiH калаган. Уыз сутпен коректенбес бурьш алынган кан сел -дер!нде антиденелер1 бар немесе алгашкы нэтиже^нде бруцелла анти-гендерх табылган буяаулар мен коэылар , ягни жуктырылган телдер , коршаган ортаныц колайсыз жагдайларына карсы нашар тезхмд1л!к керсеткон. Аталган тэсхлдщ практикада колданылуы 1ндетт1ц тара-луьша тоскауыл болып, бруцеллезге шалдыккан табындардын /отарлар-дьщ / бул аурудан тезхрек айыгуына себепкер болады.

S U ft ii A E Y

The purpose of the dissertation was to study a immune status of newborn calves and lambs from brucellosis affected herds (flocks) and definition of a correlation between the results of serological test ( ¿LISA, SAT, SiT, &BPT) of dans and their posterity defore a colostrum feed.

Anti - brucella antibodies were detected in the precolostral sera obtained from 25,5^ calves and 31,9^ lambs with the help of 2LISA v/hich v.as more sensitive than the other serological test. Soae of these neonate contained Brucella antigens in the samples of feces according to the results of ndot" sandwich-iiLISA using Monoclonal antibodies of two hybridomas. On the base of obtained results the diagnostic test for detecting neonate infected with Brucella in utero was developed. The calves and lasbs with precolostral sera antibodies or Brucella antigens in feces, that is infected young animals,show low resistance against unfavourable factors of the environment. Application of the above mentioned diagnostic test into practice will prevent spreading infeotion among animals of affectedjtierds (flocks) therefore up the therms of brucellosis eradication prograunniQ •