Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Особенности патогенеза и иммунокоррекции хронического афлатоксикоза ВI и бензольной интоксикации цыплят

На правах рукописи

РГВ од

' . ДЕРЕВНИНА Оксана Николаевна

ОСОБЕННОСТИ ПАТОГЕНЕЗА И М.ШЮКОРРЕКЦШ ХРОНИЧЕСКОГО АФЛАТОКШКОЗА Вх И БЕНЗОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ ЦШШ1Т .

16.00.02 - Патология, онкология и морфология животных 03.00.04 - Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени .кандидата.ветеринарных наук

САНКТ - ПЕТЕРБУРГ 1997

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины, Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства , Санкт-Петербург

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Колабская Л.С.

доктор медицинских наук Белокрылое Г,А.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарии* наук,

. профессор Дютинский С. К.

кандидат биологических наук, доцент Вольский Г,Г.

Ведущая организация: Всероссийский научно-иссдедовательс-кий технологический институт птицеводства.

Защита диссертации состоится "/3' " ноября 19У7 г, в часов на заседании диссертационного Совета Д 120.20. UJ в Салкт-Иеторбургской государственно?. Авддемии ветеринарной медицины но адресу 1%СЬ4, г.. Санкт-Петербург, ул. Черниговская ,f

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской Государс-твенной Академии ветеринарной медицины»

Автореферат рапослан ** /О " октября 199? г.

Учены'.! секретарь

диссертационного совета, Ншадшиа И.В,

доцент

Актуальность исследования. Афлатоксиновад и бензольная интоксикации чаще протекают в хронической форме, развиваясь при воздействии на организм малых доз токсинов /0,0025-0,05 мг/кг ц -14,0-200,0 мг/кг массы соответственно/ и вызывают, по мнению большинства исследователей / Pier , -I98I; Захаров и др, 1990/, ослабление иммунной системы. Названные токсины играют важную роль в патологии животных и'человека, поскольку способны поражать большинство видов млекопита-, ющих, птиц, рыб и других представитзлей животного мира /Гусмап, 1970; Тутельян, 1985/. Афлатоксины и бензол высоко токсичны и канцерогенны. Наиболее токсичен афлатоксин Bj / яо.*лп , 1971/.

Для коррекции патологических состояний, индуцируемых бензолом или афлатоксином Bj, актуальным является изучение особенностей патогенеза этих процессов, выявление причин снижения иммунологической реактивности организма, в частности установление долевого участия иммунной системы в развитии хронического афлатоксикоза Bj и бензольной интоксикации.

Цель и задачи исследования. Цель настоящего исследования -изучение особенностей-патогенеза хронического афлатоксикоза Bj и бензольной интоксикации, анализ (механизмов вовлечения иммунной системы в патологический процесс, в частности, установление корреляции изменений в иммунной системе в зависимости от изменений в белковом обмене печени. Оценка иммунокоррегирухшдах свойств аминокислотных препаратов.

Для выяснения сходств и различий в механизмах развития афлатоксикоза Bj и бензольной интоксикации у млекопитающих и птиц опыты проводились на разных видах животных: мышах и цыплятах.

Для достижения поставленной Цели решались следующие задачи:

1. Изучить действие малых доз афлатоксина Bj, бензола, аминокислотных препаратов авиамина, церебролизина на иммунный ответ, содержание общего белка и альбуминов в зависимости от продолжительности скармливания с оценкой корректирующих возможностей аминокислотных препаратов.

2. Изучить влияние малых доз афлатоксина Bj, бензола, авиамина и церебролизина на фагоцитарный показатель й показатель завершенности фагоцитоза в зависимости от продолжительности аппликации препаратов.

3. Изучить механизмы действия малых доз афлатоксина Bj, бензола и различных доз аминокислотных препаратов на иммунную систему: а/, установить зависимость изменений в показателях специфической в неспецифической резистентности на разных- сроках после воздействия

малых доз афлатоксина Bp бензола или разных доз аминокислотных препаратов от содержания в сыворотке общего белка и альбуминов; б/, сравнительно исследовать способность низких, нетоксичных для клеток концентраций анатоксина Bj, бензола и аминокислотных trpo-ратов, индицировать in.vitro экспрессию на костномозговых Т-пред-шоственнкках основного маркера зрелых Т-клеток Thy-1-антигена; в/, проанализировать .возможность воздействия малых доз афлатокснне Bj и бензола на иммунный ответ путем активации цитокинов грануло-цитов; г/, установить зависимость содержания лизосомально-катионнь белков в фагоцитах к степенью завершенности фагоцитоза.

Основные положения, пьшоепуце на заа;иту.

1. Хронический афлатоксккоз Вт и бензольная интоксикация, индз цирозашше матами дозами токсинов, протекают двуфазно. В начальный /15 дноекый/ период интоксикации афлатоксин Вт и бензол активируют Т-систему иммунитета, что проявляется в стимуляции тимуеза-вкеймого иммунного ответа. При втом действие токсинов на фагоцита] яый показатель гранулоцятов неоднозначно: афлатоксин Bj увеличивает, а бензол не изменяет его.

2. па поздней стадии интоксикации- оба токсина снижают показатели специфической и кеспоцифичоской резистентности. Угнетение анатоксином Bp но не бензолом,иммунного ответа и показателя завершенности фагоцитоза коррелирует со снижением концентрации белковых фракций крови.

3. Авиамин, независимо от дозы не нормализует сниженных при ■ афлатоксикозе В^ иммуко- биохимических показателей, а при хронической бензольной интоксикации препарат высоко эффективен.

Научная новизна. Впервые показано, что афлатоксин Ь- и бензо. в малых дозах в начальный период -интоксикации, аналогично малым дозам аминокислотных препаратов стимулируют тимусзависимый, но не влияют на тпмуснозавнсдкый кммутшВ ответ, механизмы иммуно"5тиму=" ля или токсинами и амин окислотными препаратами различаются. Аминокислотные препараты усиливают иммунный ответ путем ускорения созревания Т-предивствеинкков. Токсины подобным свойством не облада*-ют. Иммуностимуляция токсинами осуществляется преимущественно путем Т-клоточного перераспределения. • В регуляции иммунного ответа при хроническом афлатокеккозе Bp но не бензольной интоксикации-, участвуют цитокины гранулоцитов.

Угнетение специфических и неспецифическкх показателей резисте ности афлатоксином Bp но не бензолом,коррелирует с и.чгийировалие белкового обмена в печени.

Авиамин и церебролизин обладают не только иммуно,-ф<агоцитоамо-'дулирувщими, но: й антитоксическими свойствами. Пммуномодулируютая активность аминокислотных препаратов в норме и патологии различается.

Теоретическое я'Практическое значение. Впервые установлено, что ингибирование афлатоксином Bj функциональной активности Т-системн иммунитета'коррелирует'С угнетением белкового обмена печони. Показано, что иммуностимулирующая и трофическая функции а?дшокислотннх препаратов обратнозавискми: авкамин и дерэбролизин в малых дозах стимулируют иммунный ответ, а в большей, трофической дозе, но влияют или да?е подавляют его, не .изменяя фагоцитарной активности гра-нулоцитов. Работа имеет и практическую значимость. Полученные результата важны при разработке методологических подходов в вопросах профилактики, лечения хронического афшатоксккоза 3j и бензольной интоксикации.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на втором и третьем Симпозиумах по проблема 'загрязнения, окружающей среды Центральной и Восточной Европы./Будапешт, 20-23 сентября 1994г., Варшава, 10-13 сентября I9S6r./, конференции молодых-физиологов и биохимиков России /С.-Петербург, 21-23 сентября 1995г./, Ученом Совете Б1ШШ1 /С.-Петербург, 28 декабря 19Э4г и 6 июня 1996г./, Методическом Совете кафедры биохимии Петербургского Государственного Университета /21 июня 1996г./.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ, 2 статьи приняты к печати.

Структура и обьам диссертации. Диссертация содержит введение, ' обзор литературы, методы исследования, три главы с описанием собственных экспериментов, заключение, выводы, практические предложения, список литературы. Работа изложена на 97 страницах машинописного текста, содержит 14 таблиц. Библиографический указатель включает 34 отечественных и 119 зарубежных источников.

Материалы и методы исследования.

Опыты ín vi'-'o проведены на 582 мышах-самцах линии СВА, начиная с 4-х недельного возраста /масса 14-16г/, и 369 цыплятах-бройлерах, начиная'с Ю-т'и дневного возраста /масса 50-6Сг/. Мыши получены из питомника Рапйслово, а цнллята - из птицефабрики Русско-Внсонкое /Россия/. Использовали препараты: афлатоксин Bj /Институт питания РАЖ, Москва/ в бензоле с. содержанием анатоксина Bj 1.10"^ мг/мл; бензол , Венгрия/; авиамин /гядролизаткрова кур, состоя-

щий из .18'аминокислот, завод медпрепаратов, С.-Петербург/; церебролизин /гидролизат мозговой тканв, "Ebsve" , Австрия/.

Препараты скармливали мышам через зонд в течение 15-60 дней, £ цыплятам - с кормом в течение I5-I2U дней в дозах: афяатоксин Bj-и бензол мышам - 2,5.10~® и 2,2-Ю"4 мг/кг, цыплятам - 6,5«10~4 * 88,0 мг/кг массы соответственно; авиамин и церебролизия - обоим видам /по белку 32,0 и I0G0 мг/мл соответственно/ - 6,5'Ю""^ и 65,0 мг/кг массы. Группа животных аминокислотные препараты скармливали сочетанно с анатоксином Bj или бензолом. Контрольные животине по аналогичной схеме получали физиологический раствор.

Затем часть животных внутривенно иммунизировали эритроцитами барана: мышей - 2<106, цыплят - 5.10^ клеток или vi • -антигеном

С •

/1-10"° мг/мышь/. На 4-ые сутки после иммунизации в селезенке каждого животного модифицированным метолом Jeme , jiordin определят число ф«гМ-антителообразувдих меток /АО/У. Для выявления АОК к-vi-антигену последний нагружали на' эритроциты барана. Конечная концентрация антигена составляла мг/мл. Для освобождения

от несвязавшогося vi-антигена эритроциты отмывали не менее б ра: Для выявления числа igM-AOK у мшшй и цыплят использовали свежий комплемент морской свинки /1:10/ или свежий куриный комплемент /1:3/ соотвотствонно. Число АOK у обоих видов пересчитывали на I01 кариоцитов селезенки.

Экспрессию in vivo и in vitro Thy-I-антигена на костномозговых Т-продшестьеннЕках мышей и цыплят под влиянием препаратов onpi деляли в комплементзависимом цитотокоическом тесте /»iaderhubor, м ler., .1978/с помощью специфических антн-ТНу~1-сывороток. ¿ля выявления мышиных тЬу-1+-клеток использовали кроличью антисыьоротку против гомогената коры головного мозга;мышей .-СБА. Для идентификации Tliy-I^-iuieTOK ццплят-антисыворотку против тимоцитов кур. ¿ля достижения специфичности антясыворотю! абсорбировали эритроцитами барана, гомогенпто« печении эритроцитами жинотного того вида, клетки которого исследовали /Fetjlo/a, ,1972/. После абсорбции антисыворотки в присутствии свежего комплемента соответствующего вида животного специфически реагировали с Т-кдетками: антнсыворот ка против коры головного мозга мышей /I:50/вызывала гибель 88,01,3% тимоцитов и не взаимодействовала с клетками костного'мозга, а ангискяоротка против куриных тимоцитов /1:1СО/ индуцировала гибель 92,0-^,тимоцитов и всего - 1,2-0,7/5 клеток бурсы.

В сыворотке неиммунизированных цыплят, получавших препараты, помощьп биуретового реактива' определяли концентрацию альбуминов в общего белка.

В другой группе у неиммунизированных животных и i- vitrj оц»

нивали влияние Препаратов на фагоцитарную активность царитонеаль-них гранулоцитов мышей.и цыплят..Конечная концентрация клеток лари-тонеального экссудата составляла 12,5 млн/мл, а микробных клеток-250 та/мл. Тест-микробом служит суточная культура aureus. Определяли фагоцитарный показатель /% гранулоцитов^ участвующих в фагоцитозе/, и фагоцитарное число /среднее арифметическое количество микробов в одном гранулоците/.

Для определения действия препаратов на способность первтоноалъ-ных гранулоцитов дезинтегрировать микробные клетки были проведены эксперименты по изучению завершенности фагоцитарного процесса методом Бермана, Славской /1958/.

В другой группе неиммунизирйванных цыплят, получивших препараты, в гранулоцитах определяли содержание лязосом&льно-катионннх белков.

Оценку антитоксических свойств аминокислотных препаратов проводили in vitro /Белокрылов и.др, 1996/. В качестве соединений, ока-» бывающих токсическое воздействие на спленоциты, использовали афла-

• А

токсин Bj или бензол в разведении /10/.

Каждый из проведенных опытов повторяли не менее 2-3 раз. 13 опытах in vitro подсчитывали не менее 6GG-8G0 клеток. Выявление погибших клеток проводили с помощью G,2% водного раствора трипанового голубого /"Sigraa"/. Жизнеспособность клеток в экспериментах in vitro составляла не менее 80-85$. Статистическая обработка данных производилась с помощью критерия Стыодента-для независимых выборок.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЯсЩОВАНИй

■ Изменения в иммуно-блохимяческих показателях в зависимости от продолжительности аппликации различных доз токсинов и .аминокислотных препаратов. Известно, что на поздней стадии афлатоксикоза Bj угнетение белкового обмена в печени сопряжено с уменьшением числа Т-клетОк /G-hosh et ai , 1990/. При этом остается невыясненным, сопровождается ли уменьшение количества Т-лимфоцитов снижением их функций, и коррелирует ли снижение числа Т-клеток со степенью инги-бярования белкового обмена. Для выяснения этого вопроса было проведено сравнительное изучение влияния малых доз анатоксина Bj на концентрацию сывороточных альбуминов, общего белка, отражающих состояние белкового обмена в печени, и показатель функциональной furthe-ностй Т-системн иммунитета•- уровень тлуусзависеаого аумуииого ответа.

Как следует из таблицы I, афлэтоксиц 3, на хортксм, 1.5-лм-. срока интоксикации, стимулировал иммунный ответ па эр'4т$.оц?.гч 6а.-

рана как у мышей, так и у цклЛят. Стимуляция иммунного ответа была сопряжена с увеличением концентрации сывороточных альбуминов, но не общего белка. 3 отличие от афлатоксина Bj, бензол на коротком /15 дневном/ сроке интоксикации стимулировал антителопродукцию у мышей, но подавлял её у цыплят, не изменяя концентрации альбуминов и общего белка. Афлатоксин Bj ua позднем, 60 дневном, сроке интоксикации подавлял иммунный ответ у обоих видов. Бензол в аналогичных условиях влиял на иммунный ответ у разных видов неоднозначно: у мышей утрачивал свойственное на раннем сроке иммуностимулирующее действие, а у цыплят сохранял им;;;уносупрессивний эффект. При.этом афлатоксин Bj снижал концентрацию альбуминов и общего белка, а бен зол не изменял их содержания. Снижение концентрации альбуминов и общего белка бензолом наблюдалось только на 120 день интоксикации и соответственно составляло 12,5^1,2, 27 ,'5^1,6 г/л против 23,0±1,2 и 46,4±1,6 г/л в контроле, Р<0,01.

Церебролизин в малой дозе /6,5»10"^ мг/кг массы/ на раннем /1Е дневном/ сроке испытания стимулировал иммунный ответ на эритроцит* барана как у мышей, так и у цыплят: число АОК составляло соответственно 34,5±3,8 и 6I,4-9;6 против 11,0-1,6 и 27,9±4,8 в контроле, Р.с 0,01. Авкамкн в той же дозе /6,5-10"^ мг/кг массы/, независимо от продолжительности аппликация /15 тля 60 дней/, стимулировал им-»лунный ответ у обоих видов. При стимуляции иммунного ответа авиа-мяном концентрация белковых фракций крова не менялась /табл.1/. Не наблюдалось изменений в содержании сывороточных альбуминов и ос щего белка и под влиянием цсребролизяиа: ях концентрации колебалис в пределах контрольных величин. Авиамин, церебролизин, как афлатоксин Bj и бензол в малых дозах, стимулируя тимусзависимый Иммунный ответ на эритроциты барана у мышей, не влияли на уровень тимус независимого иммунного ответа на tfi-антиген: чИсло АОК варькровш в диапазоне 3,4±G,5 - IC,CÄ2,2 против '9,1-0,7 в контроле. Испытание на раннем, 15 дневном, сроке кнтоксикации авиамина сочетанно с афлатоксином Bj практгчеоки не изменяло или даже снижало иммуностимулирующий эффект испытуемых препаратов, но достоверно /Р < 0,0J повышало содержание альбуминов, обцего белка у цыплят и приводило к гибели 23i птиц. В группе цыплят получивших только афлатоксин Bj гибели не наблюдалось. Сочетанное применение в аналогичных условиях авиамина с бензолом не имело подобных последствий. Авиамин при сочетшшом применении с афлатоксином Bj не нормализовал сниженных на позднем /60 дневном/ сроке у цыплят иммуно-биохимических показателей, в то же время восстанавливал до контрольных цифр ениженш

Тайдаца I

Изменения, иммуно- биохимических показателей з зависимости от срока скаршагвания зевотным различных препаратов /

i ; • Препараг : Число ig М-АОК на 10° каряоцатов 1 Общий белок,, г/л Альбуманы, г/л селезенки !

мыши. 15 дней бСдней . Ц Ы П Л Я T А ' 15 дней 60 дней ЦЫПЛЯТА 15 дней 60 дней t 15 днай 60 дней-

Физиологический раствор /контроль/ 15,0^1,0 ia,G±G,6 22,8*1,7 25,6*2,1 35,3*1,3 41,3*2,3 I5,5il,2 20,5il,2

Бензол 42,Q±6,2 18,5^1,3 s ^ * 9,0*1,1 13,2*1,3 38,Sil,2 44,4=0,3 II,9il,3 '18,5*0,5

Афгатоксин Вт • ЗЕ&" jg 34,2^7,8 10,.4*1,Э 38,4*1.9 16,В*3?0 37,Iii,3 30,8*1,0 19,Sil,3 15,Dil,0

Бензол + адиамин, о о.П'Ш чг/кг 28,5*6,4 25,5-1,9 24,6*2,8 25,1*2,4 35,3il,3' 44,4*0,3 12,Iii,3 . 18,0*1,5

Афлагоксзш Ь-г + -2 авиамин, о,5*IG МХ/;СГ , * -хз 25,5±3,2 12,5*2,0 37,2*2*3 18,0*1,1 54,2*3,8 . 31,4*1,3 25,7il,9 14,7*2,1

Афлатоксаа Bj + аваагдш, 65,0 мг/кг X ЛИ. 27,1-3,6 10,9*2,5 35,2*2,1 11,6*1,2 33,2-2,4 35,3*0,4 27,3iQ,4 16,0-0,5

Аьаашш, б. 5. IG -¿г/кг 29,5*5,1, :26,5*2,1 3G,3*2,1 32,5^2,0 34,Iii,3 38,74,8 I5,5il,2. 19,6*1,3

Авиамин. 85,0 иг/кг 9,0^2,0 10,5*1,3' 24,Ii9,2 11,4*1,4 35,3*1,3 39,0*1,7 14,3*2,1 I8,3i0,5

Примечание, Звездочка - достоверное различие с контролем: одна - при ? < 0,01, две -пра ?<0,05. В каждой груше. оОслодоаано по 5 цыплят ж 8 мышей.

. lö

бензолом на обоих сроках число АОК, но не изменял концентрации альбуминов и общего белка. Сниженные бензолом на 120 день концентрации альбуминов и общего белка соответственно с 23,0- 1,2 и 46,4¿ 1,4 г/л в контроле до 12,5^1,2 и 27,5^1,6 /Р<0,01/ нормализовались авиачином. Церебролизин в сравнительно большой дозе /65,0 мг/кг/ на раннем, 15-ти дневном, сроке испытания не влиял на уровень иммунного ответа у'обоих видов: число АОК составляло IS,'¿¿6,I, 3G,G±IÖ,2 против 15,(£1,1 и 27,9-4,8 в контроле. Авиамш.в той же дозе инги-бировал иммунный ответ у мышей, но не влиял на его уровень у цыплят На позднем сроке препарат'угнетал антителопродукцию у Обоих ввдов' /табл. I/,

Полученные данные свидетельствуют о различиях в механизмах действия анатоксина Вг,- бонзола .и аминокислотных препаратов.

Изменения"в фагоцитарной активности грькулоцлтов в зависимости от продолжительности аппликации различных доз токсинов и аминокислотных препаратов. .Действие- анатоксина ii. и бензола на фагоцитарную активность гранулоцитов изучено недостаточно.

Цель настоящего раздела работы - изучить in vivo изменения fjaromiтарной активности гранулоцитов мышей и цыплят под влиянием малых доз анатоксина В|, бензола с оценкой фагоцитоэкорректиру.»-щих свойств аминокислотных препаратов аьиачина и церебролизина.

Из представленных в таблице 2 данных следует, что.афлагоксин у мышей, независимо от сроков наблюдения /15 или 60 дней/, достоверно /Р<0,01/ увеличивал Фагоцитарный показатель. У цыплят анатоксин Bj усиливал фагоцитарную активность гранулоцитов на раннем, но но на позднем сроке наблюдения. Бензол у обоих видов, независимо от продолжительности аппликации, не влиял на фагоцитарный показатель. Усиление анатоксином Б|, но но бензолом, :{агоцитарноЕ активности гранулоцитов объясняется, вероятно, увеличением анатоксином числа гралулоцитоБ в периферической крови. Так у цыплят афлатокснн ¡ увеличивал число гранулоцитов с 43,0-3,4а в контроле до 75,G-3,3Í с одномоментным снижением количества моноцитов- с 56,0-3,0% в контроле до 25,0*2,5;». Бензол в аналогичных условиях не наменял количества гранулоцитов и моноцитов: число последних соответственно составляло 43,0-3,4%, 56,0-3,0:í в контроле и 45,0-3,5Í, 55,0±2,?,Е в опыте.

о

Авиамин у мышей и цыплят как в малой /6,5-10 мг/кг/, так и в сравнительно большой /65,0 мг/кг/ дозе, независимо от срока скармливания препарата, уволичивал фагоцитарный показатель. Переброли-тин, влияние которого на фагоннтарный показатель било изучено

нами только у мышей на коротком сроке, стимулировал фагоцитарную активность гран'улоцитоь лишь в большой дозе /65,0 мг/кг/: фагоцитарный показатель состаьлял 25,0^0,6 против 17,5±0,7;£ в контроле,. Р* 0,01. Авиамин при сочетанном применении с афлатоксином Бр независимо от дозы и срока наблюдения, не изменял у обоих видов даго-цитозстимулирующего эффекта анатоксина Вт. При сочетанном испытании авиамина /6,5*10 мг/кг/ с бензолом фагоцитарный показатель гранулоцитов у мышей увеличивался на обоих сроках, а у цыплят -только на раннем /15-ти дневном/ сроке; фагоцитарное число под влиянием вышеупомянутых препаратов не менялось и колебалось в диапазоне 1,96-и-,04 против 2,2-0,2 в контроле.

Поскольку фагоцитарный показатель отражает'преимущественно изменения в хемотаксисе фагоцитов, но не характеризует биохимических процессов и степени дезинтеграции микробов внутри фагоцитов, и последующем при изучении фагоцитоза у цыплят охарактеризовали изменения не только фагоцитарного- показателя, но такг.е изменения внутриклеточных процессов в фагоцитах, в частности степень завершенности Фагоцитоза и уровень ЛКБ.

Показано, что афлатоксин В£ на раннем сроке интоксшсашш не снижал дезинтегрирующих свойств фагоцитов. На более позднем /60 дневном/ сроке афлатоксин В^ снижал показатель завершенности, но не изменял уровня ЛКБ. Бензол на обоих сроках снижал показатель завер- . шенности. При этом уровень ЛКБ под влиянием бензола на раннем сроке не менялся, но достоверно /Р<0,01/ снижался на позднем сроке интоксикация. Авиамин в обеих дозах, независимо от срока аппликаций, не изменял показателя завершенности фагоцитоза и уровня ЛКБ. В то же время авйамин пря сочетанном применении с анатоксином BJ на коротком сроке, независимо от дозы, резко снижал показатель завершенности фагоцитоза. Аналогичным действием обладал в малой дозе цэребро-лкзин: показатель завершенности снижался с'8?,сД1,7$ в контроле до 33,5^2,<}';», Р<0,С1. Фагоцитарное число при изучения влияния афяа-токсина , авяачшна и их смеси на завершенный фагоцитоз не менялось и колебалось в диапазоне: 1,7^0,6 - 1,9^0,7 против 2,3^0,7 в когтро-ле. Вместе с тем аниамнн в малой дозе в сочетании с бензолом увеличивал фагоцитарное число с 2,3^0,7 в контроле до 5,3^1,0 /Р<0,05/ и восстанавливал сниженные под влиянием бензола на обоих сроках показатели завершенности до уровня контрольных цифр. Авиамин в малой дозе восстанавливал и сниженный на позднем сроке бензолом уровень ЛКБ.

' Таблица 2

Изменения неспеширичеокой резистентности в зависимости от срока скармливания жзтотнык различна* препаратов /5Йп /

Препарат Фагоцитарн МН|1 ' 15 дней 60 шей ый показатель, % ЦЫПЛЯТА 15 дней . 60" дней Показатель завершен- .Уровень ЛКБ, ед ноет*, % ЦЫПЛЯТА-Г5 дней 60 дней ! 15 дней 60 дней ,

Физиологический .раствор /контроль/ 25,9*0,Л 22,0*1,9 25,5*1,6. 23,5*1,7 87,0*1,7 92,0=1,3 1,8=0,03 1,8*0,02

Бензол ■ 27,1*4,1 24,5*1,7 27,0*0,7 27,8=2,2 ¡80,3*1?6 37,0=2,4 1,6*0 ,13 ' 1, 4*0 ,04

Афлатоксин В| 39,5=3,1 33,6*2,4 43,6*2,8 .24,4=2,1 '¡83,3*1,5 61,0=2,0 1,8*0,03 1,6=0,02

Бензол + авинияя, 6,5-Ю-2 мг/кг 29,710,8 ¿8,5*2?3' 37,5*2,3 28,4*1,9 92,0*1,9' 86,0*2,4 ' ■1,8*0,03 1,7*0,04

Анатоксин +• . авиамин, 6.5-1С"2 мг/кг 36,6*3,3 35,6*2,4 37,5*3,0 36,7*2,1 30,5*2,1 .58,0*1,9 1,7*0,03 1,7*0,04

Афлатоксин В| + а&камин,- 65,0 мг/кг " ** 1 3 33,9-2,5 33,3=2,3 41,8*2,6 40,2*2,2 36,5=2,5 55,5*2,5 1,7*0,04 1,7=0,12.

Авиамнн, : • ■■ (30,3±1^Ь,5*2?2 6.5- мг/кг !' 1 ■ 40,5*2,5 33,9*2,2 85,0=1,9 88,0=1,5 1,8=0,02 1,8=0,02

Авищжн, 65,0 мг/кг 1 ¿631 31,2=0,8 ¡30,5=1,9 44,5*2,8 42,8*2,7 88,1=1,6- 89,0=1,6 1,5=0,02 1,8*0,03.-

Примечание.' Звездочки -при Р < 0,05. достоверное различие с контролем: одна - при Р--0.01, две -В каждой группе обследовано по 5 цыплят и 8 мышей.

Вышеизложенное показывает, что при хроническом афлатоксикозе Bj и бензольной интоксикации снижается уровень не только специфической, но и неспецифичвской резистентности. При атом аминокислотные препараты авиамин и церебролизин неспособны восстанавливать сниженный афиатоксином Bp но не бензолом. показатель завершенности фагоцитоза. В связи с этим важно было выяснить, не обладают ли аминокислотные препараты i'i vivo и in vitro антитоксической активностью. Показано, что авиамин и церебролизин в низкой концентрации /1,3. 10"^ мг/мл/ защипали in vitro спленоциты мышей и цыплят от токсического воздействия афлатоксина Bj /1,0.10~® мг/мл/. Индексы цитотоксичности афлатоксина Вj для спленоцитов мышей и цыплят, предварительно обработанных аминокислотными препаратами, составляло: 21,2* 2,9, 23,0*2,1 и 17,5*2,6, 16,5*2,б£ соответственно против 31,0* 2,3% в контроле /Р<0,05/. Для клеток цыплят авиамин и церебролизин были испытаны не только в малой, но и в сравнительно большой концентрации /1,3 мг/мл/, что соответствует дозе 65,0 мг/кг в опытах in vivo . Оба препарата в этих условиях защищали 1п спленоциты цыплят от токсического воздействия афлатоксина Bj: индексы- Цитотоксичности снижались с 31,0*2,3$ в контроле до 9,7*1,5 и 11,5*1,92 /Р<0,01/. Антитоксические свойства авиамина сохранялись in vitro и при добавлении к клетка« мышей и цыплят в смеси с афта-токсином 3j. Авиамин и церебролизин /1,3« 10"^ мг/мл/ заярнцалй In vitro спленоциты мьшей не только от афлатоксина Bj, Но и от бензола /8,8*10~^ мг/мл/: индексы цитотоксичности снижались с 21,1*1,4? в контроле до соответственно 12,9*2,4, 4,3*1,4$ /Р¿ 0,01/. Церебролизин, независимо от концентрации /1,3«10 мг/мл И 1,3 мг/мл/, задияал клетки цыплят от бензола: индексы цитотоксичности составляли 3,5*1,3, 6,9*1,3* против 19,3*1,3% в контроле /Р< 0,01/. Авиамин в аналогичных условиях не обладал протективными свойствами. Б то же время in vivo авиамин проявлял антитоксическое свойство в отношении, обоих токсинов.

Полученные данные показывают, что афлатоксин Bj и бензол в малых дозах способны снижать показатели неспецифической резистентности, резко угнетать дезинтеграцию микробных клеток внутри фагоцитов. Механизмы снижения афлатоксином Bj и бензолом показателей несиецн-фической резистентности различны. Об этом свидетельствует неспособность авиа-шна нормализовать сниженного афшатоксином Bj, но не бензолом показателя завершенного фагоцитоза, при одинаково выраженной антитоксической активности в отношении обоих токсинов.

Сходства и различия в механизмах имздуномодулирурщвго.действия аФлатоксина Bj, бензола и аминокислотных препаратов. Иммуномодули-. руюцие свойства анатоксина Bj-, бензола, как и аминокислотных препаратов /авиамкна и церобролизина/, не могут быть объяснены конкуренцией антигенов, поскольку имеют низкий молекулярный вес /менее 10 ООО в / и,следовательно,не обладают антигенными свойствами / g<*i-rel , 1989; Захаров и др, 1990/. '

Несмотря на. сходство в действии анатоксина 11 бензола, проявляющееся в ранний период /через 15 дней/ после скармливания препаратов иммуностимуляцией, а в поздний /на 60 день/ снижением показателей специфической и неспецифической резистентности, долевое участие иммунной системы в развитии хронической бензольной и афлатокси-новой интоксикаций неоднозначно. Стимуляция афлатокеаном Bj или бензолом в рашшй пераод интоксикации тимусзависимого, но не тимус-неьалисимого иммунного ответа свидетельствует о вовлечен»» в процесс X-, но не В-системы иммунитета.

ВовлечениеТ-системн в ранний период хронической бензольной интоксикации реализуется неспецифически путем Т-клеточного перераспределения. Ой этом свидетельствует увеличение in vivo бензолом /2,2.10"4 мг/га/ у обоих видов числа ТЬу-1+-клеток в костном мозге /у мюлей с С% в контроле до 25,6±3,0#, у цыплят с 1,2-0,5/5 в контроле до 22,9*2,5$/при одновременном снижении их количества в селезенке /с 20,0±2,8 и 29,3-3,0/5 до соответственно 5,2¿I,5 и 8,9±2,Of/. Действие в аналогичных условиях афдатоксииа Bj /2,5-10~9 иг/кг/ на перераспределение Т-клеток значительно менее выражено. У шлей и цыплят число тЬу-1*-лимфоцитов повышалось соответственно с 0%, 1,2-0,5% в контроле до 8,0*2,0 и 9,6*2,1$ /Р< 0,01/ и не изменялось й оелеэенке /20.0*2,8 в контроле и 24,7*2,8$ в.опыте/. '

-Стимуляция иммунного ответа афлатоксином В-, вероятно, может

реадизовнваться так&е путем активацви цитошшв гранулоцитов. Этот постулат подтвердился в опытах- in vitro• г перитонеальные грануло-цитн мышей, обработанные нетоксичной для клеток концентрацией афлатоксина Bj, приобретали способность вырабатывать фактор, стимулирующий иммунный Ответ. Число'АОК после введения мытам надосадка кле-. ток, обработанных афлатоксином Bj,возрастало о 10,2*0,6 в контроле до 1Э.1-1.0 /Р<0,05/, но не изменялось под влиянием бензола: число АОК составляло 10,9±0,9 против 10,2*0,6 в контроле.

Иммуностимулирующий эф]ект аминокислотного препарата авиамина в малой дозе /b,5.10~2 мг/кг/, как и изучаемых токсинов, сопровождался увеличением Thy-I^-клеток .в костном мозге: у мышей с С,5 в .

в контроле до 14,3*1,6%, у цыплят с 1,2*0,5% в контроле до 14,31,7% /Р<0,01/. Однако, увеличение аьи&шшом числа Тку-1+-клеток в костном мозге, в отличие от аналогичного эффекта токсинов, не связано с перераспределением Т-клеток, поскольку авиамин способен индуцировать экспрессию Tby-1-антигена непосредственно на костномозговых Т-предшественниках: обработка in vitro авйачином /1,3-10"^ мг/мд/ клеток костного мозга мышей повышала число ТЬу-1+-лим-фоцитов ей в контроле до 11,5*2,3%,'а у цыплят - с 1,5*0,6% в контроле до 13,9*1,7% /Р-tO.QI/. Токсины подобным свойством не обладали: обработка m vitro клеток костного мозга анатоксином Вт- /I,0-Ю-^ мг/мл/ или бензолом /8,6.мг/мл/, не оказывающих прямого цитотоксического действия, не приводила к экспрессии Ttiy-1-антигена /индекс цитотоксичности колебался в диапазоне контрольных величин : 0% - 1,5*0,8%.

Утрата авиамином иммуностимулирующей активности при испытании в трофической дозе /65,0 мг/кг/ объясняется, вероятно, неспособностью препарата индуцировать экспрессию Thy-1-антигена на Т-предшествен-никах: обработка in vitro авиамином в дозе I(3 мг/мл /соответствует дозе. íü vivo 65,0 мг/кг/ клеток костного мозга мышей или цыплят не приводила к увеличению числа т1гу-1+-клеток /индексы цитотоксичности составляли соответственно 1,2*0,3, 1,4*0,6% против 0% -1,5*0,5% в контроле/.

Афлатокснн Bj и бензол действуют на разные субпопуляции грану-лоцитов, о чем свидетельствует: I/. увеличение m vivo и in vitre афл&токсином Bj, но не бензолом фагоцитарного показателя; 2/. удвоение in vitro числа погибших от бензола гранулоцитов.

Известно, что изменения концентраций белковых фракций крови отражают состояние белкового обмена печени. В наших опытах уменьшение концентрации общего белка набладалось при хроническом афш-токсикозе Bj, но не бензольной интоксикации. Следовательно снижение анатоксином В^ показателей специфической и неспецифической резистентности отражает в первую очередь угнетение белкового обмена печени. Последнее подтверждается отсутствием изменений в концентрациях общего белка при воздействии -бензола, действие которого направлено главным образом на костномозговые клетки кроветворения, функционально связанные с Т-системой иммунитета /Захаров и др, 1990/,

В поздний период интоксикации под влиянием бензола снижается функциональная активность не только Т-, но и Б-снстемы иммунитета. Об зтом свидетельствует уменьшение клеточности не только селезенки, но и бурсы.

Поскольку афлатоксин Bj снияал концентрацию альбуминов, обладающих выраженной детоксицирувщей активностью /Луйк и др, 1584/, а бензол, как известно, может способствовать .приобретению сыворотками лимфоцитотоксических свойств /Мусихин, 1958/, следовало ожидать приобретения сыворотками цитотоксичности. Однако цитотоксичность сывороток оказалась крайне низка и составляла всего 3-5%. Приведенные данные показывают, что уровень цитотоксичности не отражает степени интоксикации, индуцированной малыми дозами афлатоксина Bj-или бензола.

Основными механизмами, способствующими отягощению авиаминоы течения афлатоксикоза Bj, вероятно являются: I/. резкое угнетение /с 83,до 30,о%/ показателя завершенности фагоцитоза. 2/. снижение устойчивости сдленоцитоБ к анатоксину Bj /индекс цитотоксич-' ности афлатоксина Bj /1:10 ООО/ in vitro составлял 73,4-3,1% против 44,0-3,5$ в контроле, ?<0,05.

■ вывода

I. В опытах-на цыплятах и мышах показано, что афлатоксин Bj и бензол в малых дозах на раннем сроке интоксикации аналогично малым дозам аминокислотных препаратов авиамина и церебролизина стимулируют таиусзависимый имчункый ответ.

■ 2. Механизмы иммуностимуляции токсинами и аминокислотными препаратами различаются. Бензол стимулирует иммунный ответ путем перераспределения Т-клеток, попадания их в костный мозг, индукции эксп-. рвссиг TÍiy-I-антигена на Т-предшественниках и, соответственно, усиления Т-клеточной дифференцировкй. Афяатоксин Bj стимулирует иммунный ответ не только посредством Т-клеточного перераспределения, но путем активации цитокинов гранулоцитов. Авиамин и церебролизин стимулируют иммунный ответ посредством экспрессии Tiiy-l-антигена некое редственно на костномозговых Т-предшественниках с последующим усилением Т-Меточной дифф>еренцировки.

3. Авиамин и церебролизин в сравнительно большой /трофической/ дозе лри многократной аппликации интактным животным утрачивают иммуностимулирующее свойство. Утрата иммуностимулирующей активности коррелирует с неспособностью препаратов в концентрации, соответствую дей дозе in viro , индуцировать in vitro экспрессию Tby-I-ан-твгена на Т-предшественниках.

4. Авиамин у Интактных животных как в малой, так и в сравнительно большой /трофвЧеской/ Дозе, независимо от сроков адшшкациж, повывает фагоцитарный показатель, не ьлияя на завершенность.фаго- . ця7арного процесса. ..'..:.

5. Авнамин и церебролизин, независимо от дозы и сроков аппликации, не изменяют концентрации сывороточных альбуминов, но обладают выраженными антитоксическими свойствами.

6. Анатоксин Bj.ii бензол в малых дозах на раннем этапе интоксикации неоднозначно действуют на фагоцитарный показатель: анатоксин повышает фагоцитарный показатель, но не влияет на завершенность фагоцитарного процесса, а бензол не изменяет фагоцитарного показателя, но снижает показатель завершенности.

7. Снижение на позднем сроке интоксикации анатоксином Bj, уровня гуморального иммунного ответа и показателя завершенности Фагоцитоза коррелирует со снижением концентрации белковых фракций крови,

8. Аминокислотный препарат авиамин неоднозначно действует на сниженные показатели резистентности при хроническом афлатоксикозе и бензольной интоксикации: нормализует уровень иммунного ответа, показатель завершенности фагоцитоза при бензольной, но не афлаток-синовой интоксикации.

■ 9. Видовых различий у цыплят и мышей в механизмах иммуно,-*аго-цитозмодулирующего действия токсинов н аминокислотных препаратов не выявлено.

ПРАКТИЧЕСКИЕ 11РШСКЕНИЯ *

1. Рекомендовать применение различных.гидролизатов типа авиамина, церебролизина в малой дозе /6,5-I0-ii мг/кг/ для коррекции у цылдят сниженных бензолом иммуно-биохимическит. показателей.

2. Разработаны методические указания "Модифицированный способ определения количества Tg М-антителообразущих клеток у цыплят методом локального гемолиза в геле", одобренные Ученым Советом Всероссийского ГС1ВИ птицеводства 29 апреля 1997 г.

3. Материалы, изложенные в диссертации используются в учебном процессе на курсах повышения квалификация ветеринарных врачей Всероссийского НЛБИ птицеводства. •

СПИСОК РАБОТ, 0ПУБЛ1К0ВАИШХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Белокралов Г.А., деревнина О.Н.,. Попова О.Я. Иммунб.-фагоци-тозмодулирупдио свойства малых доз анатоксина Bj и бензола // Еюлл. экспер. биол. -1ЭЭ4.-#2.-СЛ58-160.

2. Еелокрклов Г.А,, Попова О.Я., Деревнина O.K., Молчанова И.В. ■

Неоднозначность действия больших и малых доз аминокислотных препаратов на иммунный ответ и фагоцитоз у мышей //Билл, экспер. биол 1994,-^5.-С.500-501.

3. Деревнина О.Н. Различия эффектов на иммунную систему малых доз афшатоксина Bp бензола и^пептидно-аминокислотных препаратов //В тезисах конференции молодых физиологов и биохимиков России "Биохимические и биофизические механизмы физиологических функций". СПб. -1995.-С". 60.

4. Белокрылов Г.А., Деревнина О.Н., Попова О.Я., Молчанова И.В. Сорочинская Е.И.■ Различия в иммунном ответе, фагоцитозе и деток-сицирующих свойствах иод влиянием пептидных и аминокислотных пре-. паратов //Бюлл. Экспер.Биол.-1996,-№5.-С.509-512.

5. Деревнина О.Н. Модифицированный способ определения количест ва 1б(Л-аитителообразующих клеток у цыплят методом локального гемо лиза в геле //Методические Указания, БШШП.-Спб.1997.

6. Белокрылов Г.А., Деревнина О.Н..Попова О.Я., Коровин Р.Н. Различия в йммуно-биохимических показателях и их иммунокоррекции йри хроническом афлатоксикозе Bj и бензольной интоксикации //Доклады РАСХН.-1998,-И. :

7.Белокрылов Г.А.., Попова О.Я., Деревнина О.Н. Различия в показателях фагоцитарной активности гранулоцитов и их иммунокоррекции при хроническом афлатоксикозе Bj и бензольной интоксикации //Бюлл. экспер. биол.-1997.-принята к печати.

3. Derevnina O.W., Belokrylov G.A., Popova O.Ya, Low concentration of benzene and aflatoxin B^ stimulate the immune response but irifluenco phagocytosis in a different way //Second International Symposium and Exhibition on EnviroaTiental Contamination in -Central_and_Ea3tern Europe. Budapest, Hungary.-1994.-P.538-540.

9. Popova O.Ya., Belokrylov G. A., Derevnina 07N7~Tj0w~d0ses

of benzene, aflatoxin B^ and peptide-amino acid preparations acti' vate irainurie system by different mechanisms' //International Symposium and Trade Fair on the Clean-up of Manufactured Gas Plants. Prague, Czech Republic.-1995.-P.14-8. ,

10, Belokrylov G.A., Derevnina O.K., Popova O.Ya. Aflatoxin В and benzene influence the immuno-biochemical indeces of chickens in a different way //Third International Symposium and Exhibition on Environmental Contamination in-Central and Eastern Europe. Warsaw, Poland. 1996.-P.33. ■

11, Belokrylov G.A., Popova O.Ya,, Der'evnina O.H,, Molohanova I.V., Sorochlnakaya E.I. Iramuno,-phagocytosis-modulating antitoxic properties of amino aoide and peptide preparations //Drug Development Industrial Pharmaoy and Biotechnology Therapeuties#-1996-in press*

fun bHUmfrl^atUjup fOO. ¿[f-Sh.