Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Определение количества живых микробных клеток в противобруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом

ДИССЕРТАЦИЯ
Определение количества живых микробных клеток в противобруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом - диссертация, тема по ветеринарии
АВТОРЕФЕРАТ
Определение количества живых микробных клеток в противобруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом - тема автореферата по ветеринарии
Зверев, Дмитрий Сергеевич Москва 2008 г.
Ученая степень
кандидата биологических наук
ВАК РФ
16.00.03
 
 

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Определение количества живых микробных клеток в противобруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом

На правах рукописи

Зверев Дмитрий Сергеевич

ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОЛИЧЕСТВА ЖИВЫХ МИКРОБНЫХ КЛЕТОК В ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ ВАКЦИНАХ БИОЛЮМИНЕСЦЕНТНЫМ МЕТОДОМ

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксшсологией и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 2008

003459302

Работа выполнена в лаборатории качества и стандартизации лекарственных средств против хронических болезней животных Федерального государственного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») и на кафедре химической энзимологии химического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель: Научный консультант:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор ветеринарных наук, доцент Скляров О. Д. кандидат химических наук, доцент Фрунджян В. Г.

доктор биологических наук Телишевская Л .Я.

доктор биологических наук Бедоева З.М.

Федеральный центр токсикологической и радиационной безопасности животных -Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт (ФГУ «ФЦТРБ -ВНИВИ»), г. Казань

Защита состоится г^Аф^1^ 2009 г. в « тУ» часов на заседании дис-

сертационного совета Д.220.011.01 в Федеральном государственном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГУ «ВГНКИ») по адресу: 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д. 5, тел/факс 253-14-91.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан Ф^» г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат ветеринарных наук, Заслуженный ветеринарный врач РФ

'А. Козырев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В России для борьбы с бруцеллезом животных проводится комплекс организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий, успех которых во многом определяется применением средств специфической профилактики, преимущественно живых сухих вакцин (Иванов М.М., 1977).

Количество жизнеспособных микробных клеток определяет количество иммунизирующих доз в конкретном объеме вакцины, а их количество в дозе, наряду со свойствами штаммов - ее иммуногенность. В связи с этим, контроль выживаемости бруцелл в живых бруцеллезных вакцинах осуществляют на предприятии-производителе при их выпуске, а также в ФГУ «ВГНКИ» в порядке проведения контроля за сертифицированной продукцией в процессе хранения (Апсите А.Ф., 1968; Опарин Ю.Г. и др., 1996; Пучков Е.О., Говорунов И.Г., 1983; АпШеишве 1 е1 а1„ 1981; ВоизйеМ и., Маскегше А.Я., 1976). В настоящее время это делают с помощью культурального (чашечного) метода, определяя количество живых бруцелл - колониеобразующих единиц (КОЕ) по числу колоний бруцелл, выросших на плотной питательной среде, и биохимического метода, оценивая дегидрогеназную активность живых бруцелл с использованием метиленового синего. Культуральный метод являются трудоемким, и позволяет получить результат через 4-5 суток, а с учетом предварительной проверки ростовых свойств питательной среды этот срок увеличивается еще в 2,5 раза. Биохимический метод проще по воспроизведению, время анализа занимает до 5-6 часов. Однако результаты исследований, полученные с помощью указанных методов, не всегда коррелируют (Баландин Г.А., Сазы-кин С.П., 1963), что обусловлено, в первую очередь, визуальной оценкой результатов биохимического теста.

В связи с этим, в биотехнологических производствах все шире используют ускоренные (косвенные) методы определения титра жизнеспособных клеток. По данным литературы среди большого разнообразия методов, используемых для этих целей, весьма перспективными являются методы, осно-

ванные на определении содержания различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов, в первую очередь, внутриклеточного аденозинтрифос-фата (АТФ). АТФ - универсальный внутриклеточный метаболит, который содержится в относительно высоких концентрациях в любых живых микро - и макроорганизмах. Его количество с большой точностью можно определить при помощи биолюминесцентного метода даже при ультра малом содержании в образце - до 10"14 - 10'15 моль/кювета люменометра (Дементьева В.И. и др., 1999; Cousins С.М. et al., 1981). После гибели клеток содержание АТФ, в отличие от других внутриклеточных метаболитов, резко снижается в течение нескольких секунд (Gibson D.M., 1987). Таким образом, по содержанию внутриклеточного АТФ в анализируемом образце можно судить о наличии в нем, в количественном выражении, живых клеток, что представляет практический интерес при проведении контроля живых вакцин при выпуске организацией-производителем или в процессе их хранения, а также при оценке качества бактерийной массы, подвергшейся стрессовым воздействиям (замораживание-оттаивание, лиофилизация и др.).

С учетом вышеизложенного разработка методики экспресс определения количества жизнеспособных микробных клеток в бруцеллезных вакцинах, основанной на применении биолюминесцентного метода, представляется актуальной.

Цель работы. Разработать методику определения количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах, основанную на использовании биолюминесцентного метода.

Основные задачи исследования:

1. Оптимизировать порядок подготовки образцов нативных и лиофили-зированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ.

2. Установить оптимальные параметры определения количества живых микробных клеток в суспензиях нативных и лифилизированных культур бруцелл биолюминесцентным методом.

3. Провести сравнительное исследование методик определения живых

бруцелл на основе биолюминесцентного и культурального методов с использованием коммерческих серий бруцеллезных вакцин.

4. Разработать методические рекомендации по определению количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах с использованием биолюминесцентного метода.

Научная новизна. Впервые изучены и определены оптимальные параметры пробоподготовки, установлены возможность и порядок определения количества живых бруцелл разных видов в составе бруцеллезных вакцин или бактерийных суспензий биолюминесцентным методом.

Практическая значимость. Применение биолюминесцентного метода для определения количества живых бруцелл позволяет:

- сократить время контроля выживаемости бруцеллезных вакцин в 5-10 раз, в сравнении с культуральным методом, исключив применение при этом использование питательных сред;

- значительно уменьшить контакт технического персонала биопредприятий с вакциной, предохранив его тем самым от сенсибилизации и аллер-гизации.

Апробация полученных результатов. Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на 5-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006г.), конференциях молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006, 2007г.), заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.).

Положения, выносимые на защиту:

- оптимизация подготовки образцов нативных и лиофилизированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ;

- разработка порядка определения количества жизнеспособных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом;

- анализ результатов сравнительного изучения выживаемости микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным и культуральным методами.

Публикация результатов исследований. По теме диссертационной работы опубликовано 4 научные статьи, в том числе 2 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 92 страницах машинописного текста и включает введение, обзор литературы, собственные исследования, результаты собственных исследований, обсуждение результатов, выводы, практические предложения, список литературы и приложения. Работа иллюстрирована 14 таблицами, 4 схемами.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы

Бруцеллезные препараты. В работе использованы 454 образца 36 серий четырех вакцин:

- против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма № 19 живая сухая; выпускается по 4 см3 в стерильных ампулах или по 4-6 см3 во флаконах вместимостью 20 см3, погрешность фасовки ± 3 %;

- против бруцеллеза из слабоагглютиногенного штамма В.аЬогШз N2 82 живая сухая; выпускается по 2-8 см3 во флаконах вместимостью 20 см3, погрешность фасовки ± 3 %;

- против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма В.аЬогШэ 75/79 -АВ живая сухая, изготовленные ФГУП «Щелковский биокомбинат»; выпускается по 4-8 см3 во флаконах вместимостью 20 см3, погрешность фасовки ± 3 %;

- против бруцеллеза овец и коз и инфекционного эпидидимита баранов из штамма В. теГиет'ю Яеу-1 живая сухая, производства ООО «Агровет»; выпускается по 2 см3 или 4 см3 во флаконах, погрешность фасовки ± 3 %.

Питательные среды. Мясо-пептонный печеночный глюкозо-глицериновый агар (МППГГА); триптозный агар М 097 (основа триптозного

кровяного агара фирмы «HIMEDIA», Индия).

Растворы. Физиологический раствор хлорида натрия (NaCl - 0,85 %, рН = 6,8-7,0); разбавитель для сухих бруцеллезных вакцин; маточные растворы неонола - 10, 20 и 30 % (рабочие растворы 10, 15,20 %).

Реактивы и реагенты. АТФ-реагент «МИКРОЛЮМ» (Химический факультет МГУ им. М.В. Ломоносова), содержащий иммобилизованную люци-феразу светляков, D-люциферин, MgCl2, компоненты буферной системы, стабилизаторы; водный раствор АТФ («Merck», Германия), приготовленный по точной навеске с концентрацией 10"6 моль/мл; свежеперегнанный диметил-сульфоксид ДМСО («Реахим», Россия); аминопептид («ЗМП», Россия).

Аппаратура. Люминометр «Биотокс-ЮМ» (ОАО «НЕРА-С», Россия); центрифуга с охлаждением «Beckman» (Германия); низкотемпературный холодильник; стерильный бокс/ламинар; установка Milli-Q для получения деио-низированной воды («Millipore», Франция); термостат ТС-80М-2 (Россия).

Концентрацию бруцелл в суспензиях после регидратирования вакцин определяли по оптическому стандарту мутности ГНИИСК им. Л.А. Тарасеви-ча на 10 ЕД (1,65 млрд. микрб. кл./ мл).

Экспериментальную часть работы проводили в соответствии положениями действующих НД на бруцеллезные вакцины и с учетом рекомендаций ФАО/ВОЗ, по изучению штаммов бруцелл и бруцеллезных вакцин.

Количество живых бруцелл в суспензиях и вакцинах определяли двумя методами: культуральным (чашечным) и биолюминесцентным. Каждый образец, исследовали в трех повторностях.

При определении количества живых бруцелл культуральным методом, сухую вакцину в трех флаконах ресуспендировали разбавителем или физиологическим раствором до первоначального объема, содержимое каждого из них переносили в три другие флакона, в которые предварительно было налито по 36-72 см3 (в зависимости от объема фасовки вакцины) стерильного разбавителя или физиологического раствора, получая, таким образом, разведение 1:10, и помещали в холодильник при (4-6) °С на 30 мин.

Ресуспендированную вакцину, разведенную 1:10, объединяли в равных

объемах в одном флаконе, смешивали и разводили последовательно десятикратно до 10"9, используя для каждого разведения отдельную пипетку. Суспензию двух последних разведений (10"8 и 10"9) высевали отдельными пипетками по 0,1 см3 соответственно в 3 и 5 чашек Петри на МППГГА или триптозный агар М097, предварительно проверенный на ростообеспечивающие свойства и подсушенный в течение 24 часов. Посевы инкубировали при 37-38 °С в течение 4-5 сут, и учитывали количество выросших колоний.

Количество колоний, выросших на всех чашках каждого разведения, суммировали и делили на соответствующее количество чашек (3 или 5). К полученным числам добавляли количество нулей, равное показателю степени разведения, суммировали их, делили на 2 и умножали на 10. Полученный результат отражал количеству живых бруцелл в 1 см3 вакцины.

При измерении биолюминесценции образцов вакцины проводили стандартизацию активности АТФ-реагента по водному раствору АТФ с концентрацией 10"6 моль/мл.

Массу сухой вакцины определяли по разнице веса флаконов с вакциной перед регидратацией стерильной дистиллированной водой до первоначального объема и пустых сухих флаконов с пробками после извлечения вакцины. Разведенную вакцину выдерживали в холодильнике при (4-6) °С в течение 20 мин., разводили так, чтобы в 1 мл суспензии содержалось 100 мкг сухой вакцины. С целью получения АТФ-экстрактов из каждого образца бактериальной суспензии отбирали аликвоты по 0,1 мл и вносили в пробирки типа «Эппен-дорф», содержащие по 0,9 мл ДМСО. Измерение биолюминесцентных сигналов АТФ-экстрактов проводили с использованием АТФ-реагента «МИКРОЛЮМ» на люминометре «Биотоке-ЮМ» сразу после получения. При необходимости их замораживали и хранили в низкотемпературном холодильнике до исследования.

Для построения калибровочной кривой интенсивности свечения в зависимости от концентрации АТФ, измеряли величины (/ обр) для стандартных АТФ-растворов и рассчитывали коэффициенты а и Ъ уравнения линейной регрессии (1).

Ig([ АТФ, моль/мл]) = a + bx Ig {1„бр) (1),

где: ¡-„op - максимум интенсивности биолюминесцентного сигнала АТФ-раствора (показания люминометра);

а и b - коэффициенты уравнения линейной регрессии, рассчитанные по массивам экспериментальных данных «концентрация АТФ стандартных АТФ-растворов, моль/мл» и «1оВр стандартных АТФ-растворов, условные единицы» методом наименьших квадратов.

Формулу (1) использовали для расчета концентрации АТФ в анализируемых суспензиях вакцины, учитывая их разбавление дистиллированной водой и ДМСО.

Для нескольких образцов регидратированных вакцин параллельно определяли титр клеток культуральным методом и рассчитывали концентрацию внутриклеточного АТФ, используя калибровочную зависимость (1), полученную для АТФ-растворов. По экспериментальным данным «титр клеток, КОЕ/мл» и «концентрация АТФ, моль/мл» рассчитывали коэффициенты А и В корреляционной зависимости (2).

Ig ([КОЕ/мл]) = А + В х Ig ([АТФ, моль/мл]) (2)

Зависимость (2) использовали для расчета титра клеток в анализируемых образцах вакцин по концентрации внутриклеточного АТФ этих образцов. Образцы каждой серии вакцины анализировали в трех повторностях. Коэффициенты корреляции (Rs) между титром живых клеток и концентрацией АТФ в образцах, а также между титрами клеток в образцах, определенных культуральным и биолюминесцентным методами, рассчитывали с помощью программы Microcal Origin. Достоверность различий между результатам, полученными с помощью двух методов, оценивали также по критерию Стъюдента (Ашмарин И.П. и др., 1971).

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции

С целью оценки баланса внеклеточного и внутриклеточного АТФ образцы вакцины из штамма В. abortus 19 регидратировали стерильной дистиллиро-

ванной водой до исходного объема и разводили ДМСО последовательно десятикратно. Сигналы биолюминесценции измеряли:

- в нативном образце (образец вакцины из штамма В. abortus 19);

- в отцентрифугированном образце (супернатант);

- в нативном разведенном образце (вакцина из штамма В. abortus 19);

- в тех же образцах, отфильтрованных через бактериальный фильтр (табл.1).

Таблица 1

Определение внеклеточного АТФ в образцах вакцины из штамма В. abortus 19

[АТФ] нативной культуры (2,17±0,05)*10-8

[АТФ] супернатанта (1,27±0,05)*10"1°

Разведение ю-2 10° ю-4 ю-5

[АТФ] нативного образца (9,43±0,03) *ю-9 (4,03±0,01) *10"9 (1,58±0,03) *10"9 -

[АТФ] разведенного и отфильтрованного образца (1,41 ±0,2) *10"п (2,55±0,3) *10"13 (2,49±0,07) *10"14

Согласно табличным данным, концентрация внеклеточного АТФ в исследуемых образцах была на 2-4 порядка меньше, чем - внутриклеточного АТФ.

В следующем опыте две серии вакцины из штамма В. abortus 19 регидра-тировали стерильной дистиллированной водой. Образцы, полученных бактериальный суспензий в объеме по 1 мл центрифугировали в течение 5 и 10 минут при 5 тыс. об/мин. Биолюминесцентный сигнал образцов супернатанта и осадка измеряли после первоначального разведения их ДМСО соответственно в 10 и в 2 раза и последовательного разведения тем же экстрагентом в 100, 1000 и 10000 раз (табл.2).

Таблица 2

Влияния режимов центрифугирования на степень экстракции АТФ из бактериальных клеток

Исследуемая № Разве- 5 тыс. об/мин 5 тыс. об/мин

проба серии дение 5 мин. 10 мин.

вакцины

Супернатант 16 - (1,88±0,1)*Ю"10 (4,89±0,2)*10"п

18 (2,32±0,02)*Ю"10 (3,43±0,3)*10"и

Осадок 16 ю-2 (2,47±0,1)*10'у (3,36±0,2)*10"9

10° (3,52±0,4)*10"9 (4,76±0,1)*10'9

ю-4 (6,00±0,4)*10"9 (5,35±0,1)*10~9

18 ю-2 (3,09±0,02)*10"у (3,18±0,2)*10"9

ю-3 (4,14±0,3)*10"9 (4,20±0,3)*10-9

ю-4 (4,58±0,6)*10"9 (5,89±1,2)*10"9

Как видно из материалов таблицы, с увеличением продолжительности центрифугирования образцов бруцеллезных вакцин и, таким образом, с осаждением большего количества бруцелл, концентрация целевого АТФ в осадке увеличивается, а внеклеточного в супернатанте - снижается. Эти данные, как и результаты предыдущего опыта, свидетельствующие о незначительном количестве внеклеточного АТФ (0,1 - 0,6 %) в бруцеллезных вакцинах позволили пренебречь им и, при проведении дальнейших исследований, центрифугирование тестируемых образцов не проводить.

2.2.2. Калибровка АТФ-реагента при использовании АТФ-стандартов В каждом эксперименте по измерению биолюминесценции опытных образцов противобруцеллезных вакцин АТФ-реагент калибровали при помощи стандартных АТФ-растворов. Это обусловлено тем, что активность АТФ-реагента разных партий резко отличалась, а также не исключено ее снижение в процессе длительного хранения.

Перед измерением интенсивности сигнала биолюминесценции при тестировании образцов вакцины, определили значения коэффициентов а и Ь уравнения калибровочной зависимости во всех проведенных опытах, измеряя 1обр от АТФ-стандартов.

([АТФ, моль/мл]) =а + Ьх\& (10йр), (1);

а и Ь - коэффициенты уравнения линейной регрессии, рассчитанные по массивам экспериментальных данных «концентрация АТФ стандартных АТФ-растворов, моль/мл» и «1„-,р стандартных АТФ-растворов, условные единицы» методом наименьших квадратов.

При этом в зависимости от партии АТФ-реагента коэффициенты а и Ъ калибровочной зависимости (1) варьировали в диапазоне 13,26-14,32 и 0,88-1,04 соответственно. Для зависимости (1) коэффициент корреляции Яэ был равен 0,99 во всех случаях (табл. 3).

Таблица 3

Стандартизация активности АТФ-реагента при помощи стандартных АТФ-растворов

Разведение АТФ-стандарта № опыта Коэффициенты anb Rs

1 1 2 1 3

I обр

10*" 1695 384 1466 -14,32; 1,04 0,99

ю-12 152,5 27 138 -13,26; 0,88 0,99

ю-13 20 2,5 11,5 -13,99; 0,94 0,99

2.2.3. Определение оптимальных объемов реакционной смеси (реагент-испытуемый образец)

Для определения оптимального соотношения объемов «образец - реагент»

испытуемую вакцину из штамма В.abortus 19 регидратировали. стерильной дистиллированной водой до первоначального объема и выдерживали в течение 20 мин при (4-6) "С. Затем по 100 мкл суспензии вакцины переносили в пробирки типа «Эппендорф», в которые заранее, в каждую отдельно, были внесены ДМСО и 1 %-ный раствор неонола-10 в объеме по 900 мкл.

Непосредственно перед измерением биолюминесцентного сигнала в стрипы вносили АТФ-реагент и экстракты вакцины в разных объемах. В одни - по 90 мкл АТФ-реагента и 10 мкл экстракта, в другие - по 50 мкл АТФ-реагента и экстракта. Результаты исследования показаны в таблице 4.

Таблица 4

Интенсивность сигналов биолюминесценции в зависимости от соотношения объемов измеряемого образца

Экстрагент «Образец -реагент», мкл Сигнал от образца Сигнал АТФ -стандарта [АТФ], моль/ мл

ДМСО 10:90 280 ± 14 233 ± 12 1,2 * 10'7

ДМСО 50:50 128 ±4 115 ± 11 0,6 * 10"7

Неонол-10 -1 % 10:90 2024 ± 44 2967±100 6,0 * 10"8

Неонол-10 - 1% 50:50 448 ± 59 809 ± 24 1,4* 10"8

Как видно из материалов таблицы, максимально высокий биолюминесцентный сигнал был зарегистрирован при тестировании аликвот «испытуемый образец - АТФ-реагент» в соотношении 10:90 по объему.

В заключительных опытах перешли на следующее соотношение АТФ-реагента и исследуемого образца: 0,02 мл АТФ-экстракта образца - 0,05 мл деионизованной воды - 0,05 мл АТФ-реагента. Такое соотношение объемов было использовано с целью экономии АТФ-реагента. Коэффициент корреляции между концентрацией АТФ стандартного раствора и биолюминесцентным сигналом при соотношении объемов 10:90 и 20:50:50 составил Rs -0,99.

2.2.4. Изучение экстрагирующих свойств ДМСО и неонола-10

Образцы нативной культуры штамма В. abortus 19 разводили ДМСО и неонолом-10 в соотношении 10:90 по объему. Неонол использовали в виде 20 %, 30 % раствора, получая при этом суспензии бактериальных клеток с содержанием 10, 15 и 20 % экстрагента. Непосредственно перед измерением сигнала биолюминесценции образцы, содержащие разное количество нено-ла-10, разводили дистиллированной водой, таким образом, чтобы его конечная концентрация в суспензиях составила 1 %.

Тестирование проводили при соотношении объемов «образец-реагент» 10:90. При расчете концентрации АТФ учитывали степень разбавления испытуемых образцов в ДМСО и неоноле-10 (табл. 5).

Таблица 5

Экстракция бактериального АТФ при помощи высоких концентраций неонола-10

Экстрагенты [АТФ], 20 % раствора неонола-10, моль/ мл [АТФ], 30 % раствора неонола-10, моль/ мл [АТФ], 30 % раствора неонола-10, моль/ мл

ДМСО (5,70±0,3)*10'и (2,3±0,1)*10"13 (1,59±0,1)*10'п

Неонол-10, 10% (1,39±0,1)*10"п (6,22±0,1) *10"13 (4,85±1,2)*10*13

Неонол-10, 15% - (2,40±0,2) *10'13 (1,03±0,1)*10-13

Неонол-10, 20% - (1,16±0,4) *10"12 (4,27±1,8)*10"13

Согласно полученным результатам, неонол-10 при содержании в суспензии бактериальных клеток в количестве 10 % обладает более высокими экстрагирующими свойствами в сравнении с ДМСО.

Для определения влияния времени экстракции неонолом-10 на концентрацию АТФ образцы бруцеллезной вакцины из штамма В. abortus 19 разбавляли, используя маточные растворы неонола-10 с концентрацией 30 %, и получили при этом суспензии бактериальных клеток с содержанием 10, 15 и 20 % неонола-10. Непосредственно перед измерением сигнала биолюминесценции образцы, содержащие разное количество ненола-10, разводили дистиллированной водой, таким образом, чтобы его конечная концентрация в суспензиях составила 1 %. Время экстракции образцов перед измерением сигнала биолюминесценции составляло 2, 5,10 минут.

Таблица 6

Влияние концентрации неонола-10 и продолжительности экстракции на

концентрацию АТФ

Концентрация Время экспозиции

2 мин 5 мин 10 мин

Неонол-10 Концентрация АТФ в образцах, моль/ мл

(10%) (7,40±0,1)*10'13 (2,85±0,7)*10"13 (1,06±0,1)*10-13

(15 %) (4,81±0,4)*10"и (3,93±1,1)*Ю'П (4,26±0,5)*10*12

(20 %) (7,60±1,4)*10'13 (2,60±0,2)*10"13 (0,9±0,1)*10~и

Согласно табличным данным, показатели концентрации АТФ в образцах, полученных с использованием неонола-10 в разных количествах, статистически достоверно (р<0,05) снижались при увеличении времени экспозиции экстрагирования и не зависели от концентрации экстрагента.

2.2.5. Определение возможности получения экстрактов лиофилизированной культуры бруцелл в ДМСО

С целью сокращения числа манипуляций при подготовке вакцины для тестирования биолюминесцентным методом была предпринята попытка изучения возможности получения АТФ-экстрактов из сухой бакмассы с помощью ДМСО и определения влияния величины навесок бакмассы на растворимость в ДМСО. В навески сухой вакцины массой 50 мг, 100 мг, 150 мг, 200 мг и 250 мг внесли по 0,5 и 1,0 мл ДМСО. При визуальном учете результатов опыта оказалось, что лиофилизированная вакцина разбавляется ДМСО частично, независимо от соотношения величины навески и объема экстрагента.

2.2.6. Определение титра живых микробных клеток в бруцеллезных сухих вакцинах из штаммов В. abortus

Образцов бруцеллезных вакцин, регидратированных стерильной дистиллированной водой до первоначального объема, разводили ею же с таким расчетом, чтобы в 1 мл суспензии содержалось 100 мкг сухой вакцины. С целью получения АТФ-экстрактов к полученным аликвотам в объеме по 0,1 мл добавляли по 0,9 мл ДМСО. Перед измерением интенсивности сигнала биолюминесценции АТФ-экстрактов, используя АТФ-стандарт, определяли значения коэффициентов а и Ъ уравнения калибровочной зависимости (1) и устанавливали коэффициент корреляции (Rs), который был равен 0,99 во всех случаях.

Затем было проведено 3 опыта с использованием образцов разных бруцеллезных вакцин (таблицы 7, 8, 9). Перед тестированием каждый подготовленный образец вакцины разводили ДМСО в 100 раз.

Определение количества живых микробных клеток в 72 образцах 18 серий бруцеллезных вакцин проводили биолюминесцентным методом с использованием корреляционной зависимости (2), а также культуральным чашечным методом (табл. 7).

Таблица 7

Титр живых клеток в образцах лиофилизированной бруцеллезной вакцины, определенный чашечным и биолюминесцентным методами

№ п/п [АТФ], моль/мл Титр клеток, КОЕ/мл № п/п [АТФ], моль/мл Титр клеток, КОЕ/мл

Чашечный метод (контроль) Биолюминесцентный метод Чашечный метод (контроль) Биолюминесцентный метод

1 2 3 4 5 6 7 8

1 7,16*10"® 2,34*10'° 6,86*10'" 37 5,15*10'® 1,37*10'° 3,76*10'"

2 7,75*10-® 6,99*10'" 7,91*10'" 38 5,41*10'® 5,37*10'" 4,12*10'"

3 5,57*10'® 3,77*10'° 4,34*10'" 39 9,06*10"® 7,91*10'" 1,05*10"

4 6,46*10"9 3,10*10"' 5,69*10'° 40 7,88*10"® 7,91*10'° 8,15*10'°

5 5,31*10® 4,00*10® 3,97*10'" 41 6,74*10® 4,14*10"' 6,15*10'"

6 6,85*10"® 2,95*10'" 6,32*10'" 42 7,56*10"® 4,14*10'° 7,56*10'"

7 6,62*10® 2,95*10'" 5,94*10'" 43 6,45*10"® 1,14*10'° 5,67*10'"

8 5,48*10"® 1,18*10'" 4,22*10'" 44 7,08*10'® 2,14*10'° 6,72*10'"

9 3,11*10"® 2,90*10® 1,51*10'" 45 7,17*10'® 4,23*10'" 6,87*10'"

10 4,57*10"® 1,25*10" 3,03*10'° 46 8,49*10"® 5,23*10'° 9,35*10'°

1 5,49*10-® 1,68*10" 4,22*10'" 47 1,18*10"® 1,59*10® 1,70*10"

12 4,64*10"® 3,57*10'" 3,11*10'" 48 9,96*10'® 1,09*10" 1,25*10"

13 4,28*10"® 3,24*10'" 2,69*10'" 49 9,27*10"® 8,79*10'° 1,10*10"

14 4,66*10"® 5,39*10'" 3,13*10'" 50 7,77*10"® 6,79*10'" 7,95*10'"

15 3,39*10'® 1,38*10" 1,76*10'" 51 8,2*10"® 6,29*10'" 8,78*10'°

16 3,14*10"® 1,37*10'" 1,53*10'° 52 6,12*10'® 2,00*10"' 5,15*10'°

17 5,32*10"® 1,69*10" 3,99*10'" 53 6,58*10"® 2,90*10'° 5,88*10'°

18 4,45*10"® 1,84* 10'° 2,89*10'" 54 6,37*10"® 2,29*1010 5,54*10'°

19 7,08*10"® 2,34*10'" 6,71*10'° 55 8,49*10"® 2,15*10'° 9,34*10'°

20 7,86*10'® 6,99*10'" 8,12*10'" 56 9,93*10"® 2,15*10'" 1,24*10"

21 6,88*10'® 3,77*10'" 6,37*10'" 57 8,84*10'® 6,89*10'° 1,01*10"

22 6,88*10'® 3,10*10'" 6,38*10"' 58 7,16*10"® 4,19*10'° 6,86*10'°

23 4,45*10'® 4,00*100® 2,88*10'" 59 7,24*10"® 6,89*10'" 7,00*10'"

24 5,83*10"® 2,95*10'" 4,71*10'° 60 7,37*10"® 5,19*10'° 7,23*10'°

25 6,2*10'® 2,92*10'" 5,28*10'" 61 5,31*10'® 2,00*10'° 3,97*10'°

26 7,08*10"® 6,18*10'" 6,72*10'" 62 1,59*10"® 3,20*10® 4,46*10®

27 4,2*10"® 1,98*10" 2,60*10'° 63 1,69*10"' 3,20*10® 4,96*10®

28 3,89*10'® 5,29*10" 2,26*10'" 64 1,94*10'® 2,80*10® 6,34*10®

29 4,54*10"® 1,25*10" 2,99*10'° 65 2,01*10® 2,80*10® 6,80*10®

1 2 3 4 5 6 7 8

30 5,54*10'" 1,68*10" 4,29*10'" 66 1,61*10" 2,70*10" 4,56*10"

31 3,43*10'" 3,57*10'° 1,80*10'" 67 1,57*10"" 2,70*10" 4,34*10"

32 5,68*10*" 3,24*10'" 4,50*10'" 68 1,92*10"'' 2,10*10" 6,23*10"

33 4,98*10"" 1,39*10'" 3,53*10'° 69 1,99*10" 2,10*10" 6,65*10"

34 7,19*10"" 5,97*10'" 6,91*10'° 70 5,15*10'' 1,37*10'° 3,76*10'"

35 6,19*10"" 5,97*10'" 5,25*10'° 71 5,41*10"'' 5,37*10'° 4,12*10'°

36 8,81*10" 2,84*10'" 9,99*10'" 72 9,06*10" 7,91*10'" 1,05*10"

Согласно результатам программного обсчета полученных данных, коэффициент корреляции между средним количеством живых бруцелл, установленный при тестировании 72 образцов вакцин биолюминесцентым и культу-ральным методами, составил 0,72.

С использованием корреляционной зависимости (2) были проанализированы 12 образцов лиофилизированной противобруцеллезной вакцины 7 серий (табл.8).

Таблица 8

Титр клеток в образцах лиофилизированной вакцины, определенный чашечным и биолюминесцентным методами (п=12)

№ п/п [АТФ], моль/мл Титр клеток, КОЕ/мл

Чашечный метод (контроль) Биолюминесцентный метод

1 2 3 4

1 1,17*10'8 1,05*10" 9,80*10'°

2 9,1*10" 6,74* 10'° 5,00*10'°

3 1,09*10"8 9,16*10'° 6,10*10'°

4 7,86*10"' 5,21*10'° 5,10*10'°

5 7,55*10"" 4,86*10'° 3,10*10'°

6 5,77*10"" 3,03*10'° 2,42*10'°

7 1,12*10"' 9,69*10'° 1,00*10"

8 1,08*10"8 9,08*10'° 1,22*10"

9 9,92* 10'9 7,83*10'° 1,02*10"

10 9,48*10"' 7,23*10'° 6,20*10'°

11 9,3*10"' 6,99*10'° 4,84* 10'°

12 1,36*10"8 1,37*10" 7,20*10'°

Коэффициент корреляции между средним количеством живых бруцелл, установленный при тестировании 12 образцов вакцин биолюминесцентым и культуральным методами, составил 0,82.

С использованием корреляционной зависимости (2) были проанализированы 27 образцов 13 серий бруцеллезной вакцины (табл. 9).

Коэффициент корреляции между средним количеством живых бруцелл, установленный при тестировании 27образцов вакцины биолюминесцентым и культуральным методами, составил 0,73.

Таблица 9

Титр клеток в образцах лиофилизированной противобруцеллезной вакцины, определенный культуральным и биолюминесцентным методами (п=27)

№ п/п [АТФ], моль/мл Титр клеток, КОЕ/мл

Чашечный метод (контроль) Биолюминесцентный метод

1 2 3 4

1 2,11*10"9 8,03*10'° 6,40*10'°

2 9,31*10-'° 2,68*10'° 5,00*108

3 9,75*10"'° 2,85*10'° 1,30*10'

4 7,3*10'10 1,94*10'° 3,60*10'

5 7,52*10"'° 2,02*10'° 2,85*10"

6 7,77* 10"'° 2,10*10'° 9,50*10'

7 1,2*10"9 3,76*10'° 1,05*10'°

8 1,81*10"' 6,53*10'° 8,72*10'°

9 1,53*10"9 5,20*10'° 4,06*10'°

10 1,6*10'9 5,56*10'° 5,30*Ю10

11 2,18*10"' 8,41*10'° 5,40*10'°

12 1,94*10"' 7,19*10'° 3,60* 10'°

13 3,72*10-'° 7,83*10' 5,70*10'

14 7,97*10"'° 2,18*10'° 9,50*10'

15 8,8*10'10 2,49*10'° 1,Ю*Ю10

16 3,51*10"'° 7,25*109 1,60*10'

17 6,61*10"'° 1,69*10'° 1,80*10'°

18 7,59*10-'° 2,04*10'° 9,00*10'

19 4,5*10"'° 1,01*10'° 1,20*10'°

20 1,02*10"' 3,01*10'° 7,20*10'

21 4,2*10"'° 9,23*10' 1,04*109

1 2 3 4

22 3,69*10"'° 7,77*10' 7,40*10"

23 4,78*10"10 1,10*10'° 1,67*10'°

24 5,67* 10"1" 1,38*10'° 7,90*10"

25 7,29*10"'° 1,93*10'° 1,75*10"

26 5,43*1010 1,30*10ш 1,60*10"

27 4,98*10-'" 1,16*10'° 1,67*10"

Результаты тестирования вакцин были обработаны статистически (таблица 10). При этом коэффициент корреляции (Яб) между количеством живых бруцелл, определенным по данным тестирования биолюминесцентным методом, и их количеством, определенным культуральным (чашечным) методом, составил 0,93. Статистически значимого различия между титрами живых клеток, определенными двумя методами, не установлено (Р<0,05).

Таблица 10

Корреляционная зависимость между средними значениями трех опытов по изучению выживаемости бруцелл

№ п/п Титр клеток, КОЕ/мл Коэффициент

Чашечный метод Биолюминесцентный корреляции

(контроль) метод Ив

1 (5,00±1,1)*10ш (5,48±0,8)*10ш

2 (6,85±3,9)*1010 (7,84±4,4)*Ю10 0,93

3 (1,85±0,7)*10ш (2,92±0,8)*10ш

С учетом полученных результатов, разработана следующая схема определения количества живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом (схема 1).

Схема 1

Определение количества жизнеспособных клеток в сухих бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом

Регидратация и разведение вакцины

Вакцину регидратируют стерильной дистиллированной водой до первоначального объема, а затем разводят так, чтобы в 1 мл суспензии содержалось _100 мкг сухой бакмассы_

_1_

Экстракция АТФ диметилсульфоксидом (ДМСО)

К 0,1 мл разведенной вакцины добавляют 0,9 мл ДМСО. АТФ-экстракт тестируют сразу после получения или в течение 6 часов в случае хранения при комнатной температуре и до 180 дней - при - 40 "С

_1_

Измерение биолюминесцентного сигнала

В кювету люминометра автоматическим дозатором вносят последовательно 0,05 мл реконструированного АТФ-реагента, 0,02 мл АТФ-экстракта и 0,05 мл дисстилированной воды; регистрируют максимальное значение показателя интенсивности биолюминесцентного сигнала -10„р. Таким же образом изме-_ряют I „с,„. АТФ-экстрактов из тестируемых вакцин_

Расчет титра живых бактерий в бруцеллезных вакцинах по кореляционной зависимости

Концентрацию внутриклеточного АТФ рассчитывают, используя калибровочную зависимость (1), полученную для стандартных АТФ-растворов. По экспериментальным данным «титр клеток, КОЕ/мл» и «концентрация АТФ, моль/мл» рассчитывают коэффициенты А и В корреляционной зависимости (2).

^ ([КОЕ/мл]) = А + В х ^ ([АТФ, моль/мл]) (2) Зависимость (2) используют для расчета титра клеток в тести_руемых образцах вакцин по концентрации внутриклеточного АТФ._

2.2.7. Биолюминесцентное определение титра бруцелл в лиофилизироваиных бруцеллезных вакцина на разных сроках хранения

Определения количества жизнеспособных клеток в промышленных образцах бруцеллезных вакцин проводили, руководствуясь представленной выше схемой. В работе использовали образцы следующих серий вакцин на разных сроках хранения при (2-8) °С:

- вакцина из штамма № 19 живая сухая - сер. 1, 2,28,29, 30;

- вакцина из № 82 живая сухая - сер. 2,4;

- вакцина из штамма 75/79 - АВ живая сухая - сер. 5 (табл. 11).

Таблица 11

Результаты определения выживаемости бруцелл в промышленных образцах бруцеллезных вакцин

Количество живых бруцелл Срок хранения

Чашечный метод (контроль) Биолюминесцентный метод

Вакцина из штамма В.аЬогШ 82 с.2 (02.06г.)

(3,37±0,4) *10ш (3,94±0,4) *Ю10 9 мес.

(3,09±0,8) *Ю10 (2,61±0,8)*10'° 10 мес.

Вакцина из штамма В.аЬогШ 82 с.4 (02.06г.)

(1,29±0,8) *10" (2,59±0,8) *10ш 10 мес.

(3,62±0,1) *101С (2,4б±1,2) *Ю10 11 мес.

Вакцина из штамма В.аЬоПт 19 с. 1 (04.06г.)

(4,29±1,8) *Ю10 (7,16±2,2) *101и 6 мес.

(6,89±0,1) *Ю10 (8,55±1,8) *101и 7 мес.

(3,1±0,2) *10ш (6,04±0,5) *Ю10 9 мес.

Вакцина из штамма В.аЬоИж 19 с.2 (04.06г.)

(7,79±0,9) *Ю10 (9,48±2,1) *10|и 6 мес.

(4,69±0,5) *Ю10 (7,05±0,3) *101и 7 мес,

(3,77±0,2) *Ю10 (5,36±1,4) *Ю10 9 мес.

Вакцина из штамма В.аЬоПив 19 с.28 (12.05г.)

(1,64±0,5) *Ю10 (5,7±0,3) *Ю10 10 мес.

(2,05±0,1) *Ю10 (4,56±0,8) *10!У 11 мес.

(0,4±0,01) *Ю10 (3,43±0,7) *10ш 12 мес.

Вакцина из штамма В.аЬогШ 19 с.29 (12.05г.)

(4,15±0,01) *10ш (6,86±0,9) *Юю 10 мес.

(2,9±0,6) *1010 (5,88±0,3) *101и 11 мес.

(2,88±0,1) *10'° (5,52±1,1) *101и 12 мес.

Вакцина из штамма В.аЬогШэ 19 с.30 (12.05г.)

(7,94±0,04) *10ш (9,33±1,6) *Ю10 10 мес.

(2,94±0,02) *10ш (5,61±0,5) *10'° 12 мес.

Вакцина из штамма В.аЬоПш 75/79-АВ с.5 (05.06г.)

(5,97±0,5) *Ю10 (6,98±1,2) *10ш 5 мес.

(5,84±0,6) *Ю10 (6,0±0,7) *Ю10 8 мес.

X (4,51±1,2)*Ю10 X (5,76±0,9)*Ю10

При анализе результатов, представленных в таблице 11, не установлено статистически значимого различия между титрами живых бруцелл, опреде-

ленными двумя методами (Р<0,05) на разных сроках хранения вакцины. Коэффициент корреляции (Яб) между результатами, полученными каждым из методов, составил 0,93.

3. Выводы

1. Биолюминесцентному исследованию с целью определения количества живых микробных клеток подвергают только водные суспензии бруцелл. Лиофилизированная культура бруцелл в экстрагенте не растворяется.

2. ДМСО является лучшим в сравнении с неонолом-10 экстрагентом АТФ из водных суспензий бруцелл. В экстрактах, полученных с помощью ДМСО, концентрация АТФ снижается через 6 часов, а с использованием не-онола-10 - в течение нескольких минут.

3. Концентрация внеклеточного АТФ в сухих бруцеллезных вакцинах составляет меньше 1 % по отношению к внутриклеточному АТФ и при тестировании бруцеллезных вакцин на выживаемость микробных клеток биолюминесцентным методом не отражается на объективности результатов.

4. Результаты определения количества живых микробных клеток, полученные при сравнительном тестировании репрезентативной выборки сухих бруцеллезных вакцин биолюминесцентным и культуральным методами, коррелируют (118>0,7). При статистическом анализе, с использованием коэффициента Стьюдента, достоверных различий (Р<0,05) между этими показателями также не установлено.

5. Разработанная методика определения количества живых бруцелл в бруцеллезных вакцинах, основанная на использовании биолюминесцентного метода, позволяет получить результат в течение 5-7 часов. При этом существенно ограничивается продолжительность работы технического персонала с живой культурой бруцелл, в сравнении с культуральным методом, за счет исключения многочисленных разведений и подсчета колоний бруцелл, что предохраняет его от сенсибилизации и аллергизации; повышается объективность результатов за счет инструментального учета в сравнении с биохимическим методом.

4. Практические предложения

Разработанная методика определения количества живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом может быть рекомендована для использования на предприятиях биологической промышленности при производстве и контроле качества данных препаратов, как при выпуске, так и в процессе хранения.

Разработаны «Методические рекомендации по определению количества живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом». (Утв. директором ФГУ «ВГНКИ» 16 декабря 2008 года).

Порядок определения живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом внесен в проект стандарта организации на вакцину против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма № 19 живую сухую.

1. Зверев, Д.С. Определение выживаемости бруцелл биолюминесцентным методом / Зверев Д.С., Скляров О.Д. //Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных: Сб. науч. тр. ВНИИБТЖ. -Омск, 2006. - С. 81-83

2. Зверев, Д.С. Оптимизация биолюминесцентного метода для определения количества живых бруцелл / Зверев Д.С., Скляров О.Д., Фрунджян В.Г. // Сб. науч. тр. ФГУ «ВГНКИ». - М., 2007. - Вып.68. - С. 118-125

3. Скляров, О.Д. Определение выживаемости бруцелл в сухих бруцеллезных вакцинах / Скляров О.Д., Зверев Д.С., Фрунджян В.Г. // Ветеринарный врач. -Сдана в печать.

4. Зверев, Д.С. Оптимизация биолюминесцентного метода для определения количества живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах / Зверев Д.С., Скляров О.Д., Фрунджян В.Г. // Ветеринарная медицина. - Сдана в печать.

5. Список работ, опубликованных по теме диссертации

Заказ № 140/12/08 Подписано в печать 13.11.2008 Тираж 100 эю. Усл. п.л. 1,5

, ^000 "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76; (495) 778-22-20 )¡www.cfr.ru; е-тай:info@cfr.ru

 
 

Оглавление диссертации Зверев, Дмитрий Сергеевич :: 2008 :: Москва

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Специфическая профилактика бруцеллеза сельскохозяйственных животных

1.2. Методы определения количества жизнеспособных бактерий

1.2.1. Прямые методы анализа жизнеспособности микробной культуры

1.2.2. Косвенные методы определения количества жизнеспособных микробных клеток

1.2.2.1. Определение количества жизнеспособных микробных клеток биолюминесцентным методом при помощи люцифе-рин-люциферазной системы светляков

1.2.2.2. Применение люциферазы светляков для решения биоаналитических задач

1.2.2.3. Методология биолюминесцентного определения количества микробных клеток

1.2.2.4. Подготовка образцов для определения АТФ

1.2.2.5. Методы экстракции внутриклеточного АТФ

1.2.2.6. Применение АТФ-метрии для контроля качества лиофили-зированных вакцин

ГЛАВА 2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1. Материалы и методы

2.2. Методики проведения экспериментов

2.2.1. Определение оптической концентрации бактерий

2.2.2. Определение количества живых бактерий чашечным методом

2.2.3 Измерение концентрации АТФ в бактериальных суспензиях биолюминесцентным методом

2.2.3.1. Приготовление растворов и экстрактов АТФ

2.2.3.2. Измерение биолюминесцентного сигнала

2.2.3.3. Расчет концентрации АТФ

2.2.3.4. Расчет количества жизнеспособных клеток по результатам биолюминесцентных измерений

2.2.3.5. Статистическая обработка результатов

2.3. Результаты собственных исследований

2.3.1. Влияние внеклеточного АТФ в образцах вакцины на интенсивность сигнала биолюминесценции

2.3.2 Калибровка АТФ-реагента при использовании стандартных АТФ-растворов

2.3.3. Определение оптимальных объемов реакционной смеси (реагент-испытуемый образец)

2.3.4. Изучение экстрагирующих свойств неонола-10 и влияния продолжительности экспозиции образца в экстрагенте на интенсивность биолюминесцентного сигнала

2.3.5. Определение возможности получения экстрактов лиофи-лизированной культуры бруцелл в ДМСО ^

2.3.6. Влияние длительности инкубирования водной суспензии бруцелл после восстановления лиофилизированной культуры на концентрацию АТФ

2.3.7. Определение количества жизнеспособных клеток в лиофи-лизированных вакцинах Brucella abortus

2.3.8. Биолюминесцентное определение количества жизнеспособных бруцелл в лиофилизированных бруцеллезных вакцинах на разных сроках хранения

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

 
 

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Зверев, Дмитрий Сергеевич, автореферат

Бруцеллез сельскохозяйственных животных, являясь широко распространенной инфекцией, наносит существенный экономический ущерб животноводству, обусловленный массовыми абортами, бесплодием и яловостью маточного поголовья, снижением их продуктивности и жизнеспособности приплода, а также затратой значительных сил и средств на его ликвидацию [31, 110].

Бруцеллез является зоонозом и относится к особо опасным инфекционным заболеваниям [1, 116].

В России для борьбы с бруцеллезом животных проводится комплекс организационно-хозяйственных и ветеринарно-санитарных мероприятий, успех которых во многом определяется применением средств специфической профилактики, преимущественно живых сухих вакцин [116, 215].

Продолжительность жизнеспособности бруцелл в составе вакцины требует соблюдения ряда условий [32, 87]. В частности, на выживаемость бруцелл при производстве и в процессе хранения вакцин влияют физические, химические и биологические факторы [4, 71, 79, 121, 130]. При этом количество жизнеспособных микробных клеток определяет количество иммунизирующих доз в конкретном объеме вакцины, а их количество в дозе, наряду со свойствами штаммов - ее иммуногенность. В связи с этим, контроль выживаемости бруцелл в живых бруцеллезных вакцинах осуществляют на предприятии-производителе при их выпуске, а также в ФГУ «ВГНКИ» в порядке проведения контроля за сертифицированной продукцией в процессе хранения [57, 63,72, 111].

В настоящее время для этой цели используют культуральный и биохимический методы. Культуральный метод (определение количества живых бруцелл - колониеобразующих единиц (КОЕ) по числу колоний бруцелл, выросших на плотной питательной среде) является достаточно трудоемким и позволяет получить результат через 5 суток. Биохимический метод (в частности, оценка дегидрогеназной активности бруцелл в отношении метилено-вого синего) проще по воспроизведению и сокращает время анализа до 5-6 часов.

Однако результаты исследований, полученные с помощью этих методов, не всегда коррелируют [40, 56, 152]. Анализ данных литературы, посвященной контролю выживаемости микроорганизмов в живых бактерийных вакцинах, показал, что с начала второй половины прошлого века были предложены и апробированы «косвенные» экспресс-методы, основанные на измерении какого-либо физико-химического параметра образца, абсолютная величина которого или её изменение пропорциональны количеству жизнеспособных клеток в образце. Среди достаточно большого разнообразия таких методов высокой точностью и воспроизводимостью отличались методы, основанные на определении содержания различных внутриклеточных или внеклеточных метаболитов, в первую очередь, внутриклеточного аденозин-трифосфата (АТФ), содержащегося в относительно высоких концентрациях в клетках любых микро- и макроорганизмов. Количество АТФ с большой точностью можно определить при помощи биолюминесцентного метода даже при ультрамалом содержании в образце - до 10"14 -10"15 моль/кювета люми-нометра [20, 142]. Причем, после гибели клетки содержание АТФ в них, в отличие от других внутриклеточных метаболитов, резко снижается в течение нескольких секунд [155]. Таким образом, количество АТФ коррелирует с количеством живых микробных клеток, содержащихся в анализируемом образце.

Процедура биолюминесцентного определения АТФ получила достаточное распространение в разных областях биометрии. Многие фирмы производят коммерчески доступные АТФ-реагенты и приборы для детекции биолюминесценции - люминометры, как портативные, так и стационарные. Их стоимость, по сравнению с большинством оптических приборов, невелика. Следует отметить, что биологические образцы, как правило, помимо микробного (целевого) АТФ содержат внеклеточный АТФ в концентрациях, часто превышающих концентрацию целевого на несколько порядков [104, 139]. Поэтому для правильного определения микробного АТФ необходимо проводить специальную пробоподготовку образца, включающую такие стадии, как концентрирование микробных клеток и/или удаление из образца нецелевого АТФ. Методика пробоподготовки образца зависит от его состава, поэтому для конкретного образца очень важно подобрать и оптимизировать условия её проведения. От этого зависит возможность широкого практического использования биолюминесцентного метода в биотехнологических производствах.

С учетом вышеизложенного, совершенствование процедуры определения количества жизнеспособных микробных клеток в бруцеллезных вакцинах представляется актуальной.

Цель работы. Разработка методики определения количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах, основанной на использовании биолюминесцентного метода.

Основные задачи исследования.

1. Оптимизировать порядок подготовки образцов нативных и лиофили-зированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ.

2. Установить оптимальные параметры определения количества живых микробных клеток в суспензиях нативных и лифилизированных культур бруцелл биолюминесцентным методом.

3. Провести сравнительное исследование методик определения живых бруцелл на основе биолюминесцентного и культурального методов с использованием коммерческих серий бруцеллезных вакцин.

4. Разработать методические рекомендации по определению количества живых бактерий в бруцеллезных вакцинах с использованием биолюминесцентного метода.

Научная новизна.

Впервые изучены и определены оптимальные параметры пробоподго-товки, установлены возможность и порядок определения количества живых бруцелл разных видов в составе бруцеллезных вакцин и бактерийных суспензий биолюминесцентным методом.

Практическая значимость.

Применение биолюминесцентного метода для определения количества живых бруцелл позволяет:

- сократить время контроля выживаемости бруцеллезных вакцин в 510 раз, в сравнении с культуральным методом, исключив при этом использование питательных сред;

- значительно уменьшить контакт технического персонала биопредприятий с вакциной, предохранив его тем самым от сенсибилизации.

Апробация полученных результатов.

Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на 5-ой Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы ветеринарной медицины продуктивных и непродуктивных животных» (Омск, 2006г.), конференциях молодых ученых ФГУ «ВГНКИ» «Лекарственные средства для животных и корма. Современное состояние и перспективы» (Москва, 2006, 2007г.) и заседаниях ученого совета ФГУ «ВГНКИ» (Москва, 2004, 2005, 2006, 2007 гг.).

Положения, выносимые на защиту:

- порядок подготовки образцов нативных и лиофилизированных культур бруцелл для измерения концентрации внутриклеточного АТФ;

- порядок определения количества жизнеспособных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом;

- результаты сравнительного изучения выживаемости микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным и культуральным методами.

Публикация результатов исследований.

По теме диссертационной работы опубликовано 4 научные статьи, в том числе 2 - в изданиях, рецензируемых ВАК РФ.

Объем и структура диссертации.

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Определение количества живых микробных клеток в противобруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом"

ВЫВОДЫ

1. Биолюминесцентному исследованию с целью определения количества живых микробных клеток подвергают только водные суспензии бру-целл. Лиофилизированная культура бруцелл в экстрагенте не растворяется.

2. ДМСО является лучшим в сравнении с неонолом-10 экстрагентом АТФ из водных суспензий бруцелл. В экстрактах, полученных с помощью ДМСО, концентрация АТФ снижается через 6 часов, а с использованием не-онола-10 - в течение нескольких минут.

3. Концентрация внеклеточного АТФ в сухих бруцеллезных вакцинах составляет меньше 1 % по отношению к внутриклеточному АТФ и при тестировании бруцеллезных вакцин на выживаемость микробных клеток биолюминесцентным методом не отражается на объективности результатов.

4. Результаты определения количества живых микробных клеток, полученные при сравнительном тестировании репрезентативной выборки сухих бруцеллезных вакцин биолюминесцентным и культуральным методами, коррелируют (Я8>0,7). При статистическом анализе, с использованием коэффициента Стъюдента, достоверных различий (Р<0,05) между этими показателями также не установлено.

5. Разработанная методика определения количества живых бруцелл в бруцеллезных вакцинах, основанная на использовании биолюминесцентного метода, позволяет получить результат в течение 5-7 часов. При этом, в сравнении с культуральным методом, за счет исключения многочисленных разведений и подсчета колоний бруцелл, существенно ограничивается продолжительность работы технического персонала с живой культурой, что предохраняет его от сенсибилизации; в сравнении с биохимическим методом, за счет инструментального учета данных, повышается объективность результатов.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ Разработанная методика определения количества живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом предлагается для использования на предприятиях биологической промышленности при производстве и контроле качества данных препаратов, как при выпуске, так и в процессе хранения.

Разработаны «Методические рекомендации по определению количества живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом» (утв. директором ФГУ «ВГНКИ» 16 декабря 2008 года).

Порядок определения живых микробных клеток в бруцеллезных вакцинах биолюминесцентным методом внесен в проект стандарта организации (СТО) на «Вакцину против бруцеллеза сельскохозяйственных животных из штамма № 19 живую сухую».

 
 

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2008 года, Зверев, Дмитрий Сергеевич

1. Бруцеллез животных и его специфическая профилактика / Авилов В. М., Селиверстов В. В., Пылинин В. Ф. и др. // Ветеринария. -1997. №7. - С. 313.

2. Антонов, В. К. Сравнительная оценка вакцины из бруцелл штамма 115 типа Br. melitensis и из штамма 19 типа Br. abortus / Антонов В. К., Усманова Ф. И. // Труды НИВИ казах. Академ, е.- х., 1961. Т. 10. - С. 119-123.

3. Аскерова, С. А. Дифференциальная диагностика больных и вакцинированных против бруцеллеза животных / Аскерова С. А. // Бюллетень ВИЭВ. -Москва, 1985.- Вып.57. С. 12-15.

4. Апсите, А. Ф. Влияние степени обезвоживания на жизнеспособность клубеньковых бактерий люцерны. / Апсите А. Ф. // Микробный синтез биологически важных веществ. Рига. Зинатне, 1968. - С. 99-104.

5. Ашмарин, И.П. Быстрые методы статистической обработки и планирования экспериментов / Ашмарин И.П., Васильев Н.Н., Амбросов В.А. // Л.: Издательство Ленинградского университета, 1971. 78 с.

6. Баландин, Г.А. О поствакцинальной аллергии при бруцеллезе. Сообщение 1 / Баландин Г.А., Сазыкин С.П. // ЖМЭИ. 1963. - №8. - С. 44-49.

7. Бельченко, В. Б. Пластинчатая реакция агглютинации с влагалищным содержимым как метод диагностики бруцеллезных абортов у коров / Бельченко В. Б. // Вестник е.- х. науки. Алма-Ата, 1963. - №12. - С. 89-95.

8. Бельченко, В. Б. Опыт и оздоровление крупного рогатого скота от бруцеллеза. / Бельченко В. Б., Бжевская А. Н. // Ветеринария. 1967. - №8. - С. 55-56.

9. Балинер, Л.М. Разработка биолюминесцентного метода определения количества живых бактерий в лиофилизированных вакцинах: Дис. . канд. биол. наук: 16.00.03 / Л.М. Балинер; ФГУ «ВГНКИ». -М., 2003. 96 с.

10. Бровко, Л. Ю. Оптимизация биолюминесцентного метода определения микробной биомассы. / Бровко Л. Ю., Трдатян И. А., Угарова Н. Н. // Прикладная биохимия и микробиология. 1991. - Т.27. - №1. - С. 134-140.

11. Буланов, В. А. Аттенуация бруцелл и получение вакцинных штаммов / Буланов В. А., Наурызбаев Е. Е., Мекушина А. Л. // Труды Алма Атинского зооветеринарного института. - Алма - Ата, 1959. - Т. 11. - С. 321-325.

12. Вершилова, П. А. Бруцеллез/ под редакцией Вершиловой П. А.- М.: Медицина, 1972. 439 с.

13. Вершилова, П. А. Изучение иммуногенных свойств протективного антигена к экспериментальной бруцеллезной инфекции / Вершилова П. А., Дра-новская Е. А. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. -1974,-№7.-С. 92-97.

14. Определение оптимальной прививочной дозы бруцеллезной химической вакцины / Вершилова П. А., Драновская Е. А., Каринская Т. А. и др. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1982. - №10. -С. 59-65.

15. Вершилова, П. А. Морфологическая и биологическая характеристика вакцинного процесса при бруцеллезе / Вершилова П. А., Кокорин И.Н. // ЖМЭИ. 1954. - №1. — С. 7-13.

16. Вершилова, П. А. Течение бруцеллезной инфекции в иммунном организме / Вершилова П. А., Кокорин И.Н. // ЖМЭИ. 1954. - № 1. - С. 27-31.

17. Вершилова, П. А. Патогенез и иммунология бруцеллеза / Вершилова П. А., Чернышева М. И., Князева Э. Н. М.: Медицина, 1974. - 272 с.

18. К изучению иммунологической эффективности бруцеллезной химической активности на добровольцах. Автореферат / Вершилова П. А., Дранов-ская Е. А.,Шувалов Л.П., Вермул М.С. // ЖМЭИ. 1976. - №12. - С. 129-130.

19. Патент на изобретение № 2164241. / Деменьтьева В. И., Лундовских И. А., Кутузова Г. Д., Угарова H. Н. // 1999. -Реагент для определения аденозин -5'- трифосфата

20. Драновская, Е. А. Способ получения антигена для профилактики бруцеллеза / Драновская Е. А. и Самойленко И. И. // Описание к авторскому свидетельству №957471.

21. Драновская, Е. А. Изучение синтетических полимеров в качестве стимуляторов пролонгаторов иммуного действия бруцеллезного протективного антигена / Драновская Е. А., Игнатов П.Е. // ЖМЭИ. 1982. - №3. - С. 69-73

22. Дуранов, В. С. Свойства бруцелл, выделенных из абортированных плодов коров, привитых вакциной из штамма 82. / Дуранов В. С. // Ветеринария. 1975. - №11. - С. 32-33.

23. Егоров, Н. С. Практикум по микробиологии. / Егоров Н. С. (ред.). М.: Изд-во МГУ, 1976. - С. 61-70.

24. Жованик, П. Н. Убитая вакцина против бруцеллеза. Опыт иммунизации лабораторных животных / Жованик П. Н. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1950. - №6. - С. 9-13.

25. Жованик, П. Н. Образование иммунитета против бруцеллеза без поствакцинальной серопозитивности / Жованик П. Н. // Ветеринария. Киев. -1966.-№9.-С.15-22.

26. Жованик, П. Н. Вакцинопрофилактика в системе борьбы с бруцеллезом / Жованик П. Н. // Ветеринария. 1983. -№5. - С. 31-35.

27. Жованик, П. Н. Вакцинопрофилактика в системе мер борьбы с бруцеллезом сельскохозяйственных животных / Жованик П. Н. // Ветеринария. Киев. - 1984. - №59. - С. 3-5.

28. Жованик, П. Н. Испытание инагглютиногенной бруцеллезной вакцины из штамма В-8 в опытах иммунизации крупного рогатого скота / Жованик П. Н., Майборода А. А., Ерж Н. И. // Доклады ВАСХНИЛ. Москва, 1972. -Вып.8. - С. 10-14.

29. Заседателева, Г. С. Сравнительное изучение на крупном рогатом скоте вакцинных штаммов Br. abortus 19 и 19-А. / Заседателева Г. С., Селиванов А. В. и др. // Труды ВИЭВ. Москва, 1962. - Т.29. - С. 5-30.

30. Здродовский, П. Ф. Бруцеллез / Здродовский П. Ф. М.: Медгиз, 1953. -243 с.

31. Иванов, М. М. Итоги изучения вакцинных штаммов бруцелл / Иванов М. М. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов, М.,1977. Т.23. - С. 94-103.

32. Иванов, М. М. Изучение иммуногенных свойств живых бруцеллезных вакцин из штамов вида Br. melitensis / Иванов М. М., Кириллов Л. В. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов. М., 1968. - Т.15 - С. 75-80.

33. Иванов, М. М. Получение и испытание вакцинного штамма бруцелл вида Br. melitensis / Иванов М. М., Кириллов Л. В. // Бюллетень ВИЭВ. М., 1971. -Вып. 10.-С. 23-28.

34. Иванов, М. М. Итоги изучения вакцинных штаммов бруцелл / Иванов М. М., Малахова Т. И., Ниязов У. Э. // Труды ВГНКИ. М., 1977. - Т.23. - С. 94103.

35. Иванова JI. В., Бровко Л. Ю., Шеховцова Т. Н. и другие. Журнал аналитической химии. 1986. - Т.41. - Вып.4. - С. 743-749.

36. Игнатов, П. Е. Действие иммуностимуляторов в условиях in vitro и in vivo / Игнатов П. Е., Блинов Н. И., Кирш Ю. Э. // Труды ВИЭВ. М., 1983. -Т.53. - С. 74-77.

37. Имшеницкий, А. А. Отношение к окраске у живых и мертвых клеток / Имшеницкий А. А. // Микробиология. 1983. - Т.2. - №2. - С. 162-173.

38. Спектротурбидиметрический метод быстрой оценки чувствительности микроорганизмов к действию антибиотиков / Иосипенко А.Д., Щеголев С.Ю., Шендеров Б.А. и др. // Антибиотики. 1985. - Т.30. - №3. - С.208-212

39. Калмыков, В. В. Профилактическая эффективность иммунизации крупного рогатого скота адъювант-вакциной из штамма Бруцелла абортус

40. KB 17/100 / Калмыков В. В., Бобылев А. Н. // Материалы международной научной конференции, посвященной 70-летию образования зооинженерного факультета. Инфекционные и инвазионные болезни. Казань, 2000 г. - С. 6970.

41. Изучение стабильности штамма Бруцелла абортус 82, предложенного в качестве вакцинного / Климанов А. И., Малахова Т. И., Шумилов К. В., Са-моруков Ю. А. // Тр. ин-та ВГНКИ. М.,1983. - С. 20-24.

42. Результаты изучения биологических свойств штамма Бруцелла абортус 82 / Климанов А. И., Малахова Т. И., Шумилов К. В., Саморуков Ю. А. // Тр. ин-та ВГНКИ. М.,1983. - С. 14-19.

43. Коваленко, Я. Р. Научные основы совершенствования мероприятий против инфекционных болезней животных / Коваленко Я. Р. // Вестник сельскохозяйственной науки. 1963. - С. 484-487.

44. Косилов, И. А. Роль специфической профилактики в системе противо-бруцеллезных мероприятий / Косилов И. А. // Эпизоотология и меры борьбы с инфекционными болезнями животных. Новосибирск, 1985. - С. 30-34.

45. Кочурин, А. Н. Об опыте применения противобруцеллезных вакцин из инагглютиногенных штаммов / Кочурин А. Н., Шумилов К. В. // Бюллетень ВИЭВ. М.,1972. - ВыпЛО. - С. 33-37.

46. Лим, А. А. Иммунологическая реактивность крупного рогатого скота при различных методах введения вакцины из штаммов Br. abortus 104 М: Авто-реф. дис. . канд. вет. наук / Лим А. А. 1987. - 21 с.

47. Лискина, И. В. Определение живых микробов в вакцинной смеси без посевов на искусственные питательные среды / Лискина И. В. // ЖМЭИ. -1960.-Т.4.-С. 128-129.

48. Ломинейшвили, М. М. Изыскание оптимальных иммунизирующих доз вакцины из штамма Br. abortus 19 при вакцинации крупного рогатого скота против бруцеллеза: Автореф. дис. . канд. вет. наук / Ломинейшвили М. М. -Тбилиси,1985.-20 с.

49. Луста, К. А. Методы определения жизнеспособности микроорганизмов / Луста К. А., Фихте Б. А.; Под ред. В. К. Ерошина. Пущино: ОНТИ НЦБН АН СССР, 1990. С. 3-25.

50. Малахова, Т. И. Сравнительная оценка иммуногенных свойств производственных серий противобруцеллезных вакцин / Малахова Т. И., Климанов А. И., Саморуков Ю. А. и др. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов. М., 1978. -Т.27. - С. 47-51.

51. Малахова, Т. И. Изучение стабильности штамма Бруцелла абортус 82, предложенного в качестве вакцинного / Малахова Т. И., Климанов А. И., Саморуков Ю. А., Шумилов К. В. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов. М., 1983. - С. 20-24.

52. Малахова, Т. И. Изучение свойств эталонной и производственной серий вакцины из штамма Бруцелла абортус 82 / Малахова Т. И., Климанов А. И., Саморуков Ю. А., Шумилов К. В. // Труды ВГНКИ ветпрепаратов. М., 1983.-С. 6-11.

53. Мейсель М. Н., Медведева Г. А., Алексеева В. Н. // Микробиология. -1961 Т.ЗО. - №5. - С. 855-862.

54. Мейнелл, Д. Экспериментальная микробиология / Мейнелл Д., Мейнелл1. Э.-М.:Мир, 1967.-347с.

55. Невский, И. Н. Иммунобиологическая характеристика штамма бруцелл №12 УзНИВИ / Невский И. Н. // Труды УзНИВИ, 1959. - Вып. 13. - С. 140146.

56. Изучение иммуногенных свойств и оптимальной иммунизирующей дозы экспериментальной противобруцеллезной вакцины из штамма 75/79 А Вг. abortus / Никифоров И. П., Разумовская И. Б., Бокова Т. В. и др. // Ветеринария. - 1995. - №12. - С. 29-32.

57. Апробация вакцины из штамма 75/79 A Br. abortus на крупном рогатом скоте / Никифоров И. П., Разумовская И. Б., Степанов В. А. и др. // Ветеринария. - 1995. - №8. - С. 20-23.

58. Новаев, H.H. Опыт оздоровления овец от бруцеллеза в каракулеводческом совхозе "Улус" с применением вакцины из штамма №19 / Новаев, H.H. // Сб. науч. трудов инта УЗНИВИ, 1963. Т.15. - С.63-68

59. Новицкий, А. А. Результаты исследований лаборатории по изучениюбруцеллеза / Новицкий А. А. // Сб. научи, раб. СибНИВИ. Омск, 1977. -Вып. 28.-С. 13-20.

60. Омаров, К. С. Опыт заражения рыб Br. melitensis / Омаров К. С. // Известия АН Казахской ССР. Сборник научных работ по бруцеллезу, 1951. -Вып.5 С. 37-38.

61. Совершенствование технологии лиофильного высушивания производственного штамма Salmonella typhimurium / Опарин Ю. Г., Богаутдинов 3. Ф., Пивоварова И. К. и др. // Биотехнология. 1996. - №9. - С.29-31.

62. Орлов, Е. С. Испытание иммуногенных свойств слабовирулентного штамма Br. bovis 1 / Орлов Е. С., Борисович Ю. Ф. // Бюллетень ВИЭВ. -М.,1956. Вып.1. - С. 12-13.

63. Новое в лечении и профилактике инфекционных болезней животных // Орлов, Е. С. Диагностика и специфическая профилактика бруцеллеза животных / Орлов Е. С., Касьянов А. Н. М.: Колос, 1972. - С. 52-57.

64. Орлов, Е. С. Сравнительное изучение вирулентных и иммуногенных свойств шести вакцинных штаммов бруцелл / Орлов Е. С., Уласевич П. С., Иванов М. М. и др.//Бюллетень ВИЭВ. М., 1971. - Вып.10. - С. 160-165.

65. Островская, Н. Н. Экспериментальное изучение вакцинного штамма варианта Br. abortus, полученного под воздействием бруцеллезного фага "ТБ" / Островская Н. Н. // Журн. микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 1965. - №7. - С. 42-44.

66. Печникова, И. В. Влияние состава среды высушивания на термоустойчивость чумной живой сухой вакцины ЕВ в процессе длительного хранения:

67. Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1967. - 19 с.

68. Пучков, Е. О. Методы определения содержания и жизнеспособности микроорганизмов / Пучков Е. О. // Биотехнология. 1988. - Т. 4. - №1. - С. 132-142.

69. Пучков, Е. О. Проблемы криоконсервации бактериальных культур. Консервация генетических ресурсов / Пучков Е. О., Говорунов И. Г. Пущино, 1983.-23 с.

70. Изменение пула адениновых нуклеотидов в клетках бактерий E.coli 257 при воздействии низкоинтенсивного He-Ne-лазера / Романова Н. А., Бровко JI. Ю., Сепульведа-Бессера М., Угарова Н. Н. // Биохимия. 1993. -Т.58. -Вып.З. - С. 376-384.

71. Рягузов, В. С. Новый вакцинный штамм бруцелл №21 / Рягузов В. С. // Сборник научных трудов Донского с. х. института. - Ростов, 1967. - Т. 3. -Вып.З. - С. 5-17.

72. Саттаров, A.C. Дифференциация вакцинного штамма Бруцелла абортус 19 от эпизоотических штаммов бруцелл / Саттаров A.C. // Труды института ВИЭВ. -М.,1967. Т.ЗЗ - С.202-204

73. Салмаков, К. М. Специфическая профилактика бруцеллеза крупного рогатого скота / Салмаков К. М. // Сборник научн. Трудов Казанского ветеринарного института. Казань, 1980. - Т.135. - С. 3-16.

74. Абортогенные свойства противобруцеллезной вакцины из штамма Бруцелла абортус 75/79 AB / Самобочий А. В., Никифоров И. П., Филиппов В. А., Коваленко Л. Д. // Ветеринария. - 1999. - №10. - С. 17-19.

75. Селиванов, А. В. Бактериологическая характеристика вакцинного процесса и иммунитета у овец, привитых через неповрежденную конъюнктиву вакциной из штамма 19 / Селиванов А. В. // Бюллетень Сибирского НИВИ, 1959.-С. 2-5.

76. Сидякина, Т. М. Консервация микроорганизмов. Консервация генетических ресурсов / Сидякина Т. М. Пущино, 1985. - 63 с.

77. Софронов, Н.В. Эффективность вакцины из штамма 19 при ликвидации бруцеллеза мелкого рогатого скота в Узбекской ССР// Сб. науч. трудов Уз-НИВИ. 1963.-Т.15-С.43-48

78. Софронов, Н.В. Эффективность прививок вакциной из штамма №19 в условиях Самаркандской области / Софронов Н.В., Махмудов A.M., Нурит-динов H.H. // Сб. науч. Трудов УзНИВИ. 1963. - Т. 15 - С.51-54

79. Степин, В. С. Компоненты клеточного иммунитета в зависимости от способа введения вакцины / Степин В. С., Проскурина JI. И. // Вестник с.-х. науки Казахстана. 1986. - №4. - С. 66-67.

80. Сюсюкин, В. А. Результаты изучения иммуногенных свойств противо-бруцеллезных вакцин из штамма 82 на крупном рогатом скоте / Сюсюкин В. А., Карпова В. А., Объедков В. А., Ровнейко 3. JI. // Тр. ин та белНИИЭВ. -Белгород, 1980. - Т. 18. - С. 28-32.

81. Триленко, П. А. Особенности иммунитета под влиянием вакцин инагг-лютинабельных штаммов бруцелл / Триленко П. А. // Бюллетень ВИЭВ. -М.,1971. Вып. 10. - С. 43-46.

82. Угарова, Н. Н. Биоаналитические применения люциферазы светляков / Угарова Н. Н. // Прикладная биохимия и микробиология. 1993. - Т.29.2.-С. 180-191.

83. Угарова, Н. Н. Иммобилизованные биолюминесцентные системы / Угарова Н. Н., Бровко JI. Ю., Лебедева О. В. // Итоги науки и техники. Сер. Биотехнология. М.:ВИНИТИ, 1986. - Т.6. - С. 88-163.

84. Биолюминесцентные методы анализа в микробиологии / Угарова Н. Н., Бровко Л. Ю., Трдатян И. А., Райнина Е. И. // Прикладная биохимия и микробиология. -1987. -Т.23. №1. - С. 14-24.

85. Биолюминесцентные методы и реагенты для целей медицинской диагностики / Угарова Н. Н., Бровко Л. Ю., Лебедева О. В., Березин И. В. // Вестник Академии Медицинских Наук СССР. 1985. - №7. -С. 88-94.

86. Уласевич, П. С. Разработка научных основ программы профилактики и ликвидации бруцеллеза сельскохозяйственных животных / Уласевич П. С. // Труды ВИЭВ.-М., 1982.-Т.55. С. 96-101.

87. Уласевич, П. С. Перспективы вакцинации крупного рогатого скота против бруцеллеза малыми дозами штамма Br. abortus 19 / Уласевич П. С., Ро-махов В. А. // Ж. Сельское хозяйство за рубежом. 1983. - №6. - С. 47.

88. Фихман, Б. А. Микробиологическая рефрактометрия// Фихман Б. А. -М.: Медицина. 1967. - С. 191-223.101 .Микробиологическая рефрактометрия. // Фихте Б. А. Культуральные методы. / Фихте Б. А. М.: Медицина. -1967. - С. 194-196.

89. Микрокинемаграфические методы исследования микроорганизмов. // Фихте Б. А., Печников Н. В., Будницкий А. А., Корн М. Я. М.: Наука, 1975. -С. 157-161.

90. Фрунджян, В. Г. Разработка методов биолюминесцентного определения целевого АТФ (соматического и микробного) в различных образцах клинической и санитарной микробиологии: Автореф. дис. . канд. хим. наук. -М., 1999.-28 с.

91. Биолюминесцентное определение общей бактериальной обсемененности сырого молока / Фрунджян В. Г., Бабунова В. С., Бровко JI. Ю., Карта-шова В. М., Угарова Н. Н. // Молочная промышленность. 1998. - №6. - С. 38-39.

92. Фрунджян, В. Г., Биолюминесцентный метод определения антибиоти-кочувствительности септической крови / Фрунджян В. Г., Бровко JL Ю., Угарова Н. Н. // Прикладная биохимия и микробиология. 1997. - Т.ЗЗ. -№4. -С. 455-460.

93. Черкасов, В. В. Опыт оздоровления хозяйств от бруцеллеза с применением живой вакцины из штамма 82 / Черкасов В. В., Ростов А. П. // Науч. тр. ин та/КазВИ,-Казань, 1980. - Т.135. - С. 80-82.

94. Инфекционные болезни животных. / Шумилов К. В. // Бруцеллез М., 1987.-С. 170-175.

95. Вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота / Шумилов К. В., Альбертян м. П., Клочков А. А., Ромахов В. А. // Ветеринария. 1984. - №12.- С. 26-28.

96. Адъювант-вакцины против бруцеллеза крупного рогатого скота из штамма КВ 17/100 В. abortus / Шумилов К. В., Калмыков В. В., Бобылев А. Н., Селезнев Н. А. и др // Ветеринария. 1999. - №8. - С. 17-24

97. Бруцеллез крупного рогатого скота: профилактика и меры борьбы / Ярославцев Г. П., Таранчук А. Т., Боярынцева Г. Г., Кунцрюкова JI. П. // Ветеринария. 1986. - №2. - С. 11-12.

98. Alton G.G. The control of bovine brucellesis / Alton G.G. // World Ann. Rev.-1981.-V.39.-P.17-24

99. Alton G.G. Vaccination of cattle against brucellosis using lither e reduced dose of strain 19 or one or two doses of 45/20 vaccine / Alton G.G., Corner S.A.,

100. Plackett P. // Austral. Vet. J. -1983. V.60. - №6. - P.175 -181

101. Alton G.G. Vaccination of heifers with a reduced dose of Brucella abortus strain 19 vaccine before first mating / Alton G.G., Corner S.A. // Austral. Vet. J. -1981. V.57. - №12. - P. 548 -550

102. Alton G.G. Vaccination of pregnant cows with low doses of Brucella abortus strain 19 vaccine / Alton G.G., Corner S.A., Plackett P. // Austral. Vet. J. -1980. -V.56. -№8. -P.369 -372.

103. Antheunise J. Viability of microorganisms after drying and storage / An-theunise J. et al. // Antonie van Leeuwenhoek.- 1981. V. 47. - №6. - P. 539-545

104. Bang B. Die Aetiologis des seuchenhaften ("infectiosen") Varwerfens // Zeitschrift fur Tiermedicin. 1897. - P. 241 - 278

105. Barton C.T. Reduced dose whole herd vaccination against bruccellosis: A review of recent experience / Barton C. T., Lomme J.R. // JAVWA. - 1980. -V.177. -№12. -P.1218- 1220

106. Bautista D.A. The application of ATP bioluminescence for the assessment of milk quality and factory hygiene / Bautista D.A., Mclntyre L., Laleye L., Griffiths M.W. // J. Rapid Metods and Automation in Microbiology.- 1992.- V.l.- P. 179193

107. Berman D.T. Summary of research on brucellosis conducted in Department of veterinary science / Berman D.T., Jones L.M. // WHO/BRUC/80.363 WHO/ZOON/ 80.137

108. Bishop J.R. Assessment of dairy product quality and potential shelf-life. A review / Bishop J.R., White C.H. // J. Food Protection. 1986. - V.49. - №9. - P. 739-753

109. Bryant S. M. Enhanced chemiluminescence production by purified macrophage monolayers form C. parvum treated mice / Bryant S. M., Hill H. R. // Im-munopharmacol. -1981. -V.3. №3. - P. 19- 29

110. Bosman R.R. Skema vir die befieer en niteiindelike Uitraeiing van beesbrucellosis / Bosman R.R. // J. South Afr. Vet. Ass. 1980. - T.51. - №2. - P.75-81

111. Botha W.S. The application of adenosine triphosphate metod as a rapid bacteriological platform test / Botha W.S., Lusk J., Jooste P.J. // South African J. Dairy Technology. 1985. - V. 17. - P. 59-64

112. Bousfield I.J. Inactivation of bacteria by freeze-drying / Bousfield I.J., Mackensie A.R. // In: Inhibition and inactivation of vegetative microbes. Ed. By F. A. Skinner and W. B. Hugo. Acad. Press, N. Y. 1976. - P. 329-344

113. Bossuit R. A 5 minute ATP platform test forjudging the bacteriological quality of raw milk / Bossuit R. // Netherlands Milk and Dairy J. - 1982. - V.36. -P.355-364

114. Bowser D.V. Immunologic properties of soluble materials from Brucella species / Bowser D.V., Faster G.N., Cooper M.D. // Am. G. Vet. Res. -1979. -V.40. №2. - P. 256-259

115. Cameron H.S. Differentiating postvaccination reactions in Brucellosis from virulent infection / Cameron H.S., Kendrik G.W. // G. Amer. Veter. Med. Assoc. 1957. - V. 130 - №2. - P.90-92

116. Cannat A. Induction of autoantibodies and circulating immune complexed in mice after infection of Brucella fraction "pi" or inoculation with live Brucella suis / Cannat A., Escanda A., Peraldi F. and Serre A. // Ann. Immunol. 1983. -V. 1340.-P. 43- 53

117. Chen I.M. Application of an enzyme-linked immunosorbent assay for detection of Brucella antigens in vaginal discharge of cows / Chen I.M., Thoen C.O., Pietz D.E. at all. // Am. J. Vet. Res. 1984. - V. 45. - №1. p. 32 -34

118. Chung I.S. Immunoglobulin classes in serum antibody reactions in cattle following vaccination with Brucella abortus strain 19 and kelled 45/20 vaccines / Chung I.S., Hall W.T.K., Simmons G.G. // Austral. Vet. J. 1980. - V. 56. - № 9. -P. 413 -416

119. Colwell R.R. In: Native Aquatic Bacteria: Enumeration, Activity and ecology ASTM STP 695 / Eds. J.W. Casterton, R.R. Colwell // Philadelphia, Pa: Amer. Soc. for Testing and Materials. - 1979. - P. 56 - 61

120. Corbel M.J. The effect of passively acquired antibodies to Brucella abortus on the immune response to strain 19 vaccine / Corbel M.J. // Br. Vet. J. 1972. -V.128.-P. 107-110

121. Cousins C.M. The pyruvate test for monitoring the bacteriological quality of raw silo milk / Cousins C.M., Rodrigues U.M., Fulpord R.J. // J. Dairy Research.- 1981.-V.48.-P. 45-50

122. Cunningam B. The Use of Killed 49/20 Adjuvant-Vaccine as a Diagnostic Agent in the Final Stages of the Eradiation of Brucellosis / Cunningam B., O'Connor M. // Vet. Ree. 1971,- 89(26). - P. 680 - 686

123. Cox C. Effect of oxygen upon freeze-dried and freeze-thawed bacteria: vir ability and free radical studies / Cox C., Heckly R. // J. canad. Microbiol. 1973. -V.19. - №2. - P. 189-194

124. Cousins C.M. The pyruvate test for monitoring the bacteriological quality of raw silo milk / Cousins C.M., Roudrigues U.M., Fulpord R.J. // J. Dairy Recearch.- 1981.-V.48.-P. 45-50

125. Delpy L. P. Methode de numeration dfs bacteries vivantes / Delpy L. P., Beranger G., Kaweh M. // Ann. Inst. Pasteur. 1956. - V.91. - №1. - P. 112-114

126. Dhemin L. Resultat de lietude comparye de sept vaccins antibrucelliques / Dhemin L. // Bull, de I'Acad. Vet. France. 1973. - V. 46. - №4. - P. 171 - 190

127. Die Bekämpfung der B. brucellose. // Deutsche Schafzucht.- 1985. B. 77. -№2. - P. 24-28

128. Diesterich R.A. Effects of cilled Brucella abortus strain 45/20 vaccine on Reindev Lates Challenge exposed with Brucella suis Type 4 / Diesterich R.A., DeyocB.S., Morton J.K. //Am. J. Vet. Res. -1981.-V. 42. -№1. -P. 131 134

129. Draft Text Propasals to Joint FAO/WHOExpert Committee on Brucellosis.

130. Quelity and potency control of vaccines. Geneva. 1985. - Annex. 7. - P. 195 -201

131. Dubray G. Propriétés vaccinales de fractions de Brucela / Dubray G., Bosseray N., Plommet M. // Copte de l'Academic des Sciences. 1974. - V. 279. -P. 1805- 1808

132. Dukhovich A.F. Bioluminescence and Chemiluminescence, Current Status /, Philippova K.Y., Ugarova N.H. // Eds Stanley Ph. E. Kriscka L.J. Chichester: Yohn Wiley. 1991. - P. 507-510

133. Enringht F.M. Bovine brucellosis and its control / Enringht F .M., Knox J.W. // Louisiana Agr. 1984. - V. 27. - № 4. - P. 18 -19

134. Falade S. Stadies on Brucella melitensis Rev 1 vaccine in goats / Falade S. // Ibl. Veter. - 1981. - V. 28. - № 9. - P. 749 - 758

135. Foster J.W. Immunological role of Brucella abortus cell walls Foster J.W., Ribi E. // J. Bacteriol. 1962. - V. 84. - P. 258 - 268

136. Gibson D.M. Some modification of the media for rapid automated detection of salmonellas by conductance measurement / Gibson D.M. // J. Appl. Bacteriol. -1987. V.63. - P. 299-304

137. Graumlich T.R. Estimation of microbial population in orange juice by bioluminescence / Graumlich T.R. // J. Food Science. 1985. - V.50. - P. 116-117

138. Gracia E. In vitro development Staphylococus aureus biofilming of variants, manufacturing to slime and ATP for computerized bacterial quantification / Gracia E., Fernandez A., Conchello P. and all. // Luminescence. 1999. - P.23-31

139. Griffiths M. ATP to detect bacteria in dairy products / Griffiths M. // J. Soc. Dairy Techno. 1989. - V.42. - №3. - P. 61-62

140. Han S.H. Determination bacterial number in milk by ATP assay monitored by luciferin luciferase bioluminescence reaction / Han S.H., Kim C.H., Kim J.B. and all. // Korean J. Animal Science. - 1985. - V.27. - P.782-784

141. Hawking B. States change minimum brucellosis standards / Hawking B. // Hoard's Dairyman. 1984. - V.129. - №22. - P. 1300-1332

142. Highsmith A.K., Abshire R.L. // Appl. Microbiol. 1975. - V. 30. - № 4. -P. 596-601

143. Jenkinson D.C. A method for measuring of adenosin triphosphate in soil / Jenkinson D.C., Oades J.M. // Soil Biology and Biochemistry. 1997. - V.ll. -P. 193-199

144. Jennison M. Relations between plate counts and direct microscopic counts of E. coli during the logarithmic growth / Jennison M. // J. Bacteriol. 1937. - V. 33. -P. 461-467

145. Jones L., Berman D. Bovine brucellosis. WHO/Bruc. - 1980. - 365 p.; ill.

146. Kahru A. Use of luciferin-luciferase assay of ATP for measuring the bacterial growth: Appl. To E. coli / Kahru A., Vilu R. // Acta Biotechnology. 1988. -V. 8. - №1. - P. 93-98

147. Kennedy J.E. Application osf bioluminecence to rapid determination of microbial levels in ground beef / Kennedy J.E. and J.R., Oblinger J.I. // J. Food Protection. 1985. - V. 48. - №4. - P. 334-340

148. Koch A.I. Kultur der Microorganismen. Teubner, Leipzing. 1981. - P. 5363

149. Koh S.H. The effect of Calfhood vaccination with strain 19 on the Serological Diagnosis and Eradication of Bovine Brucelosis / Koh S.H., Morley F.H.W. // Ausral. Vet. J. V.57 (12). - 1981. - P. 551-553

150. Kolar J. Some observations on antigenic properties and immunogenic effects of Brcella vaccine PB 19 / Kolar J. // Br. Vet. J. 1978. - V. 134. - № 4. - P. 384 -392

151. Levin G.V. Methodology for application of adenosine triphospate determination in waste water treatment / Levin G.V., Schort J.R., Hees W.S. // Environmental Science Technology. 1975.- V.10.- P.951-965

152. Langeveld L.P.M. De ATP-verschilmethode en de microscopishe telmethode voor de kwaliteitscontrole van rauwe melk / Langeveld L.P.M., Van der Waals C.B. // Voedingsmiddelentechnologie. 1987. - V.19. - P.20-23

153. Langeveld L.P.M. The ATP platform test, the ATP test and the direct microscopic count procedure as methods of estimating the microbial quality of raw milk / Langeveld L.P.M., Van der Waals C.B. // Netherlands Milk and Dairy J. -1988.-V.42.-P. 173-182

154. Lister J. On the lactic fermentation and its bearings on pathology / Lister J. // Trans. Path. Soc., Lond. 1978. - V.29. - P. 425-432

155. Lundin A. Analytical application of bioluminescence: the firefly system / Lundin A. // Clinical and Biochemical Luminescence. Eds. Kricka L. J. & Carter T. J. N. N. Y.: Marcel Dekker Inc. 1982. - P.43-74

156. Lundin A. Comparison of methods for extraction of bacterial adenine nu-cleotides determined by firefly assay / Lundin A., Thore A. // Applied Microbiology. 1975. - V.30. -N.5. - P.713-721

157. Mc Mahon K. I. Comparison of agar-gel Ummunodiffusion Test with other

158. Serological Methods for differentiating Brucella Sufected from vaccinated cattle / Mc Mahon K. I. // Can. J. Comp. Medic. 1983. - V. 47. - P. 86 - 87

159. Murray H.W. Macrophage-dependendent killing of intracellular parasites / In Host deferences to intracellular pathogens / Murray H.W. // New York, London. -1983.-P. 127- 143

160. Nicoletti P. Vaccination of cattle with Brucella abortus stain 19 administered by differing routes and doses vaccine / Nicoletti P. // Vaccine. 1984. - V. 2. -№2. - P 133 - 135

161. Nicoletti P. The control and prevention of bovine brucellosis. / Nicoletti P. // Outlook Agr. 1984. - V.13 (2). - P.77-79

162. Nigrelli A. Production and control of fruzedried Brucella abortus strain 19 vaccine by using celle produced by fermentation units / Nigrelli A., Zavanella C., Ciuchini F., Sala V. // Appl. Microb. And Biotechn. 1984. - V. 19. - №4. - P. 229 -231

163. Ogden I.D. A modified conductance method for the detection of Salmonella spp. / Ogden I.D., Cann D.C. // J. Applied Bacteriology. 1987. - V.63. - P.459-464

164. Olitzki A. L. Toxicity, infectivity and antigenecity of a streptomycin dependent mutant of Brucella abortus (strain 19) / Olitzki A. L., Szenberg E. // Proc. Soc. Exptl. Boil. Med. 1953. - V. 82. - №6. - P. 539 - 541

165. O'Tool D.K. A review. Methods for the direct and indirect assessment of the bacterial count of milk / O'Tool D.K. // J. Applied Bacteriology. 1983. - V.55. -N2.-P. 187-201

166. Pardon P. Resistance of Brucella abortus infected mice to intravenous or intraperitoneal Brucella reinfection / Pardon P., Marly J. // Ann. Immunol. 1976. -V. 127.-P. 57-70

167. Pardon P. Resistance of normal of immunized guinea pigs against a subcutaneous challenge of Brucella abortus / Pardon P., Marly J. // Ann. Rech. Vet.1978. V. 9. -№3. - P. 419 - 425

168. Phillips M. Immunogenic properties of ribosomes isolated from Bracella abortus / Phillips M., Leyos B. L. // Vet. Microb. 1981. - V. 6. - P. 95-106

169. Plommet M. Immunisationagainst bovine brucellosis / Plommet M. / WHO // Bruc.- 1980. -№358.-P. 1 8

170. Plommet M. Les dernieres etapes de la prophylaxie de la brucellose bovine / Plommet M. // Bull. Soc. Veter. Prat. Fr. 1984. - V. 68. - №8 - P. 507 - 520

171. Plommet M. Brucellose bovine experimentale / Plommet M., Fensterbank R., Renoux G., Gestin J. et Philppon A. // Ann. Rech. Vet. France. 1973. - V. 4. -№3.- P. 419 -435

172. Plommet M. L'evolytion de la Brucellose chronique de la souris. n'est pas amelioree par 1'administration dun antigene vaccinal / Plommet M., Plommet A. M., Bosseray N. //Ann. Rech. Vet. 1972. - V. 13. - № 2. - P. 127 - 132

173. Plommet M. Progre recents on immunisation control'infection a Brucella abortus. Immunisation chez les bovins / Plommet M. // Preventtive Veterinary Medicine. 1984. - V.2. - P. 205-214

174. Popescu C. The preservation of viability of BCG vaccine freeze-dried in a new exracellular protector, evaluated by ATP-dependent bioluminescence assay / Popescu C., Balazs D., Tasca G., Pitur I. // Ciyo-Letters. 1999. - № 20. - P. 71-76

175. Postgate J. R. Accelerated death of Aerobacter aerogenes starved in the presence of growth-limiting substrates / Postgate J. R., Hunter J. R. // J. Gen. Microbiol. 1964. - V.34. - P. 459-473

176. Postgate J. R. In: Adv. Microb. Physiology. V. 1 / Eds. A. Rose, J. F. Wilkinson // London - N. Y.: Acad. Press. - 1961. - P. 1 -23

177. Prohaszka L. Versuche zur herstellung von Brucella suis -stammen mit herabgesetzter virulenz / Prohaszka L. // Acta Vet. Acad. Seien. Hung. 1959. -V. 9-№l.-P. 67-72

178. Prohaszka L. Immunization of cattle against Brucellosis with a new livingvaccine / Prohaszka L. 11 Acta Vet. Acad. Scien. Hung. 1960. - V. 10. - №3. -P. 229-232

179. Purnendu C.V. Rapid methods and automation in dairy microbiology / Purnendu C.V. // J. Dairy Science. 1993. - V.76. - P. 3101 -3113

180. Rowlands A. Dye tests as measures of the keeping quality of milk / Rowlands A., Barkworth H., Hosking Z.5 Kemphorne O. // J. Dairy Research. 1950. -V.17. - P. 161-191

181. Russek E., Colwell R. R. // Appl. Env. Microbiol. 1985. - V. 45. - №5. - P. 1640- 1650

182. Sala-Newby G. B. Ultrasensitive detection of microbes by ATP analysis / Sala-Newby G. B., Goodfield C., Johnson I. R. et al. // In: ATP Luminescence: Society for the Applied Bacteriology. 1989. - P.261-269

183. Selan L. Reliability bioluminescence ATP test for detection of bacteria / Se-lan L., Berlutti F., Passarielo C., Thaller M. C., Renzini G. // J Clin Microbiol. -1992. V.30. - №7. -P. 1739-1742

184. Sheppard E.P. Luciferin-luciferase assay of ATP from bacteria. A comparison of DMSO and acetone with other solvents / Sheppard E.P., Gow J.A., Geor-ghiou P.E. // Microbios. 1987. - V.52. - N210. - P. 39-50

185. Simon E. M. Pathogenicity and immunogenicyty of streptomycin- dependent mutation of Brucella / Simon E. M., Berman D. T. // J. Bacteriol. 1962. - V. 83. - №6. - P. 1247- 1355

186. Standart Methods for the Enamination of Water and Waste Water // Washington: D. C. American Public Health Association. 1971. - P. 635 - 678

187. Stanley P. Introduction to ATP rapid microbioligy. Biolumenescence and Chemiluminescence, 1992. - V.7, 255 p.; ill

188. Subramani S. De Luce M. / Subramani S. // OCT. engeoeer. 1988. - V.10. -P.75-89

189. Sutherland A.D. The Biotrace method for estimating bacterial number inmilk by bioluminescence / Sutherland A.D., Bell C., Limond A. and all. 11 J. Society of Dairy Technology. 1994. - V.47. -N.4. - P. 117-121

190. Thomas V.J. Biometrics. / Thomas V.J., Doughty N.A., Fletcher R.H. // Can. J. Plant Sci. 1972. - V.28. - N4. - P.947-958

191. Ugarova K.H. Bioluminescence and Chemiluminescence. Current Status / Ugarova K.H., Vozny Y.V. and all. // Eds Stanley Ph. E., Kricka L.J. Chichester: Yohn Wiley. 1991. - P.511 -514

192. Van Crombrugge J. Methods for assessing the bacteriological quality of raw milk from the farm / Van Crombrugge J., Waes G. // Bulletin of the International Dairy Federation. 1991.-N256.-P.53-60

193. Webster J. A. J. Improved sensitivity of the bioluminescenct determination of numbers of bacteria in milk samples / Webster J. A. J., Hall M.S., Rich C.N. and all. // J. Food Protection . 1988. - V.51. - N12. - P.

194. Webster J. A. J. ATP in soil: a new extractant and extraction procedure / Webster J. A. J., Hampton G. J., Leach F. R. // Soil Biology and Biochemistry. -1984. V.16. - №4. - P. 335 - 342

195. Wilkowa G. Proda identyfikowania bydta szczepionego S19 I zakaronego w sposob naturalny, przy pomocy aglutynacji z serwatha mleka / Wilkowa G. // Med. Veter. 1960. - V. 16. - №3. - P. 140 -142

196. Woodard L. F. Brucellosis vaccine for cattle containing mycolate esters of trefalose / Woodard L. F. // Patent of USA. 1982. - № 4340588

197. Woodard L. F. Brucella abortus Vaccines: Comparison of Protection Provided by Immunopotentiated 45/20 Bacterins and Live Strain 19 Vaccine in

198. Guinea Pigs / Woodard L. F., Toone N. M., Jasman R. L. // Am. J. Vet. Res. -1981.-V. 49. -№ 11.-P.1959- 1962

199. Yamazaki T. Antimicrobial test of a susceptibility for Mycobacterium tuberculosis bioluminescence by test mycobacterial ATP use filamentous processing cell / Yamazaki T., Sato N., Ymashita K., Okazawa Y., Tanno K. // J Environ Health.-2001.-P.9-14