Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Сравнительная иммуноморфологическая ультраструктурная, иммуногенетическая оценка эффективности и реактогенности противобруцеллезных вакцин



с

/ /' /

/ Р / V 1

'""К"

¡v'

КАЗАНСКАЯ ГОСУДАРСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ ВЕТЕРИНАРНОЙ МЕДИЦИНЫ ИМЕНИ Н.Э.БАУМАНА

На правах рукописи

ЛИ "Г""' МУЛЛАКАЕВ ОКАЗАЛИ ТУРМАНОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ИММУНОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ, УЛЬТРАСТРУКТУРНАЯ, ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ И РЕАКТОГЕННОСТИ ПРОТИВОБРУЦЕЛЛЕЗНЫХ ВАКЦИН

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

Диссертация на соискание ученой степени доктора ветеринарных наук

Научные консультанты: заслуженный деятель науки РТ и РФ, академик АНТ, доктор ветеринарных наук, профессор Г.З.ИДРИСОВ доктор ветеринарных наук Т.Х.ФАИЗОВ

Казань 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

ВВЕДЕНИЕ 5

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 12

1.1. Специфическая профилактика бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота....................................................... 12

1.2. Иммуноморфологическая оценка безвредности вакцин.... 27

1.3. Клеточные и гуморальные факторы иммунитета и их иммунобиологический надзор............................................ 41

1.4. Значение Л-форм бактерий в патогенезе инфекционных болезней................................................................................ 56

1.5. Современные молекулярно-генетические методы (ДНК-ДНК гибридизация, мультилокусная геномная "дактилоскопия", полимеразная цепная реакция) индикации и дифференциации возбудителей инфекционных болезней...................................................... 67

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 81

2.1. Материалы и методы исследований.................. ............... 81

2.2. Дифференциация различных штаммов бруцелл методами мультилокусной геномной "дактилоскопии" и электронной микроскопии................................................... 91

2.3. Иммуноморфологические, ультраструктурные изменения в органах и тканях лабораторных животных после одно-и многократной вакцинации и иммуногенетическое определение продолжительности пребывания в организме различных штаммов бруцелл............................. 103

2.3.1. Патоморфологические и электронно-микроскопические изменения в организме морских свинок после одно-, двух- и трехкратной иммунизации...................................... 103

2.3.2. Определение продолжительности пребывания в организме вакцинных штаммов бруцелл, их индикация и дифференциация методами ДНК-ДНК гибридизации,

V/ о СС эу

мультилокуснои геномной дактилоскопии и. полимеразной цепной реакции............................................ 133

2.3.3. Изучение уровня содержания иммунокомпетентных клеток в крови и органах вакцинированных животных..... 142

2.3.4. Гистохимическое изучение напряженности и длительности иммунитета у морских свинок после одно-

и многократной вакцинации................................................ 154

2.4. Иммуноморфологическая и иммуногенетическая оценка эффективности противобруцеллезных вакцин из штаммов 19, 82 и 82-ПЧ на крупном рогатом скоте........... 164

2.4.1. Сравнительная иммуноморфологическая оценка эффективности вакцин из штаммов бруцелл 19, 82, 82-ПЧ и индикация бруцелл методом полимеразной цепной реакции.................................................................................. 164

2.4.2. Морфологическая оценка иммуногенных свойств и безвредности вакцины из штамма бруцелл 82-ПЧ в разных дозах......................................................................... 174

2.4.3. Иммунофлуоресцентные исследования органов и тканей и определение уровня содержания лизосомных катионных белков в них у телок, привитых противобруцеллезными вакцинами..................................... 191

2.4.4. Иммуноморфологическая оценка длительности и напряженности иммунитета при разных сроках ревакцинации животных противобруцеллезной вакциной

из штамма 82-ПЧ.................................................................. 204

2.5. Иммуноморфологическая, ультраструктурная и иммуногенетическая оценка эффективности вакцин из штаммов бруцелл 19, 82 и 82-ПЧ на мелком рогатом скоте...................................................................................... 215

2.5.1. Морфологическая оценка иммуногенных свойств и реактогенности вакцины из штамма бруцелл 82-ПЧ в зависимости от дозы препарата........................................... 215

2.5.2. Патоморфологические и электронно-микроскопические изменения в органах и тканях овец, привитых противобруцеллезными вакцинами в динамике иммуногенеза....................................................................... 224

2.5.3. Индикация различных штаммов бруцелл в органах и тканях вакцинированных овец при помощи полимеразной цепной реакции и иммунофлуоресцентных исследований............................... 236

2.5.4. Морфологическое, гистохимическое и электронно-микроскопическое изучение напряженности иммунитета у овец, привитых разными вакцинными штаммами бруцелл.................................................................................. 242

2.5.5. Патоморфологические гисто- и иммунохимические изменения в органах и тканях овец, привитых вакцинами

из штаммов 19, 82 и 82-ПЧ против бруцеллеза.................. 256

3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 275

4. ВЫВОДЫ 306

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 309

6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 310 ПРИЛОЖЕНИЕ 384

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. В связи с напряженной эпизоотической и эпидемической обстановкой в отдельных регионах страны проблема с бруцеллезной инфекцией, наносящей большой экономический ущерб, до сих пор остается весьма актуальной. В свете сказанного вопрос изыскания эффективных средств и методов специфической профилактики и диагностики этой болезни является весьма важным.

Известно, что структурные изменения в органах при развитии вакцинального иммунитета повторяют черты соответствующей болезни. Поэтому окончательное решение о целесообразности применения новых вакцин может быть вынесено только на основе сопоставления двух основных их качеств - иммуногенной активности и повреждающего действия на организм прививаемого поголовья животных (Г.З.Идрисов, 1977).

Иммуноморфология в последнее время стала занимать одно из ведущих мест при определении эффективности новых вакцинных препаратов и решении комплекса вопросов, связанных с их оценкой иммуногенности, длительности и напряженности иммунитета, безопасности и остаточной вирулентности.

Частота выявленных побочных реакций и осложнений зависит от сочетания иммуногенных и аллергических свойств вакцин, характера их влияния на организм, способа введения прививочного препарата, иммунизирующей дозы, кратности и интервалов между вакцинациями, а также от индивидуальных особенностей прививаемых животных.

С помощью иммуноморфологических исследований органов и тканей вакцинированных животных стало возможным выяснение эффективности и реактогенности значительного числа вакцинных препаратов (Г.З.Идрисов, 1964 - 1977; Г.З.Идрисов, К.М.Салмаков, 1975; Н.И.Архипов и соавт., 1980; М.С.Жаков и соавт., 1977, 1980, 1996; Л.И.Кундрюкова, 1982, 1984; Э.И.Алиев, Г.А.Белозерова, 1985; Э.И.Алиев, Д.Ш.Шарипов,1986; Т.А.Перегудов и соавт.,1987; В.С.Прудников,1990; Н.Г.КолоусоваД991; Н.А.Лутфуллина,

Д.Ш.Шарипов, 1992; Б.Т.Артемов и соавт., 1996; Ф.З.Авзалов, Р.Х.Хамадеев, Ф.М.Хусаинов, 1997; К.Р.ВаБсЬ, 1К.КасШс11, 1978; ХБ.МШег, 1991).

В настоящее время применяемые для специфической профилактики бруцеллеза крупного рогатого скота вакцины из штаммов 19 и 82 несмотря на ряд положительных качеств имеют и отрицательные свойства. Так, при иммунизации вакциной из штамма бруцелл 19 животные долгое время остаются серопозитивными (В.П.Ярославцев и соавт., 1980; К.В.Шумилов и соавт., 1984; В.К.Гринько и соавт., 1987; В.А.Мироненко, М.А.Бажин, 1988; Г.А.Белозерова, 1993; Г.А.Белозерова и соавт., 1996; У.Б.СесШо & а1., 1986; БЖВеске«, 8.С.Мс01апшс1, 1987), что затрудняет проведение ветеринарно-санитарных мероприятий, дифференциацию реакций животных на вакцинный и полевые штаммы и определение эпизоотического состояния стад по бруцеллезу. Вакцина из штамма 82 является реактогенной при первичном применении на беременных коровах, нетелях и может вызвать аборты (К.М.Салмаков и соавт., 1978; В.С.Ивановский, Р. М. Хамитов, 1981; К.В.Шумилов и соавт., 1983; Л.И.Кундрюкова, 1986).

Во Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте К.М.Салмаковым и Г.А.Белозеровой путем генетического отбора из вакцинного штамма бруцелл 82 был получен и испытывается с 1976 года новый прививочный штамм - 82-ПЧ (пенициллинчувствительный вариант Вг.аЬогЦгБ 82). Эта вакцина обладает достаточной иммуногенностью и в отличие от противобруцеллезных препаратов из штаммов 19 и 82 при вакцинации беременных животных абортов не вызывает, так как бруцеллы вакцинного штамма 82-ПЧ не используют для своей жизнедеятельности (роста и размножения) 4-х атомный спирт - эритритол, который синтезируется в тканях матки, в организме растущего плода и содержится в плодных оболочках крупного и мелкого рогатого скота. Это свойство нового прививочного препарата выгодно отличает его от других предшественников противобруцеллезных вакцин.

Вакцина из штамма бруцелл 82-ПЧ подвергнута всестороннему изучению и испытанию на лабораторных животных и крупном рогатом скоте в экспериментальных и производственных условиях. На этот штамм получено авторское свидетельство (К.М.Салмаков, Г.А.Белозерова, 1983), а на вакцину из этого штамма - патент (К.М.Салмаков, Г.А.Белозерова, 1991). Живая вакцина из штамма бруцелл 82-ПЧ испытана в различных регионах России, Армении, Азербайджана и Грузии на сотнях тысяч голов крупного рогатого скота. Анализ материалов и отзывы с мест показывают, что противобруцеллезная вакцина из штамма 82-ПЧ обладает высокой эффективностью и ею можно прививать крупный рогатый скот всех возрастов, в том числе коров и нетелей, находящихся в различном периоде стельности (К.М.Салмаков, Г.А.Белозерова и соавт., 1995).

Однако иммуногенные качества и побочное действие как вакцины из штамма бруцелл 82-ПЧ, так и прививочных препаратов из штаммов 19 и 82 против бруцеллеза на организм животных, особенно мелкого рогатого скота, изучены недостаточно, а ультраструктурные и молекулярно - генетические исследования пока вообще не проводились.

Кроме того, главным этапом оздоровления животных неблагополучных хозяйств от инфекционных болезней, в том числе и от бруцеллеза, является своевременная и быстрая диагностика и дифференциация возбудителей в патологическом материале. К тому же, необходимо учесть относительный характер иммунитета при бруцеллезе и его связь с наличием специфического антигена в организме, что диктует необходимости определения продолжительности пребывания в органах и тканях привитых животных антигена вакцинных штаммов бруцелл. Это даст возможность судить об уровне интенсивности и продолжительности индуктивной фазы противобруцеллезного иммунитета, изыскать и разработать адекватные средства и методы иммунопрофилактики и иммунокоррекции.

Вышеизложенное определяет необходимость применения таких высокочувствительных и специфичных методов индикации и дифференциации бруцелл как ДНК-ДНК гибридизация, мультилокусная геномная "дактилоскопия" и полимеразная цепная реакция.

Цель и задачи исследований. Цель исследований - разработать молекулярно-генетические методы индикации и дифференциации различных штаммов бруцелл в патологическом материале и провести сравнительную иммуноморфологическую оценку эффективности и реактогенности противобруцеллезных вакцин из штаммов 19, 82, 82-ПЧ на крупном и мелком рогатом скотах.

При этом в задачи исследований входило:

1.Провести дифференциацию различных штаммов бруцелл в органах и тканях крупного рогатого скота методами мультилокусной геномной

(I (1 V-»

дактилоскопии и электронной микроскопии.

2.Изучить динамику и характер иммуноморфологических, ультраструктурных изменений в организме привитых морских свинок, а также определить продолжительность пребывания в органах и тканях бруцелл вакцинных штаммов 19, 82, 82-ПЧ молекулярно-генетическими методами.

3.Провести сравнительную иммуноморфологическую оценку эффективности и реактогенности противобруцеллезных вакцин из штаммов 19,82, 82-ПЧ на крупном, мелком рогатом скотах и разработать способ индикации бруцелл этих вакцинных штаммов в органах и тканях подопытных животных при помощи полимеразной цепной реакции.

4. Изучить характер иммуноморфологических реакций и уровень безвредности различных доз вакцины из штамма бруцелл 82-ПЧ при иммунизации телок и овец, а также выяснить патоморфологические и электронно-микроскопические изменения в органах и тканях мелкого рогатого скота, привитых противобруцеллезными вакцинами в динамике иммуногенеза.

5.Определить степень напряженности иммунитета у крупного и мелкого рогатого скота,создаваемого вакцинами из штаммов бруцелл 19, 82 и 82-ПЧ, в зависимости от дозы , а также после одно- и многократной иммунизации у морских свинок.

6. Дать морфологическую оценку длительности и напряженности иммунитета при различных сроках ревакцинации животных вакциной из штамма бруцелл 82-ПЧ.

7.Изучить динамику уровня содержания иммунокомпетентных клеток в крови, органах, тканях лабораторных и сельскохозяйственных животных, привитых противобруцеллезными вакцинами из штаммов 19, 82 и 82-ПЧ, а также выяснить степень побочного влияния последних на организм иммунизированных животных.

Научная новизна. Разработан способ дифференциации вакцинных и патогенных штаммов бруцелл методом мультилокусной геномной "дактилоскопии" и электронной микроскопии.

Дана сравнительная иммуноморфологическая оценка эффективности и реактогенности вакцин из штаммов бруцелл 19, 82, 82-ПЧ и разработаны методы индикации и дифференциации, а также определены сроки пребывания в организме бруцелл вакцинных штаммов молекулярно-генетическими методами - ДНК-ДНК гибридизацией и полимеразной цепной реакцией. Выяснены закономерности развития неспецифических, специфических и аллергических изменений в органах и зависимость интенсивности проявления их от антигенной активности, дозы и кратности прививочных препаратов против бруцеллеза. Кроме того, определены ультраструктурные изменения в органах, тканях вакцинированных и зараженных животных.

Практическая ценность работы. Получен патент Российской Федерации на изобретение: "Способ дифференциации бруцелл крупного рогатого скота" (№ 2095418 от 10 ноября 1997 года) и разработаны методические рекомендации

по спец. тематике, утвержденные Департаментом ветеринарии Российской Федерации. Результаты наших исследований послужили дополнением к объективной оценке безвредности, реактогенных и иммуногенных свойств противобруцеллезной вакцины из штамма 82-ПЧ и были использованы при разработке нормативно-технических документов:

1. Временной инструкции по изготовлению и контролю живой сухой вакцины из штамма 82-ПЧ против бруцеллеза крупного рогатого скота. Утверждена директором ВНИВИ 10 июня 1990 года.

2. Технических условий на живую сухую вакцину из штамма 82-ПЧ против бруцеллеза крупного рогатого скота. Утверждены ГУВ МСХ СССР 13 ноября 1991 года.

3. Временного наставления по применению живой сухой вакцины из штамма 82-ПЧ против бруцеллеза крупного рогатого скота. Утверждено ГУВ МСХ СССР 13 ноября 1991 года.

Кроме того, разработаны методические рекомендации по определению продолжительности пребывания в организме вакцинных штаммов бруцелл, их дифференциация методами ДНК-ДНК гибридизации и мультилокусной геномной "дактилоскопии", утвержденные Ученым советом КГАВМ 28 июня 1995 года.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на республиканских научно-производственных конференциях КГАВМ (1988 - 1997 гг.), межвузовских, республиканских и межрегиональных научно-практических конференциях молодых ученых (Фрунзе, 1990; Семипалатинск, 1991; Бишкек, 1992; Казань, 1996, 1998), XI Всесоюзной научно-практической конференции по патологической анатомии болезней с/х животных (Харьков, 1990), Всероссийских научно-методических конференциях по патологической анатомии с/х животных (Воронеж, 1993; Казань, 1996), Международном координационном совещании: "Экологические проблемы

патологии, фармакологии и терапии животных" (Воронеж, 1997), Международной научной конференции, посвященной 125-летию академии (Казань, 1998), IV Конгрессе Международной Ассоциации морфологов (Нижний Новгород, 1998), проблемных советах КГВИ и КГАВМ (1988 - 1998 гг), а также на межкафедральном заседании КГАВМ (Казань, 1999).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы в журналах "Ветеринария", "Морфология", материалах межвузовских, республиканских, межрегиональных, Всероссийских, Международных конференций, межвузовских научных трудов, издана одна методическая рекомендация, получен патент РФ на изобретение и два удостоверения на рационализаторские предложения.

Основные положения работы, выносимые на защиту:

- изыскание молекулярно-генетических и ультраструктурных методов индикации и дифференциации вакцинных и патогенных штаммов бруцелл крупного рогатого скота;

- эффективность применения живой противобруцеллезной вакцины из штамма 82-ПЧ, наряду со штаммами 19, 82, для специфической профилактики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в угрожаемых хозяйствах;

- фагоцитоз бруцелл вакцинных штаммов 19, 82, 82-ПЧ лимфоцитами и макрофагами иммунокомпетентных органов сопровождается перестройкой структурных э�