Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.02) на тему:Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе

ДИССЕРТАЦИЯ
Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе - диссертация, тема по ветеринарии
АВТОРЕФЕРАТ
Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе - тема автореферата по ветеринарии
Сахаров, Андрей Валентинович Новосибирск 2009 г.
Ученая степень
доктора биологических наук
ВАК РФ
16.00.02
 
 

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе

САХАРОВ АНДРЕЙ ВАЛЕНТИНОВИЧ

МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПЛАСТИНКИ РОСТА ТЕЛА ПОЗВОНКА МЛЕКОПИТАЮЩИХ В ОНТОГЕНЕЗЕ

16.00.02 - патология, онкология и морфология животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Саранск 2009

Работа выполнена в ГОУ ВПО Федерального агентства по образованию «Новосибирский государственный педагогический университет» г. Новосибирск

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор

Рябчикова Елена Ивановна (ФГУН ГНЦВБ «Вектор», г. Новосибирск)

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор

Донкова Наталья Владимировна (ФГОУ ВПО «КрасГАУ», г. Красноярск)

доктор биологических наук, профессор Усенко Виктор Иванович (ФГОУ ВПО КГАВМ им. Н.Э. Баумана, г. Казань)

доктор биологических наук, профессор Шубина Ольга Сергеевна (ГОУ ВПО МГПИ им. М.Е. Евсевьева, г. Саранск)

Ведущее учреждение: ФГОУ ВПО «Оренбургский государственный

аграрный университет», г. Оренбург

Защита состоится « 2009 г. часов на заседании

диссертационного Совета ДМ Л\2.\\1.\5 в ГОУ ВПО Мордовский государственный университет им. Н.П. Огарёва (430005, Республика Мордовия, г. Саранск, ул. Большевистская, 68.)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарёва.

Автореферат диссертации опубликован на официальном сайте ВАК РФ http://vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан «¿^ » _2009 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета п^фу^Я^С Т.А. Романова

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы. Осевой скелет позвоночных всех классов закладывается в принципиально одинаковом виде, и принципиальное сходство его строения сохраняется во взрослом состоянии (Smitt H., 2004; Gilberg G. 2005). Однако развитие каждого из структурных элементов осевого скелета на общем фоне тесной структурной взаимосвязи под влиянием формообразующих факторов и генетического контроля происходит относительно самостоятельно (Carrol F., 2000; Серов O.JL, 2006). Морфогенетические закономерности развития осевого скелета у различных видов млекопитающих, включая человека, изучены недостаточно. В первую очередь это касается хрящевой пластинки роста тела позвонка, функциональная активность клеток которой определяет рост позвоночного столба (Glorieux F.H., 2000; Malemud C.J., 2007). Данные о возрастных особенностях формирования пластинки роста человека и животных необходимы для понимания патогенеза аномалий и пороков развития позвоночного столба, как врожденных, так и возникающих, в постнатальном периоде онтогенеза.

Следует отметить, что актуальность исследования морфогенеза структурных компонентов тела позвонка человека и животных во многом продиктована запросами практической медицины. В настоящее время клеточная и тканевая инженерия находят всё более широкое применение при травматических повреждениях хрящевой ткани (Hu J.C., 2005; Caí D.Z., 2007). Дефицит клеток для пересадки делает настоятельной необходимость поиска альтернативных источников донорского материала (Подгорный О.В., 2004, Репин B.C., Сухих Г.Т. 2007; Ярыгин В.Н., 2007). Известная близость многих физиологических показателей человека и свиньи открывает новые перспективы для изучения возможности использования клеток и тканей свиньи в клеточных технологиях (Шумаков В.И., 2007, 2008). Очевидно, что технологии трансплантации фетальных клеток должны основываться на современных представлениях о структурно-функциональной организации хрящевой ткани и закономерностях ее развития в онтогенезе. В этой связи исследование морфофункциональных характеристик клеток хондрогенного дифферона пластинки роста человека и свиньи в динамике возрастных изменений представляется актуальной проблемой.

Целью настоящего исследования явилось изучение морфофункциональных взаимоотношений клеток и матрикса пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в возрастном аспекте, а также разработка научно обоснованных принципов оптимального выбора клеточного материала для тканевой инженерии.

Задачи исследования:

1. Выявить общие закономерности морфогенеза пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза.

2. Изучить особенности структурно-функциональной организации пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза.

3. Оценить роль активированных кислородных метаболитов в морфогенезе пластинки роста тела позвонка.

4. Определить оптимальный возрастной период забора донорской хрящевой ткани у человека и свиньи для её использования в качестве источника клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций.

5. Определить морфологические критерии выбора оптимального пассажа первичной культуры клеток, выделенных из фетальной хрящевой ткани зоны роста тела позвонка для создания тканеинженерных конструкций.

6. Изучить возможность ксенотрансплантации клеток первичной культуры фетальных хондробластов человека в условиях хирургического повреждения хрящевой ткани у лабораторных животных.

Научная новизна. Впервые выявлены общие закономерности развития пластинки роста у человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза. Впервые получены новые сведения о возрастных особенностях развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи, связанные с неравномерной пролиферацией и дифференцировкой клеток, а также пространственно-упорядоченной организацией межклеточного вещества в переднем и заднем отделах пластинки роста у человека, а у свиньи - в её вентральном и дорсальном отделах. Впервые установлены периоды неравномерного развития зоны роста тела позвонка, которые морфологически определяются у человека с 12 недель пренатального развития до 12 лет, а у свиньи - в период с 6 до 12 недель гестации. Впервые определены морфологические критерии выбора фетального гиалинового хряща зоны роста тела позвонка человека и свиньи для использования в качестве источника клеточного материала в тканевой инженерии. Впервые исследованы морфофункциональные характеристики фетальных клеток хондрогенного дифферона in vitro, которые могут быть использованы для оценки клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций. Впервые предложена концепция отбора клеточного материала для создания тканеинженерных конструкций. В эксперименте на лабораторных животных

впервые осуществлена ксенотрансплантация фетальных ховдробластов человека для замещения дефекта гиалинового хряща.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Выявленные возрастные закономерности структурно-функциональной организации зоны роста тела позвонка человека и свиньи отражают сходство морфогенетических процессов у этих видов млекопитающих и могут быть использованы для уточнения границ критических периодов развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи. Установленная неравномерность пролиферации и дифференцировки клеток хондрогенного дифферона в переднем и заднем отделах пластинки роста тела позвонка человека, а у свиньи - в её дорсальном и вентральном отделах, обусловливает асимметрию роста тела позвонка, что может рассматриваться в качестве одного из патогенетических факторов развития деформаций позвоночника.

Выявленные особенности морфофункциональной организации клеток и матрикса гиалинового хряща зон роста позволяют определить оптимальный возрастной период забора донорской хрящевой ткани человека и свиньи в качестве источника клеточного материала для тканеинженерных конструкций. Определены морфологические критерии оценки и выбора клеточного материала для трансплантации в реконструктивной хирургии.

Предложенная экспериментальная модель дифференцировки хондробластов пластинки роста человека in vitro обеспечивает возможность прямого подхода к изучению изменений пластинки роста человека и животных, а также может быть использована для оценки влияния поражающих факторов и эффективности применения лекарственных средств на клетки хондрогенного дифферона in vitro.

Результаты данного исследования используются в учебном процессе при преподавании дисциплины «Гистология и эмбриология» в Новосибирском государственном медицинском университете, при изучении курса дисциплин «Анатомия» в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарёва и «Биология свиньи» в Биолого-технологическом институте Новосибирского государственного аграрного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В развитии позвоночного столба человека и свиньи наблюдаются структурно-временные параллели.

2. Асимметрия роста и развития хрящевых пластинок роста тел позвонков грудного отдела человека и свиньи в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза является возрастной особенностью.

3. Фетальные хондробласты человека и свиньи, выделенные из гиалиновой хрящевой ткани зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель, а свиньи - 6 недель гестации являются оптимальным

источником клеточного материала для разработки тканеинженерных конструкций с целью замещения дефектов суставного хряща. Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации

доложены И обсуждены НЭ VT Мсткпунярппнпм-симпозиум-(Чпгсппн-Атя;-

2003), III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005), VIII съезде травматологов-ортопедов России (Самара, 2006), V Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития АПК в России» (Красноярск, 2007), Международной научно-практической конференции «Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации национального проекта «Развитие АПК на 2008-2012 гг.»» (Оренбург, 2008), Международной научно-практической конференции «Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях» (Волгоград, 2009), IX Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2009).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 12 - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций.

Работа выполнена в Новосибирском государственном педагогическом университете (НГПУ) в рамках научно-технического сотрудничества и при участии сотрудников ФГУН Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии «Вектор» (ГНЦ ВБ «Вектор») - отдел микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов, НИИ инновационных медицинских технологий Новосибирского государственного медицинского университета (НГМУ), Научно-исследовательского института травматологии и ортопедии (НИИТО), Биолого-технологического института Новосибирского государственного аграрного университета (НГАУ). Автор приносит искреннюю благодарность коллегам из указанных учреждений.

Особую признательность за консультативную помощь автор выражает директору НИИТО д-ру мед. наук, проф. М.А. Садовому и заведующей теоретическим отделом вертебральной патологии НИИТО д-ру мед. наук, проф. А.М. Зайдман, которые привлекли его внимание к проблеме нарушений структурно-функциональной организации пластики роста тела позвонка, а также предоставили возможность проведения исследований структурных компонентов тела позвонка человека в норме и при патологии. Автор признателен директору НИИ инновационных медицинских технологий, канд. мед. наук В.А. Валеевой, директору Биолого-технологического института НГАУ д-ру биол. наук, проф. К.В. Жучаеву, директору Института химии антиоксидантов НГПУ канд. хим. наук, проф. А.Е. Просенко и ректору НГПУ д-ру биол. наук, проф. А.Д. Герасёву за техническую и

организационную поддержку на всех этапах выполнения диссертационного исследования. Искренне признателен, за ценную консультативную помощь при выполнении и оформлении работы моему научному консультанту - д-ру биол. наук, проф. Е.И. Рябчиковой.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 290 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, выводов и библиографического списка цитируемой литературы, который включает 406 источников, из них 101 отечественных и 305 - зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 160 рисунками и 11 таблицами.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования служили тела грудных позвонков свиньи и образцы зон роста тел позвонков грудного отдела человека, которые получали из абортивного материала, а также от погибших людей, не имевших признаков патологии опорно-двигательного аппарата. Хондробласты выделяли из абортивного материала, полученного из лицензированных учреждений МЗ РФ, действующих в рамках законодательства Российской Федерации об охране здоровья граждан, в соответствии с современными этическими нормами и с подписанием Информированного согласия. Характеристика материала приведена в таблице 1.

Фрагменты тел позвонков грудного отдела эмбрионов, а также плодов человека и свиньи породы Сибирская мясная (СМ-1) фиксировали в 10%-ном растворе нейтрального формалина и в 4%-ном растворе параформа, приготовленного на растворе Хенкса. Позвонки плодов декальцинировали в забуференном растворе ЭДТА. Материал обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации, просветляли в ксилоле и заливали в целлоидин-парафин. На санном микротоме готовили серийные срезы толщиной 3-5 мкм и монтировали на предметные стекла.

Для изучения общей морфологической картины срезы окрашивали гематоксилином Бёмера и эозином. Коллаген выявляли по Маллори в модификации Б. Ромейса (1954). Локализацию кальция в клетках выявляли по Коссу (Пирс Э., 1962). Гликоген и гликопротеины определяли в реакции с реактивом Шиффа по Мак-Манусу. Реакцию на суммарные кислые гликозаминогликаны (ГАГ) ставили с альциановым синим по С. Стидмену. Локализацию кератансульфата (КС), хондроитинсульфата (ХС), гиалуроновой кислоты в клетках и межклеточном веществе, а также их пространственно-упорядоченную организацию в межклеточном веществе хрящевой ткани пластинки роста (ПР) изучали в реакции с толуидиновым синим при pH 1,5; 2,5 и 5,0. Пространственную организацию коллагена в межклеточном

веществе определяли по Эбнеру и в реакции с пикросириусом красным (Дедух Н.В. 1988). Интенсивность рефракции оценивали на срезах в поляризованном свете. Исследования проводились на базе лаборатории морфологии—ИГЛУ;—отдела—микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ГНЦ ВБ «Вектор», кафедры свиноводства НГАУ.

Таблица 1. Характеристика исследуемого материала

№ п/п Объект исследования Возрастной период Кол-во образцов

1 Первичная культура фетальных клеток человека 12 недель 100

2 Зона роста тела позвонка эмбриона человека 8 недель 45

3 Зона роста тела позвонка плода человека 12 недель 57

4 Пластинка роста тела позвонка человека Новорожденный -14 лет 187

Всего 389

5 Зона роста тела позвонка предплода свиньи 4 недели 60

6 Зона роста тела позвонка плода свиньи 6-12 недель 367

7 Пластинка роста тела позвонка свиньи Новорожденный - 40 суток 259

Всего 686

Экспрессию белков генов р-53 и Вс1-2 определяли методом иммуногистохимического анализа в реакции с вторичными антителами. Индекс апоптоза рассчитывали по отношению числа клеток в состоянии апоптоза к общему количеству клеток в препарате и выражали в процентах (Archer C.D, 1998).

Интенсивность реакции на активированные кислородные метаболиты (АКМ) в образцах нативной хрящевой ткани ПР тел позвонков новорожденных поросят, а также поросят в возрасте 7 - 40-а суток оценивали в реакции с нитротеразолиевым синим (Hill K.S., 1978). Дифференциальное определение свободнорадикального оксида азота в хрящевой ткани ПР оценивали по локализации его селективного маркера - фермента NO-синтазы (Mayer В., 1995).

Исследования проводились на базе лаборатории морфологии НГПУ и кафедры свиноводства НГАУ.

Для получения первичной культуры клеток использовали хрящевые тела позвонков плодов человека на сроке 12 недель гестации непосредственно после медицинского аборта от клинически здоровых женщин. Полученную первичную культуру клеток культивировали в концентрации 3x105 кл/мл в среде ДМЕМ/Р12 (1:1) с добавлением 20% фетальной сыворотки крови плодов коровы при 37°С в течение 4 пассажей на протяжении 12 дней. Каждые 3 дня клетки снимали с подложки смесью трипсина с версеном, четыре равные части центрифугата отбирали для проведения исследований, оставшиеся клетки пересевали. Исследования проводили на базе НИИ клеточных культур ГНЦ ВБ «Вектор», НИИ инновационных медицинских технологий НГМУ, лаборатории морфологии НГПУ.

Для морфологических и цитохимических исследований клетки в суспензии и монослое на стекле фиксировали в метиловом спирте. Для получения обзорных препаратов и морфометрии клетки окрашивали гематоксилином и эозином. Распределение гликогена и гликопротеидов изучали посредством ШИК-реакции и проведения контроля с амилазой. Суммарные кислые ГАГ выявляли альциановым синим. Для дифференцированного выявления КС, ХС и гиалуроновой кислоты ставили реакцию с толуидиновым синим при значениях рН раствора красителя 1,5; 2,5 и 5,0. Для иммуноцитохимического определения коллагена II типа ставили реакцию с вторичными антителами (Novocastra Laboratories ltd., UK) к коллагену II типа.

Для проведения ультраструюурного анализа клетки снимали с поверхности монослоя смесью трипсина (0,02%) и версена (0,025%) в соотношении 1:1. Взвесь клеток центрифугировали, осадок фиксировали в 4%-м растворе параформа, дофиксировали 1%-м раствором OsC>4, обезвоживали в растворах этилового спирта возрастающей концентрации и ацетоне, пропитывали и заливали в смесь эпон - аралдит. Ультратонкие срезы готовили на ультратоме Raichert (Австрия), контрастировали уранилацетатом и цитратом свинца. Препараты изучали в электронном микроскопе Н-600 (Hitachi, Япония). Ультраструктурные исследования проводили на базе отдела микроскопических исследований, анализа вирусных маркеров и синтеза биологических реагентов ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор».

Все манипуляции в ходе ксенотрансплантации фетальных хондробластов человека в суставной дефект крыс проводили в соответствии с международными принципами Хельсинской декларации о гуманном отношении к животным. У всех крыс - самцов линии Вистар массой 250 граммов в области межмыщелковой ямки дистального эпифиза бедренной

кости стоматологическим бором диаметром 2,5 мм производили дефект суставного хряща на глубину до субхондральной кости.

У крыс группы I (15 особей) дефект оставляли свободным; у животных группы II (15 особей) - заполняли хитозангтым гсчтем; у крмгг_ группы III (15 особей) - тканеинженерной конструкцией на основе хитозанового геля и первичной культуры фетальных хондробластов человека второго пассажа в количестве ЗхЮ5 клеток. Рану послойно ушивали шелком. В течение двух недель послеоперационного периода один раз в сутки внутримышечно вводили антибиотик линкомицин в дозе 5 мг. На 60-е сутки животных под эфирным наркозом выводили из эксперимента и выделяли фрагменты дистального эпифиза бедренной кости для проведения морфогистохимического анализа. Данный фрагмент исследований проводили на базе лаборатории морфологии НГПУ и НИИ инновационных медицинских технологий НГМУ.

Измерение морфометрических характеристик проводили с помощью комплекса программ Axio Vision. Статистическую обработку данных осуществляли по общепринятым методикам с использованием t-критерия Стьюдента, различия считали достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе

Позвоночный столб человека на сроке 8 недель, а свиньи на сроке 4 недели гестации представлен мезенхимными телами позвонков, разделенными клетками формирующихся межпозвонковых дисков. Мезенхимные клетки имеют уплощенную или полигональную форму. Ядро округлое с большим количеством гетерохроматина. Цитоплазма обильная, умеренно базофильная, содержит пылевидный ШИК-позитивный материал, исчезающий после предварительной обработки срезов амилазой, а также следовые количества суммарных ГАГ. Межклеточное вещество выражено слабо и бледно окрашивается на коллаген по Маллори. Окрашивание толуидиновым синим при значении рН раствора красителя 5,0 позволяет наблюдать слабо выраженную реакцию в цитоплазме и межклеточном веществе на гиалуроновую кислоту. Реакция с толуидиновым синим при рН 1,5 и 2,5 на ХС и КС отрицательна. Рефракция макромолекул несульфатированных ГАГ в поляризованном свете в препаратах позвоночника человека и свиньи в этот период не выявляется.

Хрящевая модель тела позвонка человека на 12-й неделе и свиньи на 6-й неделе гестации представлена мелкими клетками округлой формы, располагающимися в одиночных округлых или овальных лакунах.

Слаборазвитый матрикс бледно окашивается на коллаген по Маллори и характеризуется невысоким содержанием кислых ГАГ, которые по данным поляризационно-оптического анализа присутствуют в низкополимерной форме. Полученные результаты позволяют характеризовать эти клетки как низкодифференцированные, для которых характерно мелкое, интенсивно базофильное ядро округлой формы, расположенное в центре клетки, и высокое ядерно-цитоплазматическое отношение (рис. 1 А).

Степень дифференцировки клеток возрастает от периферии хрящевой модели тела позвонка к центру оссификации, что находит свое отражение в увеличении объема хрящевого матрикса и усилении клетками синтеза его компонентов. С повышением степени дифференцировки хондробластов изменяется их морфология. Хондробласты располагаются в овальных лакунах и принимают уплощённую форму. Снижается их ядерно-цитоплазматическое отношение (рис. 1 А), ядро становится овальным или приобретает бобовидную форму, увеличивается коэффициент формы ядра (рис. 1 В). Уплощение ядра и цитоплазмы нарастает ближе к центру оссификации.

Ш - периферическая зона ^ ■ глубокая зона {¿¿а - дорсальный отдел

и - гипертрофическая зона 0 - вентральный отдел

Примечание: различия показателей достоверны (* р < 0,05; ** р < 0,01; *** р < 0,001).

Рис. 1. Морфометрические показатели клеток зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель гестации: А - ядерно-цитоплазматическое отношение; В - коэффициент формы ядра; С - содержание низкодифференцированных клеток в хрящевой ткани зоны роста тела позвонка свиньи.

На границе с центром оссификации располагаются наиболее дифференцированные хондробласты, представляющие собой самые крупные клетки с низким ядерно-цитоплазматическим отношением (рис. 1 А). Их цитоплазма и территориальный матрикс обильно заполнены сульфатированными ГАГ. Ядро располагается в центре клетки и имеет самый высокий показатель коэффициента формы ядра (рис. 1 В). На срезах, выполненных под углом к сагиттальной плоскости, отчетливо видна

дисковидная форма ядра. Уплощенное с двух полюсов округлое ядро при изменении плоскости его расположения в клетке дает картину круга или овала, либо вытянутого профиля.

_Полученные мпрфпфунъ-пипнягттлп.кч—характеристики—позволяют

использовать в качестве критериев дифференцировки клеток хондрогенного дифферона не только площадь клетки и ядерно-цитоплазматическое отношение, но и предложенный нами новый параметр - коэффициент формы ядра. Эти критерии могут быть использованы для анализа клеточного материала, выделенного из зон роста тел позвонков человека и свиньи при культивировании in vitro с целью последующего использования в тканевой инженерии.

Сравнение формирующихся хрящевых тел позвонков 12-не дельно го плода человека и 6- недельного плода свиньи выявило различия в развитии переднего и заднего отделов зоны роста (ЗР) у человека, а у свиньи вентрального и дорсального отделов соответственно, обусловленные степенью дифференцировки хондробластов и зрелости матрикса гиалинового хряща. Смещенный к передней (вентральной) продольной связке центр оссификации определяет неравномерное распределение клеток разной степени дифференцировки в теле позвонка. Преобладание в заднем (дорсальном) отделе хрящевого тела позвонка низкодифференцированных хондробластов (рис. 1 С) и слабо выраженный синтез клетками компонентов межклеточного вещества, имеющего достоверно низкий показатель рефракции по сравнению с передним (вентральным) отделом, указывают на отставание в развитии заднего (дорсального) отдела по сравнению с передним (вентральным). Следует отметить, что в переднем (вентральном) отделе тела позвонка отмечается начало формирования колонковых структур, в то время как со стороны заднего (дорсального) отдела клетки не имеют строго определенной векторной направленности. Таким образом, у человека на сроке 12 недель, а свиньи - 6 недель гестации впервые определяется асимметрия в развитии хрящевого тела позвонка, обусловленная расположением в переднем (вентральном) отделе полюса высокой метаболической активности, а в заднем (дорсальном) отделе — полюса низкой активности.

У человека в период от новорожденное™ до 1 года, а у свиньи - до 8 недель пренатального развития происходит формирование пластинки роста (ПР) тела позвонка. На сагиттальных срезах тело позвонка новорожденного имеет овальную форму и выполнено хрящевой тканью. В центре тела позвонка расположена зона остеогенеза, в которой определяются сосуды и примитивные костные балки с включениями хрящевой ткани. Вокруг зоны остеогенеза располагаются хрящевые клетки, которые формируют зону роста. Следует подчеркнуть, что на данном этапе развития типичное строение, характерное для ПР, отсутствует. Морфологически идентифицируются зоны резервного, пролиферирующего и гипертрофического хряща. Одиночные

клетки резервной зоны лежат в овальных лакунах. Крупное округлое ядро занимает практически весь объем цитоплазмы, в которой выявляются мелкие гранулы ШИК-позитивного вещества. При окрашивании толуидиновым синим при рН 5,0 в цитоплазме этих клеток отмечается резко положительная реакция на гиалуроновую кислоту. Межтерриториальный матрикс бледно окрашивается альциановым синим.

Овальные клетки пролиферирующей зоны располагаются попарно или по 3-4 в одной лакуне и формируют изогенные группы. Плоскость их деления не имеет строгой направленности. Цитоплазма и межтерриториальный матрикс бледно окрашиваются на суммарные ГАГ альциановым синим. В цитоплазме выявляются редкие мелкие гранулы ШИК-позитивного вещества. Одиночно лежащие клетки этой зоны имеют округлое ядро, цитоплазма и территориальный матрикс интенсивно окрашиваются альциановым синим. В межтерриториальном матриксе альцианпозитивное вещество выявляется в виде крупных гранул. В зоне гипертрофированного хряща клетки располагаются группами в крупных лакунах округлой или овальной формы и формируют кластеры. Матрикс вокруг лакун неравномерно окрашивается альциановым синим.

Вышеописанные морфофункциональные характеристики свидетельствуют, что процессы пролиферации хондробластов в данный возрастной период опережают созревание хрящевой ткани. Подтверждением невысокой степени дифференцировки клеток является наличие низкополимерных ГАГ в матриксе и особенности морфологии хондробластов. В данный возрастной период рост направлен, прежде всего, на увеличение хрящевой модели тела позвонка, что обусловливает асинхронность пролиферации клеток и их дифференцировки. Отражением процесса увеличения хрящевой модели преимущественно за счет активной пролиферации хондробластов, а не их синтетической активности, является несовершенный остеогенез. Разобщение пролиферации и синтеза клетками специфических для хряща биополимеров может быть связано с отсутствием компрессии как одного из важнейших регуляторов дифференцировки хондробластов.

Следует отметить неравномерное развитие ЗР тела позвонка человека и свиньи в переднем (вентральном) и заднем (дорсальном) отделах. Колонковые структуры начинают формироваться только в переднем (вентральном) отделе ЗР, плоскость расположения хондробластов параллельна продольной оси тела позвонка. Межклеточное вещество хорошо выражено, характеризуется умеренной реакцией на кислые ГАГ. Мелкие альцианпозитивные гранулы равномерно распределены в межтерриториальном матриксе. В заднем (дорсальном) отделе клетки гипертрофического слоя локализуются группами и не имеют строгой векторной направленности. Межклеточное вещество слабо выражено. При

реакции на суммарные кислые ГАГ наблюдаются интенсивно альцианпозитивные крупногранулярные структуры. Степень рефракции макромолекул ХС, КС, гиалуроновой кислоты и коллагена в межклеточном веществе переднего отдела ЗР тела позвонка человека превышает тоответствуклций показатель заднего отдела (табл. 7}. Содержание низкодифференцированных клеток в заднем отделе ЗР тела позвонка превышает этот показатель на 22,55 % по сравнению с передним отделом. Указанные признаки могут указывать на замедление дифференцировки клеток в заднем отеле ЗР по сравнению с передним.

У человека в возрасте 1 года, а у свиньи на сроке 8 недель гестации ПР представлена гиалиновым хрящом, в котором отчетливо идентифицируются 5 зон: резервная, пролиферации, созревания, гипертрофическая и зона остеогенеза. Клетки резервной зоны имеют овальную форму, крупное округлое ядро и хорошо развитую цитоплазму. По направлению от резервной зоны к зоне созревания происходит уплощение хондробластов, меняется и морфология ядра. В клетках верхних отделов колонковых структур ядро образует инвагинаты и по мере приближения к зоне гипертрофии принимает уплощенно-вогнутую форму.

Таблица 2. Показатель рефракции биополимеров межклеточного вещества зоны роста тела позвонка новорожденного

Зоны роста Кератан-сульфат Хондроитии-сульфат Гиалуроновая кислота Коллаген

задний/ передний задний/ передний задний/ передний задний/ передний

Резервная 1,15 ±0,14»" 1,93 ±0,11 1Д4± 0,15 »* 1,98 ±0,17 3,28 ± 0,25*»* 5,53 ± 0,21 4,77 ±0,33*** 6,97 ±0,31

Пролиферации 0,12 ±0,06»»» 0,81 ±0,12 1,52 ±0,17»»» 2,61 ±0,16 1,73 ±0,13»»» 2,88 ± 0,17 2,22 ±0,31**» 4,41 ± 0,29

Гипертрофии 1,68 ±0,17»» 2,52 ±0,21 2,41 ±0,22»*» 4,9 8± 0,34 4,45 ±0,21*** 6,73 ± 0,27 5,23 ± 0,23 *»* 7,87 ±0,24

Примечание: различия степени рефракции между задним и передним отделами достоверны (» р < 0,05; ** р < 0,01; »»» р < 0,001).

Неравномерность развития тел позвонков в заднем (дорсальном) и переднем (вентральном) отделах отчетливо иллюстрируется гистохимическим и поляризационно-оптическим анализом. В переднем (вентральном) отделе ПР альцианпозитивный материал располагается в межклеточном веществе в виде мелких гранул, а матрикс заднего (дорсального) отдела ПР окрашивается гомогенно. В препаратах и человека, и свиньи интенсивность рефракции макромолекул гиалуроновой кислоты, ХС, и коллагена в межклеточном веществе ПР переднего (вентрального) отдела превышает данные показатели заднего (дорсального) отдела (табл. 3, 4). Костные балки

со стороны передней (вентральной) поверхности тела позвонка мощные и содержат незначительные включения хрящевой ткани по сравнению с задним (дорсальным) отделом. В зоне энхондрального остеогенеза сосуды инвазируют лишь матрикс, прилежащий к гипертрофическим клеткам, что является следствием интенсивного роста тела позвонка и проявлением динамичного единства процессов хондрогенеза и остеогенеза. В данный период развития вся совокупность морфогенетических процессов, в том числе и несовершенный остеогенез, являются отражением увеличения массы тел позвонков и активного замещения их хрящевой модели на костную.

Таблица 3. Показатель рефракции биополимеров межклеточного вещества пластинки роста тела позвонка годовалого ребенка

Кератан-сульфат Хондроитин-сульфат Гиалуроновая кислота Коллаген

Зоны роста задний/ передний задний/ передний задний/ передний задний/ передний

Резервная 2,23 ± 0,26 2,91 ±0,32 1,31 ±0,17»«* 2,92 ±0,11 3,34 ±0,29*** 5,97 ±0,22 4,55 ±0,30*** 6,85 ±0,29

Пролиферации 0,62 ±0,19 0,98 ±0,13 1,61 ±0,15"» 2,93 ±0,12 1,83 ±0,15*** 2,97 ±0,11 2,32 ±0,21*** 4,61 ±0,18

Созревания 1,76 ±0,49 2,73 ± 0,33 2,55 ± 0,24*** 5,11 ±0,26 4,43 ± 0,18*** 6,81 ±0,21 5,41 ±0,21 *• 7,87 ± 0,24

Гипертрофии 3,25 ±0,61 4,88 ± 0,77 3,43 ±0,23*** 5,79 ± 0,29 5,57 ±0,23*** 7,72 ±0,31 6,52 ±0,38** 8,75 ± 0,66

Примечание: различия степени рефракции между задним и передним отделами достоверны (*р < 0,05; ** р< 0,01; *** р< 0,001).

Таблица 4. Показатели рефракции биополимеров межклеточного вещества хрящевой ткани пластинки роста тела позвонка 8-недельного плода свиньи

Кератан-сульфаг Хондроитин сульфат Гиалуроновая кислота Коллаген

Зоны роста дорсальный/ вентральный дорсальный/ вентральный дорсальный/ вентральный дорсальный/ вентральный

Резервная 1,52 ±0,13 1,56 ±0,27 3,97 ±0,16*** 6,78 ± 0,35 5,34 ±0,41 5,52 ±0,3 5 5,47 ±0,28 5,39 ±0,17

Пролиферации 0,45 ± 0,18 0,51 ±0,42 2,19 ±0,24*** 4,92 ±0,19 4,42 ± 0,23 4,38 ±0,31 3,22 ±0,34 3,31± 0,39

Созревания 1,73 ±0,51 1,77 ±0,64 5,19 ±0,27 *** 8,72 ±0,23 7,98 ± 0,45 8,41 ± 0,48 9,71 ±0,28*** 13,91 ±0,43

Гипертрофии 3,86 ±0,61 4,25 ±0,67 13,53 ±0,43*** 18,76 ±0,39 15,57 ±0,63** 18,23 ±0,32 18,97 ±0,58*** 23,75 ± 0,66

Примечание: различия степени рефракции между дорсальным и вентральным отделами достоверны (* р < 0,05; **р<0,01; *«* р< 0,001).

Ширина ПР свиньи в вентральном отделе превышает соответствующий показатель дорсального отдела на 13,74 %.

У человека в возрасте 3-7 лет неравномерность развития переднего и

рефракции основных биополимеров хрящевого матргасса - гиалуроновой кислоты, ХС, КС и коллагена в препаратах ПР переднего отела тела позвонка превосходит эти показатели по сравнению с задним отделом (табл. 5). У свиньи на сроке 12 недель гестации и до рождения неравномерность развития дорсального и вентрального отделов ПР гистохимическими методами анализа не определяется. Ширина ПР в вентральном отделе на 4,45% статистически достоверно превышает данный показатель дорсального отдела.

Структурная организация ПР человека и свиньи в этот возрастной период не имеет принципиальных различий. Отчетливо определяются все зоны, характерные для сформированной ПР. Развитая зона созревающего и гипертрофического хряща, с одной стороны, и глубокая инвазия кровеносными сосудами матрикса хряща до клеток зоны созревания - с другой, свидетельствуют об активном росте тела позвонка. Динамическое единство процесса роста, обусловленного пролиферацией хрящевых клеток и остеогенезом, в данный возрастной период смещено в сторону последнего.

У детей в возрасте 11 лет, а у свиньи в течение 7 - 20 суток постнатального периода онтогенеза структурная организация ПР претерпевает существенные изменения.

Таблица 5. Показатель рефракции биополимеров межклеточного вещества пластинки роста тела позвонка человека 3-7 лет

Зоны роста Кератан-сульфат Хондроитин сульфат Гиалуроновая кислота Коллаген

задний/ передний задний/ передний задний/ передний задний/ передний

Резервная 1,49 ±0,24* 0,87 ±0,11 3,17 ±0,14» 3,99 ±0,33 2,11 ±0,80» 5,60 ±1,22 2,60 ±0,31" 3,93 ±0,18

Пролиферации 0,93 ±0,16* 0,44 ±0,13 1,36 ±0,11* 1,92 ±0,16 1,59 ±0,53» 3,36 ±0,58 2, 51 ±0,41* 3,87 ±0,35

Созревания 1,62 ±0,34"» 3,84 ±0,27 6,67 ±0,41** 8,72 ±0,53. 4,22 ±1,05** 9,56 ±1,50 9,85 ± 0,37 * 10,91 ± 0,21

Гипертрофии 3,44 ±0,29»»» 4,98 ±0,21 6,81 ±0,21" 8,92 ±0,22 6,65 ±0,21*** 10,84 ±0,31 10,72 ± 0,31*** 13,84 ±0,39

Примечание: различия степени рефракции между задним и передним отделами достоверны (* р < 0,05; " р < 0,01; ♦♦* р < 0,001).

Резервная зона у человека по ширине занимает 1/3 объёма ПР, что особенно хорошо видно на срезах, окрашенных альциановым синим на суммарные ГАГ. Клетки резервной зоны вытянутой формы, с продолговатым

ядром, содержащим преимущественно гетерохроматин. Цитоплазма умеренно базофильная. В более глубоких слоях резервная зона без четкой границы переходит в зону пролиферации. Образовавшиеся в результате деления клетки изменяют свою морфологию. Ядро молодых клеток бобовидной формы. Более зрелые клетки пролиферирующей зоны имеют уплощенное ядро. Скопления из двух-трех клеток уплощенной формы образуют изогенные группы, переходящие в колонковые структуры зоны пролиферирующего и созревающего хряща. В толще зоны пролиферации в плоскости, параллельно продольной оси тела позвонка, отмечается перфорация хрящевого матрикса кровеносными сосудами.

Зоны созревающего и гипертрофического хряща узкие, толщиной в 35 клеток овальной формы с округлым ядром, или в форме двояковогнутого диска. Матрикс хряща имеет фибриллярную структуру и неравномерно окрашивается гематоксилином. Особенностью этой зоны является присутствие клеток с признаками апоптоза и крупных бесклеточных лакун. Следует отметить, что в зоне остеогенеза костные балки вплотную прилежат к матриксу хряща. Широкие резервная зона и зона пролиферации, а также узкие зоны созревания и гипертрофии (которая остаётся перекрытой костными балками в зоне остеогенеза) позволяют заключить, что в данный возрастной период рост тела позвонка обусловлен главным образом преобладанием хондрогенеза, а не сопряжением хондро- и остеогенеза. У человека в возрасте 11 лет сохраняется неравномерное развитие клеток и матрикса в области переднего и заднего отделов ПР тела позвонка. Со стороны передней продольной связки межклеточное вещество хрящевой ткани вокруг изогенных групп клеток окрашивается альциановым синим в виде мелких гранул, в отличие от гомогенной окраски в заднем отделе ПР. В препаратах, где морфогистохимическими методами неравномерность развития не определяется, она выявляется топо-оптическими реакциями на сульфатированные и несульфатированные ГАГ. Уровень рефракции, отражающий степень пространственно-упорядоченной организации макромолекул гиалуроновой кислоты, КС и ХС межклеточного вещества ПР в переднем отделе выше, чем в заднем. Уровень рефракции макромолекул коллагена не имеет достоверных различий.

У свиньи в возрасте 7-20 суток, как и у человека 11-летнего возраста, четко прослеживаются особенности морфогенетических преобразований, приводящих к структурному обособлению ПР и замыкательной пластинки (ЗП) тела позвонка. В ПР 7-суточного поросенка отмечается формирование сосудистых каналов в матриксе, которые проходят в плоскости, параллельной продольной оси тела позвонка. У поросят в возрасте 14 суток в ПР отмечается расширение сосудистых каналов за счет деструкции матрикса хрящевой ткани. Цитоплазма клеток эндотелия кровеносных сосудов и хондробластов зоны пролиферации характеризуется умеренной реакцией на АКМ и

интенсивной реакцией на NO-синтазу, что свидетельствует об интенсивном синтезе свободного радикала - N0. Можно полагать, что локализация в матриксе хряща вокруг сосудистых каналов кластеров из 4 и более клеток в одной лакуне является реакцией хондробластов на повреждение_ свободнорадикальным N0. В цитоплазме данных клеток выявляется также" высокое содержание Са2+, который может повышать активность конститутивной формы NO-синтазы (Mayer В., 1995). Иммуногистохимическая реакция показывает высокий уровень экспрессии белка р53 в хондробластах зоны пролиферации, тогда как белок Вс1-2 регистрируется лишь в единичных клетках. Повышение в клетках активности АКМ, концентрации ионов Са2+ и экспрессии белка р53 могут указывать на их участие в свободнорадикальном повреждении матрикса хрящевой ткани и гибели хондробластов зоны пролиферации по механизму апоптоза. При этом одним из ведущих свободнорадикальных соединений выступает N0.

В возрасте 20 суток в центре зоны пролиферации ПР свиньи, как в вентральном, так и дорсальном отделах, четко идентифицируются два центра деструкции хрящевого матрикса. Лакуны клеток разрушены. Ядра - с признаками пикноза, а цитоплазма - в состоянии плазморексиса. В межтерриториальном матриксе отчетливо видны оксифильные демаскированные фибриллы. Несмотря на отсутствие морфологических и гистохимических различий в структурной организации матрикса хрящевой ткани дорсального и вентрального отделов ПР, процесс оссификации осуществляется более интенсивно в первом, что может свидетельствовать как о более низкой степени дифференцировки клеток, так и более низкой структурной организации межклеточного вещества дорсального отдела ПР по сравнению с вентральным. Индекс апоптоза в клетках зоны пролиферации дорсального отдела ПР статистически достоверно превышает таковой вентрального отдела на 12,06%.

В препаратах тел позвонков человека 12-летнего возраста и свиньи в возрасте 30-суток, в толще зоны пролиферации в плоскости, перпендикулярной продольной оси тела позвонка, отмечается активная инвазия межклеточного вещества хрящевой ткани кровеносными сосудами. В образцах ПР 30-суточных поросят в клетках эндотелия сосудов отмечается резко положительная реакция на NO-синтазу. В цитоплазме хондробластов, локализованных на периферии сосудистых каналов определяется повышение внутриклеточного содержания Са2+ и экспрессии белка р53. Данные клетки характеризуются отсутствием экспрессии белка Вс1-2, что возможно является особенностью хондробластов провизорного хряща, поскольку деление клеток в зоне пролиферации происходит достаточно быстро и обеспечение длительного «выживания» клеток в данном компартменте ПР не является обязательным. Индекс апоптоза в хондробластах зоны пролиферации ПР свиньи в её дорсальном отделе статистически достоверно превышает

соответствующий показатель вентрального отдела на 8,73%. Дистрофия клеток и матрикса вокруг сосудистых каналов приводит к оссификации и остеогенезу.

Неравномерность развития заднего (дорсального) и переднего (вентрального) отделов ПР определяется более широким фронтом остеогенеза в зоне пролиферации ПР в её заднем отделе у человека, и дорсальном у свиньи.

В более поздний интервал постнаталыюго периода онтогенеза (у человека старше 14-лет, а у свиньи старше 40-суток) неравномерность морфогенетических процессов в заднем (дорсальном) и переднем (вентральном) отделах ПР доступными методами не определяется.

Объяснение механизма структуризации ПР человека и свиньи может быть следующим. У человека в возрасте 11-12 лет, а у свиньи в период 7-30 суток ПР в зоне энхондрального остеогенеза плотно перекрыта костной тканью, и её рост осуществляется за счет увеличения зоны пролиферации. Расположенные в толще гиалинового хряща хондробласты пролиферирующей зоны оказываются удаленными от источников трофики - сосудов зоны энхондрального остеогенеза с одной стороны, а с другой - межпозвонкового диска. Вследствие этого клетки подвергаются дистрофии и гибнут. Именно в этой плоскости происходит инвазия хрящевого матрикса сосудами. Наличие крупных кровеносных сосудов в зоне пролиферации приводит к увеличению напряжения кислорода, повышенной генерации АКМ эндотелиальными клетками и хондробластами, свободнорадикальному повреждению компонентов хрящевого матрикса на периферии сосудистых каналов и апоптозу хондробластов.

Асимметричное расположение центра оссификации в теле позвонка человека и свиньи изначально является фактором, обусловливающим неравнозначность трофики и влияния регулирующих факторов (гормонов, факторов роста, цитокинов) на хондробласты переднего и заднего отделов ПР тела позвонка человека, а у свиньи - её дорсального и вентрального отделов, что предполагает существование морфофункциональных различий клеток в соответствующих отделах ПР и различной ответной реакции на регулирующие воздействия. В итоге это приводит к асимметрии роста ПР в переднем и заднем отделах тела позвонка человека, а у свиньи в дорсальном и вентральном отделах.

Анализ полученных результатов позволяет заключить: у человека, начиная с 12 недель (плодный период), а затем в первую (от рождения и до 67 лет), а также вторую фазы развития позвоночника (от 7 до 12 лет) морфогенетические процессы, обеспечивающие увеличение массы тел позвонков и структуризацию их элементов, происходят неравномерно. Эта закономерность характерна и для свиньи, с той лишь разницей, что соответствующие фазы развития тел позвонков реализуются с б недель

пренатального периода онтогенеза до 30 суток постнатального периода онтогенеза. Неравномерность развития структурных элементов тела позвонка в более поздние периоды онтогенеза доступными методами не определяется. Полученные данные об особенностях структурно-функциональной -организацш^-НР lejia пшнонка человека и свиньи в онтогенезе позволили провести параллели и выделить общие закономерности её гистогенеза (табл. 7).

Неравномерность роста и развития заднего (дорсального) и переднего (вентрального) отделов ПР тела позвонка в период её формирования и структуризации, является морфологической основой развития возможных деформаций тел позвонков как у человека, так и свиньи. Очевидно, что при одинаковых воздействиях гормонов, цитокинов, факторов роста на клетки ПР, например, во время гормонального пика в период интенсивного роста и полового созревания, реакция клеток разной степени дифференцировки неодинакова. С этой точки зрения, возрастные особенности формирования ПР могут рассматриваться как морфологическая основа такой классической ортопедической патологии позвоночного столба человека, как идиопатический сколиоз. Наши данные согласуются с предложенной М.Г. Дудиным (2003) концепцией эгиопатогенеза идиопатического сколиоза, которая постулирует, что при нарушении гормонального фона, например, при высоком содержании кальцитонина и соматотропина, передние отделы тела позвонка опережают в развитии задние на уровне суставных отростков. Компенсация этого состояния происходит за счёт торсии удлиненных передних отделов вокруг относительно укороченных задних.

Результаты проведенного исследования позволяют рекомендовать параметры отбора и оценки клеточного материала для использования в клеточных технологиях. Так, оптимальным периодом отбора хрящевой ткани в качестве источника клеточного материала для создания тканеинженерных конструкций является у человека срок 12 недель, а у свиньи - 6 недель гестации, поскольку содержание низкодифференцированных клеток в гиалиновом хряще зоны роста составляет более 70%. Для оценки степени дифференцировки клеток целесообразно использовать совокупность параметров: коэффициент формы ядра, площадь клетки, ядерно-цитогшазматическое отношение. Вместе с тем, широкому внедрению ксенотрансплантации в практику должны предшествовать комплексные исследования по изучению закономерностей пролиферации и дифференцировки клеток в динамике их развития in vitro.

Таблица. 7. Структурно-временные параллели формирования пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе

Человек Свинья

8 недель (эмбриональный период) 4 недели (предплодный период)

12 недель (начало плодного периода) 6 недель (плодный период)

1год (постнатальный период) 8 недель (плодный период)

3-7 лет (постнатальный период) 12 недель — новорожденный

11 лет (постнатальный период) 7-20 суток (постнатальный период)

12 лет (постнатальный период) 30 суток (постнатальный период)

14 лет (постнатальный период) 40 суток (постнатальный период)

2. Структурно-функциональная характеристика первичной культуры клеток, выделенных из зоны роста тела позвонка плода человека на 12 неделе гестации

Первичная культура клеток, выделенная из хрящевой зоны роста тела позвонка плода человека, на первом пассаже выглядит разреженной и представлена тремя типами клеток. Клетки всех типов имеют округлую или овальную форму и статистически достоверные различия площади клетки, коэффициента формы ядра и ядерно-цитоплазматического отношения (рис. 2). Мелкие клетки обозначены как клетки 1-го типа, среднего размера - как клетки 2-го типа и самые крупные - клетки 3-го типа.

Округлые клетки 1-го типа площадью 60,90±3,72 мкм2, являются преобладающими на первом пассаже, их содержание достигает 78,93%. Округлое ядро содержит преимущественно гетерохроматин и занимает значительный объем клетки. Цитоплазма слабо выражена, умеренно базофильная.

Клетки 2-го типа преимущественно овальные, площадью 98,5 ± 2,31 мкм2, составляют 18,03 % клеточной популяции. Ядро лежит эксцентрично и, в зависимости от плоскости расположения в клетке, имеет бобовидную, овальную или форму уплощенного диска. Цитоплазма обильная, умеренно оксифильная.

Клетки 3-го типа содержат крупное овальное ядро с небольшим количеством эухроматина. В цитоплазме выявляются мелкие оксифильные гранулы. Это самая малочисленная группа клеток на данном пассаже, составляющая 3,05%.

При постановке ШИК-реакции в цитоплазме клеток 1-го типа выявляется пылевидный интенсивно окрашенный материал. Предварительная

инкубация клеток в растворе амилазы полностью подавляет реакцию. Клетки 2-го и 3-го типов содержат гранулярное, интенсивно окрашенное реактивом Шиффа вещество, заполняющее весь объем цитоплазмы. Гранулы в цитоплазме клеток 3-го типа крупнее, чем в кгтеттау ?.-го типа и локализованы -преимущественно на периферии. Обработка срезов амилазой значительно понижает интенсивность ШИК-реакции.

Клетки всех типов различаются как по интенсивности окрашивания альциановым синим на кислые ГАГ, так и по морфологии альцианпозитивных гранул. В клетках 1-го типа мелкодисперсное вещество заполняет весь объем цитоплазмы. Клетки 2-го и 3-го типов, напротив, содержат крупные гранулы альцианпозитивного вещества, расположенные диффузно. В реакции с толуидиновым синим на КС в цитоплазме клеток 1-го типа отмечается незначительное количество пылевидного бледно окрашенного вещества. Клетки 2-го и 3-го типов характеризуются накоплением мелких, умеренно окрашенных в лиловый цвет гранул, диффузно расположенных в цитоплазме. При постановке реакции на ХС в клетках 1-го типа интенсивность окрашивания и распределение толуидинпозитивного материала аналогичны таковьм при выявлении КС. В клетках 2-го и 3-го типов содержатся многочисленные крупные гранулы, воспринимающие толуидиновый синий при значении рН 2,5 раствора красителя, которые сливаются и заполняют всю цитоплазму.

мкм

250т 200 150 100 50 О

Ш) - клетки 1 типа; К - клетки 2 типа; 11111 - клетки 3 типа. Примечание: различия между клетками 1,2 и 3 типов достоверны (* р < 0,05; ** р <0,01; ***р< 0,001).

Рис. 2. Морфометрические показатели клеток 1, 2 и 3-го типов первичной культуры. А - площадь клетки; В - ядерно-цитоплазматическое отношение; С - коэффициент формы ядра.

Анализ величины ядерно-цитоплазматического отношения всех типов клеток свидетельствует о статистически достоверном снижении этого показателя от клеток 1-го типа к клеткам 3-го типа, что говорит об увеличении степени дифференцировки клеток, равно как и изменения коэффициента формы ядра (рис. 2 В, С). Наименее дифференцированными

являются клетки 1-го типа, а наиболее — клетки 3-го типа, что подтверждается усложнением ультраструктурной организации клеток по направлению от клеток 1-го типа к клеткам 3-го типа. В цитоплазме более дифференцированных клеток 2-го и 3-го типов отмечаются морфологические признаки повышения синтетической активности: увеличивается протяженность цистерн шероховатого ЭПР, в их полости накапливается тонкогранулярный материал, электронная плотность которого несколько выше, чем плотность цитоплазмы. По мере дифференцировки клеток нарастает количество элементов аппарата Гольджи, усложняется его организация. На срезах наблюдается формирование пузырьков с гомогенным (в отличие от зернистого содержимого цистерн ЭПР) содержимым низкой электронной плотности. Многочисленные гладкомембранные и «опушенные» везикулы в зоне аппарата Гольджи свидетельствуют об интенсивном внутриклеточном транспорте компонентов, синтезируемых в этом органоиде, а также об активных процессах гликозилирования, которые свойственны хондробластам. Лизосомальные структуры в хондробластах первого пассажа немногочисленны.

Таким образом, клетки первичной культуры фетальных хондробластов человека на 1-ом пассаже представляют собой популяцию активно дифференцирующихся клеток с признаками нарастающей синтетической активности. Клетки всех типов синтезируют специфические биополимеры хрящевой ткани - сульфатированные и несульфатированные ГАГ, а также коллаген II типа, выявляющийся при постановке иммунохимической реакции с вторичными антителами. Цитохимические свойства позволяют определить три типа клеток как низкодифференцированные, среднедифференцированные и высокодифференцированные хондробласты.

Первичная культура клеток на 2-ом пассаже образует равномерный плотный монослой, сформированный тремя типами клеток. Морфометрический анализ выявил изменение соотношения между клетками трех типов: содержание 1-го типа снизилось до 59,21%, а содержание клеток 2-го и 3-го типов возросло до 34,06% и 6,73%, соответственно. Морфология клеток 1-го и 3-го третьего типов не отличалась от таковой на 1-ом пассаже.

Клетки 2-го типа на светооптическом уровне имеют овальную форму и ядро, в большинстве случаев бобовидной формы, как правило, смещенное к одному из полюсов клетки. Ядро неравномерно окрашивается гематоксилином, что особенно заметно в суспензии снятых со стекла клеток. Цитоплазма содержит гранулярные структуры, которые также неравномерно окрашиваются гематоксилином. Характерным признаком является присутствие клеток 2-го типа, как с фигурами митоза, так и с фрагментированным ядром, сморщенной и неравномерно окрашенной цитоплазмой.

Реакция на гликоген и гликопротеины в клетках 2-го и 3-го типов выявила гранулярное интенсивно окрашенное реактивом Шиффа вещество, заполняющее весь объем цитоплазмы. Гранулы ШИК-позитивного вещества в цитоплазме клеток 3-го типа крупнее, чем в клетках 2-го типа. Обработка срезов амилазой значительно снижает интенсивность ШИК-реакции. В цитоплазме клеток 2-го и 3-го типов при окрашивании альциановым синим на кислые ГАГ выявляются крупные гранулы альцианпозитивного вещества, диффузно расположенные в цитоплазме. При реакции с толуидиновым синим на КС в клетках 2-го и 3-го типов по периферии клеток выявляются крупные интенсивно окрашенные в синий цвет гранулы. Крупные гранулы ХС сливаются и заполняют всю цитоплазму.

Ультраструктура основной части клеток 2-го пассажа свидетельствует об активных процессах синтеза белка и его процессинга: ядро содержит большое количество эухроматина и крупное ядрышко; клетки имеют хорошо развитую систему цистерн ЭПР и аппарат Гольджи с большим количеством транспортных везикул. В околоядерной зоне многих клеток накапливаются небольшие секреторные гранулы средней электронной плотности. По сравнению с клетками 1-го пассажа, нарастает степень расширения цистерн ЭПР, переполненных секреторным продуктом. Площадь полей гликогена варьирует в разных клетках, включения гликогена могут занимать до четверти площади цитоплазмы. Часть клеток содержит жировые включения.

Характерной особенностью первичной культуры клеток 2-го пассажа является формирование межклеточного вещества. Между клетками и на поверхности монослоя альциановым синим выявляются кислые ГАГ в виде гомогенного, бесструктурного вещества. Иммунохимическая реакция выявляет присутствие коллагена II типа в межклеточном веществе.

Первичная культура клеток на 3-ем пассаже представлена теми же типами клеток, однако меняется характер её роста: в монослое формируются «острова» плотного роста. Центр «острова» образован плотно прилежащими клетками всех трех типов, а по периферии расположены клетки 3-го типа. Морфометрический анализ выявил дальнейшее снижение содержания клеток 1-го типа (3,11%) и увеличение содержания клеток 3-го типа (37,15%) по сравнению с предыдущим пассажем. Содержание клеток 2-го типа составило 59,74%.

Наблюдаемый на 3-ем пассаже резкий рост числа средне- и высокодифференцированных хондробластов происходит главным образом за счет дифференцировки клеток 1-го и 2-го типов. Высокодифференцированные клетки 3-го типа доминируют. На светооптическом уровне они определяются как самые крупные клетки с большим количеством отростков, обычно расположенные обособленно. Морфологически они представляют собой зрелые, функционально активные клетки. Вероятно, находясь даже не в составе ткани, а в культуре клеток, зрелые хондробласты секретируют

продукты специфического синтеза и обособляются друг от друга, реализуя генетическую программу формирования межклеточного матрикса. На препаратах, окрашенных альциановым синим, отчетливо видно, как секретируемые единичные гранулы кислых ГАГ скапливаются на поверхности монослоя, а затем, сливаясь между собой, формируют обильный матрикс.

Ультраструктурное исследование показало, что для высокодифференцированных хондробластов характерны процессы интенсивного синтеза. Их цитоплазма содержит многочисленные профили шероховатого и гладкого ЭПР. Зона комплекса Гольджи расширена, в цитоплазме наблюдается большое количество окаймленных везикул, осуществляющих транспорт макромолекул. Синтезированные белки поступают в цистерны аппарата Гольджи и гликозилируются. В аппарате Гольджи происходит окончательное формирование молекул гликопротеинов и протеогликанов (Russtll J., 2003; Sacher М., 2007). Гиперфункция ЭПР в хондробластах высокой степени дифференцировки отражает синтез специфического белка (коллагена II типа), выявляемого иммунохимически. Таким образом, культура клеток на третьем пассаже характеризуется минимальным содержанием низко дифференцированных хондробластов. Отличительной чертой данного пассажа является то, что монослой на 97% представлен высокоактивными клетками, формирующими хорошо выраженный матрикс хрящевой ткани in vitro.

Культура клеток на 4-ом пассаже формирует плотный монослой, в котором выявляются локусы округлой формы. Клеточная популяция представлена теми же типами клеток, что и на предыдущих пассажах, однако меняется их соотношение - содержание клеток 1-го типа составляет всего 1,12% от общего количества клеток. Отмечается снижение количества клеток 3-го типа до 11,83%. Основную долю клеток на данном пассаже составляют клетки 2-го типа (87,05%). Морфофункциональные характеристики этих клеток аналогичны таковым на предыдущих пассажах и соответствуют хондробластам средней степени дифференцировки.

На 4-ом пассаже не наблюдается обильного матрикса, присущего культуре клеток 3-го пассажа. Популяция клеток 4-го пассажа на ультраструктурном уровне характеризуется преобладанием клеток, содержащих расширенные цистерны ЭПР, секреторные гранулы и лизосомные структуры. В клетках наблюдаются признаки угасания синтетической активности - сокращение площади и количества транспортных везикул, вакуолизация аппарата Гольджи. В цитоплазме появляются электронно-прозрачные участки и вакуоли, отражающие нарушение водно-ионного равновесия, а также многочисленные включения липидов, являющиеся одним из признаков «старения» клеток. Срезы содержат большое количество разрушающихся клеток и клеточный детрит.

Характерным признаком 4-го пассажа является появление округлых локусов, в центре которых локализуются участки гомогенного оксифильного вещества, по периферии - интенсивно базофильный матрикс с клетками. Такие локусы имеют вид «узелков» и отграничены от. монослоя мелкими клетками с гиперхромным ядром. Базофильный матрикс на периферии «узелков» и оксифильный матрикс в его центральной части проявляют тинкториальные свойства, схожие с хрящевой тканью in vivo в зоне остеогенеза. Это позволяет предположить, что формирование «узелков» отражает завершающий этап дифференцировки клеток in vitro — их кальцификацию. Процесс кальцификации хряща генетически детерминирован и связан с изменением метаболизма хрящевых клеток, в частности, синтезом ими матриксных везикул, содержащих щелочную фосфатазу.

Проведенное исследование показало, что первичная культура клеток, полученная из хрящевых тел позвонков плодов человека на сроке 12 недель гестации состоит из хондробластов. На 1-ом пассаже культура главным образом представлена низкодифференцированными малоактивными хондробластами. Вероятно, это объясняется тем, что большая часть средне- и высокодифференцированных хондробластов разрушается при выделении из нативного фетального хряща. Далее, от пассажа к пассажу, снижается содержание низкодифференцированных клеток, накапливаются хондробласты, находящиеся на среднем и высоком уровне дифференцировки. На 3-ем пассаже увеличиваются синтез и секреция в культуральную среду основных биополимеров, происходит формирование матрикса, что характерно для клеток зоны созревания в нативной пластинке роста. На 4-ом пассаже в монослое хондробластов формируются «узелки», и этот процесс напоминает оссификацию хрящевого матрикса в зоне энхондрального остеогенеза in vivo.

Согласно современным представлениям о дифференциальной активности генов, можно предположить, что особенности клеточного состава на каждом из пассажей связаны с тем, что в каждом конкретном типе клеток функционирует свойственный только этому типу набор экспрессирукмцихся генов. Благодаря их функционированию обеспечиваются закономерные пролиферация и дифференцировка хондробластов в динамике пассажей in vitro, которые, хотя и в упрощенном виде, но все же воспроизводят основные этапы развития хондробластов фетальной пластинки роста in vivo - от момента их образования и до завершения жизненного цикла.

Полученные данные о структурно-функциональных особенностях хондробластов в динамике их культивирования указывают на сохранение клетками специфической морфологии и функций in vitro. Данный факт позволяет говорить не только о возможности использования клеток первичной культуры в качестве донорского материала, но и об использовании первичной культуры фетальных хондробластов в качестве экспериментальной модели для изучения дифференцировки хондробластов фетальной пластинки

роста человека, оценки влияния поражающих факторов и эффективности применения лекарственных средств.

Проведенное исследование позволяет сформулировать критерии оптимального выбора клеточного материала с целью использования первичной культуры фетальных хондробластов для создания тканеинженерных конструкций. Клеточная популяция, предназначенная для трансплантации, должна обеспечивать репаративную регенерацию поврежденного хряща, как за счет репродукции клеток, так и синтеза компонентов матрикса. В этом плане наиболее подходящей для создания тканеинженерных конструкций является клеточная популяция хондробластов 2-го пассажа. Это объясняется оптимальным соотношением низко-, средне- и высоко дифференцированных клеток. При этом низко дифференцированные клетки с высокой пролиферативной активностью способны заполнить хрящевой дефект, средне- и высокодифференцированные хоцдробласты -наполнить дефект матрикссм. Использование хондробластов первичной культуры 3-го и 4-го пассажей для тканеинженерных конструкций нецелесообразно, поскольку их популяция представлена в основном высокодифференцированными клетками, которые менее резистентны к изменению факторов окружающей среды, более подвержены повреждению и гибели.

4. Морфофункциональная характеристика посттравматического регенерата суставного хряща крысы при трансплантации фетальных хондробластов человека

Для проверки концепции выбора оптимального клеточного материала для тканевой инженерии в эксперименте на лабораторных животных была проведена ксенотрансплантация первичной культуры фетальных хондробластов человека второго пассажа в дефект суставного хряща дистального эпифиза бедренной кости крыс.

У крыс, не получавших лечебного воздействия, на 60-е сутки после нанесения повреждения макроскопически отчетливо заметен дефект суставного хряща, который имеет овальную форму и располагается в межмыщелковой ямке в виде кратерообразного углубления. На светооптическом уровне четко идентифицируются границы опила суставного хряща и сформировавшийся регенерат. Края опила неровные, покрыты плотной неоформленной волокнистой соединительной тканью. Величина диастаза составляет 3,89±0,35 мм. Следует отметить, что регенерат заполняет не весь дефект и имеет вид конуса, вершина которого выступает за пределы суставной поверхности. Его центральные отделы выполнены фиброретикулярной тканью, в которой выявляются формирующиеся примитивные костные балки. В более глубоких отделах регенерата по

направлению ко дну ложа дефекта наблюдаются многочисленные кровеносные сосуды, вокруг которых заметны признаки активного остеогенеза.

У крыс, дефект суставного хряща которых заполняли хитозановым гелем, на 60-е сутки отчетливо заметна область регенерата, который расположен в межмыщелковой ямке, имеет овальную форму, однородный, белого цвета. При гистологическом исследовании границы опила суставного хряща не имеют четких контуров. Величина диастаза между краями раны составляет 3,39±0,37 мм. Регенерат выполнен плотной неоформленной волокнистой тканью. На препаратах отчетливо заметно, как со стороны субхондральной костной пластинки по направлению к суставной поверхности происходит инвазия регенерата кровеносными сосудами и выселение малодифференцированных клеток из губчатой кости эпифиза.

У крыс, которым согласно протоколу эксперимента производили стандартный дефект, после чего вносили первичную культуру фетальных хондробластов с хитозановым гелем, на 60-е сутки наблюдения заметен регенерат, имеющий неоднородное строение и характеризующийся наличием темных и более светлых участков. При гистологическом исследовании видно, что сформировавшийся регенерат полностью заполняет дефект. Величина диастаза между краями раны составляет 2,61±0,23 мм и не имеет достоверных отличий от диаметра инструмента, которым наносился дефект. В области торцевых участков опила суставного хряща локализуются многочисленные группы из 4-8 клеток, основное вещество вокруг которых характеризуется интенсивной альцианпозитйвной реакцией. Можно предполагать, что широкий слой матрикса гиалинового хряща, который определяется на границе регенерата и опила суставного хряща, формируется благодаря активному синтезу протеогликанов дифференцированными хондробластами донора, а также хондроцитами реципиента. Это позволяет заключить, что в основе регенерации лежит функциональная активность не только клеток донора, но и клеток реципиента.

Регенерат в полости дефекта образует конус роста, вершина которого граничит с субхондральной костной пластинкой, а основание обращено к суставной поверхности. Его центральная зона представлена низкодифференцированными пролиферирующими клетками; более дифференцированные клетки располагаются на периферии. В основании регенерата отмечаются признаки формирования типичных для нативного суставного хряща слоев. Со стороны суставной поверхности регенерат покрыт гомогенным интенсивно альцианпозитивным веществом. Клетки формирующегося тангенциального слоя овальной формы, их цитоплазма хорошо выражена, умеренно окрашивается гематоксилином. Плоскость расположения клеток параллельна суставной поверхности.

В более глубоких слоях регенерата хондробласты принимают овальную форму. Следует отметить, что изменяется плоскость расположения клеток - последние выстраиваются в колонки перпендикулярно суставной поверхности, как в препаратах нативного суставного хряща. Клетки регенерата, расположенные на границе с субхондральной костной пластинкой, не имеют признаков деструкции. В их цитоплазме, территориальном и межтерриториальном матриксе гистохимически определяется высокое содержание суммарных кислых ГАГ.

Таким образом, трансплантированные в дефект суставного хряща крысы фетальные хондробласты человека сохраняют функциональную активность в течение 60 суток, обеспечивая заполнение дефекта хрящевой тканью. Важной характеристикой трансплантата является отсутствие признаков воспалительной реакции в его толще и в окружающей ткани. Вероятно, это обусловлено снижением иммуногенности ксенотрансплантата за счет очищения культуры хондробластов в процессе культивирования от лейкоцитов-пассажиров (ко-стимуляторов иммунного ответа), а также низким уровнем экспрессии белков главного комплекса гистосовместимости фетальными хондробластами. Очевидно, положительную роль играет также использование в качестве иммуномеханического барьера хитозанового геля, который отграничивает организм реципиента от трансплантата, обеспечивает сохранение жизнедеятельности инкапсулированных клеток и не препятствует диффузии образующихся в клетках биологических веществ. По данным Hsu S. (2004), Lee J.E. (2004), хитозановый гель выполняет и поддерживает объем дефекта, имеет хорошие показатели биосовместимости, блокирует синтез медиаторов воспаления, подавляет разрушительное действие свободнорадикалышх соединений на межклеточный матрикс и снижает активность протеолитических ферментов. Следует отметить, что формированию органотипического регенерата способствовала и использованная при трансплантации малотравматичная техника оперативного вмешательства на коленном суставе. Сохранение подвижности сустава с первых часов послеоперационного периода может быть одним из существенных факторов, оказывающих положительное влияние на последовательную дифференцировку клеток суставного хряща.

Проведенное исследование показывает, что использование при ксенотрансплантации тканеинженерной конструкции на основе первичной культуры фетальных хондробластов человека второго пассажа и хитозанового геля не вызывает острого иммунного отторжения и в течение 60 суток обеспечивает формирование органотипического регенерата за счет пролиферации и дифференцировки фетальных хондробластов донора и их интеграции с тканью реципиента.

выводы

1. Структурно-функциональная организация зоны роста тела позвонка человека на 12-й неделе гестации схожа с таковой у свиньи на 6-й неделе гестации; пластинка роста тела позвонка у человека в 1 год, 37 лет, 11 лет, 12-14 лет постнатального периода онтогенеза имеет схожие характеристики с пластинкой роста свиньи на 8, 12 неделе гестации, 7-20, 30-40 суток постнатального периода онтогенеза соответственно.

2. Увеличение степени дифференцировки клеток и пространственно-упорядоченной организации межклеточного вещества хрящевой ткани в переднем отделе пластинки роста тела позвонка человека и в вентральном отделе пластинки роста тела позвонка свиньи является возрастной особенностью и определяет асимметрию роста тела позвонка грудного отдела у данных видов млекопитающих в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза.

3. В период гисто-топографической структуризации пластинки роста тела позвонка деструкция хрящевого матрикса и апоптоз хондробластов зоны пролиферации опосредуются повышенной генерацией активированных кислородных метаболитов эндотелиальными клетками кровеносных сосудов и хондробластами провизорной хрящевой ткани.

4. Первичная культура фетальных хондробластов, выделенных из зоны роста тела позвонка плода человека на 12-ой неделе гестации может служить экспериментальной моделью для изучения закономерностей дифференцировки хондробластов фетальной пластинки роста человека in vitro и изучения различных воздействий на хрящевую ткань пластинки роста тела позвонка

5. Оптимальными сроками забора донорской хрящевой ткани для её использования в клеточных технологиях являются 12 недель гестации у человека и 6 недель гестации у свиньи.

6. Морфологическим критерием при определении оптимального пассажа первичной культуры с целью создания тканеинженерных конструкций является процентное содержание клеток низкой, средней и высокой степени дифференцировки.

7. Трансплантация клеток первичной культуры фетальных хондробластов человека в дефект суставного хряща крысы не вызывает острого иммунного отторжения, приводит к интеграции клеток человека с хрящевой тканью крысы и формированию тканеспецифического регенерата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные о закономерностях морфогенеза пластинки роста тела позвонка человека и свиньи являются фундаментальными и рекомендуются для использования в учебном процессе в высших учебных учреждениях ветеринарного и медико-биологического профиля при преподавании сравнительной морфологии человека и животных, дисциплин «Гистология, эмбриология, клеточная биология», «Анатомия» в разделах «Опорно-трофические ткани», «Опорно-двигательный аппарат», «Индивидуальное развитие организмов», «Биология свиньи».

2. Данные о возрастных особенностях формирования пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе уточняют сроки терминационных тератогенных периодов в отношении пластинки роста тела позвонка и рекомендуются для использования в практической работе специализированных свиноводческих предприятий по выращиванию поросят, медицинских перинатальных центров.

3. Полученные сведения в отношении оптимального срока получения донорской хрящевой ткани из пластинки роста тела позвонка человека и свиньи, а также критериев выбора оптимального пассажа первичной культуры фетальных хондробластов для трансплантации рекомендуется использовать при разработке тканеинженерных конструкций с целью замещения дефектов суставного хряща.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Сахаров, A.B. Возрастные особенности развития позвоночника экспериментальных животных в пренатальном онтогенезе / A.B. Сахаров, А.М. Зайдман // Матер. VI Междунар. симпоз., VII Чуйской науч.-практ. конф. - Чолпон-Ата, 2003 - Т. I. - С.252-254.

2. Зайдман, А.М. Культура хондробластов как потенциальный источник для тканевой инженерии при повреждениях и заболеваниях позвоночника / А.М. Зайдман, A.B. Сахаров, Т.Д. Колокольцова // Хирургия позвоночника. - 2004.-№ 4. - С. 115-121.

3. Зайдман, A.M. Морфофункциональная характеристика культуры эмбриональных хондробластов человека как перспективного источника клеточного материала для замещения дефектов хрящевой ткани / A.M. Зайдман, A.B. Корель, A.B. Сахаров // Материалы Междунар. конф. «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий». -Новосибирск, 2005 - С. 60-61.

4. Зайдман, A.M. Первичная культура хондробластов человека - как возможный донорский материал для коррекции нарушений хрящевой ткани / A.M. Зайдман, A.B. Сахаров, A.B. Корель, И.Г. Ким, Т.Д. Колокольцева // Материалы Всерос. науч.-практ. конф., посвященной 70-летию Новосибирского государственного медицинского университета. «Инновационные технологии в эстетической медицине и пластической хирургии». - Новосибирск, 2005. - С. 16-18.

5. Зайдман, А.М. Строение пластинки роста тела позвонка у детей различного возраста / А.М. Зайдман, A.B. Корель, A.B. Сахаров // Морфология. - 2005. - №4. - С. 51-55.

6. Сахаров, A.B. Культура хондробластов человека как возможный донорский материал для коррекции поражения хрящевой ткани Сахаров A.B., Зайдман A.M., Корель A.B. и др. // Материалы III Всерос. съезда по трансплантологии и искусственным органам 28-30 октября 2005 г. / Вестник трансплантологии и искусственных органов. - 2005. - №.3. - С. 59-60.

7. Зайдман, А.М. Регуляция метаболизма провизорного хряща пластинок роста тел позвонков в периоды формирования роста / A.M. Зайдман, A.B. Корель, A.B. Сахаров, М.В. Михайловский // Материалы VIII съезда травматологов-ортопедов России «Травматология и ортопедия XXI века». -Самара, 2006. - С.688-689

8. Зайдман, A.M. Первичная культура хондробластов человека как модель для изучения дифференцировки хондробластов пластинки роста in vitro / А.М. Зайдман, A.B. Сахаров, A.B. Корель, И.Г Ким, Т.Д. Колокольцева, Е.И. Рябчикова // Материалы VIII съезда травматологов-ортопедов России «Травматология и ортопедия XXI века». - Самара, 2006. - С. 1051-1052.

9. Макеев, A.A. Коррекция антиоксидантом тиофаном структурно-функциональных нарушений костной ткани / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, А.Е. Просенко // Материалы II Междунар. науч.-практ. конф. Новосибирск 2006.-С. 194-195.

10. Макеев, A.A. Использование антиоксиданта тиофана для коррекции метаболических нарушений костной ткани тела позвонка свиньи при окислительном стрессе / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, К.В. Жучаев // Материалы V Междунар. науч.-практ. конф. «Современные тенденции развития АПК в России». Красноярск, 2007. - С. - 323-326.

11. Сахаров, A.B. Изучение морфофункциональных особенностей хондробластов, полученных из пластинки роста тел позвонков человека, при культивировании in vitro / A.B. Сахаров, Т.Д. Колокольцева, И. Ким и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2007. - № 4. - С. 154-159.

12. Макеев, A.A. Влияние окислительного стресса на состояние костной ткани тела позвонка свиньи / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, К.В. Жучаев и др. // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2007. -№ 6. - С. 82-86.

13. Макеев, A.A. Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в возрастном аспекте / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, О.В. Кеберлайн, М.Б. Пыхтина // Материалы V Всерос. науч.-практ. конф. «Проблемы биологической науки и образования в Вузах». Новосибирск, 24-25 апреля 2008. - С. 110-113.

14. Макеев, A.A. Влияние антиоксиданта тиофана на показатели свободно-радикального окисления и активность ферментов антиоксидантной защиты у поросят / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, К.В. Жучаев, А.Е. Просенко // Материалы Сибирской Межрегион, науч.-практ. конф. «Адаптация, здоровье и продуктивность животных». Новосибирск, 22-23 мая 2008. - С. 141-144.

15. Сахаров, A.B. Использование первичной культуры фетальных хондробластов человека для ксенотрансплантации в дефект суставного хряща крыс / A.B. Сахаров, A.A. Макеев, A.B. Ефремов и др. // Клеточные технологии в биологии и медицине. - 2008. - № 3. - С. 136-140.

16. Макеев, A.A. Применение антиоксиданта тиофана для коррекции морфофункциональных нарушений в костной ткани свиньи при окислительном стрессе / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, К.В. Жучаев, А.Е. Просенко // Вестник Новосибирского аграрного университета. -2008. -№ 7. -С. 123-126.

17. Сахаров, A.B. Особенности формирования осевого скелета свиньи в пренатальном периоде онтогенеза / A.B. Сахаров, A.A. Макеев // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации национального проекта «Развитие АПК на 2008-2012 гг»». Оренбург, 21-23 октября 2008. - С. 146-151.

18. Сахаров, A.B. Морфологические критерии выбора клеток первичной культуры фетальных хондробластов для тканеинженерных конструкций /A.B.Сахаров / Материалы Всерос. науч. конф. «Интеллект 2008». Красноярск, 18 декабря 2008. - С. 72-75.

19. Сахаров, A.B. Биотехнологические подходы к восстановлению дефектов хрящевой ткани / A.B. Сахаров / Материалы Всерос. науч. конф. «Интеллект 2008». Красноярск, 18 декабря 2008. - С. 79-83.

20. Сахаров, A.B. Нарушение структурно-функциональной организации пластинки роста тела позвонка свиньи при окислительном стрессе / A.B. Сахаров, A.A. Макеев // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях». Волгоград, 27-29 января 2009. - С. 145-149.

21. Сахаров, A.B. Периодизация роста осевого скелета свиньи в онтогенезе / A.B. Сахаров, A.A. Макеев // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях». Волгоград, 27-29 января 2009. - С. 149-153.

22. Сахаров, A.B. Морфофункциональная характеристика первичной культуры клеток из разных источников локализации хрящевой ткани / A.B.

Сахаров // Материалы III Междунар. науч.-практ. конф. «Вклад ученых в реализацию хфиоритетного национального проекта «Развитие агропромышленного комплекса»». Троицк, 25-27 ноября 2008. - С. 77-81.

23. Сахаров, A.B. Модель для изучения биологии провизорного хряща пластинки роста in vitro / A.B. Сахаров // Материалы III Междунар. науч.-практ. конф. «йклад ученых в реализацию приоритетного национального проекта «Развитие агропромышленного комплекса»». Троицк, 25-27 ноября 2008. - С. 93-97.

24. Сахаров, A.B. Влияние активных кислородных метаболитов на структуризацию пластинки роста тела позвонка /A.B. Сахаров // Материалы III Междунар. науч.-практ. конф. «Образование и здоровье, экономические, медицинские и социальные проблемы». Пенза, 18 декабря, 2008. - С. 83-85.

25. Сахаров, A.B. Коррекция антиоксидантом тиофаном структурно-функциональных нарушений пластинки роста тела позвонка при окислительном стрессе / A.B. Сахаров, A.A. Макеев // Материалы III Междунар. науч.-практ. конф. «Образование и здоровье, экономические, медицинские и социальные проблемы», Пенза, 18 декабря, 2008. - С. 87-90.

26. Макеев, A.A. Влияние окислительного стресса на морфофункциональное состояние пластинки роста тела позвонка при глюкокортикиод-индуцированном остеопорозе / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, Е.С. Распутина // Сб. науч. работ ученых. Новосибирск, 2006. - Вып. VIII, ч. I. - С. 168-172.

27. Макеев, A.A. Изучение возможности использования антиоксиданта тиофана для коррекции структурно-функциональных нарушений костной ткани / A.A. Макеев, A.B. Сахаров // Сб. науч. работ ученых. Новосибирск, 2006. - Вып. VIII, ч. I. - С. 154-160.

28. Макеев, A.A. Использование антиоксиданта тиофана для коррекции метаболических нарушений костной ткани тела позвонка свиньи при окислительном стрессе / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, К.В. Жучаев // Матер, междунар. науч.-практ. конф. "Современные тенденции развития АПК в России". Красноярск, 2007. - С. 323-326.

29. Макеев, A.A. Использование антиоксиданта тиофана для коррекции структурно-функциональных нарушений костной ткани позвонка свиньи при окислительном стрессе / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, К.В. Жучаев // Материалы V Междунар. науч.-практ. конф. «Современные тенденции развития АПК в России», Красноярск, 2007. - С. 323-326.

30. Макеев, A.A. Морфофункциональная организация костной ткани тела позвонка свиньи в условиях окислительного стресса и при использовании антиоксиданта тиофана / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, К.В. Жучаев // Материалы Междунар. науч.-практ. конф. «Развитие АПК», Москва, 2007. - ч. II. - С. 265-268.

31. Макеев, A.A. Влияние окислительного стресса на энхондральный остеогенез в период полового созревания / A.A. Макеев, A.B. Сахаров, Е.К.

Акинина // Материалы Всерос. науч.-практ. конф. с междуиар. участием «Инновационные процессы в области химикопедагогического и естественнонаучного образования». Оренбург, 2008. - С. 92-94.

32. Сахаров, A.B. Морфологические критерии периодизации роста осевого скелета свиньи / A.B. Сахаров // Вестник КрасГАУ. - 2009. - № 1. -С. 104-107.

33. Сахаров, A.B. Возрастные особенности развития позвоночника свиньи в онтогенезе / A.B. Сахаров, // Вестник КрасГАУ. - 2009. - JVäJ. - С. 115119.

34. Сахаров, A.B. Влияние окислительного стресса на энхондральный остеогенез в зоне роста тела позвонка / A.B. Сахаров // Материалы IX Сибирской ветеринарной конф. «Актуальные вопр. вет. медицины». Новосибирск, 2009. - С. 88-90.

35. Сахаров, A.B. Обоснование выбора оптимального клеточного материала для тканеинженерных конструкций / A.B. Сахаров // Вестник КрасГАУ. - 2009. - № 3. - С. 122-126.

36. Сахаров, A.B. Общие закономерности развития позвоночника человека и свиньи в онтогенезе / A.B. Сахаров, A.A. Макеев, Е.И. Рябчикова // Вестник КрасГАУ. - 2009. - № 3. - С. 126-129.

37. Сахаров, A.B. Нарушение формирования осевого скелета свиньи при окислительном стрессе / A.B. Сахаров, A.A. Макеев, К.В. Жучаев и др. // Сиб. вестн. с.-х. науки. - 2009. - № 4. - С. 41-45.

38. Макеев, A.A. Влияние активированных кислородных метаболитов на структуризацию пластинки роста тела позвонка свиньи / A.A. Макеев, A.B. Сахаров // Матер. VII Межрегион, конф. ученых СФО. Новосибирск, 2009. -С. 172-175.

39. Сахаров, A.B. Активность свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты у поросят в постнатальном периоде онтогенеза / A.B. Сахаров, A.A. Макеев, А.Е. Просенко, Е.И. Рябчикова // Вестник КрасГАУ. - 2009. - № 4. - С.167-169.

40. Сахаров, A.B. Роль активированных кислородных метаболитов в структуризации пластинки роста / A.B. Сахаров, A.A. Макеев, А.Е. Просенко, Е.И. Рябчикова // Вестник КрасГАУ. - 2009. - № 5. - С.99-102.

Подписано к печати 20.03.2009 г. Формат 60x84/16. Усл. печ. л. 2,0. Тир. 100 экз. Заказ 387

Отпечатано в копировальном центре НГАУ г. Новосибирск, ул. Никитина, 155, к. 2086

 
 

Оглавление диссертации Сахаров, Андрей Валентинович :: 2009 :: Новосибирск

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Структурная организация гиалинового хряща.

1.2. Структурно-функциональная организация пластинки роста.

1.3. Формирование структурных компонентов позвоночника млекопитающих в онтогенезе.

1.4. Морфогенез .деформаций позвоночного столба.

1.5. Роль активированных кислородных метаболитов в деструкции хрящевой ткани.

1.6. Клеточные технологии в регенерации структур опорно-двигательного аппарата.

Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Глава 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ.

3.1. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека в онтогенезе. g^

3.1.1. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека в пренатальном периоде онтогенеза.

3.1.1.1. Структурно-функциональная характеристика зоны роста тела позвонка человека на сроке 8-12 недель гестации.

3.1.2. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека в постнатальном периоде онтогенеза.

3.1.2.1. Структурно-функциональная характеристика зоны роста тела позвонка новорожденного.

3. Г.2.2. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека в возрасте 1 года.

3.1.2.3. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека в возрасте 3-7 лет.

3.1.2.4. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка человека в возрасте 11-14 лет.

3.2. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка свиньи в онтогенезе. щ

3.2.1. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка свиньи в пренатальном периоде онтогенеза.

3.2.1.1. Структурно-функциональная характеристика зоны роста тела позвонка свиньи на сроке 4 недели гестации.

3.2.1.2. Структурно-функциональная характеристика зоны роста тела позвонка свиньи на сроке 6 недель гестации.

3.2.1.3. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка свиньи на сроке 8 недель гестации.

3.2.1.4. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка свиньи на сроке 12 недель гестации.

3.2.2. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка свиньи в постнатальном периоде онтогенеза.

3.2.2.1. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка свиньи в период новорожденности - 30 суток.

3.2.2.2. Структурно-функциональная характеристика пластинки роста тела позвонка свиньи в возрасте 40 суток.

3.2.3. Характеристика активности свободнорадикального окисления и функционального состояния системы антиоксидантной защиты у поросят.

3.2.3.1. Характеристика активности свободнорадикального окисления и функционального состояния системы антиоксидантной защиты у поросят в сыворотке крови.

3.2.3.2. Характеристика активности свободнорадикального окисления и функционального состояния системы антиоксидантной защиты у поросят в гомогенатах хрящевой ткани пластинки роста.

3.3. Структурно-функциональная характеристика первичной культуры клеток, выделенных из зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель гестации. ^^

3.3.1. Морфологическая и цитохимическая характеристика клеток первичной культуры.

3.3.1.1. Морфологическая и цитохимическая характеристика клеток первичной культуры на I пассаже.

3.3.1.2. Морфологическая и цитохимическая характеристика клеток первичной культуры на II пассаже.

3.3.1.3. Морфологическая и цитохимическая характеристика клеток первичной культуры на III пассаже.

3.3.1.4. Морфологическая и цитохимическая характеристика клеток первичной культуры на IV пассаже.

3.3.2. Ультраструктурная характеристика клеток первичной культуры выделенных из зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель гестации.

3.3.2.1. Ультраструктурная характеристика первичной культуры клеток на 0 пассаже.

3.3.2.2. Ультраструктурная характеристика клеток первичной культуры на I пассаже.

3.3.2.3. Ультраструктурная характеристика клеток первичной культуры на II и III пассажах.

3.3.2.4. Ультраструктурная характеристика клеток первичной культуры на IV пассаже.

3.4. Морфофункциональная характеристика посттравматического регенерата суставного хряща крысы при трансплантации фетальных хондробластов человека.

3.4.1. Морфофункциональная характеристика посттравматического регенерата суставного хряща крысы в норме.

3.4.2. Морфофункциональная характеристика посттравматического регенерата суставного хряща крысы при заполнении дефекта хитозановым гелем.

3.4.3. Морфофункциональная характеристика посттравматического регенерата суставного хряща крысы при заполнении дефекта конструкцией на основе фетальных хондробластов человека и хитозанового геля.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЯ.

ВЫВОДЫ.

 
 

Введение диссертации по теме "Патология, онкология и морфология животных", Сахаров, Андрей Валентинович, автореферат

Осевой скелет позвоночных всех классов закладывается в принципиально одинаковом виде, и принципиальное сходство его строения сохраняется во взрослом состоянии. Изначально сходство строения проявляется при сегментации мезодермы, закладок позвоночных дуг, спинномозговых узлов и сегментов спинного мозга. Важно отметить, что структурные элементы позвоночника не только закладываются в неразрывной связи друг с другом, но и сохраняют структурную связь в дальнейшем. Однако на общем фоне тесной структурной взаимосвязи между всеми образованиями, под влиянием формообразующих факторов и генетического контроля, развитие каждого из структурных элементов осевого скелета происходит относительно самостоятельно [90, 120, 179, 216, 242]. Вместе с тем, многие морфогенетические закономерности развития структурных элементов осевого скелета у различных видов млекопитающих, включая человека, изучены недостаточно. Прежде всего, это касается некоторых аспектов морфогенеза тел позвонков человека и животных.

Рост позвоночного столба представляет собой сложный морфогенетический процесс, который во многом связан с функциональной активностью хрящевых клеток пластинки роста [254, 269, 284, 324]. Следует отметить, что сведения об особенностях её морфофункциональной организации в онтогенезе у различных видов млекопитающих в современной отечественной и зарубежной литературе не нашли должного отражения. Установлено, что в различные периоды индивидуального развития организма рост позвоночного столба осуществляется неравномерно [35, 58, 74]. В процессе развития хрящевой ткани из мезенхимы, а затем на стадии провизорного хряща, изменяются отношения в системе «клетка-матрикс», что реализуется в изменении свойств хрящевой ткани и выполнении ею своих специфических функций [89, 149, 193, 211]. Ростковый хрящ пластинки роста возникает в эмбриогенезе как провизорная структура, обеспечивая функцию роста тела позвонка, и исчезает после завершения периода роста. В ходе этого процесса формирование полноценной костной ткани во многом определяется взаимоотношениями клеток и межклеточного вещества хрящевой ткани. При этом диалектически взаимосвязанные процессы хондрогенеза и остеогенеза в различные периоды развития имеют свои особенности, которые при определенных условиях могут служить морфологической основой для развития аномалий позвоночного столба [50, 63, 119]. Поскольку позвоночник является весьма уязвимым отделом скелета туловища [40, 49, 67, 137, 168, 186], на его развитие в тератогенный терминационный период могут оказывать влияние различные неблагоприятные факторы внутренней и внешней среды. С точки зрения фундаментальной биологии и медицины, сведения о возрастных особенностях формирования позвоночного столба человека и животных позволяют приблизиться к пониманию^ патогенеза аномалий и пороков-развития-его структурных компонентов — как врожденных, так и возникающих в постнатальном периоде развития. В' этом аспекте оценка возрастного антиоксидантного статуса поросят в ранние периоды постнатального онтогенеза позволяет определить параметры адаптации, организма животных к окислительному стрессу и установить критические периоды развития, пластинки роста с риском её свободнорадикального повреждения?, в период структуризации.

В связи с тем, что изучение пластинки роста в динамике её развития сопряжено с определенными методическими трудностями [165, 204], существует необходимость разработки модели для изучения биологии провизорного хряща пластинки роста в культуре клеток in vitro. Такая модель обеспечивает возможность исследования эффектов различных повреждающих факторов и влияния * лекарственных средств- на клетки хондрогенного дифферона in vitro и позволит по-новому подойти к оценке клеточного материала, используемого для трансплантации в реконструктивной хирургии.

Клеточная и тканевая инженерии находят широкое применение при травматических повреждениях хрящевой ткани [152, 215, 227]. По мнению академика М. Пальцева (2006), клеточные технологии и генная терапия представляют собой наиболее универсальные, современные подходы к лечению, с которыми связаны надежды на разработку индивидуальных схем лечения- пациентов с самыми тяжелыми заболеваниями, в том числе и наследственными.

Несмотря на стремительное развитие исследований в области клеточных технологий, проблема выбора оптимального клеточного материала для восстановления поврежденного хряща в настоящее время остается не решенной [251, 296]. Считается; что фетальные клетки могут являться универсальным модулем для клеточных реконструкций [93, 95]. Донорские клетки, интегрируясь в организм реципиента, позволяют создавать устойчивые ростки новой здоровой ткани в поврежденных зонах [85, 150, 187]. Дефицит органов для пересадки делает настоятельной необходимость поиска альтернативных источников донорского материала [96, 101, 171]. В изящных экспериментах по внутриматочной пересадке эмбриональных клеток человека зародышам овцы, было убедительно продемонстрировано возникновение устойчивых ростков клеток человека в костном мозге «гуманизированых» животных. При этом трансплантированные соматические клетки человека не давали опухолевые клоны, не нарушали эмбриогенез животного-реципиента и не провоцировали иммунный конфликт между клетками донора и реципиентом [85, 203]. Известная близость многих физиологических показателей человека и свиньи [84, 96] открывает новые перспективы для изучения возможности использования клеток, тканей и органов свиньи на службе здоровья человека. Разработка технологий выделения, культивирования и трансплантации фетальных клеток, возможно, поможет решить в будущем проблему дефицита донорского материала. Однако, разработки технологий трансплантации фетальных клеток должны основываться- на современном представлении о структурно-функциональной- организации хрящевой ткани и закономерностях ее развития в онтогенезе, что возможно поможет решить в будущем проблему дефицита донорского материала.

В этой связи, исследование морфофункциональных характеристик клеток хондрогенного дифферона пластинки роста человека и свиньи в динамике возрастных изменений представляется актуальной проблемой.

Целью настоящего исследования явилось изучение морфофункциональных взаимоотношений клеток и матрикса пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в возрастном аспекте, а также разработка научно обоснованных принципов оптимального выбора клеточного материала для тканевой инженерии.

Задачи исследования:

1. Выявить общие закономерности морфогенеза пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в пренатальном-и постнатальном периодах онтогенеза.

21 Изучить особенности структурно-функциональной организации пластинки роста тела позвонка человека» и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза.

3. Оценить роль активированных кислородных метаболитов в морфогенезе пластинки роста тела позвонка.

4. Определить оптимальный возрастной период забора донорской хрящевой ткани у человека и свиньи для её использования в качестве источника клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций.

5'. Определить морфологические критерии выбора оптимального пассажа первичной культуры клеток, выделенных из фетальной хрящевой ткани зоны роста тела позвонка для создания тканеинженерных конструкций.

6. Изучить. возможность ксенотрансплантации клеток первичной культуры фетальных хондробластов человека в условиях хирургического повреждения хрящевой ткани у лабораторных животных. Научная новизна. Впервые выявлены общие закономерности развития пластинки роста у человека и свиньи в пренатальном и постнатальном периодах онтогенеза. Впервые получены новые сведения о возрастных особенностях

10 развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи, связанные с неравномерной пролиферацией и дифференцировкой клеток, а также пространственно-упорядоченной организацией межклеточного вещества в переднем и заднем отделах пластинки роста у человека, а у свиньи - в её вентральном и дорсальном отделах. Впервые установлены периоды неравномерного развития зоны роста тела позвонка, которые морфологически определяются у человека с 12 недель пренатального развития до 12 лет, а у свиньи - в период с 6 до 12 недель гестации. Впервые определены морфологические критерии выбора фетального гиалинового хряща зоны роста тела позвонка человека и свиньи для использования в качестве источника клеточного материала в тканевой инженерии. Впервые исследованы морфофункциональные характеристики фетальных клеток хондрогенного дифферона in vitro, которые могут быть использованы для оценки клеточного материала при разработке тканеинженерных конструкций. Разработана экспериментальная модель изучения дифференцировки хондробластов пластинки роста человека in vitro. Впервые предложена концепция отбора клеточного материала для создания тканеинженерных конструкций. В эксперименте на лабораторных животных впервые осуществлена ксенотрансплантация фетальных хондробластов человека для замещения дефекта гиалинового хряща.

Теоретическая и практическая значимость исследования. Выявленные возрастные закономерности структурно-функциональной организации зоны роста тела позвонка человека и свиньи отражают сходство морфогенетических процессов у этих видов млекопитающих и могут быть использованы для уточнения границ критических периодов развития пластинки роста тела позвонка человека и свиньи. Установленная неравномерность пролиферации и дифференцировки клеток хондрогенного дифферона в переднем и заднем отделах пластинки роста тела позвонка человека, а у свиньи в её дорсальном и вентральном отделах, обусловливает асимметрию роста тела позвонка, что может рассматриваться в качестве одного из патогенетических факторов развития деформаций позвоночника.

Выявленные особенности морфофункциональной организации клеток и матрикса гиалинового хряща зон роста позволяют определить оптимальный возрастной период забора донорской хрящевой ткани человека и свиньи в качестве источника клеточного материала для тканеинженерных конструкций.

Определены морфологические критерии оценки и выбора клеточного материала для трансплантации в реконструктивной хирургии.

Предложенная экспериментальная модель дифференцировки хондробластов пластинки роста человека' in vitro обеспечивает возможность прямого подхода к изучению изменений пластинки роста человека, а также может быть использована для. оценки влияния поражающих факторов и эффективности применения лекарственных средств на клетки хондрогенного дифферона in vitro.

Результаты данного исследования используются в учебном процессе при преподавании дисциплины «Гистология и эмбриология» в Новосибирском государственном медицинском университете, а также при изучении курса дисциплин «Анатомия» в Мордовском государственном университете им. Н.П. Огарёва и «Биология свиньи» в Биолого-технологическом институте Новосибирского государственного аграрного университета.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В развитии позвоночного столба человека и свиньи наблюдаются структурно-временные параллели.

2. Асимметрия роста и развития хрящевых пластинок роста тел позвонков грудного отдела человека и свиньи в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза является возрастной особенностью.

3. Фетальные хондробласты человека и свиньи, выделенные из гиалиновой хрящевой ткани зоны роста тела позвонка человека на сроке 12 недель, а свиньи - 6 недель гестации являются оптимальным источником клеточного материала для разработки тканеинженерных конструкций с целью замещения дефектов суставного хряща.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертации доложены и обсуждены на VI Международном симпозиуме (Чолпон-Ата, 2003), III Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам (Москва, 2005), Международном симпозиуме «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий» (Новосибирск, 2005), Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 70-летию Новосибирского государственного медицинского университета (Новосибирск, 2005), VIII съезде травматологов-ортопедов России (Самара, 2006), V Международной научно-практической конференции «Современные тенденции развития АПК в России» (Красноярск, 2007), V Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы биологической науки и образования в Вузах» (Новосибирск, 2008), Сибирской межрегиональной научно-практической конференции «Адаптация, здоровье и продуктивность животных» (Новосибирск, 2008), Международной научно-практической конференции «Роль биологии и ветеринарной медицины в реализации национального проекта «Развитие АПК на 2008-2012 гг.»» (Оренбург, 2008), Всероссийской научной конференции «Интеллект 2008» (Красноярск, 2008), III Международной научно-практической конференции «Образование и здоровье, I экономические, медицинские и социальные проблемы» (Пенза, 2008), Международной научно-практической конференции «Использование инновационных технологий для решения проблем АПК в современных условиях» (Волгоград, 2009), IX Сибирской ветеринарной конференции (Новосибирск, 2009).

1 Публикации. По теме диссертации опубликовано 40 печатных работ, в том числе 12 - в журналах, рекомендуемых ВАК для публикации материалов докторских диссертаций. j

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 290 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания

 
 

Заключение диссертационного исследования на тему "Морфофункциональная характеристика пластинки роста тела позвонка млекопитающих в онтогенезе"

ВЫВОДЫ

1. Структурно-функциональная организация зоны роста тела позвонка человека на 12-й неделе гестации схожа с таковой у свиньи на 6-й неделе гестации; пластинка роста тела позвонка у человека в 1 год, 3-7 лет, 11 лет, 12-14 лет постнатального периода онтогенеза имеет схожие характеристики с пластинкой роста свиньи на 8, 12 неделе гестации, 7-20, 30—40'суток постнатального периода онтогенеза, соответственно.

2. Увеличение степени дифференцировки клеток и пространственно-упорядоченной организации межклеточного вещества хрящевой ткани в переднем отделе пластинки роста тела позвонка человека и в вентральном отделе пластинки роста тела позвонка свиньи является возрастной особенностью и определяет асимметрию роста тела» позвонка грудного отдела у данных видов млекопитающих в пренатальном и раннем постнатальном периодах онтогенеза.

3. В период гисто-топографической структуризации пластинки роста тела позвонка деструкция хрящевого матрикса и апоптоз хондробластов зоны пролиферации опосредуются повышенной генерацией активированных кислородных метаболитов эндотелиальными клетками кровеносных сосудов и хондробластами провизорной хрящевой ткани.

4. Первичная культура фетальных хондробластов, выделенных из зоны роста тела позвонка плода человека на 12-ой неделе гестации может служить экспериментальной моделью для изучения закономерностей дифференцировки хондробластов фетальной пластинки роста человека in vitro> и, изучения различных воздействий на хрящевую ткань пластинки роста тела позвонка.

5. Оптимальными сроками забора донорской хрящевой ткани для её использования в клеточных технологиях являются 12 недель гестации у человека и 6 недель гестации у свиньи.

6. Морфологическим критерием при определении оптимального пассажа первичной культуры с целью создания тканеинженерных конструкций является процентное содержание клеток низкой, средней и высокой степени дифференцировки.

7. Трансплантация клеток первичной культуры фетальных хондробластов человека в дефект суставного хряща крысы не вызывает острого иммунного отторжения, приводит к интеграции клеток человека с хрящевой тканью крысы и формированию тканеспецифического регенерата.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Полученные данные о закономерностях морфогенеза пластинки роста тела позвонка человека и свиньи являются фундаментальными и рекомендуются для использования в учебном процессе в высших учебных учреждениях ветеринарного и медико-биологического профиля при преподавании сравнительной морфологии человека и животных, дисциплин «Гистология, эмбриология, клеточная биология», «Анатомия» в разделах «Опорно-трофические ткани», «Опорно-двигательный аппарат», «Индивидуальное развитие организмов», «Биология свиньи».

2. Данные о возрастных особенностях формирования пластинки роста тела позвонка человека и свиньи в онтогенезе уточняют сроки терминационных тератогенных периодов в отношении пластинки роста тела позвонка и рекомендуются для использования в практической работе специализированных свиноводческих предприятий по выращиванию поросят, медицинских перинаталогических центров.

3. Полученные сведения в отношении оптимального срока получения донорской хрящевой ткани из пластинки роста тела позвонка человека и свиньи, а также критериев выбора оптимального пассажа первичной культуры фетальных хондробластов для трансплантации рекомендуется использовать при разработке тканеинженерных конструкций с целью замещения дефектов суставного хряща.

 
 

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2009 года, Сахаров, Андрей Валентинович

1. Абрамченко В.В. Антиоксиданты и антигипоксанты в акушерстве / В.В. Абрамченко. СПб.: ДЕАН, 2001. - 400 с.

2. Аксенович Е.А. Предварительный анализ наследования сколиоза / Е.А. Алексенович, И.Р. Семенов, Э.Х. Ринзбург // Генетика. — 1988. Т. 24. — С. 2056 -2063.

3. Альберте А. Молекулярная биология клетки: Пер. с англ. / А. Альберте, Д. Брей, Р. Льюис и др. М.: Мир, 1994. 361 с.

4. Анисимов В.Н. Молекулярные и физиологические механизмы старения. СПб.: Наука, 2003. - 468 с.

5. Анисимов В.Н. Средства профилактики преждевременного старения (геропротекторы) / В.Н. Анисимов // Успехи геронтол. — 2000. — № 4. —1. С. 275 277.

6. Аруин Л.И. Апоптоз при патологических процессах в органах пищеварения / Л.И. Аруин // Клин. мед. 20001 - Т. 78, № 1. - С. 5 - 10.

7. Барабаш Н.Е. Развитие затылочно-шейной области в эмбриональном периоде у человека / Н.Е. Барабаш // вопросы эмбриологии человека. Астрахань, 1961. С. 62 - 68.

8. Борисевич А.И. Морфогенез позвоночного столба человека. Позвонки / А.И. Борисевич // Закономерности морфогенеза опорных структур позвоночника и конечностей на различных этапах онтогенеза. Ярославль. 1986. - С. 3 - 17.

9. Бурлакова Е.Б. Биохимические механизмы действия антиоксидантов / Е.Б. Бурлакова, С.А Крашаков, Н.Г. Храпова // Биол. мембраны. -1998. № 15(2), С. 137 - 167.

10. Ванин А.Ф. Оксид азота — регулятор клеточного метаболизма / А.Ф. Ванин // Сорос, образоват. журн. 2001. - Т. 7, № 11. - С. 7 - 12.

11. Васильев Ю.М. Социальное поведение нормальных клеток и антисоциальное поведение опухолевых клеток. Сигнальные молекулы,вызывающие размножение и гибель клеток / Ю.В. Васильев // Сорос: образоват. журнал. 1997. .-№ 3. - С. 17 - 22.

12. Владимиров Ю.А. Роль нарушений свойств липидного слоя мембран в развитии патологического процесса / Ю.А. Владимиров // Пат. физиол. — 1989; -№4. -С. 7- 1-9.-.

13. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов иг физические свойства; липидного слоя биологических мембран / Ю.А. Владимиров // Биофизика-- 1987.-Т. 32, № 5. С. 830 - 844.

14. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в биологических системах / Ю.А. Владимиров,// Сорос, образоват.' журн. 2000. - № 12. - С. 131. I9V

15. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы в живых системах / Ю.А. Владимиров, О.А. Азизова, А.И. Деев // Итоги' науки и техники; Сер. Биофизика. 1991. - Т. 29. - С. 1 - 249.

16. Владимиров Ю.А. Свободные радикалы, и антиоксиданты / Ю.А. Владимиров // Вестн: РАМН. 199.8;'— № 7. - С. 43- 51.

17. Гатава Б.П. Некоторые данные о формировании аномалий тел позвонков у человека / Б.Е. Гатава // Архив патологии. —1975. — Т. 37, № 4. С. 43 -48. '

18. Голубев А.Г. Биохимия продления жизни / А.Г. Голубев // Успехи геронтол. 2003: - С. 57 - 76; .

19. Дедух Н.В. Остеоартрозы. Пути фармакологической коррекции / Н.В. Дедух, И.А. Зупанец, В.Ф. Черных. Харьков: Основа, 1992. - 139 с.

20. Дедух Н.В. Регенерация суставного хряща: достижения и перспективы / Н.В. Дедух, А.И. Жигун, А.В. Ролик // Ортопедия травматология и протезирование 1997. - № 3. - С. 25 - 26.

21. Дедух Н.В. Возрастные изменения межклеточного вещества гиалиновой и коллагеноволокнистой хрящевой ткани человека / Н.В. Дедух, С.В. Малышкина, М. Керн и др. // Архив анатомии, гистологии и эмбриологии. 1988. № 4. С. 35 - 39.

22. Дудин М.Г. Идиопатический сколиоз и директивные системы организма при сколиотической деформации позвоночника: Методы лечения // тез. докл. Междунар. симпоз. М., 2003. С. 26 - 27.

23. Дудин М.Г. Идиопатический сколиоз: Фронтальная дуга // Адаптация различных систем организма при сколиотической дифформации позвоночника: Методы лечения: тез. докл. Междунар. симпоз. М., 2003. -С. 23 -25.

24. Дыбан А.П. Реакция эмбрионов человека на неблагоприятные изменения среды / А.П. Дыбан // Проблемы современной эмбриологии под ред. В.В. Попова. М.: Изд-во Моск. ун-та , 1964. - С. 72.

25. Дьяченко В.А. Аномалии развития позвоночника в рентгеноанатомическом освещении / В.А. Дьяченко. — М.: Медгиз, 1949. -200 с.

26. Жимулев И.Ф. Политенные хромосомы: морфология и структура / И.Ф. Жимулев. Новосибирск: Наука, 1992. - 480 с.

27. Житников А.Я. Некоторые морфологические показатели развивающегося хряща /А.Я. Житников // Закономерности морфогенеза опорных структур позвоночника и конечностей на различных этапах онтогенеза. Ярославль, 1986. - С. 38 - 41.

28. Зайдман A.M. Идиопатический сколиоз / A.M. Зайдман. Новосибирск,i1. Наука, 1994.-324 с.

29. Зайдман A.M. Структурно-функциональные особенности пластинки роста тела позвонка человека в критические периоды роста / A.M. Зайдман, А.В. Корель // Хирургия позвоночника. — 2004. — № 1. — С. 113 120.

30. Зайдман A.M. Экспериментальная модель наследственной деформации позвоночника / A.M. Зайдман, П.М. Бородин, Т.В. Русова // Вестн. травматологии и ортопедии, им. Приорова. -2003№ 4. С.69- 73.

31. Зайдман A.M. Болезнь Шейерманна — May;. Клиника, морфология, биохимия, генетика, лечение / A.M. Зайдман; Н.Х. Фомичев; Е.В: Калашникова. — Новосибирск, 2002; — 111 с.

32. Зайдман A.M. Морфогенез болезни Шейерманна / A.M. Зайдман, А.В. Корель, Т.В. Руссова и др. // Хирургия позвоночника. 2005. — № 2 . -С. 73 -83.

33. Зенков Н.К. Окислительный; стресс. Биохимический и патофизиологический: аспекты / Н.К. Зенков, В;3. Ланкин, Е.Б. Меньшикова. — М.: Наука; Интерпериодика, 2001. 340 с.

34. Зенков Н.К. Фенольные биоантиоксйданты. / Н-К. Зенков, Н.В. Кандалинцева, В.З. Ланкин и др. // Новосибирск: СО РАМН, 2003. 328 с. ■

35. Зирне Р.А. Динамика ультраструктуры хондрогенной ткани в* процессе её развития / Р.А. Зирне, Т.В: Аршавская. — Рига: Зинанте, 1990. 112 с.

36. Кабак С.Л. Патогенез лучевых аномалий скелета и суставов зародышей белой крысы / С.Л. Кабак // Архив АГЭ. 1986. - № 12. - С. Г1 - 17.

37. Кабак С.Л: Эмбриональное развитие скелета, сустав конечностей и туловища у белой крысы / С.Л. Кабак, Е.П. Аниськова // Здравоохранение Белоруссии. Минск, 1982. — № 4. - С. 70 - 73.

38. Карлсон Б. Основы эмбриологии по Пэттену / Б. Карлсон. — М.: Мир, 1983.-Т. 1.-360 с.

39. Керн М. Принципы поляризационно-оптического анализа в изучении соединительной ткани / М. Керн, J1. Модиш, Н.В. Дедух и др. // Архив анатомии. 1985. - Т. 88, вып. 6. — С. 5 - 12.

40. Клишов А.А. Клеточно-дифферонная организация- тканей и проблема заживления ран / А.А. Клишов, Г.Я. Графова, В.Г. Гололобов //Архив анатомии 1990. - Т. 98,,вып. 4. - С. 5 - 23.

41. Коган Е.А. Морфологические и молекулярно-биологические особенности процессов кератинизации и апоптоза в- плоскоклеточном раке легкого / А.Е. Коган, Д:А. Угрюмов, F. Жак // Арх. пат. 2000. - Т 62, № З.-С. 16-20.

42. Копьева Т.Н. Структура суставного хряща у лиц пожилого возраста / Т.Н. Копьева, И.Я. Мульдияров; О.Б. Вельская и др. // Архив анатомии. 1983. - Т. 86, вып. 10. - С. 60 - 67.

43. Королюк М.А. Метод определения активности каталазы / М.А. Королюк //Лаб. дело.- 1988.-№1.-С.16- 19.

44. Корочкин Л.И. Взаимодействие генов в развитии / Л.И. Корочкин. М.: Наука, 1977.-261 с.

45. Крысь-Пугач А.П. Остеопенический синдром, и остеопороз у детей-и подростков / А.П. Крысь-Пугач, Т.А. Кинчая-Полищук // Ортопедия травматология и протезирование. 2000. — № 2. - С. 35 - 38.

46. Кувин С.Е. Морфогенетическое исследование структурных компонентов позвоночника / С.Е. Кувин, С.И. Колесников // Восток-Сибирь. 2005. - № 9. - С. 13 - 16.

47. Кузин A.M. Структурно-метаболическая теория в радиобиологии. — М.: Наука, 1986. -80 с.

48. Кулинский В.И. Активные формы кислорода и оксидативная модификация макромолекул: польза, вред, защита / В.И. Кулинский // Сорос, образоват. журн. 1999. -№ 1. С. 2 - 7.

49. Лаврищева Г.И. К вопросу о репаративной регенерации суставного хряща / Г.И. Лаврищева, Л.Н. Михайлова // Ревматология. 1985. — № 4. - С. 46 - 49.

50. Лаврищева Г.И. Морфологические и клинические аспекты репаративной регенерации опорных органов и-тканей / Г.И. Лаврищева, Г.А. Оноприенко. М.: Медицина, 1996. - 207 с.

51. Лаврищева Г.И. Морфология и ультраструктура регенератора при повреждении суставного хряща / Г.И. Лаврищева, Л.Н. Михайлова // Повреждения и заболевания костей и суставов. — М., 1981. — С. 79 85.

52. Лакин Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин — М.: высш. шк., 1980. 293с.

53. Лебедевский С.И. Изменения в длине сегментов спинного мозга и осевого скелета (позвонков) в течение развития у человека и свиньи / М.А. Лебедевский // Изв. науч. ин-та им. П.Ф. Лесгафта. Л., 1936. — Т. XX, вып.1.-С. 3- 102.

54. Лукьянова Н.Ю. Роль генов р53 и Ьс12 в апоптозе и лекарственной резистентности опухолей // Н.Ю. Лукьянова, Г.И. Кулик, В.Ф. Чехун // Вопр. онкол. 2000. - Т 46, № 2. - С. 121- 128.

55. Луппа X. Основы гистохимии / X. Луппа. М.: Мир. - 1980. - 343с.

56. Лушников Е.Ф. Гибель клетки (апоптоз) / Е.Ф. Лушников, А.Ю. Абросимов. — М.: Медицина. 2001. - 192 с.

57. Лущак В.И. Свободно-радикальное окисление белков и его связь с функциональным состоянием организма / В.И. Лущак // Биохимия. — 2007. Т. 72, № 8. - С. 995 - 1017.

58. Макеев А.А. Влияние окислительного стресса на состояние костной ткани тела позвонка свиньи / А.А. Макеев, А.В. Сахаров, К.В. Жучаев и др. // Сиб. вестн. с.-х. науки. 2007. - № 6. - С. 81 - 86.

59. Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты / Е.Б. Меныцикова, В.З. Ланкин, Н.К Зенков. М.: Слово, 2006. - 553с.

60. Меныцикова Е.Б. Окислительный стресс: Патологические состояния и заболевания / Е.Б. Меныцикова, Н.К. Зенков, В.З. Ланкин и др. — Новосибирск: АРТА. 2008. - 284 с.

61. Меныцикова Е.В. Окислительный стресс при воспалении / Е.В. Меньшикова, Н.К. Зенков // Успехи соврем, биологии. 1997. Т. 117. — Р. 155-171.

62. Миньков И.В. Патогенетические механизмы развития остеопороза у детей с синдромом Элерса-Данлоса 2-3 типа / И.В. Миньков // Проблемы остеологии. 2001. - Т. 4 , № 4. - С. 77.

63. Михайловский М.В. Хирургия деформаций позвоночника / М.В. Михайловский, Н.Г. Фрмичев. Новосибирск: Сиб. унив. изд-во, 2002. -431с.

64. Модяев В.П. Физиология и патофизиология соединительной ткани / В.П. Модяев. Новосибирск, 1980.-С. 149-151.

65. Нейфах А.А. Молекулярная биология процессов развития / А.А. Нейфах, М.Я. Тимофеева. М.: Наука, 1977. - 125 с.

66. Носков С.М. Свободнорадикальные реакции при ревматоидном артрите / С.М. Носков, Г.С. Козлов, Л.Ю. Широкова // Ревматология. 1988. — № 4. - С. 72-76.

67. Омельяненко Н.П. Особенности ультраструктурной организации хрящей носа и ушной раковины / Н.П. Омельяненко, Л.Д. Жеребцова // Архив анатомии 1983. - № 8. - С. 43-50.

68. Определение резистентности^ к: окислению липопротеинов низкой; плотности сыворотки крови: метод, рекомендации / сост. Ю.И. Рагина, М.И. Душкин. Новосибирск, 1998. - 11с.

69. Орел A.M. Развитие и изменение позвоночника / A.M. Орел //Бюл. Моск. профессионал, объединение мануальных терапевтов. — 2003. — №5. С. 99-101.

70. Павлова В.Н. Проблемы и перспективы современной хондрологии / B.I1. Павлова, Г.Г. Павлов // Ревматология. — 1984. — № 3. С. 3-9.

71. Павлова В.Н: Синовиальная среда сустава / В;Н. Павлова:' — М., Медицина, 1980.-295 с.

72. Павлова В.Н. Хрящ / В.Н. Павлова. М.: Медицина, 1988. - 320 с.

73. Панасенко О.М. Взаимодействие экзогенного гипохлорита и гипохлорита; продуцируемого в системе миелопероксидаза + Н202 + CI , с ненасыщенными фосфатидилхолинами / О.М: Панасенко, A.I1. Осипова, Ю. Шиллер//Биохимия.-2002. Т. 67, № 8. -С. 1071-1084.

74. Панков Е.Я. Физиология и патология соединительной: ткани / Е.Я. Панков, Н.В. Дедух. Новосибирск: изд-во Сиб. отд-ния АМН СССР, 1980. - 187 с.80; Пирс Э. Гистологическая техника / Э: Пирс. М.:: Изд. иностр.; лит. 1962.- 962 с.ч

75. Подопригорова В.Г. Окислительный' стресс и язвенная болезнь / В.Г. Подопригорова. М.: Медицина, 2004. - 175 с.83: Полтавцева Р.А. Развитие in vitro нейральных прогенетированных клеток- эмбрионов человека / Р.А. Полтавцева, А.А. Ржанинова, А.В.

76. Ревищин // Бюл. эксперимент, биологии и медицины. 2001. - Т. 132, № 9.-С. 290-293.

77. Понд У.Дж. Биология свиньи / У. Дж. Понд, К.А. Хаупт. М.: Колос. -1983.- 159 с.

78. Репин B.C. Медицинская клеточная биология /B.C. Репин, Г.Т. Сухих. М., Российская академия медицинских наук: БЭМБ, 1998. — 200 с.

79. Ромейс Б. Микроскопическая техника / Б. Ромейс. — М.: Изд-во иностр. литер.1 1954. 165 с.

80. Самуилов В.Д. Программируемая клеточная смерть / В.Д. Самуилов, А.В. Олескин, Е.М. Лагунова. 2003. - 235 с.

81. Серов В.В. Соединительная ткань / В.В. Серов, А.Б. Шехтер. М.: Медицина, 1981. - 217 с.

82. Серов О.Л. Генный и хромосомный уровни контроля развития / О.Л. Серов // Информ. вестн. ВОГиС. 2003. - № 24-25. - С. 2-8.

83. Скулачев В.П. Явления запрограммированной смерти. Митохондрии, клетки и органы: роль активных форм кислорода / В.П. Скулачев // Сорос, образоват. журн. 2001. - Т. 7, № 6. - С. 4-10.

84. Стальная И.Д. Современные методы в биохимии / И.Д. Стальная. М.: Медицина, 1977. -391 с.

85. Сухих Г.Т. Иммунологические аспекты клеточной терапии / Г.Т. Сухих, И.М. Богданова, В.В. Малайцева // Бюл. эксперимент, биологии и медицины. 2003. - Т. 136, № 7. - С. 124-129.

86. Сухих Г.Т. Нейральная стволовая клетка: биология и перспективы нейротрансплантации / Г.Т. Сухих, В.В. Малайцев // Бюл. эксперимент.биологии и медицины, 2001. Т. 131, № 3. - С. - 244-255.t

87. Сухих Г.Т. Трансплантация эмбриональных гепатоцитов: экспериментальное обоснование нового подхода к лечению недостаточности печени / Г.Т. Сухих, А.А. Штиль // Бюл. эксперимент, биологии и медицины. 2002. - Т. 134, № 12. - С. 604-609.

88. Трансплантология: руководство для врачей / под ред. В.И. Шумакова. М.: Медицина, 1995. 575 с.

89. Фатхудинов Т.Х. Особенности репаративного остеогенеза при трансплантации мезенхимальных стволовых клеток / Т.Х. Фатхудинов, Д.В. Гольдштейн, А.А. Пулин // Бюл. эксперимент, биологии и медицины.-2005.-Т. 140, № 7. С. - 109-113.

90. Фатхутдинов Т.Х. Стимуляция репаративного 'остеогенеза при ксенотрансплантации перинатальных мезенхимальных стволовых клеток и хондробластов человека / Т.Х. Фатхутдинов // Клеточные технологии в биологии и медицине. — 2005. —№ 2. — С. 75-83.

91. Фогель Ф. Генетика человека / Ф. Фогель, А. Мутольски. М.: Мир, 1990.-379 с.

92. Янковский О.Ю. Токсичность кислорода и биологические системы (Эволюционные экологические и медико-биологические аспекты) / О.Ю. Янковский. СПб:. Игра, 2000. - 294 с.

93. Adams S.L. Integration of signaling pathways regulating chondrocyte differentiation during endochondral bone formation / S.L. Adams, A.J. Cohen, L. Lassova // J. Cell Physiol. 2007. - Vol. 213, № 3. - P. 63 5-641.

94. Aebi H. Catalase in vitro / Aebi H. // Ment. Enzymol. 1984. - Vol. 105. -P.121-126.

95. Ahmed Y.A. Physiological death of hypertrophic chondrocytes / Y.A. Ahmed, L. Tatarczuch, C.N. Pagel // Osteoarthritis Cartilage. 2007. -Vol.15, №5.-P. 575-586.

96. Alhadlaq H.A. Morphological changes in articular cartilage due to static compression: polarized light microscopy study / H.A. Alhadlaq, Y. Xia, F.M. Hansen // Connect. Tissue Res. 2007. - Vol. 48, № 2. - P. 76-84.

97. Alini V.I. The extracellular matrix of cartilage in the growth plate before and during calcification: Changes in composition and degradation of type II collagen / V.I. Alini, Y. Matsui, G.R. Dodge // Caleif. Tissue Int. 1992. -Vol. 50.-P. 327-335.

98. Amarilio R. HIF1 (alpha) regulation of Sox9 is necessary to maintain differentiation of hypoxic prechondrogenic cells during early skeletogenesis / R. Amarilio, S.V. Viukov, A. Sharir // Development. 2007. - Vol. 134, № 21.-P. 3917-3928.

99. Anderson H.C. The role of matrix vesicles in growth plate development and biomineralization / H.C. Anderson, R. Garimella, S.E. Tague // Front Biosci. 2005. - Vol. 10. - P. 822-837.

100. Andrade A.C. Wnt gene expression in the post-natal growth plate: regulation with chondrocyte differentiation / A.C. Andrade, O. Nilsson, K.M. Barnes //' Bone. 2007. - Vol. 40, № 5. - P. 1361-1369.

101. Archer C.D. C-erbB2 positivity correlates with poor apoptotic response to chemotherapy in primary breast cancer / C.D. Archer, P.A. Ellis, M. Dowsett // Breast Cancer Res. Treat. 1998. - Vol. 50. - 237 p.

102. Archer C.W. The chondrocyte / C.W. Archer, P. Francis-West // Int. J. Biochem. Cell Biol. 2003. - Vol. 35, № 4. - P. 401-409.

103. Armstrong P:B. Intercellular invasion and the organizational stability of tissue: a role for fibronectin / P.B. Armstrong, M.T. Armstrong // Biochim. Biophys. Acta. 2000. - Vol. 1470. - P. 9-20.

104. Arrigo A.P. Regulation of mammalian gene expression by free radicals / A.P. Arrigo, C. Kretz-Remmy // Molecular biology of free radicals in human disease. 1998. - P. 183-223.

105. Arsenault A.L. Microvas-cuiar organization at the epiphyseal-metaphyseal junction of normal and raehitic rats / A.L Arsenault, W.L. Hunter, A.B. Hodsman // Behaviour of the Growth Plate. 1988. - P. 309-316.

106. Azzi A. Vitamin E: non-antioxidant roles / A. Azzi, A. Stacker // Progr. Lipid Res. 2000. - Vol. 39. - P. 231-255.

107. Babibor B:M. NADPH oxidase: An update / B.M. Babibor // Blood. 1999: -Vol. 93.-P. 1464-1476.

108. Back E.I. Antioxidant deficiency in cystic fibrosis: when is the right time to, take action / E.I. Back, C. Frindt, D. Nohr // Am. J. Clin. Nutr. 2004. - Vol. 80.-P. 374-384.

109. Bass S. The differing tempo of growthin bone size, mass and density in girls is region-specific / S. Bass, P.D. Delmas, G. Pearce // J. Clin. Invest. 1999. -Vol. 104.-P. 795-804.

110. Bavister B.D. Culture of preimplantation embryos: facts and artifacts / B.D. Bavister//Hum. Reprod. Update.- 1995.-Vol. l.-P. 91 101.

111. Bavister B.O. Regulation of hamster embryo development in vitro by amino acids / B.O. Bavister, S.H. Kiernan. New York: Springer, 1993. —52 p.

112. Beier F. Cell-cycle control and the cartilage growth plate / F. Beier // J. Cell Physiol.-2005.-Vol. 202, № l.-P. 1-8.

113. Benson B.M. The effects of radial shock waves on the metabolism of equine cartilage explants in vitro / B.M. Benson, C.R! Byron, H. Pondenis // N Z Vet. J. 2007. - Vol. 55, №1.-P. 40-44.

114. Bentley G. A prospective randomised comparison of autologous chondrocyte implantation versus miosaicplasty for osteochondral defects in the knee / G.

115. Bentley, L.C. Biant, R.W. Carrington // J. Bone Joint. Surg. 2003. - Vol. 85.-P. 223-230.

116. Blanco F.J. Chondrocyte xenotransplantation for treatment of the localized articular cartilage defects: an animal model pig to rabbit / F.J. Blanco, M. Ramallal, E. Maneiro et al. // Arthr. Rheum. 1999. - Vol. 42. - 1085 p.

117. Blewis M.E. Microenvironment regulation of PRG4 phenotype of chondrocytes / M.E. Blewis, B.L. Schumacher, T.J. Klein // J. Orthop. Res. — 2007. Vol. 25, № 5. - P. 685-695.

118. Bloom E.T. National policies for xenotransplantation in the USA / E.T. Bloom // Xenotransplantation. 2007. - Vol. 14, № 4. - P. 345-346.

119. Blunk T. Differential effects of growth factors on tissue-engineered cartilage / T. Blunk, A.L. Sieminski, K.J. Gooch // Tissue Eng. 2002. - Vol. 8. - P. 73-84.

120. Bluteau G. VEGF and VEGF receptors are differentially expressed in chondrocytes / G. Bluteau, M. Julien, D. Magne // Bone. 2007. - Vol. 40, №3.-P. 568-576.

121. Boettiger D. Regulation of integrin a501 affinity during myogenic differentiation / D. Boettiger, M. Enomoto-Iwamoto, H.Y. Yoon // Dev. Biol.- 1995.-Vol. 169.-P. 261-272.

122. Bohensky J. HIF-1 regulation of chondrocyte apoptosis: induction of the autophagic pathway / J. Bohensky, I.M. Shapiro, S. Leshinsky // Autophagy.- 2007. Vol. 3, № 3. - P. 207-214.

123. Bonnefont-Rousselot D. Ferrous ion autoxidation and its chelation in iron-loaded human* liver HepG2 cells / D. Bonnefont-Rousselot // Free Radic. Biol. Med. 2002. - Vol. 32. - P. 84-92.

124. Bonnelye E. The orphan nuclear estrogen receptor-related receptor-alpha regulates cartilage formation in vitro: implication of Sox9 / E. Bonnelye, R.A. Zirngibl, P. Jurdic // Endocrinology. 2007. - Vol. 148, № 3. - P. 1195 -1205.

125. Boveris A. Determination of the production of superoxide radicals and hydrogen peroxide in mitochondria / A. Bbveris // Methods Enzymol. 1984. -Vol. 105.-P. 429-435.

126. Brandl N. Effects of chondroitin sulfate on the cellular metabolism / N. Brandl, J. Holzmann, R. Schabus // Adv. Pharmacol'. 2006. - Vol. 53. - P. 433-447.

127. Breinan H.A. Chondral defects in animal models: effects of selected repair procedures in canines / H.A. Breinan, H.P. Hsu, M. Spektor // Clir. Orthop. -2001.-Vol. 391.-P. 219-230.

128. Brighton C.T. Morphology and biochemistry of the growth plate / C.T. Brighton //Rheum. Dis. Clin. North Am. 1987. - Vol: 13. - P. 75 - 100.

129. Brighton. C.T. The growth plate / C.T. Brighton // Orthop. Chn. N. Am. -1984.-Vol. 15.-P: 571-595.

130. Brittberg M. Articular cartilage engineering with autologous chondrocyte transplantation. A review of recent developments / M. Brittberg, L. Peterson, E. Sjogren-Jansson // J. Bone Jt. Surg. Am. 2003. - Vol. 85. - P. 109-115.

131. Brittberg M. Rabbit articular cartilage defects treated with autologous cultured chondrocytes / M. Brittberg, A. Nilsson, A1. Lindahl // Clin. Orthop. 1996. - Vol. 326. - P. - 270-83.

132. Brittberg M. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autoloeous chondrocyte transplantation / M. Britberk, A. Lindahl, A. Nilsson // N. Engl. J. Med. 1994. - Vol. 331. - P. 889-894.

133. Brodkin K.R Chondrocyte phenotypes on different extracellular matrix monolayers / K.R. Brodkin, AJ. Garcia, M.E. Levinston // Biomaterials. -2004. Vol. 25. - P. 5929-5938.

134. Brown R.A. Collagenase and gelatinase production by calcifying growth plate chondrocytes / R. A. Brown, M. Kayser, B. McLaughlin // Exp. Cell Res. 1993. - Vol. 208. - P. 1-9.

135. Buckwalter J.A. Growth plate chondrocyte profiles and their orientation / J.A. Buckwalter, D. Mower, J. Schafer // J. Bone Jt. Surg. 1985. - Vol. 67. -P. 942-955.

136. Bueno E.M. Increased rate of chondrocyte aggregation in a wavy-walled bioreactor / E.M. Bueno, B. Bilgen, R.L. Carrier // Biotechnol. Bioeng. — 2004. Vol. 88. - P. 767-777.

137. Bullido R. Induction of aggregation in porcine lymphoid cells by antibodies to CD 46 / R. Bullido, F. Almaza'n, A. Ezquerra // Vet. Immunol. Immunopathol. 2000. - Vol. 31. - P. - 73-81.

138. Bunnell W.P. A study of the natural history of the idiopathic scoliosis before skeletal maturity / W.P. Bunnell // Spine. 1986. - Vol. 11, № 6. - P. 773776.

139. Burkus. J.A. Development of the distal femoral epiphysis: A microscopic morphological investigation of the zone of Ranvier / J. A. Burkus, J. A. Ogden // J. Pediatr. Orthop. 1984. - Vol. 4. - P. 661-668.

140. Buster J.E. Biologic end morphologic development of donated human ova recovered by nonsurgical uterine iavage / J.E. Buster, M. Bustillo // Am. J. Obstet. Gynecol. 1985. - Vol. 153. - 211 p.

141. Byers S. Structural changes in the large proteoglycan, aggrecan, in different zones of the ovine growth plate / S. Byers, J.C. Rooden, B.K. Foster // Calcif. Tissue Int. 1997. - Vol. 60.-P. 71-78.

142. Campoccia D. Quantitative assessment of the tissue response to films of hyaluronan / D. Campoccia, J.A. Hunt, P.J. Doherty // Biomaterials. 1996. -Vol. 17, № 10.-P. 963-975.

143. Carr A.C. Oxidation of LDL by myeloperoxidase and reactive nitrogen species: Reaction pathways and antioxidant protection / A.C. Carr, M.R. McCall, B. Frei // Arterioscler. Thromb. Vase. Biol. 2000. - Vol. 20. - P. 1716-1723.

144. Carr AJ. Wordsworth B.P. Segregation of structural collagen genes in adolescent idiopatic scoliosis / A J. Carr, D.J. Oglivier // Clin. Orthop. -1992. -Vol. 2741.-P. 305-310.

145. Carroll S.B. Endless forms: the evolution of gene regulation and morphological diversity /S.B. Carroll // Cell. 2000. - Vol. 101. - P. 577 -580.

146. Caumo F. Autologous chondrocyte implantation: prospective MRI evaluation with clinical correlation / F. Caumo, A. Russo, N. Faccioli // Article in English, Italian. Radiol. Med. (Torino). 2007. - Vol. 112, № 5. - P. 722 -731.

147. Chan V. A genetic locus for adolescent idiopathic scoliosis linked to chromosome 19pl 3.3 /V. Chan, G.C. Pong, K.D. Guk // Am. J. Genet. -2002. Vol. 71, № 2. - P. 401-406.

148. Chanlalit C. Autologous chondrocyte implantation for traumatic large cartilage defect / C. Chanlalit, C. Kasemkijwattanamd, V. Varavit //J. Med. Assoc. Thai. 2007. - Vol. 90, № 7. p. 1435-1442.

149. Charies I.G. Cloning, characterization and expression of cDNA encoding an inducible nitric oxide synthase from the human chondrocyte / I.G. Charies, R.M. Palmer, M.S. Hickery // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1993. - Vol. 90. -P. 11419-11423.

150. Chen C. Mechanisms of proteoglycan inhibition of hydroxyapatile growth / C. Chen, A.L. Boskey // Calcif. Tissue Int. 1985. - Vol. 37. - P. 395-400.

151. Chen H.C. A novel rotating-shaft bioreactor for two-phase cultivation of tissue engineered cartilage / H.C. Chen, H.P. Lee // Biotechnol. Prog. 2004. Vol. 20.-P. 1802-1809.

152. Chen W.Y. Functions of hyaluronan in wound repair / W.Y. Chen, G. Abatangelo // Wound Repair Regen. 1999. - Vol. 7, № 2. - P. 79-89.

153. Chen Y.J. Study on the effects of mechanical pressure to the ultrastructure and secretion ability of mandibular condylar chondrocytes / Y.J. Chen, M. Zhang, J.J.Wang // Rch. Oral Biol. 2007. - Vol. 52, № 2. - P. 173-181.

154. Cheung J.O. A Novel Cell Culture Model of Chondrocyte Differentiation During Mammalian Endochondral Ossification / J.O. Cheung, M.C. Hillarby, S. Ayad//J.Bone Miner. Res.-2001.-Voh 16.-P. 309-318.

155. Clegg P.D. Cell phenotypic variation in normal and damaged tendons / P.D. Clegg, S. Strassburg, RK. Smith // Int. J: Exp. Pathol. 2007. - Vol. 88, № 4. -P. 227-235.

156. Coates A. Glucose-free medium in human in vitro?fertilization and embryo transfer: a large-scale, prospective, randomized clinical trial:/ A. Coates, A.J. Rutherford, H. Hunter // Fertil Steril. 1999. - Vol. 72. - P. 229. .

157. Conrad E.U. Fractures and sprains / E.U. Conrad, M.C. Rang // Pediatr. Clin. N. Am. 1986. - Vol. 33. - P: 1523 - 1539.

158. Cooper J.A. Encapsulated chondrocyte response in a pulsatile flow bioreactor / J.A. Cooper, W.J. Li, L.O. Bailey // Acta. Biomater. 2007. - Vol. 3, № 1. -P.13-21.

159. Cornwell D.G. Fatty acid paradoxes in the control of cell proliferation: Prostaglandins, lipid peroxides, and cooxidation reactions / D.G. Cornwell, N. Morisaki // Free Radicals in Biology. Vol. 6. - 1984. - P. 96-149.

160. Cozzi E. An update on xenotransplantation / E. Cozzi, M. Seveso, S. Hutabba // Vet. Res. Commun. 2007. - Vol. 11. - P. 15-25.

161. Croucher L.J. Extracellular ATP and UTP stimulate cartilage proteoglycan and collagen accumulation in bovine articular chondrocyte pellet cultures /

162. J. Croucher, A. Crawford, P.V. Hatton // Biochim. Biophys. Ada. 2000.i1. Vol. 1502.-P. 297-306.

163. Cuervo L. Inhibition of calcium phosphate mineral growth by proteoglycan aggregate frantions in a synthetic lymph / L. Cuervo, J. Pita, D. Howell // Calcif. Tissue Res. 1973. - Vol. 13. - P. 1-10.

164. Cui Y.L. Biomimetic surface modification of poly (1-lactic acid) with chitosan and its effects on articular chondrocytes in vitro / Y.L. Cui, AD. Qi, WG. Liu et al. // Biomaterials. 2003. - Vol. 24. - P. 3859-3868.

165. Dawson T.M. Nitric oxide synthase and neuronal NADPH diaphorase are identical in brain and peripheral tissue / T.M. Dawson, D.S. Bredt, M. Fotui // Proc.Nat. Acad. Sci. USA. 1991. - Vol. 88.-P. 7797-7801.

166. De Bari C. Human periosteum-derived cells maintain phenotypic stability and chondrogenic potential throughout expansion regardless of donor age / C. De Bari, F. Dell'Accio // Arthr. Rheum. 2001. - Vol. 44. - P. 85-95.

167. Dell'Accio F. Molecular markers predictive of the capacity of expanded human articular chondrocytes to form stable cartilage in vivo / F. Dell'Accio, C. De Bari, FP. Luyten //Arthr. Rheum. 2001. - Vol. 44. - P. 1608-1619.

168. Domm C. Redifferentiation of dedifferentiated bovine articular chondrocytes in alginate culture under low oxygen tension / C. Domm, K. Christesen, B. Kurz // Osteoarthr. Cartil. 2002. - Vol. 10. - P. 13-22.

169. Donkelaar C.C. Distinct developmental changes in the distribution of calcium, phosphorus and sulphur during fetal growth-plate development /

170. C.C. Donkelaar, X.J. Janssen, A.M. Jong // J. Anat. 2007. - Vol. 210, № 2. -P. 186-194.

171. Ehrenhaft J.I. Development of the vertebral column as related to certain congenital and pathological and pathogenesis changes / J.I. Ehrenhaft // Surg. Gynec. Obstet. 1943. - Vol: LXXVI. -P: 282-292.

172. Emans P.J. A novel in vivo model to study endochondral bone formation; HIF-1 alpha activation and BMP expression / P:J. Emans, F. Spaapen, D.A. Surtel // Bone. 2007. - Vol. 40, № 2. - P. 409-418.

173. Erwin W.M; Nucleus pulposus notochord cells secrete connective tissue growth factor and up-regulate proteoglycan expression by intervertebral discchondrocytes / W.M. Erwin, K. Ashman, P. O'Donnel // Arthr. Rheum. -2006. Vol. 54, № 12. - P. 3728-3729.

174. Esposito F. Redox control of signal transduction, gene expression and cellular senescence / F. Esposito, R. Ammendola; R. Faraonio // Neurochem. Res. 2004. - Vol. 29. - P. 617-628.

175. Falasca G.F. Superoxide anion-production and phagocytosis of crystals by cultured endothelial cells / G.F. Falasca, A. Ramachandrila, K.A.'Kelley // Arthr. Rheum. 1993. - Vol. 36. - P. 105-116.

176. Fazzalari N.L. Quantuative analysis of trabecular morphogenesis in the human costochondral junction during the postnatal period in normal subjects / N. L. Fazzalari, A. Moore, S. Byers // Anat. Rec. 1997. - Vol. 248. - P. 112.

177. Finkel T. Oxidants, oxidative stress and the biology of ageing / T. Finkel, N. Holbrook // Nature. 2000. - Vol. 408. - P: 239-247.

178. Fioravanti A. In vitro effects of chondroitin sulfate / A. Fioravanti, G. CollodelV/ Adv. Pharmacol. 2006. - Vol. 53. - P. 449-465.

179. Flornan^ Y. Abnormalities of aggregation, thromboxane A2 -synthesis and 14c serotonin release in platelets of patients with idiopathic scoliosis / Y. Flornan, M. Liebergall, G. Robin // Spine. 1983. - № 8. - 236: p.

180. Fragonas E. Articular cartilage repair in rabbits by using suspensions of allogenic chondrocytes in alginate / E. Fragonas, M. Valente // Biomaterials. 2000. - Vol. 21. - P. 795-801.

181. Francis S.J. Application of chitosan-based polysaccharide biomaterials in cartilage tissue engineering: a review / S.J. Francis, W.T. Howard // Biomaterials. 2000. - Vol. 21. - P. 2589-2598.

182. Freed L.E. Principles of Tissue enginnering, 2-nd Edition / L.E. Freed, G. Vunjak-Novakovic. San Diego, C.A: Academic Press, 2000. - 231 p.

183. Fuentes-Boquete I. Pig chondrocyte xenoimplants for human chondral defect repair: an in vitro model /1. Fuentes-boquete, M. Lopesz-armada, E. Maneiro // Wound Rep. Reg. 2004. - Vol. 12. - P. - 4444-4452.

184. Fukai Т. Extracellular superoxide dismutase and cardiovascular disease / T. Fukai, R.J. Folz, U. Landmesser // Cardiovasc. Res. 2002. - Vol. 55 - P. 239-249.

185. Gardner D.K. Concentrations of nutrients in mouse oviduct fluid and their effects on embryo development and metabolism in vitro / D.K. Gardner, H.J. Leese // J. Reprod. Fertil. 1990. - Vol. 88. - 361. p.

186. Garimella R. Primary culture of rat growth plate chondrocytes: an in vitro model of growth plate histotype, matrix vesicle biogenesis and mineralization / R. Garimella, B.X. Camacho, J.B. Sipe // Bone. 2004. - Vol. 34, № 6. -P. 961-970.

187. Garret J.C. Fresh osteochondral allograft for treatment of defects in osteochondritis dissecans of the lateral femoral condyle in adults / J.C. Garret // Clin. Orthop. 1994. - Vol. 303. - P. 33-37.

188. Gehron-Robey P. The cellular biology and molecular biochemistry of bone formation / P. Gehron-Robey, P. Bianco, J.D. Termine. New York: Raven, 1992.-P. 241-263.

189. Gerstenfeld L.C. Gene expression and extracellular matrix ultrastructure of a mineralizing chondrocyte cell culture system / L.C. Gerstenfeld // J. Cell Biol.-1991.-Vol. 112.-P. 501-513.

190. Gibson G.J. Type X collagen synthesis by chick sternal cartilage and its relationship to endochondral development / G.J. Gibson, M.H. Flint // J. Cell Biol.- 1985.-Vol. 101.-P. 277-284.

191. Giovanini M.A. MAP 2 expression in the developing human fetal spinal cord following xenotransplantation / M.A. Giovanini, P.J. Reier, T.A. Eskin // Cell Transplant. 1997. - Vol. 6. - P. 339-346.

192. Glorieux F.H. Normative data for iliac bone histomorphometry in growing children / F.H. Glorieux, R. Travers, A. Taylor // Bone. 2000. - Vol. 26. -P. 103-109.

193. Greenwald R.A. Degradation of gyaluronic acid by polymorphonuclear leukocytes / R.A. Greenwald, A.S. Moak // Inflammation. 1986. - Vol. 10. -P. 15-30.

194. Grigolo B. Transplantation of chondrocytes seeded on a hyaluronan • derivative (Hyal. 11) into cartilage defects in rabbits / B. Grigolo, L. Roseti,

195. M. Fiorini, et. al. // Biomaterials. 2001. - Vol. 22. - P. 2417-2424.

196. Grogan S.P. Identification of markers to characterize and sort human articular chondrocytes with enhanced in vitro chondrogenic capacity / S.P. Grogan, A. Barbero, J. Diaz-Romero // Arthr. Rheum. 2007. - Vol. 56, № 2. - P. 586595.

197. Guilak F. Functional tissue engineering: the role of biomechanics in articular cartilage repair / F. Guilak, D.L. Butler, S.A. Goldstein // Clin. Orthop. — 2001. Vol. 391. - P. 295-305.

198. Guss K.A. Control of a genetic regulatory network by a selector gene / K.A Guss, C.E. Nelson, A. Hudson // Science. 2001. - Vol. 292. - P. 11641167.

199. Hail J.N. Apoptosis effector mechanisms: a requiem performed in different keys / J.N. Hail, B.Z. Carter, M. Konopleva // Apoptosis. 2006. - Vol. -11. -P. 889-904.

200. Heinecke J.W. Superoxide-mediated oxidation of low density lipoprotein by thiol / J.W. Heinecke 11 Oxy-Radicals in Molecular Biology and Pathology. -N.Y.: Liss. 1988. - P. 443-457.

201. Hemmings R. Human embryos produce transforming growth factors alpha activity and insulin-like growth factors II / R. Hemmings, J. Langlais, T. Falcone //Fertil Steril. 1992. - Vol. 58. - 101. p.

202. Hert J. Growth of the epiphyseal plate in circumference / J. Hert // Acta Anat. 1972. - Vol. 82. - P. 420-436.

203. Hilibrand A. The role of melatonin in the pathogenesis of adolescent idiopathic scoliosis / A. Hilibrand,1 L. Blakemore, R. Loder // Spine. 1996. -Vol. 21.-P. 1140-1146.

204. Hill K.S. Nitroblue tetrazolium (NBT) activity in human leucocytes after freezing / K.S. Hill, M. Kennedy, C. Achinders // Pathology. 1978. -Vol.10, № l.-P. 69-75.

205. Ho Y.S. Mice lacking catalase develop normally but show differential sensitivity to oxidant tissue injuiy / Y.S. Ho Y. Xiong, W. Ma et al. // J. Biol. Chem. 2004. - Vol. 279. - P. 32804-32812.

206. Hoogendam J1. Novel late response genes of PTHrP in chondrocytes / J. Hoogendam, H. Farih-Sips, E. Beek // Horm. Res. 2007. - Vol. 67, № 4. -P. 159- 170.

207. Howell D.S. The biology, chemistry and biochemistry of the mammalian growth plate / D.S. Howell, D.D. Dean. New York: Raven, 1992. - P. 313353.

208. Hsu S. Evaluation of the cellular adhesion and growth on biodegradable polymers using immortalized rat chondrocytes / S. Hsu, C. Tsai, C. Tang // Artif. Organs. 2002. - Vol: 26. - P. 647-658.

209. Hu J.C. Low-density cultures of bovine chondrocytes: effects of scaffold material-and culture system / J.C. Hu, K.A. Athanasiou // Biomaterials. -2005. Vol. 26. - P. 2001-2012.

210. Hunter S.G. Control of cartilage differentiation / S.G. Hunter, A.J. Caplan // Cartilage Ed. В. K. Hall. New York, 1983. - Vol. 2. - P. 87 - 119.

211. Hunziker E.B. Articular cartilage repair: basic science and clinical progress. A review of the current status. / E.B. Hunziker // Osteoarthr. Cartil. 2002. -Vol. 10.-P. 432-463.

212. Hunziker E.B. Physiological mechanisms adopted by chondrocytes in regulating longitudinal bone growth in rats / E.B. Hunzikerand, Schenk R. K. // J. Physiol. 1989. — Vol. 414. - P. 55 - 71.

213. Hunziker E.B. Quantitation of chondrocyte performance in growth plate cartilage during longitudinal bone growth / E.B. Hunziker, R.K. Schenk, L.M. Cruz-Orive // J. Bone Jt. Surg. 1987. - Vol. 69-A. - P. 162 - 173.

214. Hutchison M.R. Insulin-like growth factor-I and fibroblast growth factor, but not growth hormone, affect growth plate chondrocyte proliferation / M.R. Hutchison, M.H. Bassett, P.C. White // Endocrinology. 2007. - Vol. 148, №7.-P. 3122 -3130.

215. Hwang N.S. Response of zonal chondrocytes to extracellular matrix-hydrogels / N.S. Hwang, S. Varghese, H.J. Lee // FEBS Lett. 2007. - Vol. 581, №22.-P. 4172-4178.

216. Hwang S.G. Regulation of type II collagen expression by cyclin-dependent kinase 6, cyclin Dl, and p21 in articular chondrocytes / S.G. Hwang, S.M. Song, J.R. Kim // IUBMB Life. 2007. - Vol. 59, № 2. - P.90-98.

217. Hynes R.O. Integrins: bidirectional, allosteric signaling machines / R.O. Hynes // Cell. 2002. - Vol. 110. - P. 673-687.

218. Imoto E. Adhesion of a chondrocytic cell line (USAC) to fibronectin and its regulation by proteoglycan /Е. Imoto S. Kakuta M. Hori // J. Oral. Pathol. Med. 2002. - Vol. 31. - P. 35-44.

219. Iwamoto M. Hypertrophy and calcification of rabbit permanent chondrocytes in pelleted cultures: Synthesis of ALPase and 1,25-dihydroxy-cholecalciferol receptor / M. Iwamoto, K. Sato, K. Nakashima // Dev. Biol. -1989. Vol. 136. - P. 500-507.

220. Jakobsen R.B. An Analysis of the quality of cartilage repair studies / R.B. Jakobsen, L. Engebretsen, J.R. Slauterbeck // J. Bone Jt. Surg. 2005. - Vol. 23, №87.-P. 2232-2239.

221. Jiang Z. A polymorphism in the promoter region of catalase is associated with blood pressure levels / Z. Jiang, J.M. Akey, J. Shi et al. // Hum. Genet. -2001.-Vol. 109.-P. 95-98.

222. Jo H. The in vitro effects if dehydroepiandrosterone on human osteoarthritic chondrocytes / H. Jo, J.S. Park, E.M. Kim et al. // Osteoarthritis Cartilage. -2003.-Vol. 11.-P. 585-594.

223. Jobanputra P. Effectiveness of autologous chondrocyte transplantation for hyaline cartilage defects in knees: A rapid and systematic review / P. Jobanputra, D. Parry, A. Fry-Smith // Health Technol. Assess. 2001. - Vol. 5, № 11. -P. 41-57.

224. Jonathan M. Embryonik Patterning: To BMP or Not BMP, Thar Is the Question/М. Jonathan//Cell. 1997.-Vol. 89.-P. 171-174.

225. Jones A.R. Bioregulation of Iubricin expression by growth factors and cytokines / A.R. Jones, C.R. Flannery // Eur. Cell Mater. 2007. - Vol. 20, № 13.-P. 40-45.

226. Jones R.D. Mechanism of superoxide formation by neutrophils and other cell, types / R.D. Jones, J.T. Hancock, S.A. Jones // Biol. Chem. Hoppe-Seyler. -1992.-Vol. 373.-737. p.

227. Juctice C.M. Familial idiopatic scoliosis / C.M. Juctice, N.H. Miller, B. Marosy // Spine. 2002. - Vol. 15. - P. 589-594.

228. Junghanns H. Die Fehbildungen der Virbel-Korper / H. Junghanns // Arch. Orthop. Unfall. Chir. -1937. Vol. 38. - P. 1-24

229. Kalya S. Extracellular matrix changes regulate calcium crystal formation in articular cartilage / S. Kalya, A.K. Rosenthal // Curr. Opin. Rheumatol. -2005. Vol. 17, № 3. - P. 325-329.

230. Kamiyama К. Biodisposition characteristics of N-succinyl-chitosan and: glycol-chitosan in normal and tumor-bearing mice / K. Kamiyama, H. Onishi, Y.Machida //Biol. Pharm. Bull. 1999. - Vol. 22, № 2.-p. 179-186.

231. Kana R. Expression of actin isoforms in human auricular cartilage / R. Kana, P. Dundr, D. Tverdik // Folia Biol. (Praha). 2006. - Vol. 52, № 5. - P. 167172.

232. Kang R. Ex vivo gene transfer to chondrocytes in full-thickness articular cartilage defects a feasibility study / R. Kang, T. Marui, I. Nita // Cartilage. — 1997. Vol 5; - P. 139-143.

233. Kang S.W. Effect of chondrocyte passage number on histological aspects^of tissue-engineered cartilage / S.W. Kang, S.P. Yoo , B.S. Kim; // Biomed Mater. Eng. — 2007. — Vol. 17, № 5i — P: 269-276.,

234. Kember N.F. Quantitative histology of the human growth plate / N.F. Kember, H.A. Sissons // J. Bone Jt. Surg. 1976. - Vol. 58 - В. - P. 426435:

235. Kim;HJ. Potential predictive markers for proliferative capacity of cultured human articular chondrocytes: PCNA and p21 / H.J. Kim, S.R. Park, H.J. Park// Artificial Organs. 2005. - Vol. 29, №. 5. - P. 393-398.

236. Kimmel D.B. Quantitative histologic changes in the proximal tibial growth cartilage of aged female rats / D.B.' Kimmel // Cells Materials. —1991. — Vol. l.-P. 11-18.

237. Knight J.A. Review: Free radicals, antioxidants, and the immune system / J.A. Knight//Ann: Clin. Lab. Sci.-2000.-Vol. 30.-P. 145-158.

238. Kosher R.A. Caartilage / R.A. Kosher // Hall, New York. 19831- Vol. 1. -P. 58-85.

239. Krejci P.* Fibroblast growth factors 1, 2, 17, and 19 are the predominant FGF ligands expressed in human fetal growth plate cartilage / P. Krejci, D. Krakow, P.B. Mekikian // Pediatr. Res. 2007. - Vol: 61, № 3: -P. 267-272.

240. Kuhn J.L. Relationship between bone growth rate and hypertrophic chondrocyte volume in New Zealand white rabbits of varying ages / J.L. Kuhn, J.H. DeLacey, E.E. Leanellett II J. Orthop. Res. 1996. - Vol. 14. -P. 706-711.

241. Kvist A.J. Chondroitin sulfate perlecan enhances collagen fibril formation. Implications for perlecan chondrodysplasias: / A.J. Kvist, A.E. Johnson; M. Morgelin // J. Biol. Chem. 2006. - Vol. 281 , № 44. - P. 33127-33139.

242. Lahiji A. Chitosan supports the expression of extracellular matrix proteins in human osteoblasts and chondrocytes / A. Lahiji, A. Sohrabi, D.S. Hungerford // J. Biomed Mater. Res. 2000. - Vol. 51. - P. 586-595.

243. Laihia J.K. Lucigenin and linoleate enhanced chemiluminescent assay for superoxide dismutase activity / J.K. Laihia, C.T. Jansen, M. Ahotupa // Free Radic. Biol. Med. 1993.-Vol. 14.-P. 457-461.

244. Landar A. Nitric oxide and cell signaling; modulation of redox tone and protein modification / A. Landar, V.M. Darley-Usmar // Amino Acids. — 2003.-Vol. 25.-P. 313-321.

245. Lanotti J.P. Growth plate physiology and pathology / J.P. Lanotti // Orthop. Clm. N. Am.- 1990.-Vol. 21.-P. 1-17.

246. Latham K.E. Mechanisms and control of embryonic genome activation in mammalian embryos / K.E. Latham // Int. Rev. Cytol. 1999. - Vol. 193. — P. 71-124.

247. Lee J.E. Effects of a chitosan scaffold containing TGF-bl encapsulated chitosan microspheres on in vitro chondrocyte culture / J.E. Lee, S.E. Kim, I.C. Kwon // Artif. Organs. 2004 - Vol. 28, № 9. - P. 829-839.

248. Lee Y.A. Redifferentiation of dedifferentiated chondrocytes on chitosan membranes and involvement of PKCalpha and P38 MAP kinase / Y.A. Lee, S.S. Kang, S.H. Baek // Mol. Cells. 2007. - Vol. 24. - № 1. - P. 9-15.

249. Lefebvre V. Transcriptional control of chondrocyte fate and differentiation / V. Lefebvre, P. Smits // Birth, defects res. embryo today. 2005. - Vol. 75, №3.-P. 200-212.

250. Li Y. Repair of adult rat coiticospinal tract by transplants of olfactory ensheathing cells / Y. Li, P.M. Field, G. Raisman // Science. 1997. - Vol. 277.-P. 2000-2002.

251. Lighten A.D. Routine addition of human insulin-like growth factor-1 ligand could benefit clinical invitro fertilization culture / A.D. Lighten, G.E. Moore, R.M. Winston // Hum. Reprod. 1998. - Vol. 13. - P. 31-44.

252. Lin Z. The chondrocyte: biology and clinical application / Z. Lin, C. Willers, J . Xu //Tissue Eng. 2006; - Vol; 12, № 7. - P. 1971-19841

253. Liochev S.I; Copper zinc superoxide dismutase as a univalent NO-oxidoreductase and as adichlorofluorescin peroxidase' / S.I. Liochev, I. Fridovich // J. Biol. Chem. 2001. - Vol. 276 - P. 35253-35257. •

254. Lu J.X. Efects of chitosan on . rat knee cartilages II J.X. Lu, F. Prudhommeaux, A. Meunier // Biomaterials. 1999.- Vol. 2, № 20. - P. 1937-1944.

255. Malemud C.J. Matrix metalloproteinases: role in skeletal development and growth plate disorders / C.J. Malemud // Front Biosci. 2006. - Vol. 11. - P. 1702-1715.

256. Mao J.S. Structure and properties of bilayer chitosan-gelatin scaffolds / J;S. Mao, L.G. Zhao, Y.J. Yin // Biomaterials. 2003.-Vol. 24. -P. 1067-1074.

257. Maresca M. Generation of hydrogen peroxide in resting and activated platelets / M. Maresca, G. Colao, G. Leoncini // Gell Biochem. Funct. 1992. -Vol. 10-P. 79-85.

258. Martin I., Modulation of the mechanical properties of tissue engineered cartilage7 I. Martin, B. Obradovic, S. Treppo ct al. // Biorheology. 2000. Vol. 37.-P. 141-147.

259. Masatoshi J. Idiopathic scoliosis / J. Masatoshi, M. Shoheib, N. Voshinori // Spine. 2002. - Vol. 27, № 20.- P. 2220-2228:

260. Matsubara T. Increased- superoxide anion release from human endothelialcells in response to cytokines // T. Matsubara, M: Ziff// J. Immunol. 1986 —1. Vol. 137.-P. 3295-3298.

261. Matsusaki T. Expression of the cadherin-11 gene is a discriminative factor between articular and growth plate chondrocytes / T. Matsusaki, T. Aoyama, K. Nishijo // Osteoarthritis Cartilage: -2006. Vol. 14, № 4. - P. 353-366.

262. Mayer B. Biochemistry and molecular pharmacology of nitric oxide synthases / В: Mayer. Ed: Vincent S; London: Acadi Press, 1995: — P. 2142

263. Min B.H. The fate of implanted autologous chondrocytes in regenerated articular cartilage / B.H. Min, J.I. Woo, W.H. Kim // Proc. Inst. Mech. Eng. -2007. Vol. 221, № 5. - P. 461-465.

264. Minas T. Current concepts in the treatment of articular cartilage defects / T. Minas, S. Nehrer// Orthopedics. 1997. - Vol. 20. - P. 525-538.

265. Moilanen E. Nitric oxide in inflammation and immune response / E. Moilanen, H. Vapaatalo // Ann. Med. 1995. - Vol. 27. - P. 359-367.

266. Mouw J.K. Dynamic compression regulates the expression and synthesis of chondrocyte-specific matrix molecules in bone marrow stromal cells / J.K. Mouw, J.T. Connelly, C.G. Wilson // Stem Cells. 2007. - Vol. 25, № 3. -P.655-663.

267. Nakamura Y. Xenotransplantation of long-term-cultured swine bone marrow-derived mesenchymal stem cells / Y. Nakamura, X. Wang, C. Xu // Stem Cells. 2007. - Vol. 25, № 3. - P. 612-620.

268. Nehrer S. Canine chondrocytes seeded in type I and type II collagen implants investigated in vitro / S. Nehrer, H.A. Breinan, A.J Ramappa // Biomed. Mater. Res. 1997. - Vol. 38. - P. 95-104.

269. Nemoto S. Role of mitochondrial oxidants as regulators of cellular metabolism / S. Nemoto, K. Takeda, Z.X. Yu // Mol. Cell Biol. 2000. -Vol. 20. - P. 7311-7318.

270. Nicolae C. Abnormal collagen fibrils in cartilage of matrilin-l/matrilin-3-deficient mice / C. Nicolae, Y.P. Ко, N. Miosge // J. Biol. Chem. 2007. -27. - Vol: 282, № 30. - P. 22163-22175.

271. Nurminsky D. Regulation of chondrocyte differentiation by actin-severing protein adseverin / D. Nurminsky, C. Magee, L. Faverman // Dev. Biol. — 2007. Vol. 302, № 2. - P. 427-437.

272. Nuttall J.D. Histomorphometric analysis of the tibial growth plate in a feline model of mucopolysaccharidosis type VI / J.D. Nuttall, L.K. Brumfield, N.L. Fazzalari // Calcif. Tissue Int. 1999. - Vol. 65. - P. 47-52.

273. O'Driscoll S.W. The chondrogenic potential of periosteum decreases with age / S.W. O'Driscoll, D.B. Saris // J. Orthop. Res. 2001. - Vol. 19. - P. 95103.

274. O'Driscoll S.W. The importance of procedure specific training in harvesting periosteum for chondrogenesis / S.W. O'Driscoll, J.S. Fitzsimmons // Clin.

275. Orthop. 2000. - Vol. 380. - P. 269-278.i ,

276. O'Driscoll S.W. The role of periosteum in cartilage repair / S.W. O'Driscoll, J.S. Fitzsimmons // Clin. Orthop. 2001. - Vol. 391. - P. 190-207.

277. Pagano P.J. An NADPH oxidase superoxide-generating system in the rabbit aorta / P.J. Pagano, Y. Ito, K. Tornheiem // Am. J. Physiol. 1995. - Vol. 37. -P. 2274-2280.

278. Palmer R.M. Induction of nitric oxide synthase in human chondrocytes / R.M. Palmer, M.S. Hickery, I.G. Charies // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. - Vol. 193. - P. 398-405.

279. Paria B.C. Preimplantation embryo development in vitro: cooperative interactions among embryos and the role of growth factors / B.C. Paria, S. K. Dey // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1990. - Vol. 87. - 4756. p.

280. Pei M. Growth factors for sequential cellular de- and re-differentiation in tissue engineering / M. Pei, J. Seidel, G. Vunjak-Novakovic // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2002. - Vol. 294. - P. 149-154.

281. Peterson L. Two- to 9 year outcome after autologous chondrocyte transplantation of the knee / L. Peterson, T. Minas, M. Brittberg // Clin. Orthop. 2000. - Vol. 374. - P. 212-234.

282. Pineda S. A semiquantitative scale for histologic grading of articular cartilage repair / S. Pineda, A. Pollack, S. Stevenson // Acta. Anat. 1992. - Vol. 143. -P. 335-340.

283. Poli G. Oxidative stress and cell signaling / G. Poli, G. Leonarduzzi, F. Biasi // Current Med. Chem. 2004. - Vol. 11. - P. 1163-1182.

284. Poole C.A. Chondrons. The chondrocyte and its pericellular microenvironment / C.A. Poole // Articular cartilage and osteoarhtritis. Ed. New York: Raven Press, 1992. - P. 201-221.'

285. Porter C.M. Characterization and expansion of baboon CD4+CD25+ Treg cells for potential use in a non-human primate xenotransplantation model / C.M. Porter, J.A. Horvath-Arcidiacono, A.K. Singh // Xenotransplantation. -2007. Vol. 14, № 4. - P. 298-308.

286. Pourquie О. The chick embryo: a leading model in somitogenesis studies / O. Pourquie I I Mechanisms of development. -2004. Vol. 121.-P. 1069-1079.

287. Prise P.A. Osteocalcin / P.A. Prise // Bone Mineral Res. Ann. 1983. - Vol. l.-P. 157-190.

288. Procedure I. Articular cartilage repair using tissue engineering technique— novel approach with minimally / I. Procedure, N. Adachi, H. Nobuto // Artificial Organs. 2004. - Vol. 28, No. 1. - P. 28-32.

289. Provot S. Molecular mechanisms of endochondral bone development / S. Provot, E. Schipani // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2005. - Vol. 328, №3.-P. 658-665.

290. Radin E.L. Role of subchondral bone in the initiation and progression of cartilage damage / E.L. Radin, R.M. Rose // Clin. Orthop. Rel. Res. 1986. -Vol. 213.-P. 34-40.

291. Reid D.L. Cell attachment, collagen binding, and receptor analysis on bovineiarticular chondrocytes / D.L. Reid, M.B. Aydelotte, J. Mollenhauer // J. Orthop. Res.-2000.-Vol. 18.-P. 364-373.

292. Roach H.I. The phenotypic switch from chondrocytes to bone-forming cells involves asymmetric cell division and apoptosis / H.I. Roach, J. Erenpreisa // Connective Tissue Research. 1996. - Vol. 5. - P. 85-91.

293. Roberts S. Matrix turnover in human cartilage repair tissue in autologous chondrocyte implantation / S. Roberts, A.P. Hollander, B. Caterson, J. Menage // Arthritis Rheum. 2001. - Vol. 44. - P. 2586-2598.

294. Rodriguez J.I. Human growth plate development in the fetal and neonatal period / J.L Rodriguez , S. Razquin , J. Palacios // J. Orthop. Res. 1992. -Vol. 10, № i.p. 62-71.

295. Rosenthal A.K. Osteopontin promotes pathologic mineralization in articular cartilage / A.K. Rosenthal, C.M. Gohr, M. Uzuki // Matrix Biol. 2007. -Vol. 26, №2.-P. 96-105.

296. Roseti L. Induction of original phenotype of human immortalized chondrocytes: a quantitative gene expression analysis / L. Roseti, A. Facchini, L. De Franceschi // Int. J. Mol. Med. 2007. - Vol. 19, № 1. - P. 89-96.

297. Roy K. Oral gene delivery with chitosan DNA nanoparticles generates immunologic protection in a murine model of peanut allergy / K. Roy, H.Q. Mao // Huang Nat. Med. 1999. - Vol. 5, № 4. - P. 387-391.

298. Ruegsegger P. microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture / P. Ruegsegger, B. Koller, R.A. Muller // Calcif. Tissue Int. 1996. - Vol. 58. - P. 24-29.

299. Russlies M.A. Cell-seeded biocomposite for cartilage repair / M.A. Russlies, P. Behrens, L. Wuensch // Ann. Anat. 2002. - Vol. 184. - P. 317 - 323.

300. Russlies M.A. Periosteum stimulates subshondral bone densification in autologous chondrocyte transplantation in a sheep model / M.A. Russlies, P. Behrens, E. Ehlers // Cell. Tissue Res. 2005. - Vol. 319. - P. 133-142.

301. Sandstrom P.A. Lipid hydroperoxides induce apoptosis in T cells displaying a HIV-associated glutathione peroxidase deficiency // P.A. Sandstrom, P.W. Tebbey, S.V. Cleave // J. Biol. Chem. 1994. - Vol. 269. - P. 798-801.

302. Sandya S. Parallel changes in fibronectin and alpha5betal integrin in articular cartilage in type II collagen-induced arthritis / S. Sandya, M.A. Achan, P.R. Sudhakaran // Indian J. Biochem Biophys. 2007. - Vol. 44, № 1. - P. 1418.

303. Sanz E. Formation of cartilage in vivo with immobilized autologous rabbit auricular cultured chondrocytes in collagen matrices / E. Sanz, L. Penas, J.L. Lequerica // Plast. Reconstr. Surg. 2007. - Vol. 119, № 6. - P.1707-1713.

304. Schneider N. Oxygen consumption of equine articular chondrocytes: Influence of applied oxygen tension and glucose concentration during culture / N. Schneider, A. Mouithys-Mickalad, J.P. Lejeune // Cell Biol. Int. 2007. -Vol. 31, №9.-P. 878-886.

305. Schulze-Tanzil G. Redifferentiation of dedifferentiated human chondrocytes in high-density cultures / G. Schulze-Tanzil, P. Souza, V. Castrejon // Cell Tissue Res. 2002. - Vol. 308, № 3. - P. 371-379.

306. Sechriest V.F. GAG-augmented polysachharide hydrogel: a novel biocompatible and biodegrable material to support chondrogenesis / V.F. Sechriest, Y.J. Miao // J. Biomed Mater. Res. 2000. - Vol. 49. - P. 534541.

307. Sevastic J. A. The thoracospinal concept of the etiopathogenesis of idiopathic scoliosis / J.A. Sevastic // State of the Art Reviews. Spine: Etiology of adolescent idiopathic scoliosis. Hanley & Belfus Inc. — 2000. Vol. 23. P. 3991-4000.

308. Shands A.R. Congenital deformities of the spine. An analysis of the roentgeno grams of 700 children / A.R. Shands, W.D. Bundens // Bull. Hosp. Joint Dis.-1956.-Vol. 17.-P. 110-133.

309. Shu X.Z. Chitosan/gelatin microspheres prepared by modified emulsification and ionotropic gelation / X.Z. Shu, K.J. Zuu // J. Microencapsul. 2001. -Vol. 18.-P. 237-245.

310. Shu X.Z. Controlled drug release properties of ionically cross-linked chitosan beads: the influence of anion structure / X.Z. Shu, K.J. Zhu // Int. J. Pharm. -2002. Vol. 233. - P. 217-225.

311. Sies H. Oxidative stress From basic research to clinical application / H. Sies //Am. J. Med. - 1991. - Vol. 91, Suppl. 3C. - P. 31-38.

312. Sims N.R. Mitochondrial glutathione: a modulator of brain cell death / N.R.

313. Sims, M. Nilsson, H. Muyderman // J. Bioenerg. Biomembr. 2004. - Vol. 36.-P. 329-333.

314. Simsa S. Endochondral ossification process of the turkey (Meleagris gallopavo) during embryonic and juvenile development / S. Simsa, E.M. Oman//Poult. Sci.-2007.-Vol. 86, №3.-P. 565-571.

315. Smits P. Sox5 and Sox6 are needed to develop and maintain source, columnar, and hypertrophic chondrocytes in the cartilage growth plate / P. Smits, P. Dy, S. Mitra // J. Cell Biol. 2004. - Vol. 164, № 5. - P. 747-758.

316. Son B.K. Mechanism of vascular calcification / B.K. Son, M. Akishita // Clin. Calcium. 2007. - Vol. 17, № 3. - P. 319-324.

317. Song B. Development of the post-natal growth plate requires intraflagellar transport proteins / B. Song, CJ. Haycraft, H.S. Seo // Dev. Biol. — 2007. — Vol. 305, № l.-P. 202-216.

318. SpecchiaN. Cytokines and growth factors in the protruded intervertebral disc of the lumbar spine / N. Specchia, A. Pagnotta, A. Toesca // Eur. Spine J. — 2002.-Vol. 11.-P. 1450-151.

319. Steeves Т.Е. Temporal and differential effects of amino acids on bovine embryo development in culture / Т.Е. Steeves, D.K. Gardner // Biol. Reprod. 1999.-Vol. 61.-P. 731.

320. Stern R. Hyaluronic acid and skin / R. Stern, G.I. Frost, S. Shuster // Cosm &Toil.-1998.-Vol. 113.-P. 43-48.

321. Stokes D.G. Assessment of the gene expression of differentiated and dedifferentiated human fetal chondrocytes by microarray analysis / D.G. Stokes, G. Liu, IB. Coimbra // Arthr. Rheum. 2002. - Vol. 46. - P. 404419.

322. Sung L.Y. Modulation of chondrocyte phenotype via baculovirus-mediated growth factor expression / L.Y. Sung, W.H. Lo, H.Y. Chiu // Biomaterials. -2007. Vol. 28, № 23. - P. 3437-3447.

323. Suzuki A. The metabolism of hyaluronan in cultured rabbit growth plate chondrocytes during differentiation / A. Suzuki, K. Tanimoto, S. Ohno // Biochim. Biophys. Acta. -2005. Vol. 1743, № 1 - 2. - P. 57-63.

324. Tachibana H. Effects of cytokines on the production of nitric oxide in a chondrogenic cell line established from human osteogenic sarcoma / H. Tachibana S. Kakuta, K. Yagami // Oral Dis. 2000. - Vol. 6. - P. 303-309.

325. Takahashi T. Bone morphogenetic protein-2 and -9 regulate the interaction of insulin-like growth factor-I with growth plate chondrocytes / T. Takahashi, E.A. Morris, S.B. Trippel // Int. J. Mol. Med. 2007. - Vol. 20, № 1. - P. 5357.

326. Tanaka T. Significance of congenital vertebral anomalies and their classification / T. Tanaka, P.M. Tsou, A. Jau // Clin. Orthop. -1980. Vol. 152.-P. 211-232.

327. Tanaka T. The pathogenesis of congenital vertebral malformations. A study based on observations made in 11 human embryos and fetuses / T. Tanaka, H.K. Uhthoff // Acta. Orthop. Scand. 1981. - Vol. 52. - P. 331-351.

328. Taskiran D. Nitric oxide mediates suppression of cartilage proteteoglycan synthesis by interleukin-1 / D. Taskiran, M. Stefanovic-Racic, H. Georgescu //Biochem. Biophys. Res. Commun. 1994. - Vol. 200. - P. 142-148.

329. Tavella S. Regulated expression of fibronectin, laminin and related integrin receptors during the early chondrocyte differentiation / S. Tavella, G. Bellese, P. Castagnola // J. Cell Si. 1997. - Vol. 110. - P. 2261 -2270.

330. Temenoff J.S. Review: tissue engineering for regeneration of articular cartilage / J.S. Temenoff, A.G. Mikos // Biomaterials. 2000. - Vol. 21. - P. 431-440.

331. Tsou P.M. Embryology of congenital kyphosis / P.M. Tsou // Clin. Orthop. — 1977.-Vol. 18.-P. 128-134.

332. Uebelhart D. Chondroitin sulfate as a structure-modifying agent / D. Uebelhart, R. Knols, E.D. Bruin // Adv. Pharmacol. 2006. - Vol. 53. - P. 475-488.

333. Ueno H. Evaluation effects of chitosan for the extracellular matrix production by fibroblasts and the growth factors production by macrophages / H. Ueno, F. Nakamura, M. Murakami et al. // Biomaterials. 2001. - Vol. 22. - P. 2125-2130.

334. Ushio-Fukai M. Novel role of gp91phox-containing NAD (P)H oxidase in< vascular endothelial growth factor-induced signaling and angiogenesis / M. Ushio-Fukai, Y. Tang, T. Fukai // Circ. Res. 2002. - Vol. 91. - P. 11601167.

335. Valentine J.S. Oxidant and antioxidant levels in preterm newborns with idiopathic hyperbilirubinaemia/ J.S. Valentine, D.L. Wertz //J. Paediatr. Child. Health. 2004. - Vol. 40. - P. 633-637.

336. Vasara A.I. Subchondral bone reaction associated with chondral defect and attempted cartilage repair in goats / A.I. Vasara, M.M. Hyttininen, M.J. Lammi // Calcif. Tissue Int. 2004. - Vol. 74. - P.107-114.

337. Vortkamp A. Recapitulation of signals regulating embryonic bone formation during postnatal growth and fracture repair / A. Vortkamp, S. Pathi // Mech. Dev. 1998. - Vol. 71. - P. 65-76.

338. Wang H. Apoptosis induced by NO via phosphorylation of p38 МАРК that stimulates NF-kappaB, p53 and caspase-3 activation in rabbit articular chondrocytes / H. Wang, Z. Wang, J. Chen // Cell Biol. Int. 2007. - Vol. 31, № 9. — P.1027-1035.

339. Ward C. Induction, of human neutrophil apoptosis by nitric oxide donors: evidence for a caspase-dependent, cyclic-GMP-independent, mechanism / C. Ward, Т.Н., Wong* J. Murray // Biochem. Pharmacol. 2000. - Vol. 59. - P. 305-314.

340. Weinert B.T. Physiology of Aging. Invited Review: Theories of aging / B.T. Weinert, S.T. Paola // J. Appl. Physiol.-2003.-Vol. 95.-P. 1706-1716.

341. Williams R.M. Solute transport,in growth plate cartilage: in vitro andan vivo* / R.M: Williams, W.R. Zipfel, M.L. Tinsley // Biophys J. 2007. - Vol. 193, № 3. - P.1039-1050.

342. Wimmer M:A. Tribology approach to the engineering and study of articular cartilage / M.A. Wimmer, S. Grad, Т. Каир // Tissue Eng. 2004. - Vol. 10. -P. 1436-1445.

343. Wise C.A. Localization of sucseptibility of fumilion idio pathic scoliosis / C.A: Wise, R. Barnes, J. Gillum // Spine. -2000. Vol. 15. P. 2372-2380.

344. Woods A. Regulation of chondrocyte differentiation by the actin cytoskeleton and adhesive interactions / A. Woods, G. Wang, F. Beier // J. Cell" Physiol. -2007.-Vol. 213, № 1.-P.1-8.

345. Wu G.J. Nitric oxide from both exogenous and endogenous sources activates mitochondria-dependent events and induces insults to human chondrocytes / G.J. Wu, T.G. Chen, H.C. Chang // J. Cell Biochem. 2007. - Vol. 101, № 6. -P. 1520-1531.

346. Wu Y.J. Creation of tissue engineered cartilage with internal support // Y.J. Wu , H. Jiang , G.D. Zhou // Article in Chinese. 2007. - Vol. 23, № 4. - P. 328-331.

347. Xu K. Cartilage oligomeric matrix protein associates with granulin-epithelin precursor (GEP) and potentiates GEP-stimulated chondrocyte proliferation / K. Xu, Y. Zhang, K. Ilalov // J. Biol. Chem. 2007. - Vol. 282, № 15. - P. 11347-11355.

348. Yagami K. Establishment of cell line with phenotypes of chondrocyte from a human osteogenic sarcoma of mandible / K. Yagami, S. Kakuta H. Tachibana // J. Oral Pathol. Med. 2000. Vol. 29. - P. 321-330.

349. Yan J. Rabbit articular chondrocytes seeded on collagen-chitosan-GAG scaffold for cartilage tissue engineering in vivo / J. Yan , N. Qi, Q. Zhang // Art. Cells Blood Sub. Immobil. Biotechnol. 2007. - Vol. 35, № 4. - P. 333344.

350. Yang X. Metallothionein prolongs survival and antagonizes senescence associated cardiomyocyte diastolic dysfunction: role of oxidative stress / X. Yang, T.A. Doser, C.X. Fang // FASEB J. 2006. - Vol. 20. - P. 260-270.

351. Yasuda T. Possible involvement of RGD (Arg-Gly-Asp)-containing extracellular matrix protein in rat growth plate chondrocyte differentiation in culture / T. Yasuda, K. Shimizu, Y. Nakagawa // J. Bone Miner. Res. 1996. Vol. 11.-P. 1430-1437.

352. Yessoufou A. Antioxidant status in alcohol-related diabetes mellitus in Beninese subjects / A. Yessoufou, K. Moutairou, A. Girard // Cell Mol. Biol. -2005.-Vol. 51, Suppl.-P. 849-858.

353. Yokoyama T. High glucose concentration induces elevated expression of antioxidant and proteolytic enzymes in cultured human retinal pigment epithelial cells / T. Yokoyama, K. Yamane, A. Minamoto // Exp. Eye Res. 2006. — Vol. 83.-P. 602-609.

354. Yoshida M. Combined effect of vitamin E and insulin on cataracts of diabetic rats fed a high cholesterol diet / M. Yoshida, H. Kimura, K. Kyuki // Biol. Pharm. Bull. 2004. - Vol. 27. - P. 338-344.

355. Zakany R. Oxidative stress-induced poly(ADP-ribosyl)ation in chick limb bud-derived chondrocytes / R. Zakany, E. Bakondi, T. Juhasz // Int. J. Mol. Med. 2007. - Vol. 19, № 4. - P. 597-605.

356. Zaucke F. Cartilage oligomeric matrix protein (COMP) and collagen IX are sensitive markers for the differentiation state of articular primary chondrocytes / F. Zaucke, R. Dinser, P. Maurer // Biochem. J. 2001. - Vol. 358.-P. 17-24.

357. Zetterberg C. Morphology of the paravertebral muscles in adolescent idiopathic scoliosis / C. Zetterberg, A. Aniansson, G. Grimby // Spine. —1983. -Vol. 8.-457 p.

358. Zhang Y. Microarray analysis of dedifferentiation related gene expression of human chondrocytes cultured in vitro / Y. Zhang, G. Chai, W. Liu // Article in Chinese. 2007. - Vol. 23, № 4. - P. 331-334.

359. Zhang Y. Versican modulates embryonic chondrocyte morphology via the epidermal growth factor-like motifs in G3 / Y. Zhang, Y. Wu, L. Cao et al. // Exp. Cell Res. 2001. - Vol. 263. - P. 33-42.

360. Zhu F. Histomorphometric study of the spinal growth plates in idiopathic scoliosis and congenital scoliosis / F. Zhu, Y. Qiu, H.Y. Yeung // Pediatrlnt. 2006. - Vol. 48, № 6. - P. 591-598.