Молекулярно-биологические характеристики полевых изолятов и аттенуированных штаммов вируса бешенства

Метлин, Артем Евгеньевич

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Молекулярно-биологические характеристики полевых изолятов и аттенуированных штаммов вируса бешенства

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Метлин, Артем Евгеньевич Владимир 2004 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Молекулярно-биологические характеристики полевых изолятов и аттенуированных штаммов вируса бешенства

На правах рукописи

МЕТЛИН Артем Евгеньевич

МОЛЕКУЛЯРНО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ ПОЛЕВЫХ ИЗОЛЯТОВ И АТТЕНУИРОВАННЫХ ШТАММОВ ВИРУСА БЕШЕНСТВА

16.00.03 «Ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2004 г.

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

Научный руководитель - доктор биологических наук, профессор

РЫБАКОВ Сергей Сергеевич

Официальные оппоненты - доктор ветеринарных наук, профессор

Ведущая организация: НГУ «Всероссийский институт экспериментальной ветеринарии им. Я.Р. Коваленко» ( г. Москва).

заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, г. Владимир, п. Юрьевец.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

РАХМАНОВ Анатолий Михайлович

(ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», г. Владимир);

-доктор ветеринарных наук НЕДОСЕКОВ Виталий Владимирович (ФГУ «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов», г. Москва).

Защита диссертации состоится «

2005 г. в 1000 часов на

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

Г.М. Семенова

4903?- 1

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. Бешенство - это широко распространенное инфекционное заболевание теплокровных животных и человека, которое проявляется расстройствами функции центральной нервной системы, параличами и энцефаломиелитом. Оно регистрируется на территории более 80 стран мира, в большинстве из которых, в том числе и в России, в последние годы отмечается постоянный рост количества случаев этой болезни (A.B. Зайковская и др., 2004; Rabies bulletin Europe, 2003, 2004).

Вирус бешенства принадлежит к порядку Mononegavirales, семейству Rhabdoviridae, которое включает, по крайней мере, три рода вирусов животных: Lyssavirus, Ephemerovirus и Vesiculovirus (N. Tordo et al., 1988).

Бешенство входит в пятёрку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб, который складывается из потерь в результате падежа животных, затрат на проведение карантинных и профилактических мероприятий, на отлов бродячих собак и кошек, регулирование численности диких хищников, а также на проведение диагностических исследований (И.П. Арутюнова, 2000). Большие средства расходуются на постэкспозиционное лечение людей, имевших контакт с больными животными.

По данным ВОЗ, ежегодно в мире от бешенства умирает от 35000 до 50000 человек (Rabies bulletin Europe, 1999). В связи с тем, что бешенство является летальной инфекцией, и имеет важное социальное значение, необходима точная и своевременная диагностика этой болезни, особенно в случае опасности передачи бешенства человеку. В России для диагностики бешенства используются методы, которые имеют некоторые недостатки. В частности, постановка биопробы на мышах может занимать до 30 дней.

Для борьбы с бешенством в дикой природе разработаны и применяются оральные антирабические вирусвакцины (К.Н. Груздев и В.В. Недосеков 2001; А.З. Равилов и др., 2000; В.И. Жестерев ц- О.Г_Лаптева, 2004). Однако,

¡■ОС. НАЦИОг!/! i бКБЛМОГСКА С Петербург ___03 WOJur

некоторые авторы высказывают опасения, связанные с наличием остаточной патогенпости аттенуированных вакцинных штаммов вируса бешенства (Р. Pastoret et al., 1999; A. Wandeler, 2000; B.C. Иванов, 2000). В связи с этим, немаловажным является изучение молекулярно-биологических характеристик вакцинных штаммов вируса бешенства и полевых изолятов, циркулирующих на территории России, с целью разработки методов, позволяющих дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса бешенства. Для этих целей могут быть использованы ГТЦР, нуклеотидное секвенирование и моноклональные антитела (МКА). С помощью указанных методов можно проводить генотипирование полевых изолятов вируса бешенства, идентифицировать различные антигенные варианты и дифференцировать их от вакцинных штаммов (N. Tordo et al., 1988, 1996; J. Cox et al., 1992; S. NadinDavis et al., 2000; B.B. Недосеков и др., 2002). Благодаря использованию нуклеотидного секвенирования, было выявлено несколько новых генотипов вируса бешенства (Y. Arai et al., 2003; A. Botvinkin et al., 2003).

Таким образом, актуальной задачей является усовершенствование существующих методов лабораторной диагностики, а также разработка современных методов, на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования, позволяющих выявлять и дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса бешенства. Существенным моментом в борьбе и профилактике бешенства является необходимость совершенствования методов выявления антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных с целью постоянного контроля эффективности и безопасности антирабических вакцин.

Цель и задачи исследований. Основной целью работы являлось сравнительное изучение молекулярно-биологических характеристик полевых изолятов и аттенуированных штаммов вируса бешенства и оценка оральных антирабических вирусвакцин, приготовленных из штаммов РВ-97 и SAD В19.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить антирабический флюоресцирующий глобулин, пригодный для первичного отбора изолятов вируса, с целью создания их коллекции и разработки набора для диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции.

2. Изучить в сравнительном аспекте антигенные свойства полевых изолятов и вакцинных штаммов (РВ-97, SAD В19, "Овечий") вируса бешенства с использованием панели моноклональных антител.

3. Провести анализ последовательностей нуклеотидов фрагментов N-, G-гена и vjz-региона полевых изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии, и G-гена вакцинного штамма РВ-97 вируса бешенства.

4. Создать банк данных нуклеотидных последовательностей генома полевых изолятов вируса бешенства, циркулирующих на территории России.

5. Сравнить на лисицах иммуногенность и безвредность оральных антирабических вакцин, приготовленных из штамма РВ-97 (вирусвакцина для оральной иммунизации диких плотоядных животных против бешенства "Синраб", Россия) и из штамма SAD В19 (живая антирабическая вакцина "Фуксорал" для оральной иммунизации диких животных, Германия).

Научная новизна работы. Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

• Изучена генетическая гетерогенность и антигенность изолятов и вакцинных штаммов вируса бешенства с помощью ПЦР, нуклеотидного секвенирования и моноклональных антител.

• Впервые определена нуклеотидная последовательность фрагментов N-, G-генов и \|/-региона 24 полевых изолятов вируса бешенства,

выделенных на территории России в 2001-2004 гг., и 2 вакцинных штаммов вируса бешенства, а также проведено сравнение полученных последовательностей с опубликованными в EMBL данными по первичной структуре различных изолятов и штаммов вируса бешенства.

• Впервые определена нуклеотидная последовательность G-гена и аминокислотная последовательность гликопротеина вакцинного штамма РВ-97 вируса бешенства.

• Дана экспериментальная оценка иммуногенности и безвредности для лисиц оральных антирабических вирусвакцин, приготовленных из штамма РВ-97 ("Синраб", Россия) и штамма SAD В19 ("Фуксорал", Германия).

Практическая значимость работы. Результаты проведенных исследований использованы при разработке следующих нормативно-технических документов:

• «Методические указания по отбору проб мозга для диагностики бешенства и сывороток крови с целью определения титра антител», утвержденные руководителем Департамента ветеринарии Минсельхоза России 03.04.2001.

• Комплект нормативно-технической документации на набор для диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции: ТУ, временная инструкция, методические рекомендации, утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» 20.11.2004;

• «Методические указания по применению реакции подавления иммунофлюоресценции (РГТИФ) для выявления антител к вирусу бешенства», утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» 10.01.2003.

Кроме того, создан банк данных нуклеотидных последовательностей фрагментов N-гена, G-гена и \|/-региона 24 изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии, который

используется для идентификации и дифференциации вновь выделяемых изолятов вируса бешенства. Нуклеотидная последовательность в-гена штамма РВ-97 используется для сравнения ее с другими вакцинными штаммами и полевыми изолятами вируса бешенства.

Показана иммуногенность и безвредность для лисиц оральной антирабической вирусвакцины "Синраб", производящейся в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» из штамма РВ-97.

Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.

Апробация работы. Результаты, полученные в ходе подготовки диссертации, доложены и опубликованы в материалах научных конференций: "Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС. Крейтцфельда-Якоба и другие прионные болезни, листериоз, болезнь Ауески. болезнь Тешена" (г. Покров, ВНИИВВиМ, 2001); "Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей" (г. Покров, ВНИИВВиМ, 2002 г.): "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных" (г. Владимир. ФГУ ВНИИЗЖ, 2003 г.); "Профилактика бешенства животных и заразных болезней рыб в Северо-Западном регионе России и Северных провинциях Баренцрегиона" (г. Мурманск, 2003 г.); на республиканской научно-практической конференции ветеринарных врачей (Карелия, г. Петрозаводск. 2003 г.); на Американо-Российском семинаре "Проблемы контроля бешенства и методы производства и применения оральных вакцин для бродячих собак, кошек и диких плотоядных" (г. Покров, Покровский завод биопрепаратов, 2004 г.), а также на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2002-2004 гг.

обсуждение результатов, выводы, практические предложения. Список литературы включает 196 источников, в том числе 33 отечественных и 162 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 24 таблицами, 18 рисунками и дополнена приложениями.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Набор для отбора полевых изолятов вируса бешенства и диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции.

• Создание коллекции полевых изолятов вируса бешенства и результаты изучения ее с помощью моноклональных антител.

• Нуклеотидные последовательности фрагментов N-, G-гена и ^-региона 24 полевых изолятов, выделенных в России, Финляндии и Эстонии, и 2 вакцинных штаммов вируса бешенства.

• Нуклеотидная последовательность G-гена и аминокислотная последовательность гликопротеина вакцинного штамма РВ-97.

• Результаты сравнительного испытания на лисицах иммуногенности и безвредности оральных антирабических вакцин "Синраб" и "Фуксорал", созданных на основе штаммов РВ-97 и SAD В19, соответственно.

2. Собственные исследования Материалы и методы. В работе использовали 154 полевых изолята и 5 аттенуированных штаммов вируса бешенства, а также 2 оральные антирабические вакцины (вирусвакцина для оральной иммунизации диких плотоядных животных против бешенства "Синраб", Россия и живая антирабическая вакцина "Фуксорал" для оральной иммунизации диких животных, Германия). С целью проведения сравнительных испытаний диагностического набора РИФ использовали коммерческие антирабические ФИТЦ-глобулины производства "Centocor" (США), "Bio-Rad" (Франция) и производства ВНИВИ (г. Казань, Россия). Для изучения антигенных характеристик полевых изолятов и фиксированных штаммов вируса бешенства использовали панель из 5 мышиных антинуклеокапсидных моноклональных

антител (МКА): W-239.17, W-187.5, W-187.11.2, MW-187.6.1 и Р-41. (J. Сох. Тюбинген, Германия). Расчет праймеров проводили на основании нуклеотидных последовательностей геномов вируса бешенства, опубликованных в EMBL, и результатах собственных исследований при участии A. Huovilainen (г. Хельсинки, Финляндия). При проведении экспериментов использовали химические реактивы фирм "Sigma", "Serva", "Fluka", "Merck", "GeneAmp", "Finnzymes", "Invitrogen", "OXOID", а также реактивы российского производства марки "ч.д.а." и "х.ч.".

Отбор проб. Пробы головного мозга и крови отбирали в соответствии с разработанными «Методическими указания по отбору проб мозга для диагностики бешенства и сывороток крови с целью определения титра антител». Пробы головного мозга от больных и подозреваемых в заболевании бешенством животных получали из региональных ветеринарных лабораторий России. Также использовали изоляты вируса бешенства, выделенные в Финляндии в 1988-1989 гг. (М. Nyberg et al., 1992) и в Эстонии в 1991 г. (К. Kulonen et al., 1993).

Подготовка антигена. Очистку и концентрирование вируса бешенства проводили в соответствии с методикой, предложенной А.П. Пономаревым с соавт. (2001). Использовали суспензию инактивированного вируса бешенства, штамм "ВНИИЗЖ", полученную путем его репродукции в культуре клеток ВНК-21. Проводили комплексную очистку, концентрирование вируса ультрацентрифугированием и дополнительную очистку в градиенте CsCl.

Иммунизация животных. Для получения антирабических антител кроликов иммунизировали дважды полученным препаратом вируса с интервалом в 40-42 дня (Н.А. Назаров и др., 2002).

Получение флюоресцирующего глобулина (ФИТЦ-глобулина). Из сыворотки крови иммунизированных животных получали фракцию IgG методом трехкратного высаливания сульфатом аммония и оценивали в ИФА. ФИТЦ-глобулин готовили общепринятым методом (F. Meslin et al., 1996).

Приготовление контрольных препаратов. Положительные контроли готовили из суспензии головного мозга кроликов, зараженных штаммом CVS вируса бешенства, которую инактивировали с использованием р-пропиолактона и лиофилизовали. Для приготовления отрицательных контролен использовали головной мозг кроликов, несодержащий вируса бешенства. Постановку прямого варианта реакции иммунофлюоресценции (РИФ) и биопробы на мышах осуществляли в соответствии с ГОСТом 26075-84.

Выделение и изучение вируса бешенства в культуре клеток. Выделение полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса проводили в культурах клеток MNA и ВНК-21 с применением опубликованных ранее методик (К. Kulonen et al. 1991; OIE Manual, 2000). Изучение антигенных свойств вирусов, выделенных в культуре клеток, проводили с использованием МКА в непрямом варианте РИФ.

Определение уровня антирабических антител. Уровень антирабических вируснейтрализующих антител (ВНА) в сыворотках крови определяли в соответствии с разработанными «Методическими указаниями по применению реакции подавления иммунофлюоресценции (РПИФ) для выявления антител к вирусу бешенства».

Выделение РНК и синтез кДНК. Суммарную РНК выделяли из 10% суспензии головного мозга с использованием набора "Rneasy Mini Kit" (QIAGEN®, Великобритания). Синтез кДНК проводили в объеме 5 мкл раствора, содержащего очищенную суммарную РНК, при 37°С в течение 90 мин. с добавлением 150 ед. обратной транскриптазы MuLV (вирус лейкемии мышей, Applied Biosystems), 5 пмоль универсального праймера (Random Hexamers, Applied Biosystems).

ПЦР. Все ПЦР-смеси включали 5 мкл 10-кратного буфера для ДНК-полимеразы, 5 пмоль каждого праймера, 1 ед. Dynazyme II ДНК полимеразы, 1 мкл Ю мМ dNTP и воду до объема 48 мкл. Проводили 35 циклов амплификации, каждый из которых включал денатурацию к ДНК при 94°С в течение 1 мин., отжиг праймеров при 55°С в течение 1 мин. и полимеризацию

при 72°С в течение 1 мин. (для амплификации протяженных фрагментов G-гена штамма РВ-97 - 1,5 мин.).

Очистка ПЦР-продуктов и нуклеотидное секвенировапие. Очистку ПЦР-продуктов проводили с использованием набора "MicroSpin S-400HR" (Amersham Pharmacia Biotech, США). Полученные препараты секвенировали с использованием 16 капиллярного автоматического секвенатора ABI 3100 (Applied Biosystems) в Институте биотехнологии Хельсинского университета (г. Хельсинки, Финляндия).

Филогенетический анализ. Для анализа нуклеотидных последовательностей использовали пакеты программ Staden Package v.2003.0-beta (R. Staden et al., 2002) и SEQPROGS (К. Knowles, 1992), а также программу Align v.l.01 (Scientific and Educational Software, 1989).

Статистическую обработку результатов, полученных в ходе выполнения данной диссертационной работы, проводили с использованием компьютерной программы Microsoft® Excel 2002 (10.4302.2625).

3. Результаты собственных исследований

Разработка и испытание набора пренараюв для диа! мистики бешенства в РИФ. Для оценки полученного ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ" провели сравнительное исследование положительных проб головного мозга и сывороток крови с использованием антирабических ФИТЦ-глобулинов "ВНИИЗЖ", "Bio-Rad" и "Centocor". Сравнительные испытания проводили в РИФ, РПИФ и путем выделения вируса бешенства в культурах клеток ВНК-21 и MNA.

В результате проведенных исследований установлено, что ФИТЦ-глобулин "ВНИИЗЖ" по активности и специфичности не уступает ФИТЦ-глобулинам "Bio-Rad" и "Centocor". Кроме того, ФИТЦ-глобулин "ВНИИЗЖ" можно использовать для выявления полевых изолятов и фиксированных штаммов вируса бешенства, выделенных в культурах клеток ВНК-21 и MNA, а также для определения уровня В НА.

В связи с тем, что положительные контрольные препараты, предлагаемые далее для контроля активности ФИТЦ-коньгатов и специфичности РИФ должны быть безопасны, возникла необходимость разработки процедуры инактивации вируса в суспензии.

Испытание активности и специфичности лиофилизованного инактивированного положительного, а также отрицательного контроля РИФ проводили с использованием ФИТЦ-глобулинов "ВНИИЗЖ", "Centocor", "BioRad" и производства ВНИВИ. Полученные данные показали, что лиофилизованные положительный и отрицательный контроли могут быть использованы с целью проверки активности и специфичности антирабических ФИТЦ-глобулинов.

Разработанный набор препаратов для диагностики бешенства в РИФ на основе ФИТЦ-глобулина "ВНИИЗЖ" включает все компоненты, необходимые для постановки РИФ, что отличает его от других наборов, предназначенных для диагностики бешенства в этой реакции, выпускаемых отечественной и зарубежной биологической промышленностью. Данный набор используется в лаборатории малоизученных болезней ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» для диагностики бешенства с 2001 года. Всего за истекший период было исследовано около 800 проб головного мозга животных, подозреваемых в заражении бешенством. Более 30% из них оказались положительными. С использованием разработанного набора проводили предварительный отбор изолятов вируса бешенства для изучения их молекулярно-биологических характеристик, а также мониторинг бешенства в граничащих с Финляндией регионах России.

Изучение полевых изолятов и вакцинных штаммов вируса бешенства с использованием МКА. Для выполнения данного этапа работы было отобрано 154 полевых изолята вируса бешенства, полученных от 11 видов животных из 13 регионов России, а также Финляндии и Эстонии. Около 60% из них (93) были получены от диких животных. Более половины изолятов было

собрано от лисиц. Результаты определения антигенных вариантов собранных изолятов вируса бешенства с использованием МКА представлены в таблице 1.

Таблица 1.

Определение антигенных вариантов изолятов вируса бешенства

с помощью МКА

Антигенный вариант/Регион Генотип Реакция с МКА

W-239.17 W-187.5 W-187.11.2 MW-187.6.1 Р-41

Собственные результаты

I. Финляндия, Эстония, Россия 1 + + + + +

II. Эстония 1 + - + + -

III. Россия 1 + -г + + -

IV. Россия 1 + - + + -

V. Россия 1 + - + - -

Данные, опубликованные в литературе

Арктический1 1 + + + + -

Европейский лисий'' 1 + + + + -

Восточно-европейский'2 1 + - + + -

Lagos bat"*"4 2 + - - + -

Mocola3,4 3 + - - + -

Duvenhage">"4 4 + - - + -

EBLl"1 5 + - - - -

EBL24 6 + - - + -

'Schneider, et al, ¡985; 2Сох et al., 1992; JUmoh et al, 1990;4Mebatsion et al., 1992.

Из таблицы 1 следует, что по результатам изучения антигенных свойств все исследованные полевые изоляты вируса бешенства относятся к первому генотипу. Антигенный вариант I соответствует арктическому антигенному варианту, антигенные варианты 111 и IV соответствуют европейскому лисьему и восточно-европейскому антигенным вариантам, соответственно. Антигенные варианты II и V не соответствуют ни одному из ранее выделенных антигенных вариантов. Установлено, что в подавляющем большинстве случаев (около 70%) выявлялся антигенный вариант III, чаще среди лисиц, а также у собак, кошек и КРС. Остальные антигенные варианты выделялись значительно реже.

Географическая локализация антигенных вариантов показана на рисунке 1. Из представленных данных следует, что антигенный вариант I циркулирует, главным образом, в северозападных регионах России, а также в Финляндии и Эстонии. Однако к этому антигенному варианту относились и несколько изолятов из Курской области. Антигенный

вариант II был выделен только на островах Эстонии, а III и IV - в центральных и в юго-западных регионах России. Изоляты, выделенные в Новосибирской области, были отнесены к антигенному варианту III. Антигенный вариант V был выделен только в Тверской области.

Фиксированные штаммы вируса бешенства по характеру реакции с МКА были разделены на 2 группы. В первую вошел штамм SAD В19, в другую группу - штаммы РВ-97, "ВНИИЗЖ", "Овечий" и CVS.

Выявление генома вируса бешенства в ПЦР. Разработку ПЦР проводили исключительно для наработки ПЦР-продуктов с целью их секвенирования, однако изучали возможность использования данной реакции и для диагностических целей. Для постановки ПЦР использовали 2 пары праймсров, первая из которых амплифицирует фрагмент N-гена размером 360

н.о. Вторая пара амплифицирует фрагмент размером 260 и.о., расположенный на G-гене, и затрагивает псевдоген (G-праймеры). Первый из указанных фрагментов локализуется в позиции 626-986 н.о., а второй - в позиции 48355095 н.о. (в соответствии с последовательностью штамма SAD В19) Результаты исследования некоторых полевых изолятов и фиксированных штаммов вируса бешенства в ПЦР представлены на рисунке 2.

N • праймам G - cipjwMepw

2 3 i f1 2 3 4

Рис. 2. Электрофореграмма полинуклеотидов, полученных методом ОТ-

ПЦР. А. Изолят №96 (треки 1 N и в) и вакцинный штамм РВ-97 (треки 2 N и б). М -маркер. Цифрами вдоль трека маркера показан размер ПЦР-продукта. к- - отрицательный контроль. Б. Изоляты №№ 1, 13, 18 и 85 (треки 1.2. 3.4 N и в. соответственно).

Как показано на рисунке 2, выбранные пары праймеров позволили амплифицировать фрагменты кДНК, имеющие размеры, соответствующие расчетным. С использованием РИФ и разработанного варианта ПЦР исследовали 17 полевых изолятов вируса бешенства, принадлежащих к 5 различным антигенным вариантам. Результаты ПЦР в 100% случаев совпадали с результатами РИФ, что свидетельствует о перспективности дальнейшей оптимизации и применения данного варианта реакции как дополнительного теста при диагностике бешенства.

Нуклеотидное секвенирование и филогенетический анализ. С целью дальнейшей оценки изолятов вируса бешенства, полученных из различных регионов России, Финляндии и Эстонии, определяли нуклеотидную последовательность выбранных фрагментов Ы-, С-гена и ^-региона. Полученные последовательности сравнивали как между собой, так и с последовательностями, опубликованными в ЕМВЬ. Результаты сравнения 24

полевых изолятов и трех вакцинных штаммов вируса бешенства по нуклеотидным последовательностям фрагмента К-гена представлены на рисунке 3.

■ SA0B19

• Омчмй

• PB 37

L-d

1-1

]¡¡

• Wolf <19 |IV) Владимир I fex-51 {(VJ Впаяяимр

1 R.<tog 190 |IV| Владимир —— Fox-96[V| Тверь

_i R.dog<45 IW| Тверь

J 1 WotfW |IV| Тверь 1 R.dog-U PI Тверь

i R. dog 113 (I) Финляндии Fox-109 [i] Финляндия Fox-7 И Псиви R.dog-3 p) Поив i Fox-124 И Эстония —J ' Fox 120 |l| Эстонии

Horae-1904 [l| Финляндия -Fox-EST (Щ Эстония

■ Fox 11 p| Пей»

■ Fox-1 (liq Воронеж

• Plq-11 ЩЬеко?од Oog J3 [DI] Белгород

■ Fox-23 jlti] Белтород - fox£47 |lll) Новосибирск i СИЛ piq H. Новгород

Fox-20 fllll H, Новгород

■ Dog4>23 pli] H. Новгород

% нуклеотидных различий

Рис. 3. Дендрограмма, отражающая генетические отношения между вакцинными штаммами и полевыми изолятами вируса бешенства по фрагменту 1Ч-гена; 'антигенный вариант данного изолята.

Анализ последовательности нуклеотидов фрагмента Ы-гена показал, что изучаемые изоляты могут быть разделены на 3 группы. Распределение изолятов по группам в большинстве случаев коррелирует с их географическим происхождением, а также с антигенными вариантами, выявленными по реакции с МКА.

Группу 1 образуют изоляты, принадлежащие к антигенным вариантам I и II, выделенные в Финляндии, Псковской области и Эстонии. Уровень нуклеогидных различий между изолятами, образующими эту группу, составляет 0,6-0,9%. Изолят Рох-ЕБТ, выделенный в Эстонии и

представляющий II антигенный вариант, отличается от остальных изолятов данной группы на 1,5-1,8%.

Группу 2 образуют изоляты, по реакции с МКА отнесенные к антигенному варианту III. В нее входят изоляты, выделенные в Воронежской, Пензенской, Белгородской, Нижегородской и Новосибирской областях. Изолят "Fox-647", выделенный в Новосибирской области, отличается от остальных изолятов этой группы на 2,4%. Группу 3 образуют изоляты, выделенные во Владимирской (антигенный вариант IV) и Тверской областях (антигенный вариант I, III, IV и V). Уровень нуклеотидных различий между изолятами данной группы составляет 0,9-2,1%. Уровень нуклеотидных различий между группами 1, 2 и 3 составляет около 4,0-6,5%.

Вакцинный штамм SAD В19 отличается от штаммов "Овечий" и РВ-97 на 7,5%. Уровень нуклеотидных различий изучаемого фрагмента N-гена штаммов SAD В19 и РВ-97 от полевых изолятов вируса бешенства, выделенных в России, составляет 5,4-7,5%.

Сравнительный анализ полученных нами нуклеотидных последовательностей фрагмента N-гена изолятов, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии и опубликованных в EMBL нуклеотидных последовательностей изолятов, выделенных в Европе, Азии и Африке, показал, что по уровню нуклеотидных различий их можно разделить на 6 групп. Три группы (1, 2 и 6) образованы изолятами, выделенными в различных регионах России. Группу 3 образуют изоляты, выделенные в Алжире, Эфиопии и Югославии. Четвертую группу образуют изоляты, выделенные в Финляндии, Эстонии и Псковской области. В группу 5 вошли 11 изолятов, которые были выделены во Франции, Эстонии, Германии, Польше и Боснии. Установлено, что анализируемые изоляты и штаммы отличаются друг от друга в пределах 0,3-9,3%. Вакцинные штаммы "Овечий" и РВ-97 отличаются от вакцинных штаммов SAD В19, Ni-Ce, HEP-Flury более чем на 7%.

В связи с тем, что N-ген считается высококонсервативным, для решения задач молекулярной эпизоотологии используют более вариабельные участки генома, один из которых расположен в конце G-гена и захватывает ^-регион

(N. Tordo et al, 1996). Сравнительный анализ нуклеотидных

последовательностей фрагмента в-гена и «(/-региона 23 полевых изолятов вакцинных штаммов вируса бешенства представлен на рисунке 4.

и 3

SADB19 Оввчмй

РВ-97

Fex 120 Д*Зстония Fox-7 П Лам Fox 124 JIJ Эстония Носм-1904 ß ¿иимидм R dog-J Р) Ласо* R. dog 113 р) Финляндия Fox U9 (I) Финляндия Plg-41 Щ Белгород Dog-ЗЭ Щ Белгород F ок23 |1llj Белгород Fox-1 Щ Воронеж Cat-78 рй{ Н Новгород Fox Д ОТ Н. Новгород DOR-C23IUÖ Н. Новмрод Fox £47 (III] Новосибирск WoK.189 |1V| Владимир Cm-188 IIV] Pea» R-AjglJO PV| впади мир Foxíl |W| Владимир Fox-96 (V) Тверь R.dog-45|ll4Twpb WbM44 JIV) Тверь R dog-U II Тверь

■I

III I I I lili

18 18 14 12 10 8 6 4 2 0 % нуклеотидных различий

Рис. 4. Дендрограмма, отражающая генетические отношения между вакцинными штаммами и полевыми изолятамн вируса бешенства по фрагменту G-гена и «(/-региона; *антигенный вариант данного изолята.

Анализ первичной структуры фрагмента G-гена и ^-региона в пределах группы изолятов, выделенных в России, Финляндии и Эстонии, позволяет выделить три группы. Распределение изолятов по группам, как правило, соответствовало антигенным вариантам, определенным по реакции с МКА, и по их географическому происхождению.

Группу 1 образуют изоляты, выделенные в Псковской области, Эстонии и Финляндии, принадлежащие к антигенному варианту I. Уровень нуклеотидных

различий между изолятами данной группы составляет около 1%. Группу 2 образуют изоляты, выделенные в Воронежской, Белгородской и Нижегородской областях и принадлежащие к антигенному варианту III. Уровень нуклеотидных различий между изолятами второй группы составляет около 4%. Изолят "Fox-647", выделенный в Новосибирской области, отличается от остальных изолятов этой группы приблизительно на 5%. Третья группа образована изолятами, выделенными во Владимирской, Рязанской (антигенный вариант IV) и Тверской областях (антигенный вариант I, III, IV и V). Изоляты, образующие группы 2 и 3, отличаются друг от друга на 5,5-6,7%, а от первой группы на 7%. Вакцинные штаммы "Овечий", РВ-97 и SAD В19 отличаются от полевых изолятов на 13-14,5%, а друг от друга на 19%.

Сравнительный анализ полученных нами нуклеотидных последовательностей фрагмента G-гена и »(/-региона изолятов, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии и опубликованных в EMBL, нуклеотидных последовательностей изолятов, выделенных в Европе, Азии, Африке, Северной Америке, показал, что по уровню нуклеотидных различий их можно разделить на 6 групп. В первую и вторую группы вошли изоляты, выделенные в Марокко, ЮАР и Зимбабве. Третью группу образуют изоляты, выделенные в Финляндии, Эстонии, Псковской области и Франции. Группа 4 образована изолятами, выделенными в различных регионах России, а также в Польше. Изоляты, выделенные от лисицы в Новосибирской области и от енотовидной собаки в Польше, отличаются от остальных изолятов четвертой группы на 6%. Пятая группа образована изолятами, выделенными во Владимирской и Тверской областях, а также в Венгрии. Шестую группу образуют изоляты, выделенные в США. Изоляты, выделенные в Иране, Югославии, Китае и на Мадагаскаре, не попали ни в одну из групп и отличаются от остальных анализируемых изолятов на 7,7-12%, 5,7-10%, 8,514% и 9-12%, соответственно.

Известно, что гликопротеин вируса бешенства является белком,

индуцирующим образование ВНА. В рамках данной работы было проведено нуклеотидное секвенирование G-гена вакцинного штамма РВ-97.

Для получения ПЦР-продуктов и нуклеотидного секвенирования использовали праймеры, опубликованные N. Tordo et al. (1996), а также оригинальные праймеры, рассчитанные на основании результатов собственных исследований. Три пары праймеров амплифицировали продукты размером около 560, 1080 и 870 н.о. Из полученной последовательности взяли фрагмент длиной 1575 н.о. (ген гликопротеина) и сравнили его с опубликованными в EMBL нуклеотидными последовательностями G-гена некоторых вакцинных штаммов вируса бешенства (SAD В19, ERA, HEP-Flury, Ni-Ce, Nishigahara, RC-HL, SRV9 и Vnukovo-32).

На рисунке 5 представлена дендрограмма, отражающая генетические отношения между различными вакцинными штаммами и штаммом РВ-97, установленные на основе структурной гомологии нуклеотидных последовательностей гена гликопротеина.

Nishigahara

Ni-CE

RC-HL

РВ-97

SRV9

SADB19

ERA

Vnukovo-32 HEP-Flury

10 в S 4 2

% Нуклеотидных различий

Рис. 5. Дендрограмма, отражающая генетические отличия между вакцинными штаммами, установленные на основе анализа нуклеотидных последовательностей гена гликопротеина.

Из данных, представленных на рисунке 5, следует, что сравниваемые штаммы по уровню различий последовательности нуклеотидов формируют две группы. В первую из них входят штаммы SAD В19, SRV9, ERA и Vnukovo-32, во вторую группу - штаммы Ni-CE, RC-HL и Nishigahara. Штаммы РВ-97 и

HEP-Flury не попадают ни в одну из групп. Штамм РВ-97 отличается от штаммов первой группы на 9,5%, от штаммов, формирующих вторую группу, на 7,7%, от штамма HEP-Flury на 11,5%.

Анализ аминокислотных последовательностей, рассчитанных из последовательностей нуклеотидов, показал, что штамм РВ-97 отличается от штаммов группы SAD (1 группа) и Nishigahara (2 группа) приблизительно на 10%. Отличие его от штамма HEP-Flury было несколько больше и составило 11,5%. Дальнейший анализ аминокислотных последовательностей проводили для штаммов SAD В19 и РВ-97, поскольку первый широко используется для производства оральных антирабических вакцин в Европе, а второй - в России.

Нуклеотидные последовательности гена гликопротеина штаммов РВ-97 и SAD В19 отличалась по 145 нуклеотидам, которые привели к замене 52 аминокислот (табл. 2).

Таблица 2.

Аминокислотные замены в гликопротеине штаммов РВ-97 и SAD В19

'Позиция аминокислоты Аминокислотные замены Позиция аминокислоты Аминокислотные замены

SAD В19 РВ-97 БАО В19 РВ-97

11.439 лейцин фенилаланин 261 серин аланин

13 валин глицин 275 лизин глютамин

15.272. 488 пролин серии 283 аргинин гистидин

63 метионин лейцин 337 фенилапанин изолейцин

69 тирозин гистидин 345,422 аспараг. к-та глютам. к-та

71 лейцин серии 357 лейцин валин

121 метионин треонин 389 аспарагин гистидин

132 гистидин глютамин 415 валин метионин

133 аргинин глютамин 444 аспарагин лизин

145,239 лизин аргинин 445 глютамин лизин

158 валин аланин 458 лизин глютам. к-та

166. 297 аргинин лизин 468,478 треонин изолейцин

181 валин изолейцин 480 цистеин аргинин

182. 466 аланин треонин 486 серин пролин

186 треонин валин 491 гистидин аргинин

204 лейцин глютамин 492 аспарагин серин

222. 367, 448, 497 глицин глютам к-та 498 аргинин метионин

223 серии аргинин 509 изолейцин фенил аланин

224,499 глютам к-та лизин 510 изолейцин лизин

241 аланин серин 516 гистидин тирозин

Номера позиций обозначены в соответствии с посчедователъностыо SAD BI9

Из данных, представленных в таблице 2, следует, что из 52 замен аминокислот в 9 случаях отмечены повторяющиеся замены. Замены лейцина на фенилаланин, лизина на аргинин, аргинина на лизин, глютаминовой кислоты на лизин, аланина на треонин, аспарагиновой кислоты на глютаминовую кислоту и треонина на изолейцин встречались по 2 раза, замены пролина на серии - 3 раза, замены глицина на глютаминовую кислоту - 4 раза.

Таким образом, выявлены значительные различия аминокислотных последовательностей гликопротеина штаммов РВ-97 и SAD В19. Для выяснения роли установленных замен были изучены иммуногенные свойства вакцин "Синраб" и "Фуксорал", созданных на основе упомянутых штаммов.

Испытание иммуногенности и безвредности оральной антирабической вакцины "Синраб", изготовленной из штамма РВ-97. Для решения поставленной задачи было проведено сравнительное изучение иммуногенности и безвредности оральных антирабических вакцин "Синраб" и "Фуксорал" на серебристо-черных лисицах, которых разделили на 5 групп. Животных, входящих в группы 1 и 2, иммунизировали одной дозой соответствующей вакцины (по 27 голов), в группах 3 и 4 - десятью дозами (по 8 голов), в пятой, контрольной группе, животных не вакцинировали (7 голов). Пробы крови для определения уровня антирабических вируснейтрализующих антител отбирали на 15, 30, 60 и 90 день после вакцинации. Пробы слюны отбирали на 3, 7, 15, 60 и 90 день после вакцинации. Результаты определения уровня ВНА в сыворотках крови выражали в международных единицах (ME). Анализ проб слюны проводили постановкой биопробы в культуре клеток MNA.

В соответствии с международными стандартами (OIE Manual, 2000), уровень ВНА, достаточный для защиты вакцинированных животных от инфицирования бешенством, должен составлять >0,5 ME/мл. Процентное соотношение числа животных, содержащих достаточный для защиты уровень В H.A.. в зависимости от срока, прошедшего после вакцинации, вида и дозировки вакцины представлено в таблице 3.

Таблица 3.

Процентное соотношение числа животных, содержащих достаточный для защиты уровень ВНА, в зависимости от вида используемой вакцины и

дозировки

Вакцина Дозировка (на 1 голову) Сроки взятия проб после вакцинации (дни)

15 30 60 90

Синраб х1 63% 90.9% 89,5% 78,9%

хЮ 85,7% 100% 100% 80%

Фуксорал X 1 85% 100% 100% 100%

хЮ 100% 100% 100% 100%

Контроль 0 0% 0% 0% 0%

Как видно из таблицы 3, при иммунизации животных одной дозой вакцины "Синраб" на 15 день после иммунизации достаточный для защиты уровень ВНА был выявлен у 63 % животных. На 30 день после вакцинации этот показатель в данной группе животных составил 91% и к 90 дню снизился до 79%. При вакцинации животных 10-ю дозами вакцины "Синраб" достаточный для защиты от заражения бешенством уровень ВНА наблюдали у 85,7% животных на 15 день после иммунизации, к 30 дню он достигал 100%, а к 90 дню снизился до 80%.

При иммунизации животных одной дозой вакцины "Фуксорал" на 15 день после вакцинации 85% животных имели достаточный для защиты уровень ВНА. Начиная с 30 дня и на всем протяжении опыта, необходимый для защиты от заражения бешенством уровень ВНА был выявлен у 100% животных этой группы. Вакцинация животных 10-ю дозами вакцины "Фуксорал" привела к образованию достаточного для защиты уровня ВНА у 100% животных на 15 день после иммунизации. Этот уровень сохранялся на протяжении всего опыта.

Установлено, что повышение уровня ВНА у животных при иммунизации вакциной "Синраб" продолжалось до 30 дня, а затем он снижался. Более высокие уровни ВНА отмечались при иммунизации вакциной "Фуксорал" и рост их продолжался до 60 дня после вакцинации.

Вирус бешенства в слюне иммунизированных животных обнаружить не удалось. Все исследованные в РИФ пробы головного мозга вакцинированных животных также показали отрицательный результат. Приведенные результаты

свидетельствуют о том, что вирусы бешенства штаммов РВ-97 и SAD В19 не имеют тенденции к накоплению в головном мозгу и выделению со слюной у лисиц, вакцинированных одной и 10-ю дозами.

Моделирование заражения животных бешенством проводили на базе Всероссийского научно-исследовательского института ветеринарной вирусологии и микробиологии (ВНИИВВиМ, г. Покров). С этой целью использовали изолят вируса бешенства R.dog-190, прошедший 1 пассаж на лисицах. В пределах срока наблюдения (30 дней) гибели среди вакцинированных животных отмечено не было. На 20 день после заражения '«

погибло одно животное в контрольной группе. Для подтверждения специфичности гибели было проведено исследование головного мозга погибшего животного в РИФ, результат оказался положительным.

При проведении испытаний указанных вакцин на лисицах установлены различия в сроках образования ВНА и иммуногенности, но несмотря на это, обе вакцины являются эффективными и безопасными препаратами для профилактики бешенства.

4. Выводы

1. Разработан набор для диагностики бешенства в РИФ, с помощью которого создана коллекция, включающая 143 полевых изолята вируса бешенства, выделенных от И видов животных на территории 13 регионов России.

2. Установлено существование на территории России 4 антигенных вариантов вируса бешенства, в том числе одного ранее неизвестного.

3. Проведен анализ первичной структуры консервативного фрагмента N-гена (360 н.о.) 24 полевых изолятов и 2 агтенуированных штаммов, а также вариабельного фрагмента G-гена и у-региона (260 н.о.) 23 полевых изолятов и 2 атгенуированных штаммов вируса бешенства.

4. Показано распределение изолятов, выделенных в России, Финляндии и Эстонии, на три группы, отличающиеся по фрагменту N-гена на 4-7%, по фрагменту G-гена и \|/-региона на 5,5-7,5%. Штамм РВ-97 отличается от

указанных выше изолятов по фрагменту N-гена на 5,5-7,5%, а по фрагменту G-гена и ^-региона на 13-14,5%.

5. Определена нуклеотидная последовательность G-гена (1575 н.о.) и соответствующая ей аминокислотная последовательность гликопротеина аттенуированного штамма РВ-97 вируса бешенства. Установлено, что он отличается по аминокислотной последовательности от штаммов группы SAD (1 группа) и Nishigahara (2 группа) приблизительно на 10%. Отличие его от штамма HEP-Flury было несколько больше и составило 11,5%.

6. Показано, что вакцина "Синраб", полученная на основе штамма РВ-97, обладает высокой иммуногенностью и индуцирует у лисиц образование вируснейтрализующих антител в титрах, достаточных для защиты 91% животных на 30 день после иммунизации.

7. Установлено, что штамм РВ-97 не имеет тенденции к персистенции в головном мозгу и выделению со слюной у лисиц, иммунизированных одной и 10-ю дозами вакцины.

5. Практические предложения

На основе результатов исследований подготовлены следующие

документы:

1. «Методические указания по отбору проб мозга для диагностики бешенства и сывороток крови с целью определения титра антител», утвержденные руководителем Департамента ветеринарии Минсельхоза России 03.04.2001.

2. Комплект нормативно-технической документации на набор для диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции: ТУ, временная инструкция, методические рекомендации, утвержденные директором ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» 20.11.2004;

3. «Методические указания по применению реакции подавления иммунофлюоресценции (РПИФ) для выявления антител к вирусу бешенства», утвержденные директором ФГУ ВНИИЗЖ 10.01.2003, которые могут использоваться для оценки иммуногенности антирабических вакцин.

Кроме того, полученные нуклеотидные последовательности консервативного фрагмента N-гена и вариабельного фрагмента G-гена и у-

региона изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России используются для идентификации и дифференциации вновь выделяемых изолятов вируса бешенства. Нуклеотидная последовательность G-гена и соответствующая ей аминокислотная последовательность гликопрстеина штамма РВ-97 используется для сравнения ее с другими вакцинными штаммам и полевыми изолятами вируса бешенства.

Получены дополнительные результаты, указывающие на безвредность для лисиц вакцины "Синраб" производства ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных».

6. Список опубликованных научных работ

1. Метлин А.Е., Рыбаков С.С., Чепуркин A.B., Егоров A.A. Выявление

антигена вируса бешенства в консервированных формалином пробах головного мозга мышей //Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельда-Якоба и другие прионные болезни, листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: Матер, междунар. науч.-практ. конф. - Покров, 2001. - С. 46-49.

2. Михалишин В.В., Рыбаков С.С., Домский H.A., Борисов A.B., Метлин А.Е., Чепуркин A.B., Егоров A.A., Рябоконь A.A. Испытание иммуногенности и безвредности вирусвакцины против бешенства орального применения //Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельда-Якоба и другие прионные болезни, листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: Матер, междунар. науч.-практ. конф. - Покров, 2001. - С. 33-36.

3. Пономарёв А.П., Назаров H.A., Рыбаков С.С., Артамонова Т.Н., Михайлина Н.М., Метлин А.Е., Манин Б.Л., Гусева М.Н. Совершенствование метода очистки и концентрирования вируса бешенства //Нейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельда-Якоба и другие прионные болезни, листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена: Матер, междунар. науч.-практ. конф. - Покров, 2001.-С. 49-51.

4. Метлин А.Е., Рыбаков С.С., Чепуркин A.B., Егоров A.A. Диагностика бешенства с использованием консервированных формалином проб головного мозга //Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей: Матер, междунар. науч.-практ. конф. - Покров, 2002. - С. 162-164.

5. Назаров H.A., Метлин А.Е., Рыбаков С.С., Михайлина Н.М., Пономарев А.П., Артамонова Т.Н., Чепуркин A.B. Сравнительная характеристика антител, полученных на разные антигены вируса бешенства //Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии с.-х. животных и людей: Матер, междунар. науч.-практ. конф. -Покров, 2002. - С. 168-170.

6. Борисов A.B., Метлин А., Домский И.А., Михалишин В.В., Рыбаков С С. Оценка эффективности иммунизации диких животных оральной антирабической вакциной //Современные проблемы природопользования, охотоведения и звероводства: Матер, междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 80-летию ВНИИОЗ. - Киров, 2002. - С. 543-545.

7. Борисов A.B., Толокнов A.C., Метлин А.Е., Михалишин В.В., Рыбаков С.С. Испытание безопасности и эффективности вирусвакцины "Синраб" на видах мишенях //Уч. зап. Витебской ордена "Знак Почёта" гос. акад. вет. медицины: - Витебск, 2002. - Т. 38, Ч. 1.-С. 15-18.

8. Метлин А.Е., Рыбаков С.С., Груздев К.Н., Михалишин В.В., Чепуркин A.B., Михалишин Д.В., Борисов A.B. Сравнительное изучение иммуногенности и безвредности антирабических вакцин «Синраб» и «Фуксорал» //Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Матер, междунар. науч. конф., посвящ. 45-летию ВНИИЗЖ. - Владимир, 2003.-С. 466-469.

9. Назаров H.A., Чепуркин A.B., Рыбаков С.С., Михайлина Н.М., Метлин А.Е. Диагностика бешенства методом твердофазного непрямого сэндвич-варианта иммуноферментного анализа //Актуальные проблемы

2005-4

инфекционной патологии животных: Матер, междунар. науч. i посвяш. 45-летию ВНИИЗЖ. - Владимир, 2003. - С. 218-222. 49037

10. Назаров Н.А., Чепуркин А.В., Рыбаков С.С., Михайлина Н.М., Eiuyuu А.А., Метлин А.Е. Разработка схемы лабораторной диагностики бешенства //Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов: Тр. междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 45-летию ВНИИВВиМ. - Покров, 2003. - С. 153-157.

И. Metlin А.Е., Сох J., Rybakov S.S., Huovilainen A., Grouzdev К.Ы., Neu\onen Е. Monoclonal antibody characterization of rabies virus isolates from Russia, Finland and Estonia //J. Vet. Med. B. - 2004. - V. 51. - P. 94-96.

12. Rybakov S.S., Metlin A.E., Gruzdev K.N., Neuvonen E. Comparative safety and potency testing of rabies vaccines "Sinrab" and "Fuchsoral //International Conference on the Control of Infectious Animal Diseases by Vaccination: Programme and Abstracts Book. - Buenos Aires, 2004. - P. 80.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных», тираж 90 экз., декабрь 2004 г.

Оглавление диссертации Метлин, Артем Евгеньевич :: 2004 :: Владимир

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Характеристика возбудителя бешенства и его молекулярпо-биологические свойства

2.2. Эпизоотологические данные и ситуация по бешенству в России и в мире

2.3. Патогенез, клинические признаки и патологоанатомические изменения при бешенстве

2.4. Лабораторная диагностика бешенства

2.5. Лабораторные, вакцинные штаммы вируса бешенства и антирабические вакцины

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Метлин, Артем Евгеньевич, автореферат

Бешенство - это широко распространенное инфекционное заболевание теплокровных животных и человека, которое проявляется расстройствами функции центральной нервной системы, параличами и энцефаломиелитом. Оно регистрируется на территории более 80 стран мира, в большинстве из которых, в том числе и в России, в последние годы отмечается постоянный рост количества случаев этой болезни [11, 145, 146].

Бешенство входит в пятёрку инфекционных болезней, общих для человека и животных, наносящих наибольший экономический ущерб, который складывается из потерь в результате падежа животных, затрат на проведение карантинных и профилактических мероприятий, на отлов бродячих собак и кошек, регулирование численности диких хищников, а также на проведение диагностических исследований [3]. Большие средства расходуются на мостэкспозиционное лечение людей, имевших контакт с больными животными.

По данным ВОЗ, ежегодно в мире от бешенства умирает от 35000 до 50000 человек [145]. В связи с тем, что бешенство является летальной инфекцией и имеет важное социальное значение, необходима точная и своевременная диагностика этой болезни, особенно в случае опасности передачи бешенства человеку. В России для диагностики бешенства используются методы, которые имеют существенные недостатки. В частности, постановка биопробы на мышах может занимать до 30 дней.

Для контроля бешенства в дикой природе разработаны и применяются оральные антирабические вирусвакцины [7, 10, 24]. Однако некоторые авторы высказывают опасения, связанные с наличием остаточной патогенное!и апенуированных вакцинных штаммов вируса бешенства [13, 141, 185|. В связи с этим, немаловажным является изучение молекулярно-биологических характеристик вакцинных штаммов вируса бешенства и полевых изолятов, циркулирующих на территории России, с целью разработки методов, позволяющих дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса бешенства. Для этих целей могут быть использованы I НДР, нуклеотидное секвенирование и моноклональные антитела (МКА). С помощью указанных методов можно проводить генотипирование полевых изолятов вируса бешенства, идентифицировать различные антигенные варианты и дифференцировать их от вакцинных штаммов [19, 63, 131, 172, 174]. Благодаря использованию нуклеотидного секвенирования было выявлено несколько новых генотипов вируса бешенства [37, 50].

Таким образом, актуальной задачей является усовершенствование существующих методов лабораторной диагностики, а также разработка современных методов на основе полимеразной цепной реакции (ПЦР) и нуклеотидного секвенирования, позволяющих выявлять и дифференцировать полевые изоляты и вакцинные штаммы вируса бешенства. Существенным моментом в борьбе и профилактике бешенства является необходимость постоянного контроля эффективности и безопасности антирабических вакцин. С этой целью необходимо совершенствовать методы выявления антирабических антител в сыворотках крови вакцинированных животных.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Получить антирабический флюоресцирующий глобулин, пригодный для первичного отбора изолятов вируса, с целью создания коллекции и разработки набора для диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции.

3. Провести анализ последовательностей нуклеотидов фрагментов N-, G-гена и \|/-региона полевых изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии, и G-гена вакцинного штамма РВ-97 вируса бешенства.

5. Сравнить на лисицах иммуногенность и безвредность оральных антирабических вакцин, приготовленных из штамма РВ-97 (вирусвакцина для оральной иммунизации диких плотоядных животных против бешенства "Синраб", Россия) и из SAD В19 (живая антирабическая вакцина "Фуксорал" для оральной иммунизации диких животных, Германия).

Научная новизна работы. Научная новизна состоит в том, что в результате проведенных исследований:

• Впервые определена нуклеотидная последовательность фрагментов N-, G-генов и \|/-региона 24 полевых изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России в 2001-2004 гг., и 2 вакцинных штаммов вируса бешенства, а также проведено сравнение полученных последовательностей с опубликованными в EMBL данными по первичной структуре различных изолятов и штаммов вируса бешенства.

• Впервые определена нуклеотидная последовательность G-rena и аминокислотная последовательность гликопротеина вакцинного штамма РВ-97 вируса бешенства.

• Дана экспериментальная оценка иммуногенности и безвредности для лисиц оральных антирабических вирусвакцин, приготовленных из штамма РВ-97 ("Синраб", Россия) и SAD В19 ("Фуксорал", Германия).

Практическая значимость работы. Полученные результаты проведенных исследований использованы при разработке следующих нормативно-технических документов:

3. «Методические указания по применению реакции подавления иммунофлюоресценции (РПИФ) для выявления антител к вирусу бешенства», утвержденные директором «Федеральный центр охраны здоровья животных» 10.01.2003.

Кроме того, создан банк данных нуклеотидных последовательностей фрагментов N-гена, G-гена и ц/-региона 24 изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России, Финляндии и Эстонии, который используется для идентификации и дифференциации вновь выделяемых изолятов вируса бешенства. Нуклеотидная последовательность G-гена штамма РВ-97 используется для сравнения ее с другими вакцинными штаммами и полевыми изолятами вируса бешенства.

Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 12 научных работ.

Основные положения, выносимые на защиту:

• Набор для отбора полевых изолятов вируса бешенства и диагностики бешенства методом иммунофлюоресценции.

• Нуклеотидные последовательности фрагментов N-, G-гена и 1|/-региона 24 полевых изолятов, выделенных в России, Финляндии и Эстонии, и 2 вакцинных штаммов вируса бешенства.

Апробация работы. Результаты, полученные в ходе подготовки диссертации доложены и опубликованы в материалах научных конференции:

• "Пейроинфекции: бешенство, губкообразная энцефалопатия КРС, Крейтцфельда-Якоба и другие прионные болезни, листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена" (г. Покров, ВНИИВВиМ, 2001);

• "Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии сельскохозяйственных животных и людей" (г. Покров, ВНИИВВиМ, 2002 г.);

• "Актуальные проблемы инфекционной патологии животных" (г.

Владимир, ФГУ ВНИИЗЖ, 2003 г.); "Профилактика бешепспк! животных и заразных болезней рыб в Северо-Западном регионе России и Северных провинциях Баренцрегиона" (г. Мурманск, 2003 г.);

• на республиканской научно-практической конференции ветеринарных врачей (Карелия, г. Петрозаводск, 2003 г.);

• на Американо-Российском семинаре "Проблемы контроля бешенства и методы производства и применения оральных вакцин для бродячих собак, кошек и диких плотоядных" (г. Покров, Покровский завод биопрепаратов, 2004 г.);

• на заседаниях ученого совета ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» в 2002-2004 гг.

Структура и объем диссертации. Исследования по диссертационной работе проводились в 2000-2004 гг. в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Диссертация изложена на 151 страницах и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов, выводы, практические предложения. Список литературы включает 196 источников, в том числе 33 отечественных п 162 зарубежных авторов. Работа иллюстрирована 24 таблицами, 18 рисунками и дополнена приложениями.

Заключение диссертационного исследования на тему "Молекулярно-биологические характеристики полевых изолятов и аттенуированных штаммов вируса бешенства"

5. Выводы

1. Разработан набор для диагностики бешенства в РИФ, с помощью которого создана коллекция, включающая 143 полевых изолята вируса бешенства, выделенных от 11 видов животных на территории 13 регионов России.

3. Проведен анализ первичной структуры консервативного фрагмента N-гена (360 н.о.) 24 полевых изолятов и 2 аттенуированных штаммов, а также вариабельного фрагмента G-гена и vjz-региона (260 н.о.) 23 полевых изолятов и 2 аттенуированных штаммов вируса бешенства.

4. Показано распределение изолятов, выделенных в России, Финляндии и Эстонии, на три группы, отличающиеся по фрагменту N-гена на 4-7%, по фрагменту G-гена и vy-региона на 5,5-7,5%. Штамм РВ-97 отличается от указанных выше изолятов по фрагменту N-гена на 5,5-7,5%, а по фрагменту G-гена и цу-региона на 13-14,5%.

5. Определена нуклеотидная последовательность G-гена (1575 и.о.) и соответствующая ей аминокислотная последовательность гликопротеина аттенуированного штамма РВ-97 вируса бешенства. Установлено, что он отличается по аминокислотной последовательности от штаммов группы SAD (I группа) и Nishigahara (2 группа) приблизительно на 10%. Отличие его от штамма HEP-Flury было несколько больше и составило 11,5%.

6. Показано, что вакцина "Синраб", полученная на основе штамма РВ-97, обладает высокой иммуногенностью и индуцирует у лисиц образование вируснейтрализующих антител в титрах, достаточных для защиты 91 % животных на 30 день после иммунизации.

6. Практические предложения

На основе проведенных исследований для практического применения предложены:

1. «Методические указания по отбору проб мозга для диагностики бешенства и сывороток крови с целью определения титра антител», утверждены руководителем Департамента ветеринарии МСХ РФ 03.04.2001.

3. «Методические указания по применению реакции подавления иммунофлюоресценции (РПИФ) для выявления антител к вирусу бешенства», утверждены директором ФГУ ВНИИЗЖ 10.01.2003, которые могут использоваться для оценки иммуногенности антирабических вакцин.

Кроме того, полученные нуклеотидные последовательности консервативного фрагмента Ы-гена и вариабельного фрагмента О-гена и ц/региона изолятов вируса бешенства, выделенных на территории России используются для идентификации и дифференциации вновь выделяемых изолятов вируса бешенства.

Нуклеотидная последовательность О-гена и соответствующая ей аминокислотная последовательность гликопротеина штамма РВ-97 используется для сравнения ее с другими вакцинными штаммам и полевыми изолятами вируса бешенства.

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2004 года, Метлин, Артем Евгеньевич

1. Ботвинкин А.Д., Селимов М.А., Клюева Е.В. и др. Антигенная характеристика полевых штаммов вируса бешенства из различных районов СССР с помощью антинуклеокапсидных моноклональных антител //Журн. микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1990. - №1. - С. 50-54.

2. Грибенча C.B., Василенко О.В., Фуралев В.А. и др. Получение и характеристика гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к структурным белкам вируса бешенства, штамм Внуково-32 //Вопр. вирусологии. 1991. - Т. 36, №4. - С. 318-321.

3. Грибенча C.B., Василенко О.В., Кузьмицкая Т.М., и др. Взаимодействие моноклональных антител к структурным белкам вакцинного вируса Внуково-32 с другими вирусами группы бешенства //Вопр. вирусологии.- 1991.-Т. 36, №5.-С. 399-402.

4. Груздев К.Н., Недосеков В.В. Бешенство животных. М.: Аквариум, 2001.-303 с.

5. Зайковская A.B., Аксенов В.И., Рассадкин Ю.Н., Шестопалов А.Н. Анализ заболеваемости бешенством в Новосибирской области //Болезни диких жив-х.: Труды междунар. науч.-практ. конф. Покров, - 2004. - С. 51-55.

6. Иванов B.C., Кузнецов П.П., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством животных и человека //Вестн. РАСХН. 2000. -№2.-С. 63-65.

7. Ковалев H.H., Усеня М.М. Новые подходы к профилактике бешенства //Биол-экол. пробл. заразных болезней диких жив-х. и их роль в патологии с.-х. жив-х. и людей: матер, междун. науч.-практ. конф. -Покров, 2002. С. 124-127.

8. Конопаткин A.A., Бакулов И.А., Нуйкин Я.В. и др. Эпизоотология и инфекционные болезни сельскохозяйственных животных. М.: Колос, 1984.-544 с.

9. Недосеков В.В. Разработка и совершенствование средств и методов оценки эффективности вакцин против бешенства: Автореф. дис. канд. вет. наук. Покров, 1998. - 26 с.

10. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Стрижаков A.A., Середа А.Д., Кирюхина Т.Р. Получение и характеризация моноклональных антител к структурным белкам вируса бешенства штамма «ТС-80» //Доклады

11. РАСХН. 1999. - №4. - С. 38-40.

12. Недосеков В.В., Пантюшенко М.С., Цыбанов Я.С., Цыбанов С.Ж. Идентификация арктических и классических вирусов в ПЦР //Вет. газета. -2002.-№21.-С. 4.

13. Недосеков В.В. Современные вакцины против бешенства животных //Ветеринария. 2003. - №8. - С. 23-25.

14. Отчёт Департамента ветеринарии за 1999 год. М., 2000. - 174 с.

15. Равилов А.З., Хисматтулина H.A., Юсупов Р.Х. и др. Комплексное изучение бешенства животных и меры борьбы с ним //Ветеринария. -2000.-№6.-С. 7-10.

16. Селимов М.А., Ботвинкин А.Д., Хозинский В.В., Грибанова Л.Я. Новые данные о распространении Р-41 положительных штаммов рабическоговируса в арктическом и виеарктическом регионах //Журнал микробиол., эпидемиол., иммунобиол. 1994. - №2. - С. 53-56.

17. Сидоров Г.Н., Ботвинкин А.Д., Кузьмин И.В. Особенности поведения диких млекопитающих, инфицированных вирусом бешенства //Зоологическийжурн.- 1998.-Т. 77.,№11.-С. 1310-1316.

18. Таршис М.Г., Черкасский Б.Л. Болезни животных опасные для человека.- М.: Колос, 1997. С. 34-39.

19. Фоменко М.В., Тутов И.К. Порядок и оценка результатов лабораторных исследований при диагностике бешенства //Вестн. ветеринарии, Ставрополь. 1997. - №4. - С. 47-50.

20. Черкасский Б.Л. Эпидемиология и профилактика бешенства. М.: Медицина, 1985. 287 с.

21. Шестопалов A.M., Аксёнов В.И., Рассадкин Ю.Н., Устинова E.H. Обстановка по рабической инфекции в Новосибирской области //Журн. микробиол. 1999. - №6. - С. 83-84.

22. Эргашев И.Э., Холматов З.Б. Применение биологической пробы для подтверждения диагноза бешенства //Судебно-медицинская экспертиза.- 1990. -№1.- С. 55-56.

23. Arai Y.T., Yamada K., Kameoka Y., et al. Nucleoprotein gene analysis offixed and street rabies virus variants using RT-PCR //Arch. Virol. 1997. -V. 142. P. 1787-1796.

24. Arai Y.T., Kuzmin I.V., Kameoka Y., Botvinkin A.D. New Lyssavirus genotype from the lesser mouse-eared bat (Myotis blythi), Kyrghyzslan //Emerg. inf. Dis. 2003. - V.9, №.3. - P. 333-337.

25. Ardoin P. Historique de la rage jusqu'à Pasteur //Med. Mal. Infect. 1984. -V. 14, №4.-P. 154-158.

26. Artois M. Transmission of rabies and impact on a population of foxesmammalian, Vulpes vulpes L.) //Mesogil. 1992. - № 52. - P. 82.

27. Baer G.M., Abelseth M.K., Debbie J.G. Oral vaccination of foxes against rabies //Am. J. Epidemiol. 1971. - V. 93. - P. 487-490.

28. Bacon P.J., Macdonald D.W. To control rabies: vaccinate foxes //New Scientist. 1980. - V. 87, № 1216. - P. 640-645.

29. Ballard W.B., Follmann E.H., Ritter D. et al. Rabies and canine distemper in ^ an arctic fox population in Alaska //J. Wildlife Dis. 2001. - V. 37, № 1. - P.133.137.

30. Beauregard M., Boulanger P., Webster W.A. The use of fluorescent antibody staining in the diagnosis of rabies //Can. J. Comp. Med. and Vet. Science. -1965. V. 29, № 6. - P. 141-147.

31. Bingham J., Schumacher C.L., Aubert M.F.A. et al. Innocuity studies of SAG-2 oral rabies vaccine in various Zimbabwean wild non-target species

32. Vaccine. 1997. - V. 15, № 9. - P. 937-943.

33. Bingham J., Schumacher C.L., Aubert M.F.A., et al. Efficacy of SAG2 oral rabies vaccine in two species of jackal (Canis adustus and Canis mesomelas)

34. Vaccine. 1999. -V. 17. - P. 551-558.

35. Black J.G., Lawson K.F. Sylvatic rabies studies in the silver fox (Vulpes vulpes). Susceptibility and immune response //Can. J. Comp. Med. 1970. V. 34, №4-P. 309-311.

36. Blancou J. Early methods for the surveillance and control of rabies in animals //Rev. Sei. Tech. Off. Int. Epiz. 1994. - V. 13. - P. 361-372.

37. Blancou J., Meslin F.-X. Modified live-virus rabies vaccines for oral immunization of carnivores //Laboratory Techniques in Rabies /Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, H. Koprowski. Geneva, 1996. - P. 88-93.

38. Bordignon J., Comin F., Ferreira S., et al. Calculating rabies virus neutralizing antibodies titers by flow cytometry //Rev. Inst. Med. Trop. 2002. - V. 44, №. 3. - P. 151-154.

39. Botvinkin A.D., Poleschuk E.M., Kuzmin I.V. et al. Novel Lyssaviruses isolated from bats in Russia //Emerg. Inf. Dis. 2003. - V. 9. №. 12 - P. 1623-1625.

40. Bourhy H., Kissin B., Tordo N. Molecular diversity of the lyssavirus genus //Virology. 1993. - V. 194. - P. 70-91.

41. Bourhy H., Perrin P. Rapid rabies enzyme immunodiagnosis (RREID) for rabies antigen detection //Laboratory Techniques in Rabies /Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, H. Koprowski. Geneva, 1996. - P. 105-112.

42. Bourhy H., Kissi B., Audry L. et. al. Ecology and evolution of rabies virus in Europe //J. General Virol. 1999. - V. 80. - P. 2545-2557.

43. Brochier B., Godfroid J., Costy F. et al. Vaccination of young foxes (Vulpes vulpes) against rabies: trials with inactivated vaccine administered by oral and parenteral routes //Ann. Rech. Vet. 1985. - V. 16. - P. 327-333.

44. Brochier B., Aubert M.F.A., Pastoret P.-P. et al. Field use of a vaccina-rabies recombinant vaccine for the control of sylvatic rabies in Europe and North America //Rev. Sei. Tech. Off. Int. Epiz. 1996. - V. 15, № 3. - P. 947-970.

45. Chhabra M., Ichhpujani R.L., Tewari K.N., Lai S. Human rabies in Delhi //Indian J. of Pediatrics. 2004. - V. 72. - P. 217-220.

46. Clark H.F. Rabies serogroup viruses in neuroblastoma cells: propagation, "Autointerference", and apparently random back-mutation of attenuated viruses to the virulent state //Infection and Immunity. 1980. - V. 27. - P. 1012-1022.

47. Clark K.A., Neil S.U., Smith J.S. Epizootic canine rabies transmitted by coyotes in south Texas //J. Am. Vet. Med. Assoc. 1994. - V. 204. - P. 536540.

48. Constantine D.G., Humphryg G.L., Herbenick T.B. Rabies in Myotis thysanodes, Lasiurus ega, Euderma maculatum and Eumops perotis in Colifornia //J. Wildlife Dis. 1979. - V. 15. - № 2. - P. 343-345.

49. Conzelmann K., Cox J., Schneider L., Thiel H. Molecular cloning and complete nucleotide sequence of the attenuated rabies virus SAD B19 //Virology. 1990. - V. 175. - P. 485-499.

50. Crepin P., Audry L., Rotivel Y. et al. Intravitam diagnosis of human rabies by PCR using saliva and cerebrospinal fluid //J. Clin. Microbiol. 1998. - V. 36, №4.-P. 1117-1121.

51. Cox J.H., Schneider L.G., Muller W.W. Eine antigenvariante der fuchstollwut in Europa //Tierarztl. Umschau. 1992. - Bd. 47. - S. 824-828.

52. Dean D.J., Abelseth M.K., Atanasiu P. The fluorescent antibody test //Laboratory Techniques in Rabies /Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, H. Koprowski. Geneva, 1996. - P. 88-93.

53. Delpietro H.A., Larghi O.P., Russo R.G. Virus isolation from saliva and salivary glands of cattle naturally infected with paralytic rabies //Preventive Vet. Med. 2001. - V. 48. - P. 223-228.

54. De Mattos C.A., De Mattos C.C., Smith J.S.et al. Genetic characterization of rabies field isolates from Venezuela //J. Clin. Microbiol. 1996. - V. 34, № 6. -P. 1553-1558.

55. De Mattos C.C., De Mattos C.A., Loza-Rubio E. et al. Molecular characterization of rabies virus isolates from Mexico: implications for transmission dynamics and human risk //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999. - V. 6, №4.-P. 587-597.

56. Desmettre P., Languet B., Chappuis G. et al. Use of vaccinia rabies recombinant for oral vaccination of wildlife //Vet. Microbiol. 1990. - V. 23.- P. 227-236.

57. Rug T.R., Fishbein D.B., Talamante H.E.et al. Urban epizootic of rabies in Mexico: epidemiology and impact of animal bite injures //Bull. WHO. 1993. -V. 5, №71.-P. 615-624.

58. Esterhuijsen J., Prehaud C., Thomos G.R. A liquid-phase blocking ELISA for detection of antibodies to rabies virus //J. Virol. Meth. 1995. - V. 51. P.31-42.

59. Favoretto S.R., Carrier M.L., Cunha E.M.S. et al. Antigenic typing of Brazilian rabies virus samples isolated from animals and humans, 1989-2000 //Rev. Inst. Med. Trop. 2002. - V. 44, № 2. - P. 91-95.

60. Fekadu M., Chandler F.W., Harrison A.K. Pathogenesis of rabies in dogs inoculated with Ethiopian rabies virus strain. Immunofluorescence, histological and ultrastructural studies of central nervous system //Arch. Virol.- 1982.-V. 71, №2.-P. 109-126.

61. Fekadu M., Nesby S.L., Shaddock J.H.et al. Immunogenicity, efficacy and safety of an oral rabies vaccine (SAG2) in dogs //Vaccine. 1996. - V. 14, № 6. - P. 465-468.

62. Flamand A., Coulon P., Lafay F., Tuffereau C. Avirulent mutants of rabies virus and their use as a live vaccune //Trends Microbiol. 1993. - V. I. - P. 317.

63. Fodor 1., Grabko V.I., Khozinski V.V., Selimov M.A. Nucleotide and deduced amino acid sequences of glycoprotein gene of rabies virus vaccine strain Vnukovo-32 //Arch. Virol. 1994. - V. 135. - P. 451-459.

64. Follmann E.H., Ritter D.G., Baer G.M. Evaluation of the safety of two 4 attenuated oral rabies vaccines, SAG1 and SAG2, in six Arctic mammals

65. Vaccine. 1996. - V. 14, № 4. - P. 270-273.

66. Fooks A.R., McElhinney L.M., Brookes S.M. et al. Rabies antibody testing and the UK pet travel scheme //Vet. Rec. 2002. - V. 150, № 14. - P. 428430.

67. Fraser G.C., Hooper P.T., Lunt R.A. et al. Encephalits caused by a lyssavirus in fruit bats in Australia //Emerg. Infect. Dis. 1996. - V. 2. - P. 327-331.

68. Gamoh K., Senda M., Itoh O. et al. Use of ELISA for in vitro potency test of # rabies vaccines for animal use //Biologicals. 1996. - V. 24. - P. 95-101.

69. Gould A.R., Hyatt A.D., Lunt R. et al. Characterization of a novel lyssavirus isolated from Pteropid bats in Australia //Virus. Res. 1998. - V. 54. - P. 165-187.

70. Goldwasser R.A., Kissling R.E. Fluorescent antibody staining of street and fixed rabies virus antigens //Proc. Soc. Exper. Biol. Med. 1958. - V. 98. - P. 219-223.

71. Goldwasser R.A., Kissling R.E., Carski T.R. Fluorescent antibody staining ofrabies virus antigens in the salivary glands of rabid animals //Bull. WHO. -1959.-V. 20.-P. 579-588.

72. Goto H., Minamoto N., Ito H., Ito N. et al. Mapping of epitopes and structural analysis of antigenic sites in the nucleoprotein of rabies virus //J. Gen. Virol. -2000.-V. 81.-P. 119-127.

73. Gram G. Rabies situation and oral vaccination of foxes in Austria //WHO Conference on Oral Immunization of Foxes Against Rabies in Central and Eastern Europe. Slovenia, Portroz, 1996. P. 33-43.

74. Gribencha S.V., Gribanova L.Y., Malkov G.B., Barinsky I.F. Populationstructure of some street rabies virus strains //Arch. Virol. 1989. - V. 104, № 34. p. 347-350.

75. Guyatt K.J., Twin J., Davis P. et al. A molecular epidemiological study of Australian bat lyssavirus //J. Gen. Virol. 2003. - V. 84. - P. 485-496.

76. Hamir A.N., Moser G., Wampler T. et al. Use of single anti-nucleocapsid monoclonal antibody to detect rabies antigen in fonnalin-fixed, para Hin-embedded tissues //Vet. Rec. 1996. - V. 138. - P. 114-115.

77. Hanlon C.A., Buchanan J.R., Nelson E. et al. A vaccinia-vectored rabies vaccine field trial: ante- and post-mortem biomarkers //Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz.- 1993.-V. 12, № 1. P. 99-107.

78. Heaton P.R., McElhinney L.M., Lowings J.P. Detection and identification of rabies and rabies related viruses using rapid-cycle PCR //J. Virol. Meth.1999.-№81.-P. 63-69.

79. Hostnik P. The modification of fluorescent antibody virus neutralization (FAVN) test for detection of antibodies to rabies virus //J. Vet. Med. 2000. -V. 47. - P. 423-427.

80. Hostnik P. Rabies in Slovenia and its control //WHO meeting of rabies control for veterinary experts in middle and east Europian countries. Estonia, Tallin,2000.-P. 15-20.

81. International animal health code: mammals, birds and bees. Paris: OIE, 2000.-P. 153-155.

82. Ito M., Itou T., Sakai T. et al. Detection of rabies virus RNA isolated from several species of animals in Brazil by RT-PCR //J. Vet. Med. Sci. 2001. -V. 63, № 12.-P. 1309-1313.

83. Ito N., Kakemizu M., Ito K.et al. A comparison of complete sequences of the attenuated RC-HL strain of rabies virus used for production of animal vaccine in Japan, and the parental Nishigahara strain //Microbiol. Immunol. 2001. -V. 45, №1. -P.51-58.

84. Johnson N., McElhinney M., Smith J. et al. Phylogenetic comparison of thegenus Lyssavirus using distal coding sequences of glycoprotein and nucleoprotein genes //Arch. Virol. 2002. - V. 147. - P. 2111-2123.

85. Johonson P.K., Swoveland P.T., M.S., Emmons R.W. Diagnosis of rabies by immunofluorescence in trypsin-treated histologic sections //J. Am. Med.tt Assoc.- 1980.-V. 4,№ 1.-P. 41-43.

86. Kantakamalakul W., Thongcharoen P., Puthavathana P. et al. Prevalence of rabies and hantaan virus infections in commensal rodents and shrews trapped in Bangkok //J. Med. Assoc Thai. 2003. - V. 86, № 11. - P. 1008-1014.

87. Kasempimolporn S., Saengseesom W., Lumlertdacha B., Sitprija V. Detection of rabies virus antigen in dog saliva using a latex agglutination test //J. Clin. Microbiol. 2000. - V. 38, № 8. - P. 3098-3099.

88. Katayama S., Yamanaka M., Ota S., Shimizu Y. A new quantitive method forrabies virus by detection of nucleoprotein in virion using ELISA //J. Vet. Med. Sci. 1999. - V. 61, № 4. - P. 411-416.

89. Kent R. Recombinant vaccine technology in veterinary medicine //Veterinary clinics of North America. 2001. - V. 31, № 3. - P. 535-538.

90. Kieny M.P., Lathe R., Drillien R. et al. Expression of rabies virus glicoprotein from a recombinant vaccina virus //Nature. 1984. - V. 312. - P. 163-166.

91. Kihm V., Flamand A., Pastoret P.P., Peterhans E. Round table on ^ epidemiology and control of fox rabies //Adv. Vet. Virol. 1992. - V. 33. - P.297.301.

92. King A., Crick J. Rabies-related viruses //Campbell J.B., Charlton K.M. Rabies. Boston, Kluwer, 1988. - P. 177-199.

93. Kohler G., Milstein C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity //Nature. 1975. - V. 265. - P. 495.

94. Koprowski P. The mouse inoculation test /Laboratory Techniques in Rabies

95. Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, H. Koprowski. Geneva, 1996 - P. 85-93.

96. Krebs J.W., Wilson M.L., Childs J.E. Rabies — epidemiology, prevention, and future research //J. Mammalogy. 1995. - V. 76, № 3. - P. 681-694.

97. Krebs J.W., Wheeling J.T., Childs J.E. Rabies surveillance in the United States during 2002 //JAVMA. 2003. - V. 223, № 12. - P. 1736-1748.

98. Kulonen K., Neuvonen E., Topi M. Methods for detecting arctic rabies virus in dilution series of field samples //J. Virol. Meth. 1991. - № 32. - P. 149155.

99. Kulonen K., Boldina I. Differentiation of two rabies strains in Estonia with reference to recent finish isolates //J. Wildlife Dis. 1993. - V. 29, №2. - P. 209-213.

100. Kulonen K., Boldina I. No rabies detected in voles and field mice in a rabies-endemic area //J. Vet. Med. 1996. - V. 43. - P. 445-447.

101. Kulonen K., Fekadu M., Whitfield S., Warner C.K. An evaluation of immunofluorescence and PCR methods for detection of rabies in archival carnoy-fixed, paraffin-embedded brain tissue //J. Vet. Med. 1999. - V. 46. -P. 151-155.

102. Kuzmin I.V. An Arctic fox rabies virus strain as the cause of human rabies in Russian Siberia //Arch. Virol. 1999. - V. 144. - P. 627-629.

103. Lafay F., Coulon P., Astic L. et al. Spread of the CVS strain of rabies virus and of the avirulent mutant AvOl along the olfactory pathways of the mouse after intranasal inoculation //Virology. 1991. - V. 183, № 1. - P. 320-329.

104. Lafon M. Subversive neuroinvasive strategy of rabies virus //Arch. Virol. -2004, Suppl.-V. 18.-P. 149-159.

105. Lawson K.F., Bachman P. Stability of attenuated live virus rabies vaccine in baits targeted to wild foxes under operational conditions //Can. Vet. J. 2001. -V. 42.-P. 368-374.

106. Linhart S.B. Some factors affecting the oral vaccination of free-ranging carnivores //Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1993. - V. 12, № 1. - P. 109-113.

107. Linhart S.B., King R., Zamir S. et al. Oral rabies vaccination of red foxes and golden jackals in Israel: preliminary bait evaluation //Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1997. - V. 16, № 3. - P. 874-880.

108. Lodmell D.L., Ray N.B., Ulrich J.T., Ewalt L.C. DNA vaccination of mice against rabies virus: effects of the route of vaccination and the adjuvant monophosphoril lipid A (MPL®) //Vaccine. 2000. - V. 18. - P. 1059-1066.

109. Luo T.R., Minamoto N., Hishida M. et al. Antigenic and functional analyses of glycoprotein of rabies virus using monoclonal antibodies //Microbiol. Immunol. 1998. V. 42, № 3. - P. 187-193.

110. Macdonald D.W., Bacon P.J. Fox society, contact rate and rabies epizootology //Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1982. - № 1-3. - P. 247-256.

111. Maclnnes C.D., Smith S.M., Tinline R.R. et al. Elimination of rabies from red foxes in eastern Ontario //J. Wildlife Dis. 2001. - V. 37, № l. p. 119.132.

112. Masson E., Cliquet F., Aubert M. et al. Safety study of the SAG2 rabies virus mutant in several non-target species with a view to its future use for the immunization of foxes in Europe //Vaccine. 1996. - V. 14, № 16. - P. 15061510.

113. Matouch O. Rabies control by oral vaccination in the Czech Republic //WHO Conference on Oral Immunization of Foxes Against Rabies in Central and Eastern Europe. Slovenia, Portroz, 1996. - P. 12-15.

114. McColl K.A., Tordo N., Aguilar Setien A. Bat Lyssavirus infections //Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 2000. - V. 19, № 1. - P. 177-196.

115. Modelska A., Dietzschold B., Sleysh N. et al. Immunization against rabies with plant-derived antigen //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95, № 5. -P. 2481-2485.

116. Morimoto K., Hooper D.G., Spitsin S. et al. Pathogenicity of different rabies virus variants inversely correlates with apoptosis and rabies virus glycoproteinexpression in infected primary neuron cultures //J. Virol. 1999. - V. 73, № l.-P. 510-518.

117. Mutinelli F., Tollis M. Rabies in Italy //WHO Conference on Oral Immunization of Foxes Against Rabies in Central and Eastern Europe.

118. Slovenia, Portroz, 1996. P. 47-51.

119. Muller T. F., Schuster P., Vos A.C. et al. Effect of maternal immunity on the immune response to oral vaccination against rabies in young foxes //Am. J. Vet. Res. 2001.-V. 62, №7.-P. 1154-1158.

120. Muller T., Schuster P., Wenzel U. et al. Maternal immunity and the immune response of fox cubs (Vulpes vulpes) to oral vaccination against rabies //Abstracts 10th Annual Rabies in the Americas Meeting. USA, San Diego, 1999.-P. 83.

121. Nadin-Davis S.A., Simani S., Armstrong J. et al. Molecular and antigenic characterization of rabies viruses from Iran identifies variants with distinctepidemiological origins //Epidemiol. Infect. 2003. - V. 131. - P. 777-790.

122. Nandy S. Recent advancement in the diagnosis of rabies //Asian livestock. -1994.-V. 19, №11.-P. 150-152.

123. Neubert A., Shuster P., Muller T. et al. Immunogenicity and efficacy of the oral rabies vaccine SAD B19 in foxes //J. Vet. Med. 2001. - V. 48. - P. 179183.

124. Nogueira Y.L. Estimate of validaty of a new method for the isolation of rabies virus //Rev. Saude Publica. 2004. - V. 38, № 2. - P. 1-8.

125. Nyberg M., Kulonen K., Neuvonen E. et al. An epidemic of sylvatic rabies in

126. Finland descriptive epidemiology and results of oral vaccination //Acta. Vet. Scand. - 1992. - V. 33. - P. 43-57.136a. Manual of Standards for diagnostic techniques, 2004. OIE, Geneva.

127. Olson C.A., Werner P.A. Oral rabies vaccine contact by raccoons and nontarget species in a field trial in Florida //J. Wildlife Dis. 1999. - V. 35, № 4. - P. 687-695.

128. Olson C.A., Mitchell K.D., Werner P.A. Bait ingestion by free-ranging raccoons and nontarget species in an oral rabies vaccine field trial in Florida //J. Wildlife Dis. 2000. - V. 36, № 4. - P. 734-743.

129. Osorio J.E., Tomlinson C.C., Frank R.S. et al. Immunization of dogs and cats with a DNA vaccine against rabies virus //Vaccine. 1999. - V. 17. - P. 1109-1116.

130. Palmer D. G., Ossent P., Suter M.M., Ferrari E. Demonstration of rabies viral antigen in paraffin tissue sections: Comparison of immunofluorescence technique with the unlabeled antibody enzyme method //Am. J. Vet. Res. -1985.-V. 46, № l.-P. 283-286.

131. Pastoret P.P., Brochier B. Epidemiology and control of fox rabies in Europe //Vaccine. 1999. - V. 17. - P. 1750-1754.

132. Peharpre D., Cliquet F., Sagne E. et al. Comparison of visual microscopic and computer-automated fluorescence detection of rabies virus neutralizing antibodies //J.Vet. Diagn. Invest. 1999. - V. 11. - P. 330-333.

133. Perrin P., Rollin P.E., Sureau P. A rapid rabies enzyme immuno-diagnosis (RREID) useful and simple technique for the routine diagnosis of rabies //J. Biol. Stand. 1986. - № 14. - P. 217-222.

134. Perrin P., Jacob Y., Aguilar-Setien A. et al. Immunization of dogs with a DNA vaccine induces protection against rabies virus //Vaccine. 2000. - V. 18.-P. 479-486.

135. Rabies bulletin Europe. Information. Surveillance. Research. FRG, Tubingen: Federal research center for virus diseases of animals, 2003. - № 4. -27 p.

136. Rabies bulletin Europe. Information. Surveillance. Research. FRG, Tubingen: Federal research center for virus diseases of animals, 2004. - № 2. -28 p.

137. Reculard P. Cell-culture vaccines for veterinary use //Laboratory Techniques in Rabies /Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, H. Koprowski. Geneva, 1996 -P. 314-322.

138. Report of a WHO Consultation on intradermal application of human rabies vaccine. Geneva, 1995. - 19 p.

139. Ronsholt L., Sorensen K.J., Bruschke C.J.M. et al. Clinically silent rabies infection in (zoo) bats //Vet. Ree. 1998. - V. 142, № 19. - P. 519-520.

140. Seghaiter C., Cliquet F., Hammami S. et al. Rabies mass vaccination campaigns in Tunisia: are vaccinated dogs correctly immunized //Am. J. Trop. Med. Hyg. 1999. - V. 61, № 6. - P. 879-884.

141. Separovic S. The current epizootiological situation and immunoprophylaxis of rabies in animals in Republic of Croatia //WHO Conference on Oral Immunization of Foxes Against Rabies in Central and Eastern Europe. -Slovenia, Portroz, 1996. P. 44-46.

142. Shluter H. Rabies control in eastern and central Europe. Country report based on questionnaire //WHO Conference on Oral Immunization of Foxes Against Rabies in Central and Eastern Europe. Slovenia, Portroz, 1996. - P. 61-86.

143. Schneider L.G., Cox J.H. Ein Feldversuch zur oralen immuniserung von fuchsen gegen tollwut in der Bundesrepublik Deutschland //Tierarztl Umschau. 1983. - Bd. 5. - S. 315-324.

144. Serra-Cobo J., Amengual B., Abellan C., Bourhy H. European bat Lissavirus infection in Spanish bat populations //Emerging Inf. Dis. 2002. - V. 8, № 4. -P. 413-420.

145. Sihvonen L., Kulonen K., Neuvonen E., Pekkanen K. Rabies antibodies in vaccinated dogs //Acta Vet. Scand. 1995. - V. 36, № 1. - P. 87-91.

146. Sihvonen L., Kulonen K., Neuvonen E. Immunization of cattle against rabies using inactivated cell culture vaccines //Acta Vet. Scand. 1994. - V. 35, № 4.-P. 371-376.

147. Sihvonen L., Kulonen K., Sovery T., Nieminen M. Rabies antibody titles in vaccined reindeer //Acta Vet. Scand. 1993. - V. 34, № 2. - P. 199-202.

148. Sikes R.K. Pathogenesis of rabies in wildlife. Comparative effect of varying doses of rabies virus inoculated into foxes and skunks //Am. J. Vet. Res. -1962. V. 23, № 96. - P. 1041-1051.

149. Smith A.L., Tignor G.H., Emmons R.W., Woodie J.D. Isolation of field rabies virus strains in CER and murine neuroblastoma cell cultures //Intervirology. -1978.-V. 9.-P. 359-361.

150. Smith J.S., Yager P.A., Bear G.M. A rapid reproducible test for determining rabies neutralizing antibody //Bull. WHO. 1973. - V. 5. - P. 35-541.

151. Smith J.S., Seidel H.D. Rabies: a new look at an old disease //Prog. Med. Virol. Basel, Karger, 1993. - V. 40. - P. 82-106.

152. Steck F., Wandeler A., Bichsel P. et al. Oral immunisation of foxes against rabies //Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. 1982. - V. 5. - P. 165-171.

153. Steck F., Wandeler A., Bichsel P. et al. Oral immunisation of foxes against rabies //Zbl. Vet. Med. 1982. B. - V. 29. - P. 372-396.

154. Steele J.H., Fernandez P.J. History of rabies and global aspects //The Natural History of Rabies. 2nd Ed /G.M. Baer, Florida, 1991. - P. 1-24.

155. Svrcek S., Sokol J., Lovas B. et al. Epizootological situation and control of rabies in animals in Slovak Republic //WHO Conference on Oral Immunization of Foxes Against Rabies in Central and Eastern Europe. Slovenia, Portroz, 1996. P. 16-32.

156. Sykes-Andral M. Comportment des animaux sauvages enrages etudies au centre national d'etudes sur la rage //Comp. Immun. Microbiol. Infect. Dis. -1982. -№ 1-3.-P. 337-342.

157. Thoulouze M-I., Lafage M., Montano-Hirose J.A., Lafon M. Rabies virus infects mouse and human lymphocytes and Induces apoptosis //J. Virol. -1997. V. 71, №10. - P. 7372-7380.

158. Tierkel E.S., Atanasiu P. Rapid microscopic examination for Negri bodies and preparation of specimens for biological tests //Laboratory Techniques in Rabies /Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, H. Koprowski. Geneva, 1996 - P. 55-62.

159. Tishendorf L., Thulke H., Staubach G. et al. Chance and risk of controlling rabies in large-scale and long-term immunized fox population //Proc. R. Soc. Lond. B. 1998. - V. 265. - P. 839-846.

160. Tollis M., Buonavoglia C., Trani L., Vignolo E. Sensitivity of different cell lines for rabies virus isolation //J. Vet. Med. B. 1988. - V. 35, № 7. - P. 504-508.

161. Tordo N., Poch O. Structure of rabies virus //Rabies /Ed. J.B. Campbell and K.M. Charlton. Boston, 1988. - P. 25-45.

162. Tordo N., Bourhy H., Sacramento D. PCR technology for Lyssavirus diagnosis //The polymerase chain reaction (PCR) for human viral diagnosis IEd. Clewley J. et al. London, - 1995. - P. 125-145.

163. Tordo N., Sacramento D., Bourhy H. The polymerase chain reaction (PCR) technique for diagnosis, typing and epidemiological studies of rabies //Laboratory Techniques in Rabies /Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, H. Koprowski. Geneva, 1996-P. 157-170.

164. Torres-Anjel M.J., Montano-Hirose J., Cazabon E.P.I. et al. A new approach to the pathobiology of rabies virus as aided by immunoperoxidase staining //Am. Assn. Vet. Lab. Diagn. 1984. Oct. 21-23. - P. 1-26.

165. Tuffereau C., Leblois M., Benejean J. et al. Arginin or lisin in position 333 of ERA and CVS glycoprotein is necessary for rabies virulence in adult mice //Virology. 1989. - V. 172. - P. 206-212.

166. Umoh J.U., Cox J.H., Shneider L.G. Antigenic characterization of street rabies virus isolates from Nigeria using monoclonal antibodies //J. Vet. Med. 1990 - V. 37. - P. 222-228.

167. Van der Poel W.H.M., Van der Heide R., Van Amerongen G. et al. Characterization of recently isolated lissavirus in frugivorous zoo bats //Arch. Virol.-2000.-V. 145. P. 1919-1931.

168. Vos A., Neubert A., Aylan O. et al. An update on safety studies of SAD B19 rabies virus vaccine in target and non target species //Epidemiol. Inlect. -1999.-V. 123.-P. 165-175.

169. Vos A., Muller T., Schuster P. et al. Oral vaccination of foxes against rabies with SAD B19 in Europe, 1983-1998: A review //Vet. Bull. 2000. - V. 70, № l.-P. 1-6.

170. Vos A., Muller T., Selhorst T. et al. Optimising spring oral vaccination campaigns of foxes against rabies //Dtsch. tierarztl. Wschr. 2001. - V. 108. -P. 55-59.

171. Wachendorfer G. Gegenwartiger Stand der Vakzination von FUchsen gegen Tollwut //Der praktische Tierarzt. 1976. - V. 12. - P. 801—808.

172. Wandeler A.I., Bauder W., Prochaska S., Steck F. Small mammal studies in a SAD baiting area //Comp. Immun. Microbiol. Inf. Dis. 1982. - V. 5. - P. 173-176.

173. Wandeler A.I., Matter H.C., Kappeler A., Budde A. The ecology of dogs and canine rabies: a selective review //Rev. Sci. Tech. Off. Int. Epiz. 1993. - V. 12, № 1.-P. 51-57.

174. Wandeler A.I. Oral immunization against rabies: afterthoughts and foresight //Swiss Arch. Vet. Med. 2000. August. - P. 455-462.

175. Warrel D.A., Warrel M.J. Human rabies: a continuing challenge in the tropical world //Schweiz Med. Wochenschr. 1995. - V. 125. - P. 879-885.

176. Watson H.D., Tignor G.H., Smith A.L. Entry of rabies virus into peripheral nerves of mice //J. Gen. Virol. 1981. - V. 56. - P. 371-382.

177. Webster W.A., Casey G.A. Virus isolation in neuroblastoma cell culture //Laboratory Techniques in Rabies /Ed. Meslin F.-X., M.M. Kaplan, II. Koprowski. Geneva, 1996 - P. 96-103.

178. Weekly Epidemiological Record. 1995. - № 37. - P. 264-266.

179. Westerling B. A Field trial on oral immunization of raccoon dogs and foxes against rabies in Finland 1988-1989 //Rabies Bull. Eur. 1989. - № 2. - P. 912.

180. Wilkinson L. Understanding the nature of rabies: an historical perspective //Rabies /Ed. J.B. Campbell, K.M. Charlton. Boston, Dordrect; London, 1988.-P. 1-23.

181. Wiktor T.J., Clark H.F. Application of the plaque assay technique to the study of rabies virus-neutralizing antibody interactions //Ann. Microbiol. 1973. -V. 124 A.-P. 271-282.

182. Wiktor T.J., Koprowski H. Monoclonal antibodies against rabies virus produced by somatic cells hybridization: detection of antigenic variants //Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1978. - V. 75. - P. 3938-3942.

183. Winkler W.G., Bogel K. Control of rabies in Wildlife //Scientific Am. 1992.1. June. P. 56-62.

184. Zalan E., Wilson C., Pukitis D. A microtest for the quantitation of rabies virus neutralizing antibodies //J. Biol. Standart. 1979. - V. 7, № 3. - P. 213-220.

185. Zimmer K., Wiegand D., Manz D. et al. Evaluation of five different methods for routine diagnosis of rabies //J. Vet. Med. 1990. - V. 37 - P. 392-400.