Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA

Цеденхуу, Пуревхуу

Диссертации по ветеринарии → Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA

ДИССЕРТАЦИЯ

АВТОРЕФЕРАТ

Цеденхуу, Пуревхуу Владимир 2005 г.

Ученая степень: кандидата ветеринарных наук

ВАК РФ: 16.00.03

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA

л/g

На правах рукописи

ЦЕДЕНХУУ ПУРЕВХУУ

КУЛЬТУРАЛЬНАЯ ИНАКТИВИРОВАННАЯ ВАКЦИНА ПРОТИВ БЕШЕНСТВА ИЗ ШТАММОВ «ВНИИЗЖ» И «ERA»

16.00.03 «Ветеринарная микробиология,

вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология»

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

Владимир - 2005

Работа выполнена в ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Научный руководитель - доктор ветеринарных наук,

старший научный сотрудник МИХАЛИШИН Валерий Васильевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

СТРИЖАКОВ Александр Анатольевич; кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник СТАРОВ Сергей Константинович

Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский и

технологический институт биологической промышленности (г.Щелково)

Защита диссертации состоится « 04 » 2005г. в /0°° часов на заседании диссертационного совета Д 220.015.01 при ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» по адресу: 600901, Г.Владимир, п.Юрьевец

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных»

Автореферат разослан 63 2005г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

^кг^Л^ Г.М.Семенова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Бешенство относится к группе опасных инфекционных заболеваний человека и животных, характеризующихся поражением центральной нервной системы, практически абсолютной летальностью и является одним из наиболее распространенных зооантропонозов. По оценке ряда исследователей, это заболевание относится к зоонозам, наносящим наибольший экономический ущерб (В.П.Назаров, 1961; М.А.Селимов, 1987).

Ежегодно в мире погибает от бешенства свыше 50 тысяч людей и более 1 миллиона животных (К.Н.Груздев, В.В.Недосеков, 2001). Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуация по бешенству наблюдается более чем в 110 странах мира. По оценке ВОЗ, ежегодно получают укусы и имеют контакты с подозреваемыми животными около 10 млн. человек, 4 млн. из их числа получают специальную медицинскую помощь (С.ИДжупина, 2002).

Вспышки болезни регистрируются среди диких и домашних животных, что в конечном счете обуславливает заболеваемость и людей (М.А.Селимов, 1987; В.А.Ведерников, 2002).

В системе мер борьбы с бешенством домашних и диких животных в современных условиях решающее значение приобретает своевременная и надежная лабораторная экспресс-диагностика. В настоящее время в мировой практике диагноз на бешенство ставится на основании результатов прямого обнаружения антигена вируса в головном мозге животных реакцией прямой иммунофлюоресценции (РПИФ), твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФА), а также изоляцией вируса биопробой.

Вакцинопрофилактика бешенства занимает ведущее место в борьбе с этим заболеванием. Для профилактики бешенства применяются как живые, так и инактивированные вакцины. В последние годы наиболее часто применяют инактивированные вакцины.

Для вакцинации домашних и сельскохозяйственных животных применяют, как правило, инактивированные вакцины, а для профилактики бешенства среди диких млекопитающих - вирусвакцины орального

применения (П.П.Кузнецов, В.С.Иванов, С.В.Кузнецова, 1979; А.В.Борисов и др. 2002).

При выборе вакцины особое внимание обращают на безопасность препарата и длительность иммунитета у животных.

Для производства вакцины необходим штамм вируса, обладающий высокими иммуногенными свойствами и сохраняющий эти свойства в процессе культивирования и хранения.

В современной биотехнологии при производстве антирабических вакцин используют различные вакцинные штаммы, которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах (ВНК-21. ПС, Vero и др.), применяя различные методические приемы - пристеночный монослой, суспензионный и псевдосуспензионный методы (М.А.Селимов, 1961, 1982; В.С.Иванов, 1995; И.Ф.Вишняков и др., 1998; В.В.Михалишин и др., 2001).

Для массового выпуска вакцины требуются методы культивирования вируса бешенства, при которых его иммуногенные свойства не изменяются, и при этом вирус накапливается в высоких титрах, исключая необходимость концентрирования при изготовлении вакцины.

Для получения инактивированных вакцин применяют различные инактнванты и подбирают оптимальные условия инактивации. В таких случаях вирус должен полностью утрачивать свои инфекционные свойства и максимально сохранять антигенность.

Указанные выше проблемы являются актуальными и послужили основной предпосылкой для исследования по разработке технологии изготовления вакцин против бешенства.

Цели и задачи исследования. Главная цель наших исследований состояла в разработке технологии получения экспериментальных образцов культуральной инактивированной вакцины против бешенства из штамма «ВН1ШЗЖ» и «ERA» и изучении иммунобиологических свойств этих вакцин в лабораторных и производственных условиях.

is* > ; -

1 ** V - . -t

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- отработать метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

- разработать метод инактивации культурального вируса бешенства, пригодного для получения антирабических вакцин;

- разработать технологию получения культуральной инактивированной сорбированной и эмульсионной антирабической вакцины;

- изучить иммуногенные свойства полученных инактивированных сорбированных и эмульсионных вакцин в лабораторных условиях;

- проверить иммуногенные свойства полученных вакцин на естественно-восприимчивых животных;

- изучить изменения иммуногенных свойств вакцин при хранении при различных температурах.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

-предложен метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21;

-разработаны методы инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и р-пропиолактоном;

- впервые использован штамм вируса бешенства «ВНИИЗЖ» для производства антирабической культуральной инактивированной вакцины;

-разработана технология получения культуральной инактивированной сорбированной и эмульсионной антирабической вакцины из штамма «ВНИИЗЖ»;

-изучены иммуногенные свойства полученных инактивированных сорбированных и эмульсионных антирабических вакцин;

-проверена иммуногенность полученных вакцин на целевых видах животных;

-изучена сохраняемость вакцин в процессе хранения.

Практическое значение работы.

Показана возможность культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства на культуре клеток ВНК-21 пристеночным и суспензионным способах культивирования.

При инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и Р-пропиолактоном получаются безвредные инактивированные препараты.

Получена безвредная, экологически безопасная и высокоэффективная инактивированная культуральная вакцина из штамма «ВНИИЗЖ», которая может быть рекомендована для практического применения для профилактики бешенства.

Разработанная вакцина из штамма «ВНИИЗЖ» сохраняет исходную активность при хранении при температуре 4-8°С в течение года (срок наблюдения).

Разработан проект НТД на технологию изготовления сорбированной и эмульсионной вакцины из штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства.

Положения, выносимые на защиту:

Методика культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

Результаты инактивации вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) Р-пропиолактоном;

Технология получения культуральной инактивированной адсорбированной антирабической вакцины;

Технология получения культуральной эмульсионной антирабической вакцнны;

Характеристика иммуногенных свойств адсорбированных и эмульсионных антирабических вакцин в лабораторных и производственных условиях;

Изменения иммуногенных свойств вакцин в процессе хранения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы: в Материалах Международной научной конференции, посвященной 45-летию ВНИИЗЖ (г.Владимир, 2003г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию питомника охотничьих собак ВНИИОЗ, (г.Киров, 2004 г.), также докладывались на ученом совете ВНИИЗЖ в 2003-2004 г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 140 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложения.

Диссертация иллюстрирована 24 таблицами. Список использованной литературы включает 231 наименование работ, из них 76 на русском языке.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материалы и методы Материалы

Вирусный материал. В исследованиях использовали следующие штаммы фиксированного вируса бешенства:

- штамм "ВНИИЗЖ", адаптированный к суспензионной культуре клеток ВНК-21, с титром инфекционности 6,50-7,50 lgJI/WM;

- штамм "ERA", выращенный в культуре клеток ПС;

- штамм "CVS''-международный референс-штамм.

Культура клеток. Для изготовления антирабических вакцин использовали:

- перевиваемую линию клеток ВНК-21 почки сирийского хомяка;

- первичную культуру клеток почки свиньи.

Животные. Для расплодки фиксированного вируса использовали следующих животных: овец в возрасте 1-1,5 года; белых мышей массой 10-12 грамм.

Для исследования иммуно-биологических свойств антирабических вакцин использовали: крупный рогатый скот, лошадей, мелкий рогатый скот, собак (беспородных) в возрасте от 2 до 12 месяцев.

Питательные среды. Для выращивания клеток в суспензии и монослое использовали: ростовую среду по прописи ВНИЯИ с 0,25% гидролизата белков мышц (ФГМС) и 0,25 % гидролизата белков крови (ФГБК); среду Игла; фетальную сыворотку крови КРС (импортную) фирмы Sigma; L- глютамин; антибиотики: гентамицин и канамицин; 0,02 % раствор версена; 0,25 % раствор трипсина; 0,15М фосфатно-буферный раствор рН-7,2-7,4; сыворотку КРС производства ВНИИЗЖ.

МЕТОДЫ Культивирование клеток

Клетки ВНК-21 выращивали в среде ВНИЯИ с 5% сыворотки в реакторах объемом 40-2000 литров в течение 1-4 дней при 37°С. Культивирование прекращали, когда концентрация клеток в конечном сосуде составляла 2,2-3,0 млн/мл.

Культивирование вируса бешенства в монослое культуры клеток ВНК-21

Культивирование вируса бешенства вели в клинских матрасах и роллерах. В культуральные сосуды вносили питательную среду, состоящую из среды Игла, 7% сыворотки КРС, 3% глютамина, и антибиотики с широким спектром действия. Затем добавляли культуру клеток ВНК-21, посевная концентрация клеток составляла 140-200 тыс/мл. После чего вносили вирус бешенства, множественность заражения составляла 0,01-0,1 ЛД50/кл. Культивирование проводили при температуре 37°С в течение 48, 72 и 96 часов. Культуральную вируссодержащую жидкость фасовали в отдельные флаконы, маркировали, исследовали на биологическую активность и хранили до использования.

Культивирование вируса бешенства в суспензии культуры клеток ВНК-21

Культивирование вируса бешенства вели в аппаратах КС-40. Посевная концентрация клеток составляла 700-1000 тыс./мл, множественность заражения 0,1- 0,5 ЛД50/КЛ. Культивирование вели при температуре 37°С в течение 48 часов. После окончания культивирования величину рН доводили до 7,0 раствором бикарбоната натрия, брали пробы для биологического контроля, хранили и использовали для изготовления вакцины.

Освежение штамма и подготовка посевного вируса

Для освежения штамма вируса бешенства использовали овец.

Производственный штамм использовали для заражения 3 овец в возрасте 1-1,5 года. Животных заражали интрацеребрально культуральной вируссодержащей жидкостью в дозе 1,0 мл с титром инфекционности не ниже 6,5 ЛД50/МЛ в разведении 10'3 и 10"4 (на растворе Хенкса или среде Игла). При появлении типичной клиники паралитического бешенства на 5-6 сутки овец забивали в атональном состоянии и в асептических условиях извлекали мозговой материал в стерильный флакон и промораживали, затем мозговой материал измельчали, тщательно растирали в фарфоровой ступке. Суспензию готовили традиционным способом на среде Игла с рН 7,4-7,6.

Мозговую суспензию с титром инфекционности вируса не ниже 6,0 1{*ЛД5о/мл исследовали на специфичность с антирабическим у-глобулином.

Очищенную мозговую суспензию фасовали во флаконы и хранили при температуре -40°С.

Определение титра инфекционности вируса

Титр инфекционности вируса определяли на белых мышах массой 1012 г. Для этого готовили 10-кратные разведения суспензии вируса на ФБР (10"1 до 10"7) и каждым разведением заражали 4 белых мышей интрацеребрально в дозе 0,03 мл. За животными вели наблюдение в течение 14 дней. Титр инфекционности рассчитывали по методу Рида и Менча.

Оценка иммуногенной активности инактивированных вакцин

Иммуногенную активность определяли объемным методом (метод NIH). Для этого из каждой серии вакцин брали пробы и из них делали 4 последовательных разведения с 5-ти кратным шагом (1:5, 1:25, 1:125, 1:625) стерильным физиологическим раствором. Разведения вакцины сохраняли до использования в сосуде со льдом. Кавдое разведение референс-вакцины и испытуемой вакцины вводили по 0,5 мл внутрибрюшинно 16 мышам, двукратно с недельным интервалом. 40 невакцинированных мышей сохраняли для титрования тест штамма CVS фиксированного вируса бешенства. Через 7 суток после второй вакцинации мышам вводили по 0,03 мл интрацеребрально разрешающую дозу международного тест штамма CVS, содержащего по предварительному титрованию 100 ЛДзо/О.ОЗмл. Срок наблюдения за инфицированными мышами 14 суток. Одновременно на 40 невакцинированных мышах проводили контрольное титрование вируса. На основании полученных результатов по методу Рида и Менча рассчитывали дозу вируса для контрольного заражения. По результатам учета выживших мышей определяли ЭДзо референс-вакцины и ЭД50 испытуемой вакцины, используя метод Рида и Менча.

Определение титра вируснейтрализующих антител в сыворотке крови

Для этого испытуемые сыворотки предварительно инактивировали в течение 30 минут при температуре 56°С. Готовили ряд двукратных разведений сыворотки и смешивали с равным объемом вируса штамма CVS, содержащим 30-300 ЛДзо/0,03мл.

Полученную смесь выдерживали при температуре 37°С в течение 1 часа и вводили интрацеребрально мышам массой 10-12 г в объеме 0,03 мл. Для каждого разведения сыворотки брали по 4 мыши. Наблюдение за животными вели в течение 21 дня. Регистрировали число погибших животных. Гибель мышей в первые пять дней после заражения считалась неспецифической. Подсчет титра вируснейтрализующих антител проводили по методу Рида и Менча.

Определение стерильности вируссодержащей суспензии, антигена и вакцины

Проверку на стерильность проводили в соответствии с ГОСТ 28085-89. Метод заключается в определении отсутствия роста бактериальной и грибковой микрофлоры в посевах образцов вакцины, вируссодержащей суспензии или антигена на питательных средах.

Определение безвредности вакцины Метод заключается в определении реакции у белых мышей после введения вакцины. Для этого пробу вакцины тщательно перемешивали и подкожно вводили по 0,5 мл 10 мышам. За мышами вели наблюдение 14 дней. Вакцина считается безвредной, если мыши в течение срока наблюдения остались живыми и клинически здоровыми. На месте введения вакцины допускается образование припухлости за счет депонирующих веществ.

Статистическая обработка результатов исследований Для обработки результатов исследований использовали статистические методы в биологии (И.П.Ашмарин, А.А.Воробьев, 1962). Достоверность статистической разницы между средними величинами определяли по методу Н.А.Плохинского, 1970.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Культивирование штамма "ВНИИЗЖ" вируса бешенства Для выращивания вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21 использовали среду Игла с 7-8% сыворотки КРС, инактивированной при 56°С в течение двух часов, с добавлением глютамина и антибиотиков. Концентрация клеток ВНК-21 при посеве составляла 150-160 тыс./мл, а множественность инфицирования-0,5-1,2 ДД50/КЛ. Инфицировали мозговой суспензией вируса бешенства, приготовленной в растворе Хенкса с рН 7,4-7,6. Через 24, 48 и 72 часа проводили смену ростовой среды. Время культивирования вируса составляло 48-72 часа.

Сравнительное изучение методов культивирования штамма "ВНИИЗЖ" вируса бешенства в монослое и суспензии клеток ВНК-21 Для репродукции штамма "ВНИИЗЖ" использовали перевиваемую монослойную культуру клеток ВНК-21, полученную в клинских матрасах и роллерах, для репродукции в суспензии клеток использовали аппараты КС-40. Результаты культивирования штамма "ВНИИЗЖ" вируса бешенства представлены в таблице 1.

Таблица 1

Параметры культивирования штамма "ВНИИЗЖ" вируса бешенства

Показатели Параметры культивирования клеток

в клинских матрасах в роллерах в КС-40

Посевная концентрация (тыс/мл) 140-200 140-200 700- 1000

Время получения полноценного монослоя (ч) 24 24 -

Оптимальное время культивирования (ч) 48 48 48

Множественность заражения (ЛД50/Ю1) 0,01 - 0,1 0,01 - 0,1 0,1-0,5

Условия культивирования (величина рН) 7,2 + 0,08 7,2 + 0,08 7,2 + 0,08

Температура культивирования (°0 36,75 + 0,125 36,75 + 0,125 36,75 ±0,125

Титр инфекционное™ вируса Ой ЛД5о/мл) М + т 7,10 + 0,28 7,25 ± 0,35 7,2 + 0,19

В опытах отмечено, что наиболее благоприятная температура для культивирования вируса 36,5-37,0°С и среда должна быть слабощелочной (значение рН 7,0-7,4). Максимальное накопление вируса происходило при монослойном культивировании при дозе заражения 0,01-0,1 ЛД50/мл, а при суспензионном культивировании - 0,1-0,5 ЛДя/мл.

Оптимальная посевная концентрация клеток при монослойном культивировании составляла 140-200 тыс/мл, а при суспензионном культивировании - 700-1000 тыс/мл. Показано, что штамм "ВНИИЗЖ" вируса бешенства при монослойном культивировании стабильно накапливается в

титрах 7,00-7,50 ДЦ50/МЛ, а при суспензионном культивировании- 6,80- 7,50 ДЦ50/МЛ.

Были проведены исследования по определению динамики накопления вируса в зависимости от срока культивирования.

В опыте показано, что титр инфекционности вируса достигал максимальных значений 7,33 ЛДд/мл после 48 часов культивирования и затем оставался на этом уровне.

Влияние способа подготовки посевного вируса на иммунобиологические свойства штамма «ВНИИЗЖ» Для заражения культуры клеток ВНК-21 использовали посевной вирус в виде 10% суспензии мозга овец, с титром инфекционности 6,0 ЛД50/мл и вирус первого пассажа на монослойной культуре клеток с титром инфекционности 6,5 ЛД50/мл.

Доза заражения для обоих способов культивирования была одинаковая (равная 0,1 ЛД50/МЛ). Культивирование осуществляли в течение 72 часов. Результаты исследований представлены в таблице 2.

Таблица 2

Влияние посевного вируса на иммунобиологические свойства штамма «ВНИИЗЖ»

Способы Вид посевного вируса

мозговой первый пассаж на монослое

культивирования

Титр инфекц. Л Титр инфекц. Л

7,5 2,0 6,5 0,5

суспензионный 7,0 7,25 1,8 1,5 6,25 7,0 0,8 0,7

7,5 2,0 7,0 0,6

М + ш 7,30 + 0,118 р<0,001 1,80 + 0,118 р<0,001 6,68 + 0,649 р<0,001 0,65 + 0,065 р<0,001

7,0 1,4 6,0 0,7

монослойный 6,75 1,0 6,75 0,5

6,5 1,2 7,0 0,8

6,5 1,1 6,5 0,7

М + ш 6,68 ±0,12 р<0,001 1,18 + 0,09 р<0,001 6,56 + 0,218 р<0,001 0,68 + 0,63 р<0,001

Результаты, представленные в таблице 2, показали, что использование 10% суспензии мозгового вируса в качестве посевного повышает иммуногенность антирабической вакцины, как при суспензионном культивировании, так и при монослойном.

Несмотря на положительные свойства мозгового вируса, используемого при заражении клеток, заготовить его в достаточном количестве для заражения больших объемов суспензионной культуры клеток трудоемко и экономически невыгодно.

Поэтому мы провели исследования по отработке технологии получения вирусного сырья, используя комбинированный метод заражения культуры клеток.

Технология культивирования вируса была следующей: в аппараты КС-40 с культурой клеток вносили 10% суспензию мозга овец и культивировали 24 часа, затем вносили равное количество свежей среды, и продолжали культивирование еще 24 часа. Весь объем полученной суспензии вносили в реактор КМ-2000, содержащий 1000 л культуры клеток. Через 24 часа культивирования в реактор КМ-2000 добавляли 800 л свежей среды и культивировали еще 24 часа до достижения концентрации клеток в реакторе 2,5-3,0 млн7мл.

В этих опытах главным условием была отработка дозы заражения клеток вирусом, которая бы не угнетала рост клеток, так как пролиферация клеток должна сохраняться.

Для этой цели «мозговой» вирус с известным титром вносили в культуру клеток в дозах 0,001; 0,01; 0,1 Л/Ьо/кл. и культивировали в культиваторах КС-40 до получения концентрации клеток 2,5-3,0 млн./мл, затем культивацию останавливали и определяли титр инфекционности, стерильность, иммуногенную активность образцов вакцин. Время культивирования 72 часа. Результаты исследований представлены в таблице 3.

Таблица 3

Влияние дозы заражения на пролиферацию клеток и выход вируса

Начальная Концентра- Концен- Концен- Титр Индекс

Доза концентра- ция клеток трация трация инфекционной иммуно-

заражения ция клеток, млн7мл через 24 час, млн./мл клеток через 32 час, млн./мл клеток через 48 час, млнУмл активности, ^ЛДзо/кл. генности, и

0,5 1,0 1,3 1,2 6,33 1,1

0,001 0,7 1,0 1,2 1,5 1,5 2,0 1,2 1,8 6,50 7,50 1,3 2,5

1,2 1,7 2,2 2,0 7,00 2,0

0,5 1,1 1,5 1,5 6,50 1,2

0,01 0,7 1,2 1,8 1,5 6,86 1,5

1,0 1,5 2,0 1,7 7,25 1,6

1,2 1,8 2,2 2,0 7,00 1,5

0,5 0,9 1,1 1,1 5,86 1,2

0,1 0,7 1,1 1,5 1,5 6,50 1,4

1,0 1,4 1,8 1,5 7,00 1,5

1,2 1,5 1,5 1,9 6,25 I 1,4

Результаты, представленные в таблице 3, показали, что при дозе заражения, равной 0,001 ДЦ50/КЛ при начальной концентрации клеток 106/мл, был достигнут оптимальный результат.

Через 48 часов культивирования титр инфекционности составил 7,5 ^ ЛДзо/мл, а индекс иммуногенности 3,5. Увеличение заражающей дозы в 100 раз (0,1 ЛД50/КЛ.) снижает пролиферацию клеток, титр инфекционности и иммуногенность полученного вируса.

Полученные результаты были воспроизведены при крупномасштабном культивировании вируса. Однако в металлических реакторах КМ-1000 и КМ-2000 время культивирования было увеличено до 72 часов, индекс иммуногенности возрос до 3,4 при начальной концентрации клеток 10б/мл.

Культивирование штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства с уменьшенным количеством сыворотки Традиционно при культивировании клеток используют сыворотку крови в 10% концентрации. Выращивание клеток с меньшим количеством сыворотки снижает стоимость и аллергенность препарата.

Мы испытали питательные среды с различным содержанием сыворотки КРС при культивировании вируса бешенства штамма «ВНИИЗЖ».

Результаты показали, что снижение количества сыворотки в питательной среде до 3% не повлияло на пролиферацию клеток. Титр инфекционности и индекс иммуногенности различались несущественно по сравнению с контролем.

Ростовые свойства сыворотки, кроме того, зависят от времени её хранения. Сыворотка, обеспечивающая ростстимулирующую активность в концентрации 3% должна храниться не более 10 суток (время получения до использования).

Культивирование штамма «ERA» вируса бешенства

Антирабические вакцины готовят из различных штаммов вируса, в том числе и из штамма «ERA». Этот низкопатогенный штамм используют также для получения инактивированных вакцин.

В наших исследованиях мы сделали попытку изготовить инактивированную вакцину из штамма «ERA». С этой целью провели адаптацию штамма к монослойной и суспензионной культуре клеток ВНК-21.

Суспендированные клетки помещали в стерильные клинские матрасы объемом 1,5 литра. Матрасы оставляли в стационарном положении при 37° на 5-6 дней - время, в течение которого происходит образование сплошного монослоя.

После образования сплошного монослоя проводили смену среды, идентичной ростовой среде, но содержащей дополнительно 2% нормальной бычьей сыворотки и 5% бикарбоната натрия.

Заражение клеток проводили путем внесения штамма "ERA" вируса бешенства непосредственно в бутыли со средой. Для заражения использовали вирус с титром инфекционной активности 5,5-6,0 ЛДдамл. Клетки инкубировали при 37° в течение 9 суток. Урожай вируса собирали через 5, 7 и 9 суток культивирования.

При указанных параметрах титр инфекционности вируса составлял 6,0 Ig ЛД50/мл, хотя и такой вирус не пригоден для изготовления инактивированных вакцин. Для получения инактивированных вакцин необходимо концентрировать антиген после инактивации.

Адаптация штамма "ERA" вируса бешенства к перевиваемой культуре клеток ВНК-21

Для выращивания вируса бешенства штамма "ERA" в культуре клеток ВНК-21 использовали среду Игла с 10% сыворотки КРС, с добавлением глютамина и антибиотиков. Концентрация клеток ВНК-21 при посеве составляла 150-160 тыс/мл, а множественность инфицирования - 0,5-1,2 ЛД50/Ю1. Культуру клеток ВНК-21 инфицировали штаммом "ERA" вируса бешенства, полученного в первичной культуре клеток почки свиньи.

Через 24, 48 и 72 часов проводили смену ростовой среды. Время культивирования вируса в зависимости от пассажа колебалось от 48 часов до 96 часов. Полученные результаты представлены в таблице 4.

Таблица 4

Культивирование штамма "ERA" вируса бешенства в культуре клеток

ВНК-21

Культура клеток Номер пассажа Титр инфекционности (1ёЛД5о/мл) Процент пораженных клеток Время культивирования (часы)

1 2,35 ±0,05 10 96

2 2,77 ±0,12 10 96

3 3,00 ±0,05 40 96

ВНК-21 4 3,33 ±0,07 45 72

5 4,50 ±0,12 50 72

6 5,33 ±0,18 60 72

7 6,00 ±0,12 90 72

8 6,50 ±0,19 100 48

В результате проведенных исследований было установлено, что при репродукции ВБ в культуре клеток ВНК-21 титр инфекционности к восьмому пассажу составил 6,50 ± 0,19 ЛДдаМЛ, время культивирования с 96 часов при

первом пассаже уменьшилось до 48 часов к пятому пассажу, а количество пораженных клеток составило 100%.

Таким образом, исходный штамм "ERA" вируса бешенства адаптирован к перевиваемой культуре клеток ВНК-21.

Культивирование штамма "ERA" вируса бешенства в перевиваемой культуре клеток ВНК-21

Одной из задач, поставленной перед нами, была разработка крупномасштабного способа получения штамма "ERA" вируса бешенства. При разработке суспензионного метода изучали накопление вируса в зависимости от посевной концентрации клеток, множественности заражения и длительности культивирования.

При отработке оптимальной посевной концентрации брали 0,5; 0,7; 1,0 и 1,2 млн.кл/мл, внося вирус в дозе 0,1 ДЩо/кл.

В результате проведенных опытов отмечено, что нет существенных различий в накоплении инфекционной активности штамма "ERA" вируса бешенства при различной посевной концентрации клеток. Наибольшие значения титра инфекционное™ вируса (6,00-6,50 1§ЛД50/мл) отмечены при посевной концентрации клеток 0,7-1,0 млн./мл.

Также сравнивали накопление титра инфекционности штамма "ERA" вируса бешенства в суспензии клеток ВНК-21 при использовании одинаковой посевной концентрации клеток и разных дозах заражения.

В суспензию клеток с концентрацией 0,7x106 кл./мл вносили штамм "ERA" вируса бешенства в дозах 0,01; 0,1; 0,5 и 1,0 ЛД5о/кл. Культивирование проводили в аппаратах КС-40 в течение 48 часов, и затем определяли титр инфекционной активности образцов.

Отмечено, что при минимальной (0,01ЛД5о/кл) дозе заражения титр вирусной активности был меньше на 1,00 -2,67 lg, чем при дозах заражения 0,10,5 ЛДзо/мл. Оптимальная доза заражения при монослойном культивировании штамма "ERA" составила 0,1 ЛДзо/мл, а при суспензионном - 0,1-0,5 ЛД5о/мл.

Одной из задач нашей работы являлось сравнение методов культивирования штамма "ERA" вируса бешенства в суспензионной и монослойной культуре клеток ВНК-21.

Для репродукции штамма "ERA" использовали перевиваемую монослойную культуру клеток ВНК-21, полученную в клинских матрасах и роллерах, для репродукции в суспензии клеток использовали аппараты КС-40.

Было отмечено, что наиболее благоприятная температура для культивирования вируса 36,5-37,0°С, и среда должна быть слабощелочной (значение рН 7,0-7,4). Максимальное накопление вируса происходило при монослойном культивировании при дозе заражения 0,1 ЛД50/МЛ, а при суспензионном культивировании - 0,1-0,5 ЛД50/МЛ. Оптимальная посевная концентрация клеток при монослойном культивировании составляла 140-200тыс./мл, а при суспензионном культивировании - 700-1000 тыс./мл. В опытах было показано, что штамм "ERA" вируса бешенства при монослойном и суспензионном способах культивирования накапливался в титрах 6,00-6,50 lg ЛД50/МЛ.

Изучение патогенности штаммов "ВНИИЗЖ" и "ERA" вируса бешенства

Следующим этапом нашей работы было изучение патогенности штаммов "ВНИИЗЖ" и "ERA" вируса бешенства для различных видов животных.

В опытах использовали 3-х овец (2-3-х летнего возраста), 3-х беспородных собак (3-6 мес.), 3 беспородных кошек и беспородных мышей (массой 10-12 грамм).

Вируссодержащий материал инокулировали животным интрацеребрально, внутримышечно и подкожно. Доза заражения для овец и собак составила 7,0 lg ЛД50/ГОЛ, для мышей - 5,25 lgЛД5o/гoл. За животными наблюдали в течение 90 дней после заражения. Вирус выявляли в РИФ и в биопробе на мышах.

Установлено, что штамм "ВНИИЗЖ" вируса бешенства вызывает заболевание и гибель овец, собак и кошек с характерной картиной

паралитического бешенства при интрацеребральном введении на 6-7 сутки после заражения. Специфическая гибель кошек установлена также при внутримышечном способе введения вируссодержащего материала.

По истечении срока наблюдения, выживших животных (овец, собак, кошек) усыпили и получили пробы головного мозга. В исследованных пробах вирус бешенства не выделен.

Отмечено, что штаммы "ВНИИЗЖ" и "ERA" вируса бешенства обладают остаточной нейровирулентностью для мышей при различных способах введения, однако штамм "ВНИИЗЖ" более патогенен, чем штамм "ERA".

Отработка режима инактивации вируса бешенства

Мы сделали попытку приготовить инактивированную вакцину из штамма «ERA».

Для этого обработали режим инактивации штамма "ERA" вируса бешенства. Инактивацию вируса бешенства аминэтилэтиленимином и р-пропилактоном проводили при температуре 4, 18 и 37°С в течение 24 часов. Конечная концентрация инактивантов в исследуемых препаратах составила 0,05; 0,025 и 0,0125%. Результаты опытов приведены в таблице 5.

Таблица 5

Инактивация штамма "ERA" вируса бешенства

Время, Титр инфекционности вируса в lgJI^oAnn

ГС Концентрация АЭЭИ, в % Концентрация

час. Р-пропилактона, в %

0,05 0,025 0,0125 0,05 0,025 0,0125

1 3,00 2,87 4,25 2,75 2,83 3,50

4 24 0,25 0,50 0,50 0 0 0

33 0 0 0 0 0 0

1 1,50 1,50 1,83 1,50 1,46 1,75

1S 24 0 0 0 0 0 0

33 0 0 0 0 0 0

1 1,33 1,50 1,75 0 0 0

з- 24 0 0 0 0 0 0

33 0 0 0 0 0 0

Установлено, что АЭЭИ и бета-пропилактон являются хорошими инактивантами для вируса бешенства. Полная инактивация вируса бешенства АЭЭИ наступает при температуре 4°С через 33 часа, при температуре 18°С -через 24 часа. При инактивации (3-пропилактоном авирулентность вирусной суспензии наступает при температуре 4-18°С через 24 часа, а при температуре 37°С - через 1 час.

В следующей серии опытов было изучено влияние этих инактивантов на иммуногенные свойства штамма «ERA» вируса бешенства. Для этого образец суспензии вируса с исходной активностью 5,5 lg ЛД50/мл был инактивирован Р-пропилактоном и ацетилэтиленимином при 37°С в течение 24 часов.

Установлено, что при инактивации штамм "ERA" вируса бешенства терял свои иммуногенные свойства. Иммуногенность инактивированного препарата на основе штамма "ERA" составила 0,3-0,5 МЕ/мл, что не соответствует международным требованиям ВОЗ по иммуногенности к антирабическим препаратам (1,0 МЕ/мл). Поэтому штамм "ERA" вируса бешенства не может использоваться при изготовлении вакцин как инактивированный антиген. Очевидно для получения инактивированных вакцин из штамма "ERA" необходимо концентрирование антигена в 3-5 раз, и тогда вакцины будут удовлетворять требованиям ВОЗ.

РАЗРАБОТКА ТЕХНОЛОГИИ ПОЛУЧЕНИЯ ИНАКТИВИРОВАННЫХ АДСОРБИРОВАННЫХ И ЭМУЛЬСИОННЫХ ВАКЦИН ИЗ ШТАММА

«ВНИИЗЖ»

Разработка способа получения вирусного сырья для получения инактивированных антирабических вакцин

Технология получения вирусного сырья для приготовления инактивированной вакцины заключалась в следующем: на первом этапе 10 литров клеток НК-21 с концентрацией 106 кл./мл заражали 0,001 ЛД50/кл суспензией головного мозга овец и культивировали в течение 72 часов, доводя концентрацию клеток до 2 млн./мл и объем до 30 литров.

На втором этапе 30 литров вируссодержащей суспензии смешивали с 800 литрами клеточной суспензии с концентрацией 106 кл./мл и культивировали 72 часа, доводя объем суспензии до 1600 л и концентрацию клеток до 2-2,5 млн/кл.

Изготовление инактивированной вакцины Полученную вируссодержащую суспензию инактивировали в течение 24 часов, при температуре 37°С димером этиленимина в концентрации 0,02%. После инактивации отделяли клеточный детрит и надосадочную жидкость использовали для приготовления вакцины.

По данной технологии были изготовлены 4 промышленные серии антирабической вакцины, которые были авирулентны, безвредны и иммуногены.

Иммуногенность вакцин, приготовленных из штамма «ВНИИЗЖ», репродуцируемого в суспензии и монослое клеток ВНК-21 Для проведения этой серии опытов вирус бешенства штамм «ВНИИЗЖ» культивировали в аппаратах КС-40 по технологии, которая описана выше. И из этого же штамма была приготовлена расплодка вируса на монослойной (роллерной) культуре клеток.

Таблица 6

Иммуногенность вакцин в зависимости от способа репродукции вируса

Характеристика антигена Доза заражения, ЛДзо/кл Время культивирования (час.) Титр инфекц. ЛД50/МЛ И

суспензионный 0,1 72 7,0 7,5 6,75 7,0 1,5 2,0 1Д 1,4

М±ш 7,1 ±0,283 р<0,001 1,5 ±0,170 р<0,001

монослойный 0,01 72 6,5 7,0 6,0 6,5 0,6 0,8 0,5 0,9

М + ш 6,5 + 0,204 р<0,001 0,7 ± 0,029 р<0,001

Репродуцированный вирус инактивировали 0,02% димером этиленимина в течение 12 часов, рН 7,2-7,4 и температуре 37°С.

Иммуногенную активность вакцин определяли по методу МН и выражали в индексе иммуногенности Л.

Результаты, представленные в таблице 6, показали, что вакцины, изготовленные из вируса, выращенного в суспензионной культуре клеток, более иммуногенны, чем из вируса, репродуцированного в монослойной культуре клеток.

Иммуногенные свойства вакцины из штамма «ВНИИЗЖ»

Следующий этап нашей работы заключался в сравнении иммуногенных свойств антирабических вакцин из штамма "ВНИИЗЖ".

Нами было проведено испытание иммуногенных свойств штамма "ВНИИЗЖ" по способности выработки антирабических вируснейтрализующих антител.

Антирабической инактивированной вакциной из штамма "ВНИИЗЖ" серии 63, изготовленной 04.01.03, было двукратно привито в октябре 2003 года 200 голов крупного рогатого скота в СПК Чамерево Судогодского района Владимирской области. В опыт были взяты животные, которые не имели ВНА к вирусу бешенства. Через 3,5 месяцев после вакцинации у 10 голов привитых животных были взяты пробы крови и исследованы на наличие антирабических вируснейтрализующих антител, которые определяли в реакции нейтрализации на мышах.

Результаты исследования сывороток крови привитых животных (таблица 7) показали, что антирабическая инактивированная вакцина из штамма "ВНИИЗЖ" индуцирует у животных напряженный иммунитет. Через 3,5 месяца после вакцинации у 8 из 10 взрослых коров уровень титров ВНА составил от 3,50 до 4,33 лог2, а у телят уровень ВНА колебался от 1,23 до 4,00 лог2.

Таблица 7

Титры антирабических ВНА в сыворотке крови вакцинированных

животных

Коровы Телята

Номер животного Титр ВНА (лог2) Номер животного Титр ВНА (лог2)

1 2,50 1 2,81

2 4,00 2 1,77

3 4,00 3 4,00

4 3,56 4 1,23

5 4,00 5 1,67

6 1,67 6 3,00

7 3,54

8 3,78

9 3,50

10 4,33

Следующим видом животных, на которых провели исследование иммуногенных свойств вакцины из штамма "ВНИИЗЖ", были собаки. Антирабической вакциной с иммуногенной активностью 1,0 МЕ/мл привили 8 собак в дозе 1мл подкожно и изучали динамику накопления антирабических вируснейтрализующих антител в течение 1 года.

Через 0,5; 1; 2; 3; 6; 8; 12 месяцев после вакцинации у животных брали пробы крови для определения уровня антирабических антител. Уровень ВНА в сыворотках крови привитых животных определяли в реакции нейтрализации на мышах. Установлено, что титр антирабических вируснейтрализующих антител в сыворотке крови животных через 15 дней после иммунизации составлял 1,50-3,23 лог2, а через 1 месяц уровень ВНА достиг максимальных значений (3,50-5,50 лог2). Напряженный иммунитет сохранялся у привитых животных в течение 1 года (срок наблюдения).

Скорость формирования активного антирабического иммунитета во многом определяется местом введения препарата.

Представляло интерес исследовать иммуногенную активность культуральной жидкой инактивированной вакцины из штамма "ВНИИЗЖ" в зависимости от места ее введения.

Для этого использовали 5 взрослых беспородных собак и 5 кошек (3- 6 месячного возраста). Вакцину вводили в дозе 1,0 мл подкожно, внутримышечно. Эффективность иммунизации оценивали по уровню ВНА в сыворотке крови животных, а также по индексу защиты, представляющего собой разницу титров инфекционности вируса бешенства CVS для вакцинированных и невакцинированных животных.

Проведенные исследования показывают, что при всех способах введения вакцины в крови животных обнаруживаются вируснейтрализующие антитела. Наиболее выраженный иммунитет формируется при внутримышечном введении вакцины в область шеи или внутренней поверхности бедра, в меньшей степени иммунная потенция проявляется при введении вакцины подкожно.

Влияние адъювантов на эффективность антирабической вакцины

В наших исследованиях в качестве адъювантов использовали гидроокись алюминия (ГОА), полиакриловую кислоту (ПАК) и масляный адъювант ISA-70. Для этого приготовили образцы инакгивированных и эмульсионных вакцин с применением указанных адъювантов, в которых содержалось одинаковое количество антагена. Этами вакцинами были привиты 3 коровы, 3 лошади и 3 овцы подкожно в дозе 2 мл. Через 1, 2, 3, 4 месяца после вакцинации у животных брали кровь для исследования. Определяли индекс иммуногенности образцов вакцин из штамма "ВНИИЗЖ" по методу NIH.

Установлено, что индекс иммуногенноста вакцин при добавлении адъювантов увеличился в 2,2-3,2 раза по сравнению с контролем. Наибольшей адъювантной активностью обладала ПАК (полиакриловая кислота).

Кроме того, перед нами была поставлена задача изучить динамику нарастания ВНА у животных, привитых антирабическими вакцинами с различными адъювантами, по сравнению с живой вирусвакциной из штамма «ERA».

Установлено, что уровень ВНА у животных, иммунизированных инактивированными вакцинами из штамма "ВНИИЗЖ" с добавлением

различных адъювантов, выше, чем у животных, иммунизированных живой вакциной из аттенуированного штамма "ERA", на 0,50- 3,00 лог2. Из исследуемых адъювантов лучшие результаты показала эмульсионная вакцина из штамма "ВНИИЗЖ", приготовленная с использованием адъюванта ISA-70.

Сохраняемость иммуногенности вакцин в процессе хранения

Нами было проведено изучение сохраняемости иммуногенной активности трех производственных серий (61,62,63) антирабической инактивированной вакцины из штамма "ВНИИЗЖ" с помощью теста NIH при хранении. Индекс иммуногенности определяли сразу после изготовления вакцины и через 12 месяцев хранения при температуре 4-8сС. В ходе проведенных исследований по изучению изменения иммуногенной активности вакцины установлено, что иммуногенная активность антирабической инактивированной вакцины из штамма "ВНИИЗЖ" не изменяется в течение 1 года при хранении ее при температуре 4-8°С.

ВЫВОДЫ

1.Разработаны безвредные, экологически безопасные и высокоэффективные культуральные антирабические вакцины из штамма «ВНИИЗЖ», которые способны индуцировать напряженный и длительный иммунитет и обеспечивать защиту животных от прямого заражения высоковирулентным вирусом бешенства.

2. Установлено, что штаммы «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства хорошо культивируются в культуре клеток ВНК-21 с использованием в качестве посевного материала 10% суспензии мозга овец, зараженных вирусом, и при культивировании в суспензионной культуре клеток можно получать большие количества вируса, необходимого для производства инактивированных вакцин.

3. Отработаны оптимальные условия культивирования штамма «ERA» вируса бешенства в монослое и суспензии культур клеток и показано, что максимальное накопление вируса бешенства в суспензионной культуре происходит за 48 часов, а в монослойной - за 72 часа.

4. Показано, что при использовании «мозгового вируса» в качестве посевного материала повышается иммуногенность антирабических вакцин по сравнению с культуральным посевным вирусом примерно в 2,7 раза.

5. Установлено, что доза заражения вируса для штаммов «ВНИИЗЖ» и "ERA" в суспензионной культуре клеток должна быть 0,001 ДД50/КЛ. при начальной концентрации клеток 1 млн/мл.

6. Разработан режим инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и бета-проллоктаном и показано преимущество использования АЭЭИ как инактиванта при производстве промышленных серий вакцин, обеспечивающего полную инактивацию вируса и получение безопасного препарата, и как более дешевого инактиванта.

7. Иммуногенная активность антирабических вакцин из штамма «ВНИИЗЖ», изготовленных из вируса репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в 2 раза выше, чем вакцин, полученных из вируса, культивируемого в монослойной культуре.

8. Показано, что после вакцинации животных вакциной из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства вируснейтрализирующие антитела в сыворотке крови обнаруживаются через 7 суток и сохраняются в сыворотке крови животных в течение 12 месяцев в титрах до 3,2 лог2, что достаточно для предохранения животных от прямого заражения вирусом.

9. Установлено, что инактивированные вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» с адъювантами ISA-70, ПАК и ГОА способствуют формированию более напряженного иммунитета у различных видов привитых животных по сравнению с иммунитетом на живую антирабическую вакцину из штамма «ERA».

10. Показано, что инактивированная вакцина из штамма "ERA" обладает низкими иммуногенными свойствами и без концентрирования антигена не обеспечивает защиту животных от заражения бешенством.

11. Показано, что разработанные инактивированные культуральные антирабические вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» сохраняют исходную

иммуногенность, стерильность и безвредность в течение 12 месяцев хранения при температуре 4-8°С (срок наблюдения).

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

Проект нормативно-технической документации на изготовление культуральной инактивированной вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» вируса бешенства:

Инструкция по изготовлению и контролю антирабической культуральной вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» (утверждена директором института 27 сентября 2004 г.).

- Технические условия на культуральную инактивированную вакцину из штамма «ВНИИЗЖ».

- Наставление по применению культуральной инактивированной вакцины против бешенства из штамма «ВНИИЗЖ» (утверждено директором института 27 сентября 2004 г.).

Кроме того, предлагаются следующие методики, которые одобрены ученым советом ВНИИЗЖ и утверждены директором института в 2004 г:

-«Методика культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства и культуре клеток ВНК-21»;

-«Методика инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и бета-пропилактоном».

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Цеденхуу П., Борисов.А.В. Изучение патогенности штамма "ВНИИЗЖ" вируса бешенства для животных // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Материалы международной научной конференции, посященной 45-летию ФГУ "ВНИИЗЖ".-Владимир.-2003.-С. 122-123.

2. Цеденхуу П., Михалишин.В.В. Инактивация вируса бешенства штамма "ВНИИЗЖ" при изготовлении вакцины // Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Материалы международной научной конференции, посященной 45-летию ФГУ "ВНИИЗЖ".-Владимир.-2003.-С.123-124.

3. Цеденхуу П. Исследование иммуногенности различных типов антирабических вакцин //Актуальные проблемы инфекционной патологии животных: Материалы международной научной конференции, посященной 45-летию ФГУ "ВНИИЗЖ". -Владимир.-2003 .-С. 124-126.

4. Борисов.А.В., Цеденхуу П., Домский .И.А., Михалишин.В.В., Рыбаков С.С., Груздев К.Н. Профилактика бешенства собак // Материалы международной научной-производственной конференции, посященной 60-летию питомника охотничьих собак ВНИИОЗ. -Киров.-2004.-С.19-23.

Отпечатано на полиграфической базе ФГУ «Федеральный центр охраны здоровья животных». Тираж 90 экз., март 2005 г.

г-

РНБ Русский фонд

2006-4 14696

Оглавление диссертации Цеденхуу, Пуревхуу :: 2005 :: Владимир

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Вирус бешенства и его свойства

2.2. Эпизоотологические особенности бешенства

2.3. Культивирование вируса бешенства

2.4. Очистка и концентрирование вируса бешенства

2.5. Инактивация вируса и инактиванты

2.6. Адъюванты и их использование в антирабических вакцинах.

2.7. Определение качества вакцин против бешенства

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Цеденхуу, Пуревхуу, автореферат

Актуальность темы. Бешенство относится к группе опасных инфекционных заболеваний человека и животных, характеризующихся поражением центральной нервной системы, практически абсолютной летальностью и является одним из наиболее распространенных зооантропонозов. По оценке ряда исследователей это заболевание относится к зоонозам, наносящим наибольший экономический ущерб (22, 52, 59).

Ежегодно в мире погибает от бешенства свыше 50 тысяч людей и более 1 миллиона животных. Сложная эпидемическая и эпизоотическая ситуация по бешенству наблюдается более чем в 110 странах мира. По оценке ВОЗ, ежегодно получают укусы и имеют контакты с подозреваемыми животными около 10 млн. человек, 4 млн. из их числа получают специальную медицинскую помощь (25).

Все страны мира несут значительный экономический ущерб из-за прямых потерь от гибели, уничтожения больных и подозреваемых в заражении бешенством животных, недополучении сельскохозяйственной продукции, приплода, затрат на проведение диагностических исследований, вынужденную и профилактическую вакцинацию. Анализ данных, характеризующих эпизоотическую ситуацию по бешенству в Российской Федерации за 1991-2003 годы, свидетельствует о тенденции к ее усугублению.

Вспышки болезни регистрируются среди диких и домашних животных, что в конечном счете обуславливает заболеваемость и людей (16,25 и др.).

В системе мер борьбы с бешенством домашних и диких животных в современных условиях решающее значение приобретает своевременная и надежная лабораторная экспресс диагностика. В настоящее время в мировой практике диагноз на бешенство ставится на основании результатов прямого обнаружения антигена вируса в головном мозге животных реакцией прямой иммунофлюо-ресценции (РПИФ), твердофазным иммуноферментным анализом (ТФ ИФА), а также изоляцией вируса биопробой.

В современной биотехнологии при производстве антирабических вакцин используют различные вакцинные штаммы, которые выращивают в первичных и перевиваемых клеточных культурах (ВНК-21, ПС, Vero и др.), применяя различные методические приемы - пристеночный монослой, суспензионный и псевдосуспензионный методы (4, 16, 20, 60 и др.).

Для получения инактивированных вакцин применяют различные инакти-ванты и подбирают оптимальные условия инактивации. В таких случаях вирус должен полностью утрачивать свои инфекционные свойства и максимально сохранять антигенность.

Цели и задачи исследования. Главная цель наших исследований состояла в разработке технологии получения экспериментальных образцов культураль-ной инактивированной вакцины против бешенства из штамма «ВНИИЗЖ» и «ERA» и изучение иммунобиологических свойств этих вакцин в лабораторных и производственных условиях.

Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- отработать метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

- разработать метод инактивации культурального вируса бешенства пригодного для получения антирабических вакцин;

- проверить иммуногенные свойства полученных вакцин на естественно-восприимчивых животных;

- изучить изменения иммуногенных свойств вакцин при хранении при различных температурах.

Научная новизна работы. В результате проведенных исследований:

-предложен метод культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства в культуре клеток ВНК-21;

-разработаны методы инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ) и (3-пропиолактоном;

-проверена иммуногенность полученных вакцин на целевых видах животных;

-изучена сохраняемость вакцин в процессе хранения.

Практическое значение работы.

При инактивации штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства ами-ноэтилэтиленимином (АЭЭИ) и Р-пропиолактоном получаются безвредные инактивированные препараты.

Разработанная вакцина из штамма «ВНИИЗЖ» сохраняют исходную активность при хранении при температуре 4-8°С в течение года (срок наблюдения).

Положения, выносимые на защиту:

Методика культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства;

Результаты инактивации вируса бешенства аминоэтилэтиленимином (АЭЭИ), Р-пропиолактоном;

Технология получения культуральной инактивированной адсорбированной антирабической вакцины;

Технология получения культуральной эмульсионной антирабической вакцины;

Изменения иммуногенных свойств вакцин в процессе хранения.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и опубликованы: в Материалах Международной научной конференции, посвященной 45-летию ВНИИЗЖ (г.Владимир, 2003г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию питомника охотничьих собак ВНИИОЗ, Киров, 2004 г.), также докладывались на ученом совете ВНИИЗЖ в 2003-2004г.

Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 4 научные работы.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения результатов исследований, выводов, практических предложений и приложения.

Заключение диссертационного исследования на тему "Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA"

6. ВЫВОДЫ

1 .Разработаны безвредные, экологически безопасные и высокоэффективные культуральные антирабические вакцины из штамма «ВНИИЗЖ», которые способны индуцировать напряженный и длительный иммунитет и обеспечивать защиту животных от прямого заражения высоковирулентным вирусом бешенства.

5. Установлено, что доза заражения вируса для штаммов «ВНИИЗЖ» и "ERA" в суспензионной культуре клеток должна быть 0,001 ЛД50/КЛ. при начальной концентрации клеток 1 млн/мл.

11. Показано, что разработанные инактивированные культуральные антирабические вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» сохраняют исходную иммуногенность, стерильность и безвредность в течение 12 месяцев хранения при температуре 4-8°С (срок наблюдения).

7. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Для практического использования предлагаются:

- Инструкция по изготовлению и контролю антирабической культуральной вакцины из штамма «ВНИИЗЖ» (утверждена директором института 27 сентября 2004 г.).

- Технические условия на культуральную инактивированную вакцину из штамма «ВНИИЗЖ».

-«Методика культивирования штаммов «ВНИИЗЖ» и «ERA» вируса бешенства и культуре клеток ВНК-21»;

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2005 года, Цеденхуу, Пуревхуу

1. Авилов В.М., Седов В А., Коломыцев С А. и др. Необходим учет новых особенностей эпизоотологии бешенства // Ветеринария.-1998.-№6.-С.З-6.

2. Ашмарин И.П., Воробьев А.А. Статистические методы в микробиологических исследованиях.- Л.: Медицина, 1962.-179с.

3. Борисов А.В. Разработка технологии изготовления вирусвакцин против бешенства диких плотоядных: Автореф. дис. . канд. вет. наук.-Владимир, 2003.

4. Бирюков В.В., Кантре В.М. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза.- М.: Наука, 1985.- С. 89-97.

5. Борисов А.В. Испытание эффективности вирусвакцины "Синраб" на диких плотоядных // Пробл. зооинжен. вет. мед.: Сбор. науч. трудов "Вет.наука". Харьков, 2001.- № 7(31). - С.293-294.

6. Борисов А.В. Продолжительность иммунитета у лисиц при оральной иммунизации против бешенства вирусвакциной "Синраб" // Нейро-инфекции: бешенство, ГЭ КРС, Крейтцфельдта-Якоба и др.прионные болезни; листериоз, болезнь Ауески, болезнь Тешена:

7. Матер. Междунар. науч.- практ. конф. 30-31 мая 2001, ВНИИВ-ВиМ.- Покров, 2001.-С. 33-34.

8. Ведерников В.А., Юрик С.А. Прогноз распространения бешенства в Сибири и на Дальнем Востоке // Сб. науч. трудов, Новосибирск, 1997.-С.50-52.

9. Бюллетень ВОЗ о распространении бешенства в мире. 1995.- №4.-С. 19-21.

10. Бюллетень ВОЗ о распространении бешенства в мире.- 1996,- №4,-С. 20-23.

11. Быков В.П., Таршис М.Г. Ситуация по бешенству в регионе Нижней Волги // Ветеринария.-1996.-№7.-С. 19-20.

12. Бурлаков С.В. Профилактика бешенства-Ветеринария, 2002.-№2.-С.8-9.

13. Вольф В.Г. Статистическая обработка опытных данных.- М.:Колос, 1966.- 255 с.

14. Вишняков И.Ф., Никишин И.В., Недосеков В.В., Горшков Т.Ф. и др. Инактивированная культуральная вакцина против бешенства животных // Ветеринария.-1988.-№1.-С.22-25.

15. Грибенча С.В. Современные аспекты биологии и профилактики лис-савирусных инфекций: Автореф. дис. д-ра мед. наук.- М., 1993.-80с.

16. Гочмурадов М.Г. Усовершенствование технологии промышленного производства инактивированной культуральной вакцины против бешенства животных: Автореф. дис. . канд. вет. наук.-Владимир, 1999.

17. Гочмурадов М.Г., Улупов Н.А., Лезова Т.Н. и др. Роль адъювантов в вакцине против бешенства// Матер. Междунар. научно-практ. конф., Воронеж, 1999.-С.97-98.

18. Груздев К.Н., Недосеков В.В. Бешенство животных// М.:"Аквариум", 2001. 303 с.

19. Горшкова Т.Ф., Недосеков В.В., Жестерев В.И., Лаптева О.Г. Технологические разработки инактивированной антирабической вакцины // Матер. Междун. науч.-практ. конф. 30-31 мая 2001, ВНИИВВиМ.-Покров, 2001.- С. 57-58.

20. Джупина С.И., Завадских А.В. Клиническое проявление бешенства у животных //Ветеринария,2002.-№2.-С.9-10.

21. Жданов В.М., Гайдамович С.Я. Вирусология// Медицина.-М., 1966.

22. Иванов B.C. Особенности крупномасштабного культивирования первичных и перевиваемых клеток животных на микроносителях, изготовленных во ВНИТИБП // Культивирование клеток человека и животных.: Матер. III Всесоюз. совещания. Пущино, 1990. - С.93-94.

23. Иванов B.C. Перспективы совершенствования технологии изготовления культуральных инактивированных антирабических вакцин // Вирусные болезни жив-ных.-Владимир, 1995.-С.203.

24. Иванов B.C., Кузнецов П.П., Школьников Е.Э. Состояние и перспективы борьбы с бешенством животных и человека // Вестник РАСХН. -2000.-№3.-С.62-65.

25. Иванов B.C., Скичко Н.Д. Разработака и внедрение в промышленцин: Автореф. дисс. . доктора вет. наук, Владимир, 1999г.

26. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф. Никишин И.В. Биотехнология: теория и практика// 1998.-№1-2.-С.136.

27. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф., Горшков.Т.Ф., Жестерев В.И. и др. Матер, междун. научно-практ. конф.-Покров, 1998.-С.240.

28. Недосеков В.В. Иммунобиологические свойства вакцинного штамма ТС-80 против бешенства //Достижения науки практики АПК.-2000.-№3.-С. 10-13.

29. Недосеков В.В. Современные вакцины против бешенства животных //Ветеринария.-2001.-№8.-С.23-25.

30. Недосеков В.В. Технология изготовления антирабического антигена //Матер, междун. конф., Покров.-С.225-227.

31. Недосеков В.В. Технология изготовления антирабического антигена // Биолого-экологические проблемы заразных болезней диких животных и их роль в патологии е.- х. животных и людей: Матер. Междунар. науч.-практ. конф. Покров,2002.- С.325-326.

32. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф. и др. К вопросу стационарности бешенства: Матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ Покров,1998.- С.167-169.

33. Назаров В.Г. Бешенство животных .-Сельхозгиз, 1961.

34. Недосеков В.В., Вишняков И.Ф;, Груздев К.Н. Изучение влияния способа и локализации места введения антигена нва формирование антирабического' иммунитета: Матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ- Покров, 1998;- С. 167-169.

35. Прилепская Е.П., Анисимова Л1И:, Недосеков В.В., Юрков С.Г. //Матер, междун. научно-практ. конф.-Покров, 2001 -С.66-68.

36. Плохинский Н.А. Биометрия: Учебное пособие: для; ВУЗов. М.МГУД970.- 367с.

37. Селимов М. А. Оральная иммунизация арктических, лис живой ра-бическошвакцинощ полученной из штамма Внуковог32 // Вестник АМН СССР. 1987.- № 32. - С. 622-623.58i, Селимов М.А.Какпредупредитьзаболеваниебешенством.-М.-1963.

38. Селимов М^А.Бешенство:-Сельхозгиз;-М;-1978:

39. Сергеев В.А. Противовирусные вакцины.-Сельхозгиз.-М.-1968;

40. СеляниновИзыбанов С.Ж., Недосеков В1В., Жестерев И;Ф.4 и др. Сравнение антигенных свойств инактивированных препаратов против бешенства //Матер. Междун; науч.-практ. конф.,. Покров, 1998.-С.237.

41. Сливко И;А., Горшков Т.Ф., Хрипунов Е.М., Недосеков В.В. и др. Чувствительность перевиваемых линий; клеток к вирусу бешенства, штамм 71-ЬелНИИЭВ-ВГНКИ // Матер. Междун., научно-пракг. конф.-Покров, 2000.-С.196-199.

42. Сливко И.А., Недосеков В.В., Хрипунов Е.М., Горшкова Т.Ф. и др. Изучение условий ■ культивирования; и инактивации вируса бешенства //Матер. Междун. научно-практ. конф.-Покров, 2001.-С.68-70.

43. Сюрин В.Н., Самуйленко А.Я., Соловьев Б.В., Фомина Н.В. Вирусные болезни животных // М.: 1998.- 928.

44. Таршис М. Г., Черкасский Б. Л. Болезни животных, опасные для человека. -М., 1997.

45. Таршис М.Г., Ковалев Н.А., Кузнецов П.П. Бешенство животных. -Минск: "Уроджай", 1990. 174 с.

46. Хисматулина Н.А. Разработка средств и методов лабораторной диагностики бешенства: Матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ.40.летию ВНИИВВиМ Покров, 1998.

47. Черкасский Б. JL, Кноп А. Г., Ведерников В. А. и др. Эпидемиология и эпизоотология бешенства на территории бывшего СССР // Журн. микробиол. 1995.-№ 2. - С. 21-26.

48. Шестопалов А. М., Рассадкин Ю. Н., Аксенов В. И., Устинова Е. Н. Бешенство в.Новосибирской области // Пробл. инфекционной»патологии в-регионах Сибири и.Дальнего-Востока: Науч. конф. Новосибирск, 1998.- С.82-83.

49. Шестопалов А. М., Аксенов В. И., Рассадкин Ю. Н., Устинова Е. Н. Обстановка по рабической инфекции в Новосибирской- области // Журн. микробиол. 1999. - № 5. - С.115-116.

50. Юсупов Р!Х. Эпизоотологические и экологически аспекты бешенства животных: Матер. Междунар. науч.-практ. конф., посвящ. 40-летию ВНИИВВиМ— Покров, 1998.

51. Abelseth М. К. Propagation of rabies virus in pig kidney cell culture. // Canad. Vet. J. 1964. - № 5. - P. 84-87.

52. Aranda M., Lopez-de Buen L. Rabies in skunks from Mexico // J. Wildl. Dis.- 1999.- V. 35; N 3.- P. 574-577.

53. Artois M., Massson-E., Barrat J., Aubert M.F. Efficacy of three oral rabies vaccine-baits in the red fox: a comparison // Vet/ Microbiol. -1993. -V. 38, 1-2-P. 167-172.

54. Artois M., Guittre C., Thomas I. Potential pathogenicity for rodents of vaccines intended for oral vaccination against rabies: a comparison//

55. Vaccine. 1992.- V. 10,8 - P. 524-528.

56. Artois M.', Chilled1 Т., Mallet E. Premiere campagne de vaccination an-tirabique du renard par voie orale menee en France controle de effi-cacite chez' le renard1 et innocuaite chez les micromamifereses // Ann. Med: Vet.- 1987.- V. 131. - P. 457-462.

57. Aubert MI Epidemiology and campaign against rabies in France and in Europe// Bull. Acad. Natl. Med. -1995.- V. 179, N 5;- P: 1033-1054.83'. Aubert M. F. Current status of animal rabies in France // Med. Trop. Madrid,- 1997. V. 57, Suppll 3. - P. 45-51.

58. Aubert M.F. Costs and benefits of rabies control in. wildlife in France // Rev. Sci. Tech: 1999. - V. 18, N2. - P. 533-543.

59. Baer G. M. The Natural History of Rabies. 2nd ed. CRC Press, Boca Raton, USA, 1991.-620 p.

60. Baer G. M:, Shaddock J\ H., Hayes D.J. Iophenoxic acid' as a serum-marker in carnivores. // J: Wildl. Manage. 1985:- V. 49. - P: 49-51.

61. Baer G.M. Oral rabies vaccination: an overview // Rev. Infect. Dis. -1988.- V 10, N4.- P.644-648.

62. Balser D'. S. Management of predator populations with antifertility agents // J. Wildl.' Manage. 1964. - V. 28. - P. 352-358:

63. Barrat'Jt, Aubert'M.F. Current status of fox rabies-in Europe // J. Vet. Res. -1993 V. 60-,N4. - P. 357-363.

64. Bijlenga G., Joubert L. High pathogenicity for mice of a viral component of the modified-live ERA/BHK rabies vaccine administered by the oral route. Rabies prophylaxis in France // Bull, de IAcademie. 1974. - V. 47.-P. 423-435.

65. Bingham J., Schumacher C.L., Hill F.W., Aubert A. Efficacy of SAG-2 oralrabies vaccine in two species of jackal (Canis adustus and Canis me-somelas) //Vaccine. 1999. - V.17, N6. - P.551-558.

66. Bingham J. Efficacy of SAD Bern, rabies vaccine given by oral route intwo species of jakal // J. Wildl. Dis. -1995.- V.31', N3.- P.416-419: 93'. Biocca E, Bellani L. Oral vaccination in the control of feral rabies// Paras.- 1988.- V. 30, N1.- P. 3-12.

67. Black J.G., Lawson K.F. The safety and efficacy of immunizing foxes using bait containing attenuated rabies virus vaccine // Can. P. Сотр. Med. 1980.-N44 N2.-P. 169-174.

68. Blancou J. Immunization of dogs against rabies by the oral route and chellenge with a virus of canine origin // Ann. Med. Vet. 1990. - V. 134: - P. 563-566.

69. Blancou J, Aubert MF, Andral L. Stadies on pathogenic, immunogenetic, and protective efficiency, of fox rabies virus befor and after adaptation to cell culture: application to vaccination'against rabies// Cam J: Microbiol. -1983.- V. 29,N1'.-R 77-83.

70. Bourhy H., Kissi В., Lafon M. et' al. Antigenic and molecular characterization of bat rabies in Europe // J. Clin. Microbiol: 1992. - V. 30, № 9. - P. - 2419-2426.

71. Borhy H., Sureau P., Tordo N. From rabies to rabies-related viruses // Vet. Microbiol1. 1990. - V. 23-. - P.l 15-128.

72. Briggs D J., Smith J.S., Mueller F.L. et al. A comparison of two serological methods for detecting the immune response after rabies vaccination- in dogs and cats being exported to rabies-free areas // Biologicals. -1998.-V.26;N4.-P. 347-55

73. Brochier В., Godfroid J., Costy F. et al. Vaccination of young foxes against rabies: trials with inactivated vaccine administered by oral and, parenteral routes // Ann. Rech. Vet. -1985.- V.16, N4.- P. 327-333.

74. Brochier B. First rabies vaccination campaign of foxes by the oral route in Belgium. Controls of efficacy andinnocuity in-foxes (Vulpes vulpes)// Ann. Med. Vet; 1987.- V. 131.- P. 463-472.

75. Brochier В., Aubert M.F., Pastoret P.P.,.Masson E. et al. Field use of a vaccinia-rabies recombinant vaccine for the control of sylvatic rabies in Europe and North America // Rev. Sci>. Tech. France.- 1996. -V. 16 , N3.- P. 947-970.*

76. Brochier B:, Pastoret P.P. Rabies eradication in Belgiumby fox vaccination using vaccinia-rabies recombinant1 virus // J Vet Res.- 1993,- V. 60, N-4. P. 469-475.

77. Cell-culture vaccines // Laboratory techniques in rabies.,- 4-th ed.-Geneva, 1996.-P. 269-350.

78. Ciuchini F. . Effects of corticosteroids mediated immunosuppression on the distribution of rabies vaccine virus in red foxes orally immunized against rabies // J. Vet. Med. 1986. - V. 33. - P. 628-631.

79. Ciuchini F. Research on a vaccine prepared from the SAD/BHK-21 (Bern) rabies virus strain for the immunization of foxes // J. Clin. Vet.1985. V. 108. - P. 219-230.

80. Cleaveland S. Epidemiology and control of rabies. The growing problem in Africa // Trans. Roy. Soc. Trop. Med. Hyg.- 1998. V. 92, № 2.- P. 131-134.

81. Crawford-Miksza L.K., Wadford D.A., Schnurr D.P. Molecular epidemiology of enzootic rabies in California // J. Clin. Virol.- 1999. V. 14; N3.-P. 207-19.

82. Gurk A., Carpenter Т.Е. Efficacy of the first oral vaccination against fox rabies in Slovenia // Rev. Sci. Tech. -1994 V. 13, N3. - P. 763-775.

83. European Pharmacopoeia. Inactivated Rabies Vaccine for- Veterinary Use. European Pharmacopoeia. 2nd ed. - Part 11 (9). - 1985.- 45 lp.

84. Fairy S.C., Henke S.E., Beasom S. L., Fearneyhogh MiG. Efficacy of bait distributional strategies to delivery canine rabies vaccines to coyotes in southern Texas// J. Wildl. Dis. 1998.- V. 34, N1. - P. 23-32.

85. Farry S.G., Henke S.E., Anderson A.M., Fearneyhough M.G. Responses of captive and free-ranging coyotes to simulated oral rabies vaccine baits // J: Wildl. Dis. 1998. -V. 34, N1.- P. 13-22.

86. Fearneyhough M.G., Wilson P.J., Clark K.A. et al. Results of an oral rabies vaccination program for coyotes // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1998. - V. 212,N4. -P. 498-502.

87. Fekadu M. Canine rabies // J. Vet. Res.- 1993.- V. 60, № 4.- P. 421-427.

88. Field'H., McCall B., Barrett J. Australian bat lyssavirus infection in a captive juvenile black flying fox // Emerg. Infect. Dis. 1999. - V. 5, N3. -P. 438-40.

89. Flamand A., Coulon P., Lafay F., Tuffereau C. Avirulent mutants of rabies virus and their use as live vaccine // Trends. Microbiol.- 1993.- V. 1, N8.-P. 317-320.

90. Follmann E.H1, Ritter I)., Baer G.M. Evaluation of the safety of two attenuated oral rabies vaccines, SAG 1 and SAG2, in six Arctic mammals // Vaccine. England. 1996. - V. 14, N4. - P.270-273.

91. Foster U. Safety tests of live rabies vaccines on wild- rodent // J.' Fortschritte Vet. rmed. - 1976. - Bd. 25. - S. 257-262.

92. Gleixner A., Sauerwein H., Meyer H. Accumulation of the |32- adrenoceptor agonist Glenbuterol in calf hair of different pigmentation // Arch. Lebensmitt. 1996. - V. 47. - P. 131-135.

93. Hafliger U. Oral immunization of foxes against rabies: Stabilization and use of bait for virus?application: // Zbl: Vet. medizin. Reihe B. - 1982. -Bd. 29.-S. 604-618:

94. Hammami S., Schumacher C., Cliquet F. et al. Vaccination of Tunisian dogs with the lyophilised SAG2 oral rabies vaccine incorporateddnto the DBL2 dog bait//Vet. Res. 1999. - V. 30, N6. -P. 607-613.

95. Hanlon C.A., Niezgoda M., Hamir A.N. et al. I-'irst North American field release of a vaccinia-rabies glycoprotein recombinant virus // J: Wildl: Dis. 1998.- V. 34, N2.-P. 228-39.

96. Hanlon С.A., Buchanan J.R., Nelson E. A vaccinia-vectored rabies vaccine field trial: ante- and post-mortern biomarkers// Rev. Sci. Tech. -1993-V. 12, N1 P.99-107.

97. Heins J.R. New vaccines // J. Med. 1999. - V. 52,N1. - P.21-22.

98. Ito N., Sugiyama M., Oraveerakul K. et al. Molecular epidemiology ofrabies in Thailand // Microbiol. Immunol. 1999.- V. 43, N6. - P. 551!559.

99. Johnston D.H. An aerial baiting system for the distribution of attenuated or recombinant rabies vaccines for foxes, raccoons and skunks // Rev. Infect. Dis. 1988.- V. 10.- P. 660-664.

100. Johnston D.H., Voigt D.R. A baiting system for the oral rabies vaccination of wild foxes and skunks// Сотр. Immunol: Microbiol. Infect. .Dis. -1982.- V5,N1-3. -P. 185-186.

101. Kaplan M.M., Korowski H. Laboratory Techniques in Rabies. 3nd ed. // WHO, Geneva, Switzerland. 1973.- V. 23.- 367 p.

102. Kieny M.P. Expression of rabies virus glycoprotein from a recombinant vaccinia virus // J. Nature. 1984. - V. 312. - P. 163-166.

103. Kihm U., Flamand A., Pastoret P.P., Peterhands E. Round table on epidemiology and control of fox rabies // Vet Microbiol. 1992 - V.33, N 14. -P. 297-301.

104. Kintscher M., Bernhard J., Lemke I. Studies on the safety, epizootiologi-cal safety and effectiveness of SAD/Potsdam 5/88 strain for rabies vaccination //Mh. Veter. medizin. - 1990. - Bd. 45. - S. 81-84.

105. Koprowski H. The mouse inoculation test // Laboratory techniques in rabies. 4-th ed. - Geneva, 1996.-P. 80-86.

106. Krebs J.W., Smith J.S., Rupprecht C.E., Childs J.E.Rabies surveillance in the United States during 1998 // J. Am. Vet. Med. Assoc. 1999.- V. 215,N12.-P. 1786-1798.

107. Lambot M., Blasco E., Barrat J. Humoral and cell-mediated immune responses of foxes after experimental primary and secondary oral vaccina-' tion using SAG2 and V-RG vaccine// Vaccine.- 2001.- V. 19, N 13-14.1. P. 1827-1835.

108. Larson G.E., Savarie P J., Okuno I. Iophenoxic acid and mirex for marking wild, bait-consuming animal. // J. Wildl. Manage. 1981. - V.45. - P. 1073-1077.

109. Lawson K. F. Safety and immunogenicity of ERA strain of rabies vims propagated in a BHK-21 cell line // Canad. J. Vet. Res. 1989. - V. 53. - P. 438-444.

110. Lawson K. F. Safety and immunogenicity of a vaccine bait containing ERA. strain of attenuated rabies vims // J. Vet. Res.- 1987. V. 51. - P. 460-464.

111. Larson J. K., Wunner W.H. Nucleotide and deduced amino acid sequences of the nominal nonstructural phoshoprotein of the ERA, PM, and COS-II strains of rabies virus // Nucleic. Acids. Res: 1990.- V. 18. - P. 71-72.

112. Lewis J. C. Use of poison baits to control rabies in Tennessee wildlife. // Pub. Health Rep. 1963. - V. 83. - P. 69-74.

113. Lewis K.T., Stiles M. Management of cat and dog bites // Am. Farm. Physic. 1995.- V52, N 2. - P. 479-485.

114. Linhart S. B. Acceptance by wild foxes of certain baits for administrating antifertility agents // N. Y. Fish Game J. 1964. - V. 11. - P. 69-77.

115. Linhart S.B., Kennelly J.J. Fluorescent bone labeling of coytes with di-methylchlor-tetracycline // J. Wildl. Manage. 1967. - V. 31. - P. 317321.

116. Linhart S.B., Blom F.S., Dasch G.J. et al. Formulation and evaluation of baits for oral rabies vaccination of raccoons.// Rev. Infect. Dis. 1988.-V. 10, N4.- P.649-653.

117. Linhart S.B., King R., Zamir S. et al. Oral rabies vaccination of red*foxes and golden jackals in Israel: preliminary bait evaluation // Rev. Sci. Tech. 1997. - V. 16, N3. -P. 74-80.

118. Linhart S.B. Bait formulation and distribution for oral rabies vaccination of domestic dogs: an overview // J. Vet. Res. -1993. V.60, N4 - P. 479490.

119. Linhart S.B., Blom F.S., Engerman R. et al. A field evalution of baits for delivering oral rabies vaccines to raccoons // J. Wildl. Dis. -1994.- V. 30, N2-P. 185-194.

120. Linhart S.B. Some factors affecting the oral rabits vaccination of free-ranging carnivores// Rev. Sci. Tech. 1993. - V. 12, N1 - P. 109-113.

121. Maclnnes C. D. Control of Wildlife Rabies: the Americas // Rabies. -Boston, 1988. P. 382-405.

122. Mackett M., Smith G. L. Vaccinia virus expression vectors // J. gen. Virol. 1986.- V. 67. - P. 2067-2082.

123. Mackett M., Smith G. L., Moss B. Recombinant vaccinia viruses as new live vaccines // Biotech, and gen. Engineer. Rev. 1984. - V 2. - P. 383407.

124. Mackowiak M., Maki J., Motes-Kreimeyer L. et al. Vaccination of wildlife against rabies: successful use of a vectored vaccine obtained by-recombinant technology // Adv. Vet. Med. 1999. - V.4. -P.571-583.

125. Masson E., Aubert M.F., Barrat J., Vuillaume P. Comparison of the efficacy of the antirabies vaccines used for foxes in France // Vet. Res. France. 1996. - V. 27, N 3. - P. 255-266.

126. Masson Т., Bruyere-Masson V., Vuillaume P., Lemoyne S. Rabies oral vaccination of foxes during the summer with VRG vaccine bait// Vet. Res. -1999. V. 30, N 6. - P. 595-605.

127. Matter H.C., Schumacher C.L., Kharmachi H. et al. Field evaluation of two bait delivery systems for the oral immunization of dogs against rabies in Tunisia.//Vaccine. 1998.- V. 16, N7.- N657-665.

128. McGuill M.W., Kreindel S.M., DeMaria A Jr., Rupprecht C. Knowledge and attitudes of residents in two areas of Massacachusetts about rabies and an oral vaccination program in wildlife // J. Am. Vet. Med. Assoc.-1997.- V. 211, N3. P.305-309.

129. McGull M.W. Kreindel S.M., DeMaria A. Jr. et al. Human contact with bait containing vaccine for control* of rabies in wildlife // J. Am. Vet. Med. Assos. -1998.- V. 213, N 10. P. 1413-1417.

130. Meltzer M.I. Assessing the costs and benefits of an oral-vaccine for raccoon rabies: a possible model// Emerg. Infect. Dis. 1996.- V.2, N4. - P. 343-349.

131. Meslin F.X., Kaplan-M.M., Koprowski H. Laboratory Techniques in Rabies // WHO. 1996. - 4-th ed.- Geneva, 1996.

132. Meyer H:H.D., Rinke L.M. The pharmacokinetics and residues of clen-buteroHn veal calves // J. Anim. Sc. 1991.- V. 69. - P. 4538-4544.

133. Muller T. Erfahrugen mit der Flugzeugbekoderung von Kogern zur oralen Immunisierung der Fuchse gegen Tollwut in Ostdeutstschland // Dtsch. Tierarztl. Wschr. 1993.- Bd. 100.- S. 203-207.

134. Muller T. Effect of maternal immunity on the immune response to oral vaccination against rabies in young» foxes// Am. J. Vet. Res. 2001.-V.62- N 7.- P.1154-1158.

135. Muller Т., Short K., Loepelmann et al. Testing of a new bait for oral immunization! of red foxes against rabies// Berl. Munch. Tierarztl. Wochenschr.- 1993. -V. 106,N2-P:41-46.

136. Oleyar С. M., Macinnes B.S. Field evaluation of diathylstilbestrobfor su-pressing reproduction in foxes // J. Wildl. Manage. 1974. - V. 38. - P. 101-108.

137. Pastoret P.P., Brochier B. Epidemiology and elimination of rabies in western Europe // Vet J: 1998. - V. 156, N 2.- P.83-90.

138. Pastoret P.P., Brochier B. Epidemiology and control rabies in Europe // Vaccine.- 1999.-V. 17, N13-14.- P. 1750-1754.

139. Pleasure S.J., Fischbein N.J. Correlation of clinical and* neuroimaging findings in a case of rabies encephalitis // Arch. Neurol. 2000. - V. 57, N12.-P. 1765-1769.180: Rabies in Europe // Rev. Sci. Techn. I'Office Internat. Epizoot. 1989. -№4.

140. Report of a WHO/APHIS Consultation on baits and baiting delivery systems for oral immunization of wildlife against rabies, Fort Collins. 1012 July 1990. - Geneva, 1990.

141. Report of the seminar on wildlife rabies control, Geneva.- July, 1990.-WHO/CDS/VPH/90.93.- Geneva, 1990.

142. Report of the Third WHO Consultations on oral immunization of dogs against rabies. Geneva. 1992.

143. Rosatte R.C., Lawson K.F., Maclnnes C.D: Development of baits to deliver oral rabies vaccine to raccoons in-Ontario // J. Wildl. Dis. 1998. -V. 34; N3.-P. 647-652.

144. Roscoe D.E., Holste W.C., Sorhage F.E. et al. Efficacy of an oral vaccinia-rabies glycoprotein recombinant vaccine in controlling epidemic raccoon rabies in New Jersey // J Wildl: Dis. 1998. - V. 34, N 4. - P.752.763.

145. Schluter H., Muller Т. Tollwutbekampfimg in Deutschland. Ergebnisse und Schussfolgerungen aus uber 10 jahriger Bekampfung // Tierarztl. Umschau.- 1995.- Bd. 50. S.748-758.

146. Schmid E. Erfahrungen mit der oralen Immunisierung von Fuchsen gegen Tollwut in Vorarlberg // Wien. tierarztl. Mschr.- Bd. 9. S. 338-340.

147. Schneider L. G., Cox J. H., Muller W.W. Der Feldversuch zur oralen Immunisierung von Fuchsen gegen die Tollwut in der BRD- Eine Zwischenbilant // Tierarztl. Umschau. 1987. - Bd. 42. - S. 184-198.

148. Schneider L.G. Der Einfluss der oralen Immunisierung der Fuchse auf die Epidemiologic der Tollwut // Fuchs- Symposium. Koblenz, 1990. -S. 145-164.

149. Schneider L. G. Application of monoclonal antibodies for epidemiological investigations and oral vaccination studies. III. Oral rabies vaccine // Rabies in the tropics. Berlin, 1985. - S. 55-59.

150. Schneider L. G., Cox J. H. Bat lyssavirus in Europe // Curr. Top. Microbiol. Immunol. 1994. - V. 187, № 2. - P. 207-218.

151. Schneider L.G. Current oral rabies vaccination in Europe: an Interim balance. // Rev. Infect. Dis. 1988. - V. 10. - P. 654-659.

152. Schneider L.G. Ein Feldversuch zur oralen Immunisierung von Fuchsen gegen die Tollwut in der Bundesrepublik Deutschland. II. Plannung, Durchfuhrung und Auswertung des Feldversuchs // Tierarztl. Umschau. -1983.-Bd. 38.- S. 476-480.

153. Schneider L.G., Cox J. H. A field trial of the oral immunization of foxesagainst rabies in the Federal Republic of Gemany // Tierarztliche Um-schau. 1983. - Bd. 38. - S. 315-324.

154. Schneider LG. Rabies virus vaccines.// Dev Biol Stand. -1995 N 84 -P.49-54.

155. Schumacher C.L. Coulon P., Lofay F. et al. SAG-2 oral rabies vaccine.// J. Vet. Res. -1993. V. 60, N4. - P. 459-462.

156. Schuster P., Gulsen N., Neubert A. Field trails evaluating baits uptake by an urban dog population in Turkey // J. Etlik.Vet. Microbiol., Ankara. -1998.-V. 9. P.73-83.

157. Selhorst Т., Schluter H. Cost-benefit analysis of the oral immuninization strategy for the control in fox populations // Epidemiol. Sante. Anim. -1997. V. 31/32. - P. 10.20.1- 10.20.3.

158. Sinnecker H. Development of the SAD/Potsdam 5/88 live rabies virus vaccine for the oral immunization of foxes as well as its characterization in the mouse model // Mh. Vet.-med. 1990. - Bd. 45. - S. 77-80;

159. Smith J. S. New aspects of rabies with emphasis on epidemilogy, diagnosis and prevention of the disease in United States // Clin. Microbiol. Rev. 1996.-V. 9, №2.-P. 166-176.

160. Smith J. S., Orciari L., Yager P. A. Molecular epidemiology of rabies in United States // Semin. Virol. 1995. - V. 6, № 4. - P. 387-400.

161. Steck F., Wandeler A'., Capt P., Schneider L. Oral immunization of foxes against rabies // Zbl. Vet. Med. 1982.- Bd. 29. - S. 372-396

162. Steelman H. G., Henlce S. E., Moore G. M. Bait delivery for oral rabies vaccine to gray foxes // J. Wildl. Dis.- 2000.- V. 36, N 4. P. 744-751.

163. Steelman H. G., Henke S. E., Moore G. M. Gray fox response to baits and attractants for oral rabies vaccination // J. Wildl. Dis.- 1998. V. 34, N4.-P. 764-770.

164. Stek F. Oral immunization of foxes against rabies // J. Experientia. -1978.-V. 34.-P. 1662.

165. Stek F., Wandeler W., Bichsel L. et al. Oral immunization of foxes against rabies. A field study // Zbl. Vet. med. Reihe B. - 1982. - Bd. 29. - S. 372-396.

166. Stohr F., Stohr E., Muller T. Orale Fuchsimpfung gegen Tollwut Ergeb-nisse und Erfahrungen aus den ostdeutschen Bundeslandern // Tierarztl. Umschau.- 1994. - Bd. 49. - S. 203-211.

167. Stohr K., Karge E., Loepelmann F. et al. Die- Entwicklung des Imp-fkoders fur die orale Immunisierung freilebender Fuchse gegen Tollwut // Mh. Vet. med.- 1990. - Bd. 45. - S. 165-169.

168. Stohr K. Orale Immunisierung freilebender Fuchse gegen Tollwut Vor-bereitung und Durchfuhrung der ersten Feldversuche in den ostdeutschen Bundeslandern // Mh. Vet. med.- 1990: - Bd. 45. - S. 782-786.

169. Stohr K., Meslin F.M. Progress and setbacks in the oral immunization of foxes against rabies in Europe // Vet. Rec.- 1996. V. 139, N 2.- P. 3235.

170. Stohr K., Stohr P., Muller T. Orale Fuchsimpfung-gegen Tollwut Er-gebnisse und Erfahrungen aus den ostdeutschen Bundeslandern // Tierarztl. Umschau. - 1994.- Bd. 49. - S. 202-211.

171. Suppo C., Naulin J.M., Langlais M., Artois M. A modelling approach to vaccination and contraception programmes for rabies control in fox populations // Proc. R!. Soc. Lond. B. Bio.l Sci. 2000.- N267. - P. 1575-1582.

172. Svrcek S., Durove A., Ondrejka R. et al. Immunogenic and antigenic activity of an experemental oral vaccine prepared from the strain Vnukovo-32/107// Vet Med.- 1995 V. 40, N3. - P. 87-96.

173. Tordo N., Poch O., Ermine A., Keith G. Primary structure of leader RNA and nucleoprotein genes of the rabies genome: segmented homology with VSV // Nucleic. Acids/ Res. 1986. - V. 14. - P: 2671 - 2683.

174. Vos A., Neubert A., Aylan O., Pommerening E. An update on safety studies of SAD B19 rabies virus vaccint in target and non-target species //h Epidemiol. Infect. 1999. - V. 123, N 1. - P. 165-75.

175. Vzral V., Matouch O. Annual testing of immunity in foxes after oral rabies immunization// Vet. Med. 1996.- V. 41,N4.- P. 107-111.

176. Wandeler A. I., Capt S., Kappeler A. et al. Oral immunizanion of wildlife against rabies: concept and first field experiments // Rev. Infect. Dis.- 1988."-V. 10.-P. 649-653.

177. Wandeler A. I'. Oral immunization of wildlife // The natural history of rabies. 2nd ed. - Boca Raton - CRC Press, 1991. - P. 485-503.

178. Wandeler A.I., Pfotenhauer P., Stacker C. Uber die Verwendung von Kodern zu biologischen Untersuchungen. an Fuchsen // Rev. Suiss. Zool.- 1975.-Bd. 82.-S. 335-348.

179. Wasi C.,Chaiprasithikul P., Thongcharoen P. et al. Progress and achievement of rabies control in Thailand // Vaccine.- 1997.- Suppl. 15. -P. 7-15.

180. Westerling' B. A field trial on oral immunization of raccoon dogs and foxes against rabies in Finland 1988-1989 // Rabies Bulletin Europe. -1989.;-V. 13,N2.-P. 9-12.

181. WHO Expert Committee on Rabies. Eighth report.// WHO Technical Report Series N824.- Geneva, 1992.-84 p.

182. Winkler W. G., Shaddok J. H.", Williams L. W. ОгаГ rabies vaccine: evalution of its infectivity in three species of rodents // Amer. J. Epidemiol. 1976. - V. 104: - P. 294-298.

183. Winkler W. G., Bogel K. Control of rabies in wildlife // J. Sci. Amer. -1992.- V. 266, №6.-P. 56-62.

184. Wandeler A., Baer G.M., Broderson J., Yager P. Determination of the site of oral rabies vaccination // Amer. J. Epidemiol. - 1975. - V. 101, N 7.-P. 160-164.

185. Wunner W.H., Larsen J.K., Dietzchold В., Smith C.L. The molecular biology of rabies viruses // Rev. Ifect. Dis. 1988. - V.10. - P.31-37.

Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA

Автореферат диссертации по ветеринарии на тему Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA

Оглавление диссертации Цеденхуу, Пуревхуу :: 2005 :: Владимир

Введение диссертации по теме "Ветеринарная эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология", Цеденхуу, Пуревхуу, автореферат

Заключение диссертационного исследования на тему "Культуральная инактивированная вакцина против бешенства из штаммов ВНИИЗЖ и ERA"

Список использованной литературы по ветеринарии, диссертация 2005 года, Цеденхуу, Пуревхуу

Похожие научные работы

Каталог диссертаций