Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Колибактериоз птиц: особенности экспресс - диагностики, профилактики и лечения

На правах рукописи

МАКАВЧИК СВЕТЛАНА АНАТОЛЬЕВНА

Колибактериоз птиц: особенности экспресс -диагностики, профилактики и лечения

16.00.03-ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология с микотоксикологией и иммунология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

о 6

Санкт-Петербург 2007

003165032

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Научный руководитель: доктор биологических наук

Сухинин Александр Александрович

Официальные оппоненты* доктор ветеринарных наук, профессор,

заслуженный деятель науки РФ Борисенкова Адель Наумовна

кандидат ветеринарных наук, доцент Щепегкина Светлана Владимировна

Ведущая организация: Федеральное государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Донской государственный аграрный университет»

Защита состоится "£1" ¿^■¿¿ф-^ЛлАй. 2008 г в 13 часов на заседании диссертационного совета Д 220 059 03 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины (196084, Санкт-Петербург, Черниговская, 5)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Автореферат разослан 2008 года и размещён на сайте http //

spbgavm ru"/6 " .ffj/ßa^L 2008г

Ученый секретарь диссертационного совета, *

доктор биологических наук У/Т*^^-*? Белова Л М.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время в России, как и в мире вообще, остается актуальной проблема острых кишечных инфекций, характеризующихся поли-этиологичностью, значительной вариабельностью антигенного состава возбудителей, длительной антигенной и токсической стимуляцией иммунокомпетентных клеток хозяина При этом одно из ведущих мест в инфекционной патологии по своей значимости занимает колибактериоз, на долю которого приходится около 50 - 60 % падежа птиц, вызванных условно-патогенной микрофлорой (Яременко Н А , Яковлев С С , 1998, Яковлев С С , 2000, Виноходов В О , 2000, Венгеренко Л А, 2003, Борисенкова АН с соавт, 2004, Галазин Н М и др , 2007 г)

Причинами этого является широкое, повсеместное распространение возбудителя болезни, высокий уровень заболеваемости, а также появление антибиотикоустой-чивых штаммов из-за бесконтрольного применения антибиотиков, и, как следствие, изменение взаимоотношений микроорганизма с макроорганизмом, нарушение микробиоценоза, повышенная заболеваемость птиц, снижение продуктивности (Никитин В Я с соавт, 1999, Тараканов Б В , Николичева Т А , 2000, Малик Н.И , Панин А Н , 2007)

Поэтому постоянный контроль бактериального фона, качества кормов и дезинфекции объектов внешней среды, своевременное проведение лечебных и профилактических мероприятий - это необходимость и залог успеха в получении доброкачественной и безопасной продукции (Борисенкова А Н, 2001)

Несмотря на широкое внедрение в бактериологическую практику методов генодиагностики и геноиндикации, классический бактериологический метод остается "золотым стандартом" при диагностике большинства инфекционных болезней Основной его недостаток - длительность исследования

По этой причине общепринятые методы бактериологического контроля не всегда удовлетворяют запросам производства. Поэтому разработка метода экспресс-диагностики, являющегося экономичным и в то же время достаточно информативным, возможным для применения в условиях птицехозяйств, представляет несомненный интерес, как для науки, так и для практики.

Для лечения колибактериоза широко используются антибиотики В тоже время, как показывает мировой опыт их применения, они не всегда обладают должной эффективностью (Тараканов Б В , Николичева Т А , 2000, Тулемисова Ж К , 2003) Поэтому не случаен интерес к использованию с целью профилактики и лечения болезни пробиотиков - препаратов, содержащих естественную микрофлору кишечника (Тараканов Б В , Николичева Т А , 2000, Поспелова В В . 2002, Шевелева С А с соавт , 2002, Панин А Н , 2007 и др ) Однако, несмотря на перспективность их применения, отказаться от антибактериальных средств сложно Поэтому наилучшим выходом, по нашему мнению, является разработка таких пробиотических препаратов, которые устойчивы к применяемым в хозяйстве антибиотикам При этом необходимо производить подбор как пробиотических, так и антибактериальных средств, исходя из их совокупного действия друг на друга и на организм хозяина

Учитывая вышеизложенное, цель работы - разработка метода экспресс - диагностики колибактериоза птиц, профилактики и лечения с использованием лакто-бактерий в сочетании с антибиотиком фторхинолонового ряда Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1 Провести ретроспективный анализ условно патогенной микрофлоры, выделенной от птиц

2 Разработать технологию приготовления питательной среды для экспресс -диагностики энтеробактерий

3 Провести биологические испытания среды и изучить возможность использования для выделения, идентификации доминирующих видов микроорганизмов от птиц разных видов и возрастов на птицефабриках различного технологического направления

4 Разработать эффективное средство лечения и профилактики колибактериоза птиц

5 Провести комиссионные испытания новой питательной среды «АВМ» и препарата «Лактофторхин»

Научная новизна. Предложен метод экспресс-диагностики колибактериоза птиц с использованием новой универсальной питательной среды, которая позво-

ляет проводить бактериологический контроль микрофлоры воздуха птицеводческих помещений и патологического материала Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Диагностическая питательная среда «АВМ»» № 2006139845/13(043446) (приоритет 03 И 2006г)

Проведены биологические испытания питательной среды Изучены ростовые свойства, чувствительность к разным видам микроорганизмов, эффективность для роста микроорганизмов, влияние среды на типичность микроорганизмов, на их морфологию, характер окраски по Граму, форму роста, сахаролитическую способность микроорганизмов

Разработан и апробирован эффективный метод профилактики и лечения коли-бактериоза с использованием нового препарата «Лактофторхин» Получено положительное решение формальной экспертизы по заявке на патент «Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта «Лактофторхин»» № 2006137178 (040477) от 23 10 2006г

Практическая значимость. Предложенный метод экспресс-диагностики ко-либактериоза позволяет ветеринарным специалистам в короткие сроки определить спектр микрофлоры и своевременно проводить необходимые ветеринарно-санитарные мероприятия Разработаны нормативно-технические документы

технические условия «Питательная среда для экспресс-диагностики энтеро-бактерий»,

- «Методические рекомендации по выделению и идентификации энтеробак-терий с использованием новой питательной среды», которые утверждены на методическом совете ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (протокол №2 от 08 11 2007г) и используются в работе врачами-бактериологами лабораторий птицефабрик и бактериологических отделов ветеринарных лабораторий, технические условия «Препарат «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза»;

«Методические рекомендации по использованию препарата «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза»,

которые утверждены на методическом совете ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (протокол №2 от 08 11 2007г ) и используются в работе ветеринарными специалистами птицефабрик

Основные положения диссертации используются в учебном процессе, в преподавании микробиологии, вирусологии и иммунологии студентам по смециачьностям 110501 Ветеринарная санитарная экспертиза, 310800 - Ветеринария в ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская академия ветеринарной медицины»

Апробация работы Основные положения и результаты исследовании заслушаны и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СТ16ГАВМ (Санкт-Петербург 2004, 2005 2006, 2007г ) на международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве« (Санкт-Петербург Ломоносов, 2004г ), на международной научно-производственной конференции «Актуальные проблемы эпиюоюлогии на современном этапе» (Санкт-Петербург, 2004 г), на II Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов аграрных образовательных и научных учреждений ^Инновации молодых ученых -сельскому хозяйству России» (Москва, 2005 г ) Основные положении, выносимые на защиту

1 Экспресс диагностика колибактериоза птиц с использованием предлагаемой новой питательной среды «\ВМ»

2 Лечение и профилактика колпбактериоза с использованием препарата «Лак-тофторхин»

Публикация результатов исследований. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста г состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка исполь¡ованной литературы, приложения Работа иллюстрирована 29 таблицами, 2 диаграммами, 4 гистограммами, 4 рисунками,

схемой и графиком Список использованной литературы включает 237 источника, в том числе 71 иностранных авторов

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в период с 2003 по 2007 год в ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Биоло1 ические испытания питательной среды проведены согласно ГОСТ Р 51758-2001

Культуры тест-штаммов микроорганизмов Enterococcus faecium А FCC 6057 DCM2146, Escherichia coli ATCC 11229 DCM 787, Proteus mirabihs ATCC 14153 DCM 788, Salmonella typhimunum ATCC 13531 DCM 1386 получены из музея Всероссийского научно-исследовательского института антибиотиков и ферментных препаратов медицинского назначения (г Санкт-Петербург), штамм Escherichia coli №389 (078) из ФГУ «ВГНКИ»

В экспериментальных исследованиях были использованы цыплята — бройлеры кросса Иза Уайт и кросса Иза Флекс Птиц содержали в виварии, в клеточных батареях типа БКМ-ЗБ Кормление осуществляли согласно "Рекомендациям по нормативному кормлению сельскохозяйственной птицы" (МСХ СССР, 1983)

Для экспериментальных и производственных испытаний подопытные и контрольные группы формировали по принципу аналогов

Материалом для исследований служили пораженные органы павших и вынужденно убитых птиц разных видов и возрастов, групповые пробы помета, смывы с тушек и пробы воды из инкубационных залов

Антагонистическую активность штаммов Д-75 и Д-76 живых молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus, входящих в состав «Лактофторхин», в опытах in vitro изучали методом штриховых посевов в соответствии с фармакологической статьей 42-252 ВС-89 в отношении тест-штаммов Escherichia coli 078 и по отношению к культурам микроорганизмов, выделенных от павшей и вынужденно убитой птицы

Выделение, видовую и родовую идентификацию культур микроорганизмов проводили в соответствии с регламентирующими документами

Определение чувствительности микроорганизмов к антибиотикам проводили методом диффузии антимикробного вещества из диска в засеянную питательную среду («метод дисков») или методом серийных разведений (Сбойчаков В Б и со-авт, 2000)

Эффективность применения «Лактофтсрхин» оценивали по следующим микробиологическим показа1елям состояние микробиоценоза кишечника цыплят, выделение и идентификация микроорганизмов из внутренних органов павшей и вынужденно-убитой птицы, клиническому состоянию птицы, производственным показателям (сохранность, прирост массы тела, расход корма, срок откорма, масса одной головы при убое)

Изучение микробиоценоза кишечника проводили по методике Р В Эпштейн-Литвак (1982) О количественном и качественном составе микрофлоры кишечника птиц судили по бактериологическим исследованиям фекалий

Для выделения различных групп микроорганизмов из фекалий птиц использовали среду Блаурокка для рода Bifidobacterium, МРС - 4 для рода Lactobacillus, элективную среду для рода Enterococcus, среду Эндо для бактерий семейства Entero-bacteriaceae, агар с мочевиной для рода Proteus, мясо - пептонный агар для аэробных бацилл рода Bacillus, желточно - солевой агар, кровяной агар для рода Staphylococcus, aiap Саб>ро для дрожжеподобных грибов рода Candida

В процессе выполнения диссертационной работы проведены бактериологические исследования 171 групповой пробы помета от птицы 3-50 - дневного возраста, бактериологические исследования 257 проб органов аг павшей и вынужденно убитой птицы, сделано 628 посевов и выделено 640 культур 14 видов микроорганизмов

Экономическую эффективность рассчитывали в соответствии с «Методикой определения экономической эффективности ветеринарных мероприятий», утвержденной Департаментом ветеринарии РФ (1997 год)

Результаты экспериментальных исследований обрабатывали статистически с использованием критерия Стыодента, придерживаясь правил вариационной статистики (Лакин Г Ф , 1990) и электронных таблиц Microsoft Excel for Windows

Пользуясь случаем, автор сердечно благодарит кандидата ветеринарных наук Виноходова В О, старшего научного сотрудника ГНИИ ОЧБ, кандидата биологических наук Вербицкую H Б, старшего научного сотрудника ГНИИ ОЧБ Батарина В И за неоценимую помощь при выполнении диссертации и всех, кто оказал помощь в организации и проведении исследований по теме работы, а также сотрудников, которые перечислены в качестве соавторов в списке публикаций по теме диссертации

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика новой питательной среды

С целью экспресс-диагностики нами разработана и предложена новая питательная среда «АВМ» для выделения энтеробактерий Она отличается от ранее применяемых сред универсальным набором индикаторов нейтральным красным, бром-тимоловым синим и метиловым красным Индикаторы имеют различную окраску в кислой и щелочной среде, четко улавливают незначительные изменения рН среды, обладают хорошо выраженными переходными тонами, широким диапазоном чувствительности, поэтому их мы и использовали в нашей среде

Использование среды «АВМ» позволяет выделить энтеробактерии из различных объектов из пораженных внутренних органов павших птиц, из помета живых клинически здоровых кур, из воздуха животноводческих помещений, среда может использоваться для проведения бактериологического контроля качества дезинфекции

В предварительных экспериментальных исследованиях нами был отработан оптимальный состав среды, содержащий в 1л 7,5 - 9,5 г минеральных солей, 8-12 г лактозы, 0,3-0,7 г маннита, красителей 0,03-0,05 г нейтрального красного, 0,01-

0,02 I метилового красного и 0,01-0,03 г. бром1имолового синего, 5-10 г агар-агара (таблица 1)

Таблица 1 - Состав новой экспериментальной питательной среды «АВМ»

Реагент На 1 литр (г) На 1 набор (г)

№С1 чда 3,64 1,1

Ма2НР04х12Н20 хч 1,36 (0,54 б/в) 0,41 (0,16 б/в)

(ИН^С^ чда 1 0,3

К2804 чда 2 0,6

МВ804Х7Н20 чда 0,5 0,15

Ыа2СОэ б/в хч 0,45 0,135

№2803 б/в чда 0,2 0,06

Лактоза чда 20 6

Маннит чда 1 0,3

Пегпон из мяса фермент Фарм 15 4,5

Дрожжевой экстракт гам 1 0,3

Метиловый красный чда 0,017 0,0051

Нейтральный красный чда 0,036 0,011 (0,022)

Бромтимоловый синий чда 0,027 0,0081 (0,0162)

Агар-агар (порошок) Б1Гсо 10 3

ИТОГО 56,23 (55,41) 16,87(16,623)

Примечание в скобках приведены количество индикаторов для среды с усиленным визуальным эффектом

Указанные количества компонентов являются оптимальными Изменение их в сторону увеличения или уменьшения снижает эффективность роста микроорга-

иизмов, ухудшает эксплуатационные характеристики среды, что влияет на плотность и прозрачность

Все компоненты, входящие в состав питательной среды «АВМ», соответствуют потребностям изучаемых штаммов Enterococcus jaecium АТСС 6057 DCM 2146, Escherichia call АТСС 11229 DCM 787, Proteu-. muabihs АТСС 14153 DCM 788, Salmonella typhimuuum ATCC 13531 DCM 1386, Eschenchia coh№389 (078)

Внешний вид, цвет наличие механических примесей определяли по ГОСГ 19618-0-78 визуально, запах - органолептически Порошок (концентрат) среды просматривали в проходящем и отраженном свете, встряхивая его

Качественные характеристики порошка среды приведены в таблице 2

Таблица 2 - Органолегггические показатели сухого концентрата среды (порошка)

№ п/п Наименование показателя Характеристика и норма

1 Внешний вид Мелкодисперсный, однородный порошок

2 Цвет Фиолетовый

3 Запах Специфический пептона

4 Наличие технических примесей Не допускается

Срок годности среды при температуре хранения +2 цо +20° С в течение 12 месяцев

Необходимо избегать влажности, так как увлажнение приводит к изменению внешнего вида (более темная окраска, комкование и т д ) и свойств, а часто к порче

Нами установлено, что концентрация Сахаров (лактозы от 8 г/л до 12 г/л и ман-нита от 0,5 до 0,8 г/л) и индикаторов (нейтральный красный от 0,03 г/л до 0,05 г/л, бромтимоловый синий от 0,01 г/л до 0,032 г/л и метиловый красный от 0,01 г/л до

0,022 г/л) оказывали влияние на идентификацию колоний по цвету Изменения цвета среды зависели от образования кислоты или щелочи при ферментативной деятельности микробов

В зависимости от вида и особенностей микроорганизмов цвет среды был красным (Escherichia), оранжевым (Citrobacter), или не изменялся (Klebsiella, Proteus, Salmonella).

Колонии микроорганизмов также изменяли окраску Escherichia coli приобретали малиново-красный, Salmonella enteritidis — лимонно-зеленый, Klebsiella pneumoniae - серо-розовый, Citrobacter freundu — оранжевый (таблица 3)

Таблица 3 - Видовой состав тест-штаммов

Среда Цвет среды до посева Индикатор Цвет колонии и среды в зависимости от ферментации лактозы

Новая пи- Коричневая Нейтральный Escherichia Красный

тательная с красный, coli Цвет среды красный

среда зеленова- бромтимоло- Salmonella Лимонно-зеленый

«АВМ» тым вый синий, метиловый красный enteritidis Цвет среды не изменяется

опенком (бурая) Klebsiella Серо-розовый

pneumoniae Цвет среды не изменяется

Citrobacter Оранжевый

freundu Цвет среды оранжевый

Установили, что испытуемая питательная среда соответствует требованиям ГОСТ Р 51758-2001 по ростовым свойствам, чувствительности питательной среды к разным видам микроорганизмов, эффективности для роста микроорганизмов и влиянию на типичность микроорганизмов — соответствие совокупности свойств микроорганизма, выросшего на испытуемой среде, установленным свойствам типа, вида и штамма тип дыхания, морфология, окраска по Граму, формы роста в питательных средах и биохимические свойства

В сравнительном аспекте изучены экспресс - методы диагностики колибактерио-за, которые использовались нами дополнительно для более точной видовой идентификации

3.2. Характеристика нового препарата «Лактофторхин» для лечения и профилактики колибактериоза

Нами впервые для лечения и профилактики колибактериоза предложен новый препарат «Лактофторхин», включающий в себя пробиотик и антибиотик Такое сочетание нами выбрано не случайно, так как полностью отказаться от применения антибиотиков в настоящее время не представляется возможным Не смотря на широкий выбор пробиотиков ветеринарным специалистам не всегда удается сделать оптимальный их выбор из-за отсутствия в наличии ангибиотикограммы пробиотиков

Эффективность препарата «Лактофторхин» достигается при одновременном заселении полезными микроорганизмами желудочно-кишечного тракта птиц и подавлении развития патогенных и условно патогенных бактерий антибиотиком фгорхинолонового ряда

При выборе молочно - кислых бактерий, мы предъявляли к ним следующие требования интенсивное развитие на различных питательных средах, проявление антагонизма к патогенным и условно - патогенным для птиц микроорганизмам, обладание адгезивностыо к слизистой кишечника, что определяет длительность лекарственного действия препарата, обладание устойчивостью к максимально широкому кругу антибиотиков, не содержание плазмид

Такие свойства обнаружены у молочнокислых бактерий Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76, которые использовали в качестве пробиотика

Живые молочнокислые бактерии Lactobacillus acidophilus штаммов Д-75 и Д-76 обладают природной резистентностью к широкому спектру антибиотиков (энроф-локсацину, канамицину, тобрамицину, полимиксину) Природная резистентность является постоянным видовым признаком микроорганизмов

Применения Lactobacillus acidophilus совместно с антибиотиками мы с одной стороны предупреждаем гибель биокультуры, что позволяет лактобактериям проявлять свое положительное воздействие, а с другой - компенсировать побочное действие антибиотиков на организм животного при лечении и профилактике

При выборе антибиотика мы остановили свой выбор на широко применяемом в птицеводстве энрофлоксацине, обладающим широким антибактериальным спектром против грамположительныч и грамсггрицательных бактерий и микоплазм, действующим на патогенную и условно-патогенную микрофлору, но не влияющим на штаммы лактобактерий, входящие в состав «Лактофторхин»

Установлено, что 11,77% микроорганизмов, выделенных от птиц были малочувствительны к энрофлоксацину из группы фторхинолонов, а 88,23% - были чувствительны и высокочувствительны В то же время наблюдали более низкий процент Е coli, резистентных к энрофлоксацину

Препарат «Лактофторхин» имеет вид гомогенной взвеси желтовато-белого цвета, без наличия плесени и не разбивающихся комочков, с кисломолочным запахом Хорошо ресуспензируется в воде при рН 7,2-7,5 в виде гомогенной взвеси Не содержит посторонней микрофлоры, безвреден и обладает высокой антагонистической активностью по отношению к тест-штаммам Escherichia colt 078,002, Salmonella enteritidis Наряду с этим препарат проявляет выраженный антагонизм в отношении клинических изолятов Е coli, S aureus, К pneumonia, С freundu, В sub-lihs

Срок годности препарата «Лактофторхин» 6 месяцев при температуре хранения в холодильнике +4 °С Количество жизнеспособных клеток Lactobacillus acidophilus снижается незначительно и составляет 2,8-3,0 х 106 в 1г препарата, что является нормой

3.3. Комиссионные и производственные испытания питательной среды

По окончании экспериментальных исследований с положительным результатом были проведены комиссионные испытания среды для выделения и идентификации

энтеробактерий в ФГ'ОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» в соответствии с программой, утверждённой ректором.

После этого питательная среда была испытана в условиях птицехозяйств. где объектами исследований были трупы цыплят и кур всех возрастов, групповые пробы помёта, смывы с оборудования на различных этапах технологического процесса птицефабрик.

Из всех объектов было выделено 928 культур микроорганизмов 15 видов, среди которых наибольший удельный вес приходился на Е. coli - 55,8%. Значительный процент составили микроорганизмы родов Staphylococcus, Streptococcus — 21,8%. Proteus и Pseudomonas составили соответственно 12,5% и 6,2%. В 3,7% случаев была выделена •■ Salmonella enteritidis. Спектр микрофлоры, выделенной в птице -хозяйствах представлен на гистограмме I.

Гистограмма 1 - Спектр микрофлоры, выделенной

в п ги цехозя йствах

9. Klebsiella pneumoniae 10. Stapylococcus gallmarum 11 Proteus mirabilis

12. Streptococcus zooepidemicus

13. Citrobacter diversus

14. Staphylococcus spp.

15. Er.terococcus

1.Escherichia coli

2. Staphylococcus aureus

3. Proteus vulgaris

4. Pseudomonas aeruginosa 5 Citrobacter fieunrtn

6. Stapylococcus epitiennidis

7. Salmonella enteritidis

8. Streptococcus spp. 11,8

При бактериологическом исследовании трупов нами было выделено 640 культур 14 видов. Escherichia coli определялась в 45,1% случаев, Staphylococcus aureus в 14,1 % и Proteus vulgaris в 1 1.7%.

Спектр микрофлоры, выделяемой из помёта, в каждом отдельном хозяйстве различен и зависит от эпизоотической ситуации на данной птицефабрике. Нами ис-

следовано 288 культур 9 видов микроорганизмов Доминирующими являются Escherichia coh, удельный вес которой составил 48%, Proteus vulgaris - 19%, Citro-bacter freundu - 15% и Staphylococcus aureus — 2,7% В 2,7% случаев была выделена - Salmonella enteritidis

3.4. Производственные испытания «Лактофторхина»

Установлено, что «Лактофторхин» позволяет в течение 3 дней восстановить уровень бифидофлоры с 6,90±0,36 lg КОЕ/г до 9,45±0,55 lg КОЕ/г (Р<0,001), увеличить количество молочнокислых бактерий на 0,98 lg КОЕ/г (Р<0,001), уменьшить численность бактерий группы кишечной палочки на 2,5 lg КОЕ/г (Р<0,001) и стафилококков на 1,94 lg КОЕ/г (Р<0,001), а также полностью исключить из организма лактозонегативные энтеробактерии Использование препарата способствовало с одной стороны восстановлению микробиоценоза в короткие сроки, с другой -повышало сохранность за счет снижения падежа от бактериальных болезней

Действие препарата не ограничивается влиянием только на микробиоценоз кишечника Применение «Лактофторхин» цыплятам-бройлерам в дозе 2,8-3 х10б микробных тел на голову в сутки, ежедневно, один раз в день, с 5 по 8 день выращивания, повышало среднесуточный прирост массы тела на 2,1 г или 5% (Р<0,01), массу одной головы при убое на 131 г или 7,3% (Р<0,01) по сравнению с контрольной птицей

Таким образом, в ходе исследований нами получены данные, подтверждающие ростостимулирующее действие препарата «Лактофторхин» Точный механизм его действия до конца не выяснен Мы придерживаемся мнения, высказанного некоторыми авторами (Зинченко Е В , Панин А В, Тараканов Б В , 2000, Jin L et al, 2000, Sindhu S С et al, 2002), считающими, что подобный эффект связан со способностью лактобацилл вырабатывать пищеварительные ферменты, улучшающими переваримость корма

Эффективность действия «Лактофторхин» оценивали по сохранности поголовья, среднесуточному приросту массы тела, массе одной головы при убое, проценту выбраковки, выходу продукции

В подопытной группе процент сохранности был на 2,9% (Р<0,05) выше по сравнению с контролем, процент выбраковки птицы, получавшей «Лактофторхин», меньше на 1,4% (Р<0,05) Применение препарата позволило увеличить среднесуточный прирост массы на 2,1 г или 5% (Р<0,01), а массу одной головы при убое на 131 г или 7,3% (Р<0,01) по сравнению с контрольной группой

Результаты наших экспериментов, проведенные в птицехозяйствах, свидетельствуют о положительном влиянии «Лактофторхин» на производственные показатели

Экономический эффект от применения «Лактофторхин» составляет 3,66 руб на рубль затрат

4. ВЫВОДЫ

1 Спектр микрофлоры, выделяемой от разных видов птиц на птицефабриках различного технологического направления достаточно широк и включает в себя 15 видов микроорганизмов Доминирующим является Escherichia coli, удельный вес которой составляет 55,8%

2 Для ускоренного выделения и идентификации энтеробактерий разработана новая питательная среда «АВМ», отличающаяся от известных питательных сред набором компонентов, что позволяет в течение 24 часов проводить не только качественный, но и количественный анализ

3 Питательная среда «АВМ» соответствует требованиям ГОСТ Р 51758-2001 по ростовым свойствам, чувствительности к разным видам микроорганизмов, эффективности для роста микроорганизмов, влиянию на типичность микроорганизмов

4 Разработан новый комбинированный препарат «Лактофторхин», для лечения и профилактики колибактериоза

Его эффективность достигается при одновременном заселении полезными микроорганизмами желудочно-кишечного тракта птиц и подавлении развития патогенных и условно патогенных бактерий с помощью антибиотика

5 Назначение препарата «Лактофторхин» в дозе 2,8-3,0 х 106 КОЕ Lactobacillus acidophilus и 3 мг/кг энрофлоксацина в течение 3 дней при колибактериозе восстанавливает микрофлору кишечника (молочнокислые бактерии, бифидобакте-рии, энтерококки, энтеробактерии), позволяет снизить частоту выделения кишечной палочки

6 Препарат «Лактофторхин» повышает среднесуточный прирост цыплят — на 5% (Р<0,01), убойную массу на 7,3% (Р<0,01), сохранность на 2,9% (Р< 0,05)

7 Экономический эффект от применения «Лактофторхин» составляет 3,66 руб на рубль затрат

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для оценки эпизоотической ситуации в отношении бактериальных болезней птиц рекомендуем новую питательную среду «АВМ» для экспресс-диагностики как эффективный метод контроля эпидемиологически опасных и условно-патогенных микроорганизмов, выделяемых от птиц, что даёт возможность быстрого выбора средств для нормализации микрофлоры кишечника и профилактики болезней бактериальной этиологии

2 Разработаны технические условия «Питательная среда для экспресс-диагностики энтеробактерий»; «Методические рекомендации по выделению и идентификации энтеробактерий с использованием новой питательной среды», которые используются в работе врачами-бактериологами лабораторий птицефабрик и бактериологических отделов ветеринарных лабораторий

3 Предложен научно обоснованный, экономически эффективный препарат «Лактофторхин» и разработаны технические условия «Препарат «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза», «Методические рекомендации по применению «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза»

4 Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии, эпизоотологии и болезней птиц.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1 Виноходов В О, Сухинин А А, Виноходова Е М , Макавчик С А Новая питательная среда для ускоренного определения энтеробактерий Материалы межвузовской научной конференции проф - препод состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ., СПб, 2003 - С 58-59

2 Виноходов В О , Беряльцева Н И, Сухинин А А., Макавчик С А Дифференциальная диагностика аспергиллеза и легочной формы Б егЛеп^сНБ — инфекции у цыплят первого возраста // Ветеринария в птицеводстве, 2004 - №4 - С 4-6

3 Евглевский А А, Пашкова Л П, Макавчик С А Среды для выделения и культивирования кишечной палочки и сальмонелл // Ветеринарный консультант -2004 -№22 -с 19

4 Сухинин А А, Виноходов В О, Макавчик С А Экспресс-диагностика энтеробактерий Материалы международной юбилейной научно-практической конференции ВНИВИП-СПб изд-во СПбГАВМ, 2004 - С 128-129

5 Сухинин А А, Виноходов В О, Макавчик С А Фторхинолоны анализ результатов широкого изучения и применения в отечественном птицеводстве // Ветеринария в птицеводстве, 2005 -№3(6) - С 9-18

6. Сухинин А А, Виноходов В О, Макавчик С А Изучение спектра энтеробактерий с использованием новой питательной среды на птицефабриках // Ветеринарная патология, 2006 - №1(20)-С 169-173

7 Макавчик С А Новая питательная среда для диагностики энтеробактерий Инновации молодых учёных - сельскому хозяйству России // Сб материалов Всероссийской конф - М : ФГНУ «Росинформагротех», 2006 - С. 52-54

8 Сухинин А.А, Макавчик С А Изучение энтеробактерий у птиц с использованием новой питательной среды для быстрого выделения и экспресс-идентификации // Ветеринария в птицеводстве, 2007. - №3 (32) - С 27-30

Тиражирование и брошюровка выполнены в учреждении «Университетские телекоммуникации» 197101, Санкт-Петербург, Саблинская ул, 14 Тел (812)233 4669 объем 1нл Тираж 100 экз

Актуальность темы

В настоящее время в России, как и в мире вообще, остается актуальной проблема острых кишечных инфекций, характеризующихся полиэтиологич-ностью, значительной вариабельностью антигенного состава возбудителей, длительной антигенной и токсической стимуляцией иммунокомпетентных клеток хозяина. При этом одно из ведущих мест в инфекционной патологии по своей значимости занимает колибактериоз, на долю которого приходится около 50- 60 % падежа птиц, вызванных условно-патогенной микрофлорой (Яременко Н.А., Яковлев С.С., 1998; Яковлев С.С., 2000; Виноходов В.О., 2000, Венгеренко JI.A., 2003, Борисенкова А.Н. с соавт., 2004, Галазин Н.М. и др., 2007 г.).

Причиной этого является широкое, повсеместное распространение возбудителя болезни, высокий уровень заболеваемости; из-за бесконтрольного применения антибиотиков - появление антибиотикоустойчивых штаммов. Как следствие - изменение взаимоотношений микроорганизма с макроорганизмом, нарушение микробиоценоза, повышенная заболеваемость птиц, снижение продуктивности (Никитин В.Я. с соавт., 1999; Тараканов Б.В., Ни-количева Т.А., 2000; Малик Н.И., Панин А.Н., 2007).

Поэтому постоянный контроль бактериального фона, контроль качества кормов и дезинфекции объектов внешней среды, своевременное проведение лечебных и профилактических мероприятий - это необходимость и залог успеха в получении доброкачественной и безопасной продукции (Борисенкова А.Н.,2001).

Несмотря на широкое внедрение в бактериологическую практику методов генодиагностики и геноиндикации, классический бактериологический метод остается "золотым стандартом" при диагностике большинства инфекционных болезней. Основной его недостаток - длительность исследования.

По этой причине общепринятые методы бактериологического контроля не всегда удовлетворяют запросам производства. Поэтому разработка метода экспресс-диагностики, являющегося экономичным и в то же время достаточно информативным, возможным для применения в условиях птицехо-зяйств, представляет несомненный интерес, как для науки, так и для практики.

Для лечения колибактериоза широко используются антибиотики. Однако как показывает мировой опыт их применения - они не всегда обладают должной эффективностью (Тараканов Б.В., Николичева ТА.,2000; Тулеми-сова Ж.К.,2003). Поэтому не случаен интерес к использованию с целью профилактики и лечения болезни - пробиотиков - препаратов, содержащих естественную микрофлору кишечника (Тараканов Б.В., Николичева Т.А., 2000; Поспелова В.В., 2002; Шевелева С.А. с соавт., 2002, Панин А.Н., 2007 и др.). Однако, не смотря на перспективность их применения, отказаться от антибактериальных средств сложно. Поэтому наилучшим выходом, по нашему мнению, является разработка таких пробиотических препаратов, которые устойчивы к применяемым в хозяйстве антибиотикам. При этом необходимо производить подбор как пробиотических, так и антибактериальных средств, исходя из их совокупного действия друг на друга и на организм хозяина.

Учитывая вышеизложенное, цель работы - разработка метода экспресс -диагностики колибактериоза птиц, профилактики и лечения с использованием лактобактерий в сочетании с антибиотиком фторхинолонового ряда.

Для реализации цели были поставлены следующие задачи:

1. Провести ретроспективный анализ условно патогенной микрофлоры, выделенной от птиц.

2. Разработать технологию приготовления питательной среды для экспресс - диагностики энтеробактерий.

3. Провести биологические испытания среды и изучить возможность использования для выделения, идентификации доминирующих видов микроорганизмов от птиц разных видов и возрастов на птицефабриках различного технологического направления.

4. Разработать эффективное средство лечения и профилактики колибактериоза птиц.

5. Провести комиссионные испытания новой питательной среды «АВМ» и препарата «Лактофторхин».

Научная новизна

Предложен метод экспресс-диагностики колибактериоза птиц с использованием новой универсальной питательной среды, которая позволяет проводить бактериологический контроль микрофлоры воздуха птицеводческих помещений и патологического материала. Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение «Диагностическая питательная среда «АВМ»» № 2006139845/13(043446) (приоритет 03.11.2006г.).

Проведены биологические испытания питательной среды. Изучены ростовые свойства, чувствительность к разным видам микроорганизмов, эффективность для роста микроорганизмов, влияние среды на типичность микроорганизмов, на их морфологию, характер окраски по Граму, форму роста, сахаролитичеркую способность микроорганизмов.

Разработан и апробирован эффективный метод профилактики и лечения колибактериоза с использованием нового препарата «Лактофторхин». Получено положительное решение формальной экспертизы по заявке на патент «Препарат для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта «Лактофторхин»» № 2006137178 (040477) от 23.10.2006г.

Практические результаты

Предложенный метод экспресс-диагностики колибактериоза позволяет ветеринарным специалистам в короткие сроки определить спектр микрофлоры и своевременно проводить необходимые ветеринарно-санитарные мероприятия.

Разработаны нормативно-технические документы: технические условия «Питательная среда для экспресс-диагностики энтеробактерий»;

Методические рекомендации по выделению и идентификации энтеробактерий с использованием новой питательной среды», которые утверждены на методическом совете ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (протокол №2 от 08.11.2007г.) и используются в работе врачами-бактериологами лабораторий птицефабрик и бактериологических отделов ветеринарных лабораторий; технические условия «Препарат «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза»; «Методические рекомендации по использованию препарата «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза», которые утверждены на методическом совете ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» (протокол №2 от 08.11.2007г.) и используются в работе ветеринарными специалистами птицефабрик. Основные положения диссертации используются в учебном процессе, в преподавании микробиологии, вирусологии и иммунологии студентам по специальностям 110501 - Ветеринарная санитарная экспертиза, 310800 -Ветеринария в ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская академия ветеринарной медицины».

Апробация работы Основные положения и результаты исследований заслушаны и обсуждены на научных конференциях профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников и аспирантов СПбГАВМ (Санкт-Петербург, 2004, 2005, 2006, 2007г.); на международной юбилейной научно-практической конференции «Новое в эпизоотологии, диагностике и профилактике инфекционных и незаразных болезней птиц в промышленном птицеводстве» (Санкт-Петербург, Ломоносов, 2004г.); на международной научно-производственной конференции «Актуальные проблемы эпизоотологии на современном этапе» (Санкт-Петербург, 2004 г.); на II Всероссийской конференции молодых ученых и специалистов аграрных образовательных и научных учреждений «Инновации молодых ученых - сельскому хозяйству России» (Москва, 2005 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Экспресс-диагностика колибактериоза птиц с использованием предлагаемой новой питательной среды «АВМ».

2. Лечение и профилактика колибактериоза с использованием препарата «Лактофторхин».

Публикация результатов исследований По теме диссертации опубликовано 8 научных работ.

Структура и объём работы Диссертация изложена на 156 страницах компьютерного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка использованной литературы, приложения. Работа иллюстрирована 29 таблицами, 2 диаграммами, 4 гистограммами, 4 рисунками, схемой и графиком. Список использованной литературы включает 237 источника, в том числе 71 иностранных авторов.

4. ВЫВОДЫ

1. Спектр микрофлоры, выделяемой от разных видов птиц на птицефабриках различного технологического направления достаточно широк и включает в себя 15 видов микроорганизмов. Доминирующим является Escherichia coli, удельный вес которой составляет 55,8%.

2. Для ускоренного выделения и идентификации энтеробактерий разработана новая питательная среда «АВМ», отличающаяся от известных питательных сред набором компонентов, которые позволяют в течение 24 часов проводить не только качественный, но и количественный анализ.

3. Питательная среда «АВМ» соответствует требованиям ГОСТ Р 51758-2001 по ростовым свойствам, чувствительности к разным видам микроорганизмов, эффективности для роста микроорганизмов, влиянию на типичность микроорганизмов.

4. Разработан новый комбинированный препарат «Лактофторхин», для лечения и профилактики колибактериоза.

Его эффективность достигается при одновременном заселении полезными микроорганизмами желудочно-кишечного тракта птиц и подавлении развития патогенных и условно-патогенных бактерий с помощью антибиотика фторхинолонового ряда.

5. Назначение препарата «Лактофторхин», содержащего Lactobacillus acidophilus в дозе 2,8-3,0 х 1 ОбКОЕ и энрофлоксацин 3 мг/кг, в течение 3 дней при колибактериозе восстанавливает и поддерживает микрофлору кишечника (молочнокислые бактерии, бифидобактерии, энтерококки, энтеробактерий), позволяет снизить частоту выделения кишечной палочки.

6. Препарат «Лактофторхин» повышает среднесуточный прирост цыплят- на 5% (Р<0,01), убойную массу на 7,3% (Р<0,01), сохранность на 2,9% (Р< 0,05).

7. Экономический эффект от применения «Лактофторхин» составляет 3,66 руб. на рубль затрат.

5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Для оценки эпизоотической ситуации в отношении бактериальных болезней птиц рекомендуем новую питательную среду «АВМ» для экспресс-диагностики как эффективный и безопасный метод контроля эпидемиологически опасных и условно-патогенных микроорганизмов, выделяемых от птиц, что даёт возможность быстрого выбора средств для нормализации микрофлоры кишечника и профилактики болезней бактериальной этиологии.

2. Разработаны: технические условия «Питательная среда для экспресс-диагностики энтеробактерий»; «Методические рекомендации по выделению и идентификации энтеробактерий с использованием новой питательной среды», которые используются в работе врачами-бактериологами лабораторий птицефабрик и бактериологических отделов ветеринарных лабораторий.

3. Предложен научно обоснованный, экономически эффективный препарат «Лактофторхин» и разработаны: технические условия «Препарат «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза»; «Методические рекомендации по применению «Лактофторхин» для лечения бактериальных болезней и профилактики дисбактериоза».

4. Материалы, изложенные в диссертации, используются в учебном процессе на кафедрах микробиологии, вирусологии и иммунологии, эпизоотологии и болезней птиц.