Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:Изучение микробактерий лазерной спектроскопией

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА

ОМСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ИНСТИТУТ ВЕТЕРИНАРНОЙ -Г 6 ОД МЕДИЦИНЫ

- ~ На правах рукописи

УДК 619:616.98:579.841.93.616-076

МАРТЫНОВА ЕЛЕНА СЕРГЕЕВНА

ИЗУЧЕНИЕ МИКОВАКТЕРИЙ ЛАЗЕРНОЙ СПЕКТРОСКОПИЕЙ.

16.00.03 - ветеринарная микробиология, вирусология, эпизоотология, микология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук

г. Омск - 1995 г.

Работа выполнена в лаборатории физико-химических методов исследования Всероссийского научно-исследовательского института бруцеллеза и туберкулеза животных г.Омск.

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук В.И.Околелов

Официальные оппоненты: Доктор ветеринарных наук, профессор Н.П.Овдиенко Кандидат ветеринарных наук, доцент В.П.Сухотина

Ведущее предприятие: Институт экспериментальной ветеринарии Сибири и Дальнего востока СО РАСХН.

у у Защита диссертации состоится £> 1995 года

в ^' час наг заседании специализированного совета К. 120.48.01

при Омском государственном институте ветеринарной медицины. 644007, Омск - 7, ул.Октябрьская, 92.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Омского государственного института ветеринарной медицины.

/Г

Автореферат разослан ^ 1995 года,

Ученый секретарь специализированного совета кандидат ветеринарных наук,

доцент В.М.Барабанов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Туберкулез сельскохозяйственных .„_-животных занимает особое место среди инфекционных заболеваний вследствие опасности его возбудителя для человека и значительного

продукции и затрат на проведение мероприятий по его ликвидации. " " Ситуация осложняется широким распространением во внешней среде нетуберкулезных микобактерий различных видов (Лазовская АЛ., Блохина И.Н., 1976; Кадочкин A.M., 1979; Wayn L., 1971; Portales F., 1988 и др.), что приводит к необоснованной сдаче на убой реагирующих на туберкулин животных, сенсибилизированных атипичными микобактериями.

В комплексе мероприятий по оздоровлению неблагополучных хозяйств от туберкулеза крупного рогатого скота важное место занимает совершенствование методов диагностики. В настоящее время лабораторная диагностика туберкулеза традиционно основывается на комплексе анализов и тестов по изучению патогенных, тинкториальных, биохимических и других свойств выделяемых культур и требует значительных затрат времени и труда (Благодарный Я. А.,1980).

Кроме того, использование в ветеринарной практике химиотерапевтическжх средств вызвало в ряде регионов изменение биологии возбудителя, что также может затруднять его идентификацию.

В этой связи весьма актуальными являются разработка и внедрение в ветеринарную практику новых, чувствительных методов биодетекции и идентификации микобактерий, которые совмещают простоту методики и возможность автоматизации.

Особенно перспективным в этом отношении является метод спектроскопии комбинационного рассеяния света (СКР) (Кэри П.,1985), в частности резонансной спектроскопии KP с возбуждением спектров в ультрафиолетовой области спектра (УФ РКР). Это объясняется уникальными возможностями метода для биодетекции клеток и их компонентов, которые позволяют наблюдать спектры в водных растворах - естественной среде микроорганизмов, исследовать живую клетку и получать информацию о хемотаксономических маркерах без ее дополнительной дезинтеграции и использования при анализе дорогостоящих реактивов.

экономического ущерба,--складывающегося из недополучения

• 4 _

До недавнего времени из за отсутствия лазерных источников требуемого спектрального диапазона ультрафиолетовая область (<250нм) была малодоступна. Полностью отсутствует методическая информация по изучению патогенных микроорганизмов in vivo.

Все это определило цели и задачи проведенных исследований.

Цель и задачи исследований. Целью работы было разработать методику исследования живых культур микобактерий лазерной спектроскопией ультрафиолетового резонансного комбинационного рассеяния (УФ РКР). Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- получить воспроизводимые спектры микобактерий разных видов с использованием экспериментальной установки на основе отечественного приборостроения

провести селективное исследование основных хемотаксономических маркеров микобактерий (белкового и нуклеотидного компонентов) in vivo

- выявить характерные линии спектров и видоспецифические области для создания банка данных с последующей идентификации микобактерий на ЭВМ ^ i

провести сравнение лазерной спектроскопии с другими методами исследования.

Научная новизна.

1. На базе созданной в лаборатории физико-химических методов исследования ВНИИБТЖ экспериментальной установки -лазерного спекторметра УФ РКР - разработана методика исследования микобактерий in vivo.

2. Изучены культуры микобактерий разных видов. Отработаны подходы применения метода, установлены высокоспецифичные области спектров для идентификации микобактерий.

3. Проведено исследование спектров УФ РКР микобактерий на разных стадиях роста. Установлена закономерность изменений спектральных характеристик нуклеотидного компонента микобактерий в зависимости от возраста.

4. По спектрам УФ РКР выявлены внутривидовые отличия между микобактериями одного вида.

Практическая и теоретическая значимость работы. Результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности применения лазерной спектроскопии для идентификации

микобактерий.

Продемонстрированы уникальные возможности УФ РКР для изучения электронно-конформационных характеристик биомолекул в-составе живой клетки. Использование лазерной спектроскопии (УФ РКР) позволяет изучать микроорганизмы в раачичных физиологических состояниях, оценивать воздействие лекарственных и дезинфекционных средств, напраштенно отбирать штаммы или их фрагменты для создания диагностикумов и вакцин.

Разработанная методика открывает возможности

использования УФ РКР для идентификации и изучения любых бактериальных культур.

Апробация результатов работы. По материалам диссертации сделаны сообщения на научных конференциях и заседаниях Ученого совета ВНИИВТЖ (Омск, 1989-1993), Всесоюзной научно-теоретической конференции по биотехнологии в животноводстве (Новосибирск, 1991), 1-ом международном конгрессе по биофизике и биотехнологии (Турция, 1991), на Всероссийском координационном совещании по туберкулезу и бруцеллезу животных (Омск, 1992-1993).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация иачожена на 103 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, обсуждения, выводов, практических предложений и списка литературы.

Диссертация иллюстрирована 12 рисунками, 10 фотографиями и 6 таблицами. Список литературы включает 170 источников из них 55 - отечественных и 115 зарубежных авторов.

Основные вопросы, выносимые на защиту: методика и результаты изучения микобактерий лазерной спектроскопией (УФ РКР).

, СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований. Работа выполнена в лаборатории физико-химических методов исследования ВНИИБТЖ (г.Омск) и лаборатории - физико-химического анализа института биоорганической химии им. Шемякина АН СССР (Москва). Для получения спектров были использованы культуры 15 музейных штаммов микобактерий 6 видов, полученных из

государственного контрольного института (ВГНКИ): M.tuberculosis (2 штамма), М,bovis (3 штамма), M.avium (6 штаммов), M.intracellulare (2 штамма), M.smegmatis, M.phlei и 3 культуры микобактерий, выделенных от больных животных и отнесенных

к M.bovis в стадии стационарного роста. 4 штамма музейных культур М.tuberculosis, M.bovis и M.avium исследовали на трех стадиях роста (логарифмического, стационарной и стадии отмирания).

Культуры выращивали на жидкой питательной среде Сотона, собирали бактериальную массу и трижды отмывали ее стерильным 0,85% раствором NaCl, охлажденным до температуры +4°С с промежуточным центрифугированием в течение 30 минут при 6000 об/мин и температуре +4°С. Осажденную бакмассу ресуспендировали 0,05М фосфатным буфером с добавлением 0.2М Ní^SO^ в качестве внутреннего спектроскопического стандарта. Концентрацию микроорганизмов в образце доводили по стандарту мутности до 0,1-1 млрд микробных тел в 1 мл.

Модельные соединения ароматических аминокислот, полипептидов, moho-, дезоксирибонуклеотидов фирмы Sigma (США), фосфорно-кислые калий и натрий, сернокислый натрий категории ОСЧ использовали без дополнительной очистки.

Для работы использовали экспериментальную установку, созданную на основе приборов отечественного производства: лазерной системы (АПАГА-1312 и ЛТИ-403), спектрометра КП ДФС-520, микроЭВМ ДВК-ЗМ, со спектральным диапазоном - 930-190 нм.

Перед изучением образцов производили юстировку лазерной системы и калибровку спектрометра излучением ртутной лампы высокого давления по линии 253,6 нм.

Работу по лазерной спектроскопии проводили совместно со старшим научным сотрудником ВНИЙБТЖ А.П.Татариновым.

На ЭВМ загружали математическое программное обеспечение, которое позволяет скорректировать зарегистрирован-ные спектры микобактерий, учесть и вычесть сигнал воды и следовых количеств питательной среды, на которой были выращены исследуемые культуры, а также сравнивать полученные спектры со спектрами других культур, хранящихся в памяти ЭВМ.

Для обеспечения безопасности работы с живыми микобактериями сконструирована герметичная бактериальная камера из которой суспензия бактерий перистальтическим насосом подается в кварцевую кювету. На находящийся . в кювете образец подавали расфокусированный лазерный луч со средней мощностью 3-6 мВт.

Средняя длительность одного импульса 10- 15 не при частоте повторения импульсов 1-60 Гц.

С целью селективного вгсяедов&кня мсдо»фа измереяие проводили прп длнпе воякы 230-252 як.

Для ггредотяращения фотораэложения ететаг под лучом лазера использовали систему прокачка и термости-гяровапкк суспажшк.

. — : Проводили регистрацию шсхгроя УФ РКР- кссяедуемой культуры.

Дшг колкпоственрого сопуставлеги'й спектров УФ РКР измеряли относительную иктеасиввость лнннй Опенку отаосятечыгой ивтенсяяпястя лякий ароердилп tro отяитсидю к интергигдюетн ленки 981 см-! от склада ввутреннрго реаера' сернокислого натрия на едедавяу глоточной кассы в rrftsz.

Посяе математической ofipeSoiut. я- rcpi^puwctr- св**трев УФ . РКР микоорктсрДа. прйжкггл" анализ, -усгаиааднвак»ез£й оОлясп.' споткфк ¿еокого . црофавя разшгашх видов микобактеркй и специфичность oteoeishws шггекеявааети яшпгй от вкладов различных составляюнщ£

После .получения спектров онраделеяиего вдда бгетррив данные обрабатывали на ЭВМ в заносили в банк дайпых.

Сравнительные исследования мгагодастеряй пртаодпяп сдгяаш» • ГОСТ 26072-84.. '^Жявотные к отита с.»«й*згочоз^сгздкяш", "Наставлению по ддагяостаи; т»"бзпк.тз««зг. гплм rawx" íiSfiü).

ДжЬфй^гш.йапкл и ицеитпфкхацл и м» ьоГшгтнргялы» ал культур с целью отбора штаиков для вгс-идггаки» .-f»'-.'г/1?; У4» ПКР проводив: в соотавтегвяв < м-топьчсогаш» Г- -.пмсидаиьямя "Бактерпояогштес&аг в бисхяик-хескаа лдогггфяшшш-. -.. «rí>f.«srt-ppj t Т.Е.Ид ыша, 1980.'.

У мшсойахтерияльных культу;) азиата: екор^ть роста па среде Лепеяпзтейн^-Йексена при температуре 2'í, 3?, 45 и 52 С; характер роста па среде Леиекштейпа-Иексеп:; при. гемиературе 37 С; т1и£кторпаяы1ые свойо-гва .(окраска по Цидда-Нкльсену*' с'тэсоГ.яость ••• лш-меитиобразовашш. ва свету и р -¡емяэте но mcto.¡v £ (1973);' рост на сред,* Левеянпсйиа-Кенсепй t ccaejgy'-a в 0,2% среды 0,5 п 1,0 мг саиицилата шраамид«^'*^® аътрвя п-0

ксвпвдгграиш. по методу Tsukaniura (1962)яЩ^у По !'етоду

методу Kestle е.а. (1967); реакншо rrt); jratp^- °ППо f-3ñ7}: Wayne (1952); пиашшовый rg aU!íШс'К

каталазную активнее) ь па асор.тго.~~

• ■-..л':/,, * * —"íx

йкдовуш пс.ггшдл!»' -bteo. ред

культур MHKf.fiKEJlf" "°fano

ыо общепрп:;'"

/

мирских свянок, 36 кроликов и 36 кур. Степень патогенности изучаемых культур оценивали по срокам гибели, по снижению массы тела, по интенсивности поражения внутренних органов. Павших и убитых по истечения трех месяцев животных вскрывали, учитывали наличие туберкулезных изменений и проводили посев патологического материала на среду Левенштейна-Йенсена по методу Гона-Левенштейяа-Сумиошн.

С целью изучения субмикроскоппческой организации исследуемых микобактерий . их- колонии обрабатывали по методике Ryter, Kellenberger (1958), (работа проводилась совместно с научным сотрудником ВНИИБТЖ Б.И.Коганом). При пропитке материала эпоксидными смолами было использовано воздействие ультразвуком с целью оптимизации процесса пропитка по методу предложенному Татариновым А.П. и Коганом Б.И. (1990).

Полученные блокй с колониями микобактерий после 14-дневной выдержки ультратомяровали на ультрамикротомах УМТП-4 и УМТП-5 по общепринятой методике (Уикли В., 1985). Срезы помещали на электролитические сеточки с формваровой подложкой (по методу Пиз Д.1963). Срезы на сеточках контрастировали 3% раствором ураиилацетата на .30% этаноле в течение 3-4 часов и цитратом свинца по Reynolds (1963).

Исследование образцов и получение мектронограмм осуществляли в электронном микроскопе ЭМВ-100Б при усгорякмцем напряжении 75-100 кВ.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ..

Спектроскопия УФ___РКР______ШЩоОает^рий. Идентификация

микобактерий физико-химическими методами связапо, как правило, с деструкцией образцов и специальной подготовкой объекта пря свИЮЙ его свойства подвергаются определенным изменениям. В acooft«- этим весьма интересной представляется возможность й3учейщ'-»я нового метода лазерной спектроскопии УФ РКР Для и.пф°?,АайЙ ^гических объектов и получения селективной

и3^клеток интактных микроорганизмов, досре^ данного метода является возможность

^СйЛЯвагГЬ преи»УтеСГГ*" 'чы волны возбуждения резонапсно тдавяь® сецеКтйвВи групп б'иохромофоров. Одним из

во3,ло "чемого метода является

- спектров РКР белкового

или ' нуклеоГидного компонентов мтароорганизмой. Таетм образом, возможно одновременно изучать как фено-. так в генатипичеекие призпвки. „ __-—----------

Анализ спектров погггоЕгения бактерий и изучение спектров - модельных: соединений показал, что для кзучрнпя .. кикобактерий перспективно использовать дянны возбуждения, равные 230 пм в 250 им. ТвкоВ.вывоп определяется следующим» соображениями:

- на длпне волны 252 нм проистодат-селективиое резонансное усиление сигвала кояебательнгтк мод вуклеотядяого компонента при

. минимальном уровне сигнала УФ РКР ароматических аминокислот цепей белков; ' "

- на длине ьоляы 230 нм салектгтшо . ьодагрждаётся байховип компонент кл&Хок - ■ прй Г ызшшалпьят« сагвале нуклеотидных оснований;

- возбуждение при длапе войны < 260 нм позволяет значнтельво умеакаить фоновую флюоресценцию,

Таким Образом, выбранные длины воли воэбуадеввя позволяют получать ияформапию об особенвостях етроегпгя генам а микроорганизма в составе и структуре' белков.

Спектры модельных ёоедявйййй 'аиураааъкмт кои»>о"угггг.г1 Дай- матер iptrtvtwv ¿acarpos: 'шиюбяхтегШ . иря возбуждение ве выбраявых Jtrtifssx волк, нами получены сгякгрм моайльпых соеяскеяий: основных ароматических аминокислот и »^клпглядиых исяоваяий (тирозина. триптофана, фенил чяаиикг., тимуса

теленка, полкпуклеотяяов ю липадов). Ооотнесе: :•« огдельгтых лияпй в спектрах УФ РКР опредвлечкь,.. колебательным модам биохромофоров проведены по Rava R.P. f 19S9).

Результаты нзучення спектров модельных соединений показали, что при возбуждении на определенных длинах зола яаблюдавтся увеличение пятепсияпостей. , Линий. которые соответствуют различным-колебательным модам бяоштекуя, что подтверждает : возможность неполъяойяния метода спектроскопии УФ РКР для; селективного исследования сложных молекулярных структур.

Спектры нуклеотндн<)ГО чомдоневтрв

микобактерив _ разных видов,: В настоящей работе впервые

методом лазерной скчктроскоп'Ш (УФ.РКР) исследованы 18 культур микобактерий относящихся к шести разным видам. На рис. 1-2 изображены слгг.тры УФ РКР мякоЗактернн M-ti¡berca!osi&, шт.192 и LVSt, M.bovis, шт.8. Valle, ввкгагнпого глтаима BCG, М. avium, crr.61 в 2282 в стационарной стадяп роста- При

возбужденна излучением 252 нм спектры характеризуются сходным набором линий, которые отличаются их относительными интенснвностами.

Рнс.1. Спеггры УФ РКР микобактерий M.tuberculosis шт. 192, Dt/St, Млшат шт • 1, 2282, M.bovis шт. RCG, 8 и Valle при возбуждении на длине волны 252 им.

Сравнение спектров УФ : РКР . перечисленных выше культур микобактерий .со спектрами нуклеотидов позволяет' заключить,. что преимущественный вклад в спектр дают ДНК и РНК различных типов, а также свободные ауклеотиды. Липии РКР микобактерий при длине волны 252 нм в основном .являются суммой вкладов А,Т и G, при минимальном вкладе С. . .

Белок дает относительно малый вклад в спектры клеток при возбуждении на 252 нм. Основные линии: У-Ф РКР клеточных культур локализованы в области 1200 - - 1700 см-1 и представлены тремя группами линий: I - 1300-1400 см-1, II -сильная линпя при 1490 см-1, III - 1570-170Ó см-1.

. В спектрах Уф РКР микобактерий при длине волны 230 им нуклеотвдный .. комтюв8пт имеет минимальный сигнал за Исключением вклада гуавив-аденивовой коаигонйиты.

«.BOVfS

UJT.YA'.LeE

лда1

. . PacJ2.; Спеггры УФ РКР мняобактерий M.tubereulosis ЮТ-192, Dt/St, M.avitun шт. 61,2282, M.bovis nrr.BCG, 8 и Valle 0рн возбуждении яа давне волны 230 им.

Проаналвзаровав спектры ивкобактерий, мы установили, что для M.aviura интенсивность лпнвй в области 1700-1640 см-1 более значительна по сравнению с культурами M.bovis.

Характерно, что M.bovis, шт.8 и Valle имеют меньшую интенсивность линии- при 760 см-1, чем в спектрах M.avium » штамма BCG. Причем;, я спектре M.avium, шт.2282 эта л^ наиболее выражена. Для линии же -1016 см-1 не набл"" таких pesmx отличив в интенсивности , сальную

Проведенные исследования показали о-^Яве пелой возможное» . изучения яатявньи макромолекул жавой мвкобактеряи н получения как качественной информация

так и

возможность

изучения нувяеотидвого н белково»- методвческяз: п длины ваяны возбуздения. ^ ^ были использованы. для

прамевения спектроскопии УФ РКР для -биодетекции и . идентификации мнкобактерий.

Исследование относительной концентрация макромолекул

мнкобактерий как показателя специфичности________культур. В

исследовании анализировались, спектры УФ РКР 8 штаммов мнкобактерий двух видов bovis и avium. В качестве реперов были выбраоы интенсивные и хорошо разрешенные лияни. В спектрах УФ РКР мнкобактерий (1 =230нм) интенсивиая линия. 1660 см-1 (валентные, колебания С=С) отражает' значительное ..содержание липидов в мнкобактерижс, линии -1609 и 1550см-1 . отражают относительное содержание .Туг п Тгр соответственно. Вычислив отношение пвтенсианостей линий 1660. см-1 липидов к лийии 1609 см-1 Тут и сравнив эти. значения, культуры мнкобактерий разделили на две группы: I.- М.avium 9,12,14, П.- M.bovis 8, К-36,0-14, П-62 и BCG. . .

При сравшшнении отношения иитенсиввостей липшг 1550 Тгр к интенсивности линии 1600 Тут, эта культуры могут быть разделены на три группы: I - M.ayium 9. 12, 14; И - M.bovis 8, BCG и К-36; III -M.bovia 0-14, П-62. -

Таким образом; очевидна корреляция - между относительный интенсивностью линий ароматических аминокислот а липидов в . снзктре УФ* РКР клетки и видом микобактерий. Во втором случае M.bovis разделились на две группы, что является отражением внутривидовых отличий исследованных штаммов.

Селективное : возбуждение нукдеотидного компонента микобактерий (длина волны 252 ни) позволяет по спектрам УФ РКР измерить относительные- интенсивности отдельных 'линий нуклеотидаых оснований. Полученные данные сравнивали для разных штаммов мнкобактерий. •

Выл использован критерий специфичности в виде отношения G/T t ,как . линии, соответствующие колебаниям этих . оснований, пр^еяы в спектре УФ РКР. Данные проведенных измерений

^-чны в таблице 1. M.smegnv.4IJbI следует, что для атипичных мнкобактерий . соотношение pthlei характерно , более высокое значение

OTHOnB'^1660).. . T^rtVTtnV культур» .

^ 6okw (1238) отчетливо' выделило в отдельную

несколько ajrreBuiosis. Для : M.bovis это отношение

относительная ддя M.ävium. '. Значит,

•чий G(1610) и Т(1238) может

илулшть дополнительным ' . : критерием при идентификации микобактерий.,,

' ■ Таблица 1.

Относительная интенсивность ляний гуанидина (1603 см-1) и тимипа (1670 и 1233 см-1; в спектрах УФ РКР микобактерий разных видов при

NN пп

2

- 3

-JL.

о

: 8 Га

i ю

| 13

Основываясь на полученных данных можно утверждать, что измерение реперных линий в спектре УФ РКР может быть использовано-яля'биояетеюши и идентфикации микобактерий разных видов. ' .;. • ■

Спектры УФ РКР микобактерий разных; видов отличаются по положению 'и . интенсивности основных лилий. Особый интерес представ^ет область спектра- с , цетп-ром -1340 см-1, в которую вносят, -оклад колебания нескольких-1 мод— разных компонентов клеток. Любое изменение в интенсивности илЬ частоте какой-либо составляющей моды значительно меняет общую ' форму и тонкую структуру этой группы линий (Dalterio. RA, Spiro T.G., 1987), которые пыеокоспецифнчны для каждого вида микроорганизма.

Для микроорганизмов относящихся к одному роду или даже одному виду, детальный: анализ фбрмы и тонкой структуры группы линий с центром 1340 см-1 до выполнения настоящего исследования яе проводился. • .

Для выявления возможности использования этого феномена при идентификации микобактерий- были изучены спектральные

возбуждеаии излучением с длиной волны 252 нм.

Наимеяоваял?• культуры

Отношение интотсавнрети линий

0(1603)/Тав70) G( 1603УШ23в

M.tuberculosis, dt/st

1.04

3.18

ÜLtiibercuIosis, 192

1.12

3.25

M.boviSjS

1.06

3.00

M.bpvis,Vallee

1.21

2.71

M.bovis,ri-62

1.28

2.36

iM.bovis.BCG'

1.01

3.08

IM.avium,61

1:14

2.86

M.avium;2282

0.98 .

2.38

M.avium,9

1.13

2.40

M.avium.12

1.11

3.03

M.avium.l4

0.90

2.70

M.smegmatis M.phlsi_

1.32 1.50

2.20 3.51

характеристики двух видов микобзктернй М.атоип (штаммы 9, 12, 14) и М.Ьои8. (пгг 8, 0-14, П-36 к ВСО, проанализированы пзкевения группы линий с центром- 1340 см-1, экспериментальные результаты представлены ей рисунке 3, где продемонстрированы участки, спектров в области 1400-1300 см-1 для разных штаммов ыикобактеряй двух видов: М.Ьо-га и M.avi иш. Показано, что профиль группы лееей имеет специфические очертания дня каждого вида мико&сктерий. ; Для М.а-ишп (рис.З.а) это интенсивная . ляивя в центре, ' резко поднимающееся коротховолковое плечо и более пологое плечо с дпиЕоволяовон стероБЫ. Ддя М.Ьоу1& (рис,3.6) характерно наличие четырех шжов прааерно равной интеясавпоии с преобладанием кектрвльвого пюса (1340 см-1).

■' _ а - б

*Л

Рис.3 УФ РКР А: Млтша Б: М.Ьоти; в области 1300 -1400 см-1 при г-оаоуждоняи 230 и* . А1, шт.9, А2 - шт.12, АЗ - шт.14, В1 - пгг.8, Б2 - игг.0-14, ЕЗ - штЛ-82, В4 - игг-ВСС.

Если асе равжшпршига^-эааргай и 1шгевсжввое^ линий в спектрах кеждо2 .от^даа1ь.5К1й куяьтуры, то, видны отанчия между опдальЕымя шздшшя впугрн дадев.

Одной вз^дашйда иреткн специфики «изжой структуры этой группы линий . является ивпаитррвиость хонформациовиого построения баомодекул клетки.

Таким образом, исследование профиля этой грутагы л пап Г;

определяет ~ спепифпческую принадлежиость_______исследуемых

объектов и представляется перспективным направдемкек использования . спектроскопии УФ Р1<Р доя бнокетакдка и идентификации мнкобактернй. '

Спектры УФ Р]№_микобает?^ стадиях. роста ^ С

целью выяснения вяляная возраста зсультури на спектры УФ РКР исследовали культуры МTuberculosis (nrr. Dt/St, 192), M.bovi? шт. - BCG ■ и М.аишв шт.61 _ на _ рзаньиг стаднях рдаггя: логарифмической (I), стационарной (II) и стадия отмяриияя (Щ) 'цр2 Д'ОЗбУЖДёЦЦИ fcU'gfpOB.T«>-irHHg-lH»W4 2&Л «Л». ■ ■■

Результаты исследований представлены на рясуяке 4, где также от>,кчеиы масштабные единицы, которые позволяют оценить изменения интенснвностей I (п) колебательных мод в расчете на единицу клеточной массы в зависимости от возраста колоний. .

ДШ- Щ г М'А ч- AAÄr

I /{

А 1 у/1$ дT« д v ^ а

/ш JM ^ .ш

М№ МП'

J J "VVr

Рис,4.Спектры УФ РКР M.tubarcuJasis шт. 192 л Dt/St, H.bovis iht.BCG и М.avium mi.Gl на " трех стадиях роста 1-логарифмпческон, 2 - стационарной, 3 - отмкрапиа, прм возбуждении на длйнс волны 252 ям.

Из сравнения отгггро» и анализа гистограш* кзмекеяий отдельных колебательных мод отчетливо кросле^стаетс^ изменение лшша как ¡те относительным, так и по абсолкгтык иятенсивностям; Так 71ЛЯ :М.ЯУ1ит , МЛиЬатах^З пгг 192 и В^Зг сигнал нуклеотидпогг, компопата возрастает со а для

ВС& незначительно бывает,........

Б спектрЛх М.а\аит л ВСС на стадиях роста I я II пшш РКР в области 1550-1700 см-1 практически полностью перекрываются,

причем, число пиков значительйо больше, чем ' для пятинедельных культур. '.

В процессе роста клеток культур в . спектрах РКР значительно изменяются частотные характеристики и интенсивность линий в области. 1300-1390 см-1. Одной из причин, вызывающих многие из этих отличий, является изменение с возрастом соотношения массы между нуклеотняным компонентом й всеми другими компонентамиклеток.

Кроме того, спектральные возрастные отличия могут быть связаны с более широким набором состояний клеток в процессе активного роста колоний по: сравнению со стадией отмирания с преобладанием старых неделящихся клеток.

Анализ изменения частот линий гуанина ьи питозина показал, что значений частоты коррелирует с . уровнем активности клеточного метаболизма. Так, . при переходе клеток из состояния замедленного роста (стадия HI) в - состояние пролиферации (стадии I и II). .наблюдается увеличение количества . спектральных лнкий с отличающимися частотой я интенсивностью. Для спектров всех культур... характерно на стадии роста Щ,- узкие три- четыре, спектральные линии. Это свидетельствует о том, что силы водородных, связей между . основаниями нуклеиновых кислот клетки примерно одинаковы для всех молекул. На стадии же I и II в спектрах присутствует бальшее количесгво линий, что говорит либо . об образовании . новых нуклеоткдных молекул с меньшим стэкингом, либо структурном переходе существующих молекул с уменьшением стэкинга.

Динамика перехода, молекул ДНК и РНК в структуру . с меньшим стэкингом имеет специфический характер для каждого отдельного вида мшсобактернй.Этот результат, установленный по спектрам УФ РКР согласуется с представлением о генетической детерминированности возрастных-изменений в клетке.

Анализ спектров УФ РКР показал также, что при изменения состояния клепки происходит изменение свойств внутриклеточной среды (ионной силы, рН и тл.), причем более резкие изменения наблюдается прн переходе между стадиями II u III.

Обнаруженная зависимость между -во&растой культур клеток и интенсивностью? сигнала: УФ РКР нуклеотидиого компонента требует стандартизации . приготовления : : образцов . для

идентификации и свлцетельствует о необходимости полного учета различных факторся; способных вызвать спектральные иаышмшг.'!.

Кроме того, проведенные исследования структурных изкепркаи макромолекул в составе целых клеток методом _ спектроскопии УФ РКР продемонстрировали уникальные козмохггастл метода для анализ.", натнвных структур микроорганизмов ч различных фуыихионалкшя соегтетаяях. • -

Зависимость спектров от возраста микооактерай может служить ' дополнительной информацией для идентификации «теток:.

Культурально-морфрлогическнб; биохимические и биологические свойства изучаемых &.уяы}]> цйз65йгглрйЧ: • •*

Для сравнения эффективности применений оошепр»шлты5: методов идентификации микобактериальных культур были проведены исследования по комплексу прязгаков, который включал изучение^ ткнкториальных, культур алыш-морфо-логических, биохимических и патогенных свойств.

Общие результаты изучения культурально-морфологических свойств, тинкториальпых и биохимических свойств представлены в таблицах 2,3." " • •

Таблица 2.

Нанмвнозание

\t.bov. МЛиЬег. .ая'гдт М т'.га. 1 К...... о

! штанмоы 6 '2 Ч 1 1

1 С:.оро(.гь роста УИ 1 М "Л М •7

; ¡'ост па среде под Т _ .„ л 5

¡22 +

57 +

143 Г + + т

»52 ■. - ■

Рост на с * |

I добавлением:'

1 салитгтптата N.4

! 0,05-0, КЬ 5-/1+ 1-/1 + + + +

0,2% ПЛСК 5-/1+ 1-/1+ + + + :

5«лКпС1 ■ . - - - + +

Окраска колодаи Н* н н н н С

'.Окраска яо Цилю-11 lK.ii.ceHv + + + ' 1-

Н - неокрашенные мшеобактерин С - скотохромогеипые микобактерии М - иеддеапорастущпе (от.10 до 18 дяей) .чикобагггерии В - быстрорастущие (от 3 до 5 дней) микобактеран

При изучении скорости роста отмечали более быстрое появление видимого роста в музейных штаммах М.Ьств по сравнению с. полевыми изолятами.

Просмотр мазков, окрашенных по Цшш-Нильсену показал, что все изучаемые культуры однородны, представлены кислотоустойчивыми палочками, отличающимися по размерам и форме в зависимости от видовой '. принадлежности. В мазках из М.8тае£р&а<28 и М.рЫе» отмечали наличие некислотоустойчивых палочек.

Таблица 3.

. Биохимические свойства микобактерий

I . ВЕД . Яжспо Ниацвноиая Гидролиз Тераостай. Разрушение

| мпкобакгэрнй штаммов проба Твин-80 катвлазы ПАСК до

I катехола

АМ.Ьсгпь 6 - - - -

| М.ШЬегсЫоз. 2 + - ■ 1

1М.атяшп 6 - + . ,. - !

|Мля«гасе1. 2 - - + 1

1 - + I

1ЫрЫе1 1 - + . 1 _________«." ____л

Все музейные* штаммы по морфологическим, тинкториальным. и бнозэшвчесЕам свойствам вписывались в параметры описанные для даиных видов.

При - подкоакпом заражении ев и по к микобаетериями туберкулеза бычьего веща (за исключением М.Ьоуш шт. ВСв ) и М.ШЬегси1окз у всех животных продолжительность жпзпи после заражения М.Ьота составляла 28-37 дней.

Вяутрнвеияоё заражение кроликов как музейными, так и палевыкн штаммами М.Ъгтая вызывало развитие генерализованной инфекции с обширными поражезиями легких, с поледукпцей гибелью животных в течение 25-35 дней.

Внутривенное введение МЛиЬегси1ов18 кроликам не вызывало гибели гшвотвых. После убоя, произведенного через три месяца после заражения отмечали отдельные туберкулезные очажки в легких.

Подкожное введение морским свивкам кикобактернй птичьего вида вызывало у скх местную -воспалительную реакцию в виде абсцессов, которые со временем подвергались рубцеванию, и увеличения региональных лимфоузлов. Гибели животных не происходило.

Все исследуемые штаммы М.аушт были патогенны для кур при введении бактериальной суспензии в подкрыльцовую вену, а также для кроликов при внутривенном заражении.

Введение морским свинкам, кроликам и курам культур М.т1гасеПи1агае, М.вп^таНз и М.рЬЫ не вызывало у животных развития патологического процесса.

В результате проведенных исследований становится очевидным, что для идентфикации микобактериатыгой культуры необходимо проводить комплекс исследований, . включающий изучение морфологических, тинкториальных, культуральных, биохимических и биологических свойств. При этом минимальным сроком идентификации можно считать 3 месяца. Ни один из проведенных тестов не может быть использован исключительно для определения вида микобактерий.

Субмикроскопическая организация микобактерий. Современные литературные данные отечественных и зарубежных авторов о строении микобактерий указывает на общность и различия патогенных и атипичных микобактерий.

Электронно-микроскопическое изучение интактных клеток микобактерий разных видов показало, что все они обладают четко выраженной трехслойной клеточной стенкой, трехслойной цитоплазматической мембраной, цитоплазмой с наличием в ней мембранных структур, рибосом, полирибосом и различных включений.

Нуклеоид микобактерии располагается как правило в центральной части клетки и представлен зоной, содержащей фибриллы

днк.

Микобактерии разных видов отличаются между собой по размерам, форме, строении нуклеоида, цитоплазмы, толщине клеточных стенок и отдельных ее слоев, однако эти отличия не являются регулярным признаком и во многом зависят от физиологического состояния культуры в момент фиксации и других факторов в связи с чем сведения о субмикроскопической организации микобактерий могут служить лишь вспомогательной информацией при их идентификации и изучении.

ВЫВОДЫ

1. Установлена возможность и разработана методика получения спектров ультрафиолетового резонансного комбинационного

рассеяния (УФ РКР) живых культур микобактерий. Получены спектры 18 культур патогенных и атипичных микобактерий.

2. Доказана возможность изучения белкового и нуклеотидного компонентов микобактериальных клеток при смене длины волны возбуждения, определены оптимальные длины волн возбуждения для получения информации * о белковой и нуклеотидной составляющих микобактерий 230 и 252 нм соответственно.

3. Выявлена корреляция между относительной интенсивностью отдельных линий в спектрах УФ РКР и концентрацией бактериальных компонентов (ароматических аминокислот, нуклеотидных оснований, липидов) и возможность использования этой зависимости для идентификации микобактерий.

4. Установлено, что тонкая структура профиля группы линий в области спектра 1300-1400 см-1 высокоспецифична для микобактерий разных видов.

5. Показана возможность лазерной спектроскопии УФ РКР выявлять внутривидовые отличия различных штаммов микобактерий.

6. При изучении спектров микобактерий на разных стадиях роста установлена корреляция между фазой роста культуры и изменением силы водородных связей нуклеотидных молекул, что необходимо учитывать при интерпретации результатов спектроскопии.

7. Сравнительное проведение идентификации микобактериальных культур морфологическими, субмикроскопическими культу-рально-биохимическими и биологическими методами с лазерной спектроскопией показало преимущество последней за счет сокращения времени исследований (до 10 минут на 1 культуру) и повышения достоверности благодаря высокой чувствительности, перехода к компьютерной технологии идентификации и созданию банка данных полученных спектров микобактерий.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Методические рекомендации получения УФ РКР спектров микобактерий разных видов. Рассмотрены и одобрены на заседании Ученого совета ВНИНБТЖ от 20 ноября 1992 г., протокол N 14.

2. Биофизическая методика получения УФ РКР спектров микобактерий разных видов. Рассмотрена и одобрена на заседании Ученого совета ВНИИБТЖ 5 ноября 1989 г, протокол N11 и

утверждена экспертной комиссией ОНКвет ВАСХНИЛ 15 декабря 1989 г.7 протокол N5. - ----------------- --------

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мартынова Е.С., Татаринов А.П., ОколеловВ.И. и др. Ультрафиолетовые резонансные спектры комбинационного рассеяния микобактерий туберкулеза //Сибирский вестник сельхоз.- науки, 1990, N 4 -С. 61-66.

2. .Мартынова Е.С. и др. Применение спектроскопии комбинационного рассеяния для идентификации микобактерий // Разработка средств и методов борьбы с туберкулезом ж-х:Сб.научн.тр./ ВАСХНИЛ, ВНИИБТЖ. -Новосибирск, 1990. С. 33-44.

3. Мартынова Е.С. и др. Оптимальные дозы гамма-инактивации микобактерий// Система мер борьбы с туберкулезом животных: Сб.научн.тр,- Новосибирск, 1991. -С. 128-143.

4. Martynova E.S. et al. UV-resonance raman spectroscopy of mycobacteria// The 1-th Int. biophisics congress and biotechnology at GAP, Turkiye. -1991, -Abstracts. -P. 109.

5. Околалов В.И., Татаринов А.П., Мартынова Е.С. и др. Идентификация микобактерий лазерной спектроскопией // Ветеринария, -1991.-N2. -С. 28.

6. Мартынова Е.С. и др. Селективный анализ нуклеиновых кислот в составе микобактерий по данным спектроскопии резонансного КР// Ж-л прикладной спектроскопии. -1991, т.55, N3,- С. 410-417

7. Мартынова Е.С., Околелов В.И. Изучение белковой компоненты микобактерий //"Современные методы борьбы с бруцеллезом и туберкулезом ж-х : Сб.научн.тр./ СО РАСХН. Новосибирск, -1992, -СГ77-82.

С

№