Автореферат и диссертация по ветеринарии (16.00.03) на тему:ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ГИДРОПЕРИКАРДИТА ПТИЦ

4-ЗШз

На правах рукописи

■

КРОН НАТАЛЬЯ ВЛАДИМИРОВНА

ИММУНОБИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОГО ГИДРОПЕРИКАРДИТА ПТИЦ

16.00.03, - ветеринарная микробиология, вирусологи», эпизост&яюгй», микология с мшатжсшсологаей и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации васопскшше ученой сггаеви кандидата ветеринарных наук

Санкт-Петербург 2003

Работа выполнена а» Всероссийском научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства.

Научный руководитель - доктор эетернаарных наук, профессор Алиев Алаугдив Серажугдннович

Официальные оппоненты: доктор ветеряиарных кяук, профессор Калипша Михаил Ншолаевнч; доктор ветеринарных иаук, главный научный ссярудних Бакулнн ВалерийАяександрович

Ведущее учреждение - Казанская государственна* академия ветеринарной медицины им. Н.Э.Еаумапа

часов ва заседании диссертационного совета д ¿¿и.иэ^д». при л_.анхт-Петербургекой государственной академии ветеринарной медицины по адресу; 196084, Саякт-Детербург, уд, Черлиговская, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины.

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат ветеринарных наук Черкай З.Н.

Защита диссертации

I. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Аетуальвость темы. Иифекшюгаый гидроаерикардит птиц (ИГП) - высококонтшиозное вирусное заболевание цыплят, основными признаками которого яаляются накопление транссудата в пернкардкалыюй полости, геиаткт и нефрозо-нефрнты. В настоящее время инфекционный гщцюперияврдит (ИГП) регистрируется в Пакистане (Anjum М.А. et aL, 1989), Индии (Kumar R- eí aLf 1997), Ирехе (Abdul-Aziz T.A., AJ-Attar МЛ., 1991), Кувейте, Японии (Abe Т. et al., 1998), Мексике (Borrego JJu, Soto E., 1995), Перу (Fernandez D.M., 1989), Эквадоре {Mazahen A. et a!., 1988), Чили (Toro H. et aL, 1999) и Египте (Azab A. et al., 1992).

С момента установления болезни в до настоящего времени ведутся широкие исследования по изучению морфологии и вымунобнологвческнх свойств возбудителя (Afea! M.R. et aL,1991; Cowan RÜ.,1992), которые ныектг большое научное н практическое значение, так как на основе всестороннего изучения свойств возбудителя разрабатываются эффективные метода диагностики и средства специфической профилактики болезни.

Специфическая профилактика ИГП занимает ведущее место в борьбе с этой болезнью. За рубежом создана н успешно применяется ин активированная вакцина (Chishtí М.А. et а!„J989; Ап]шп A.D.,1990; Alznad M.I. et al.,1990). В 90-е годы прошлого столетня кяышкн инфекционного гндроперикардига с высоким уровнем смертности регистрировались на территории России (Алиев А.С. с соавт., 1996; ВогНюу V.V. et al., 1997; Бакулнн В А. с соавт., 1998; Виноходов В.О., 1998).

Цель н задачи работы. Целью настоящих исследований явилось изучение иммунобиологических свойств вируса и конструирование инактнвироваиной вакцины против инфекционного гидроаерикардита птиц,

В соответствии с поставленной целью было необходимо решить следующие задачи:

•провести элшоотологнческое обследование ряда птицехозяйств с цепью выделения н иденэдфикацни вируса ИГП;

- изучить иммунобиологические свойства вируса ИГП;

- испытать реакцию диффузионной прециштщни для диагностики ЙГП;

• изучить антигенные свойства вируса ИГП;

- изучить физи го-химические и морфологические свойства вируса ИГП;

-разработать технологию изготовления и контроля мн активированной вакцины против ИГП; -разработать схему иммунизации;

-провести испытания вакцины в лабораторных и производственных условиях.

Научней новклш. Впервые в нашей стране тфоведено изучение морфологии, физико-химических н иммунобиологических свойств возбудителя ИГП; доказан» инфекционная природа болезни, выделен в охарактеризован инфекционный агент.

Установлена патогенность вируса ИГЛ для эмбрионов кур, - а также цыплят и перевелят.

Изучены эпизоотодогические особенности болезни (возрастная восприимчивость цышцгт и некоторые пути передачи возбудителя), клинические признаки и штологоав атомические изменения у больных цыплят в экспериментальных ж производственных условиях.

Определена диагностическая ценность реакции диффузионной преципитации (РДП) при ИГТГ.

Разработана тшегивированная вакцина для специфической профилактики ИГП.

Практический ценность. Разработана технологи* изготовления и контроля имактивированной вакцины и предложена эффективная схема профилактики болезни.

Вопросы, выносимые на дацнту. 1.Инфекционная щэарода болезни птиц с признаками гидроперикардита.

2 .Характеристика инмунобиологичесик свойств штамма "АДВ": -чувстмгтельность культуры клеток к заражению вирусом;

- наггогеяностъ для эмбрионов кур я цыплят

- распределение вируса я органах и тканях экспериментально зараженных эмбрионов кур и цыплят.

З.Обоснование выбора чувствительной системы для титрации штамма "АДВ".

4.Эффективность реакции диффузионной преципитации для диагностики ИГП.

5.Характеристика аятнгенных свойств штамма "АДВ'\ ¿.Характеристика физико-химических свойств штамма "АДВ": -устойчивость к воздействию различных температур;

- устойчивость к эфиру, хлороформу, формалину и изменению рН среды.

7.Характерис1Ика морфологических свойств вируса ИГП.

8.Технологические параметры изготовлен»«, усложм, схема применена! и контроль инактивироааняой вакцины против ИГП из штамма "ЛДВ".

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены на Методических я Ученых советах Всероссийского ветеринарного НИИ птицеводства (1996-2003); на научно-производственной конференции, посвященной 190-летию высшего ветеринарного образования в России и 100-летию ветеринарной науки (г.Санкт-Петербург, 1998), н на научной конференции профессорско-преподавательского состава, научных сотрудников к аспирантов Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины (г.Санкт-Петербург, 2003).

Публикация неслеюжяммй. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ.

Структуре к объем работы. Диссертация изложена на. 130 страницах машинописного текста ж состоят из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результате«, выводов, практических предложений, списка нсполъзованной литературы и приложения. Работа иллюстрирована 7 фотографиями, 24 таблицами и 3 рисунками. Список литературы включает 151 источник, -а том числе 121 зарубежный.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1 .Материалы н мсгош

Вирусный наггеряял. Патологический материал получали из птицефабрик, в которых наблкщался повышенный отход птцц с признаками гидропернкардита: "Буранная** и "Сосиовская" Челябинской области, "Красноярская" Красноярского края, Тайская" Оренбургской области, "Владимирская" Владимирской" области, "Петрозаводская" республики Карелия, "Фаггежская" Курской области, "Чебоксарская" республики Чувашия, "Светлый путь" Липецкой области, "Роскар" Ленинградской области и "Лебедеоская" Новосибирской области.

Изолят выделяли путем заражения бройлеров в возрасте 15 суток гомогеяатом печей, полученным от павших дышит, я дополнительно исследовали при помощи электронной мюсроскепни.

Дм проведения опытов н нзготовлени* инактивиро венной вакцины использовали штамм "АДВ" вируса ИГП, выделенный из печени цыплят, павших с явлениями гидропершеардита во время вспышки заболевания на птицефабрике "Сошовсжа*" Челябинской области. Штамм был получен путем проведения дяти последовательных пассажей на 15-суточных цыплятах.

Подопытные животные. В лабораторных исследованиях было использовано 100 цыплят, выведенных из эмбрионов СПФ-кур (фирма "Ломанн" Германия), 1600 цыплят-бройлеров кроссов "Бройлер "Смена-2", "Арбор", "Барос-123", 50 цыплят породы белый леггорн и 50 перепелят.

Культуры клеток и куриные эмбрионы. В опытах использовали: первичную культуру фибробласгов эмбриональных кур (ФЭК), а также 300 развивающихся эмбрионов СПФ-кур 5-П-суточной инкубации (фирма "Ломайн" Германия).

Постановка решешш даффужшиой преояшпяцяк при инфекционном гидроперккаранте птиц. Реакцию даойной иммунодиффузяи (РДП) в агаровом геле ставили по методу, предложенному Оухтерлоаи (1948).

В качестве положительного антигена использовали 10%-ныЙ гомогензт печени павших с признаками ИГП дьшлят.

Гипериымуииую сыворотку получали путем введения цыплятам вначале ннахтивнровашюго формалином, а зятем патогенного вируса в нарастающих объемах (0,3мл, 0,5мл и 1мл), Биологическая активность вируса составляла 4,2tgHZWW.

Изучение устойчивости вируса ИГП к воздействию физико-хнмнчвеннх факторов. Устойчивость к фиэиимшмнческнм факторам исследовали по следующим критериям: -к действию различных температур (-18°С,+40С+37°С, +56°С); -к действию эфира (метод Andrewes С.Н., Horstmann D.M., 1949); -к действию хлороформа (методFeldman H.A., Wang S.S.,1961); -к действию 10%-ного раствора формалина (по общепринятой методике);

-к действию pH среды в диапазоне- от 3 до 10. Нужную концентрацию водородных ионов устанавливала с помощью 0,IN HCL и OJNNaiOH.

О влиянии физико-химических факторов яа вирус судшш по результатам титрации на 6-сутсгашх эмбрионах СПФ-кур до н после воздействия указагаых веществ.

Морфологические свойства возбудителя ИГЛ изучали во Всероссийском I [ИИ особо чистых препаратов. Материалом для электронно-микроскопического исследования служили нэоляты, выделенные из патматернала птнаефабрюс "Красноярская", "Сосновская", "Буранная", "Петрозаводски" н "Фагежская". Дня этого гомогензты печени обрабатывали методом нашивного контрастирования поКегтй (1975).

Изгот овление н контроль опытных образцов кнактнвнроеамной

вакцины.

В качестве антигена для изготовлена* низктивиранаыной вакцины использовали 10%-шйЙ гоиогенег печени цнолят, экспериментально зараженных ИГЛ. Дяя наиболее полного выхода вируса из клеток гомогеиат печени дошмшвтеньно обрабатывает ультразвуком. Инактивацию вируссодержащего материала проводили 10%-вьш водным раствором формалина. Прн изучении условий шшггиаащш вируса ИГЛ исподьэоваян различные концентрации формалина (0,05%-0,5%), разный температурный режим и различную экспозицию с инактнвагором. Полученную суспензию терыостатировали при +37® С к при +4°С в течение 48 часов при равномерном перемешивании, В процессе инактивации, через определенные промежутки времени (12, 24, 36 н 48 часов) отбяралн пробы обработанного инакти автором материала н прностаи заливали процесс инактивации 20%-ным раствором тиосульфата натрия. Для изготовления сорбированной формы вакцины использовали стерильный коллоидный 2%-ный тель гидроокиси алюминия (ГОЛ), который смешивали с ннактнвированвьш вирусом ИГП до конечной концентрации от 0,5 до 1,5%.

Контроль качества вакцшы лротав ИГП включает определение стерильности, полноты инактивации вируса, безвредности, антигенной и нммуногенной активности.

2Л, РЕЗУЛЬТАТЫ 2.2.13« ижишмкничеосое обследование птице 1го*Аств.

Впервые инфекционный гидроперикардвт (ИГП) в нашей стране был зарегистрирован в 1992г. да птицефабрике "С основс кая" Челябинской области (Алиев A.C. с совет, 19%).

В 1998г. камк было проведено эпязоотологическое обследование п/ф "Петрозаводская" республики Карелия. В данном хозяйстве резко увеличился падеж цыпл»т~бройлеров в возрасте 30-40 суток от болезни невыясненной этнологии. Заболевание проявлялось отказом от корма, сонливостью, вялостью, юъерошенностыо оперения н быстрой потерей массы тела. Некоторые цыплята погибали внезапно без проявления клинических признаков. Продолжительность болезни составляла 7-10 суток. Заболеваемость к смертность нарастали быстро, достегал максимума яа 3-4 день, в течевие последующи* 6-7 суток отмечали снижение заболеваемости и гибель птнд прекращалась. Отход птицы от болезни в разных партиях составлял от 12,5 до 19,2%. Прв вскрытая павших цыплят обнаруживали нктсрнчьостк подкожной клетчатки и внутреннего жира, скопление в перикарднашлой шшосгв прозрачного соломенно-желтого транссудата водянистой нон желеподобвой хонсисгеацин, .гепатиты различие* степени тяжести, отечность легочной пешв, увекнчешше почки с хотурврованными мочеточниками, увеличение селезенки, бледное окрашивание костного мозга.

В период с 1996 по 2000гг. мы наблюдали заболевай не со сходной патодогоанаггомической картиной на бройлерных птицефабриках "ВурашшГ Челябинской облает«, "Красноярская" Красноярского края, "Чебоксарская" Чувашии, "Светлый путь" Липецкой области, "Фатежская" Курской области и ял птицефабрике "Лебедевская" Новосибирской области, а также на яичных птицефабриках "Гайская** Оренбургской области, "Владимирская" Владимирской области и тттицефабрнке Тоскар" Ленинградской облает. Во всех выше перечисленных пгнцехоэяйствях от трупов цыплят были отобраны пробы печева, из которых аэготавлнвали гомогенат. После ороверкя на стерильность юмогенат подкожно вводили цыцлятам-бройлерам 15чугочного возраста в объеме 0,3мл. В ходе проведения экспериментов мы установили, что клиническое проявление заболевания и гибель цыплят с шгтологоанвтомнческнмн

изменениями, аналогичными выявленным, в хозяйствах» имели место при заражении гомогенатами печени от павших цыплят из птицефабрик "Красноярская", "Сосновская", "Буранная", "Петрозаводская" и "Фатежская".

Инкубационный период при экспериментальном заражении составлял 2-3 суток. Заболевание характеризовалось расстройством рефлекторной возбудимости, общей депрессией птицц (вялость, скученность, сонливость, угнетение, отказ от корма, группирование цыплят и адинамия). Гибель птицы иногда происходила до проявления клинических признаков. Отход в условиях эксперимента отмечался в течение короткого периода времени - с третьего по шестой день после заражения. Уровень смертности составлял от 55 до 70%.

Результаты биопробы при исследовании патматериала из остальных тпищехозяйств были отрицательными, что указывает на необходимость лабораторного подтверждения диагноза ввиду полнэтиологнчности синдрома "гидропернкардит".

Результаты исследований по установлению инфекционного гидроперикардита птиц в России вскоре были подтверждены другими исследователям и (Бакулин Б.А. с соавт., 1998; Виноходов В.О. с соавт., 1998; Сурне» Д.С. с соавт., 2000; Вопяо* У.У. е1 а!,, 1997).

Изучение клинических признаков, течения болезни, а также паталогоанатомнческих изменений у дьшдят после экспериментального заражения вирусом инфекционного гндроперикарднта птиц дает ответ на вопрос о возможности применения биологической пробы для диагностики заболевания.

Данные по заражению цыплят материалом различного происхождения показали, что наиболее высокий уровень смертности (70%) вызывал и золят "Сосновская", шитому для дальнейших исследований использовали штамм "АДВ", полученный из этого изолята путем и яги кратного пассажирования на 15-е уточных цыплятах. Для заражения цыплят использовали разведение вируса 1:10 в объеме 0,3мл. Цыплят-бройлеров в возрасте 15 суток заражали штаммом "АДВ" виутривешю, подкожно, внутримышечно, перорально, а также контактно. Контактное заражение осуществлялось путем совместного содержания интактной и зараженное птицы.

Инкубационный период был минимальным при парентеращ,ном введении вируса (2-3 суток), а ври аероральном и коншктном заражении более продолжительным и составил - 5-6 суток. Отход

среди больных цыпдгг колебался к широких пределах, огг 20% дог 90%, и зависел от метода введения вируса. Так, наиболее низкие показатели отхода птиц выявлены при контактном и пероральном заражении цыплят - 20% и 30% соответственно. Парентеральное введение вируса всегда приводило к массовой гибели зараженной тицы. Отход при этом был равен 70-90%. Продолжительность заболевания обычно составляла 5-7 суток, после чего общее состояние _цшт*т начинало постепенно улучшаться и клинические признаки угасали, однако переболевшая птица значительно отставала в росте и развитии.

На основании результатов проведенных опытов при постановке биолробы рекомендуем парентеральный метод »ведения вируса.

При изучении чувствительности цыплят разного возраста и пород установили, что наиболее восприимчивыми к экспериментальному заражению являются цыплята 1-10-суточного возраста. С увеличением возраста тггиц происходило снижение чувствительности к вирусу.

Цыплята яичных пород были менее восприимчивы к заражению, чем цыплята мясных кроссов. В производственных условиях вспышек этого заболевания среди цыплят яичных пород или несушек мы не наблюдали, хотя в литературе имеются отделите сообщения (АШаг 8.<йа1., 1992).

Инкубационный период у перепелят составил 48 часов. Заболевшие перепелята переставали потреблять корм, становились вялыми, оперение было взъерошено. Падеж наблюдался на протяжении 3-5 суток и составил 40%. У павших птиц, наблюдались очаги некроза в печени. Признаков гадроперккарднта при заражении перепелят нами зарегистрировано не было.

Дня определения локализации вируса в органах павших птиц использовали гомогсиаты печени, почек, бурсы Фабрициуса и перикарднальную жидкость, которые вводили цыплятам-бройлерам 15-суточного возраста.

В ходе выполнения эксперимента было установлено, что заболеваемость и гибель цыплят происходили при введения им гомогеиата печени. Это послужило основанием рекомендовать отбор печени от больной и павшей птицы для проведения лабораторной диагностики на инфекционный гидрояерикарднт птиц.

2.2^.Культивнровамвв пгттммя "АДВ" вирус» ИГЛ.

Штамм "АДВ" вируса инфекционного гидроперикарднта птиц оказался патогенным для 6-суточных эмбрионов СПФ-кур, зараженных в желточный мешок. При этом наблюдали их гибель, отставание в росте и развалин, а также разлитые геморрагия на коже головы, теза и конечностей, отеки головы, подчелюстного пространства и брюшной полосги.

Специфическая гибель эмбрионов при заражении к желточный мешок в первом пассаже напивалась на 5 сутки после заражения и составляла 43%. С увеличением количества проведенных пассажей вируса инкубационный период сокращался и увеличивался процент павших эмбрионов. Так, в восьмом пассаже инкубационный аермод был равен трем дням 7 огащ составил 97%, Материал третьего пассажа использовали дна определения инфекционной активности вируса. По итогам титрования инфекционная активность штамма "АДВ" вируса И1Т1 в третьем пассаже составнлл 3,9^ЭЛДзд/мл.

При вскрытш зародышей отмечали изменения в печени. Печень у погибших на Э-4 сутки была увеличена, кровенаполаена, темного цвета, а в более поздний срок (5-6 суток) - желто-коричневого цвета со множеством иекротическнх очажков (пятнистая). ХАО а единичных случаях были отечны н непрозрачны.

При введении вируссодержащего материала л шшантшеную полость и на ХАО эмбрионов специфические признаки поражения исчезали во втором или. в третьем пассажах, что свидетельствовало о низкой адаптационной способности -возбудителя при этих методах инокуляции.

Была изучена тропность вируса х тканям печени, хориоаллантоисной оболочки и кожно-мышечной ткани эмбрионов кур. Для этого производили заражение в желточный мешок гомогенатями указанных псаией, полученных от павших эмбрионов.

В ходе проведения эксперимент* было установлено, что характерные паггологоанатомнческне изменения и гибель эмбрионов наблюдались только при заражении их гомогенатом печени.

Для исключения контаминации гемагглютинируюацими вирусами материал на всех этапах культивирован ня на куриных эмбрионах проверяла в реакции гемагглютнкацин.

Исследования показали, что штамм "АДВ" вируса ИГЛ не вызывал агглютинации эритроцитов петуха, барана, кролика, досади н кттгнлга «оттого скота.

Первично-трипсннизиро ванная культура клеток фибробластов эмбриональных кур (ФЭК) оказалась непригодной для культивирования вируса ИГЛ, так как видимое цнтопатическое действие вируса не наблюдали в течение пят последовательных пассажей вируса в ФЭК. Отсутствие вируса в культуре было подтверждено заражением 6-суточных эмбрионов СПФ-кур в желточный мешок.

Результаты опытов по культивированию вируса ИГЛ в развивающихся эмбрионах СПФ-кур дают возможность иснользовать этот метод для титрования вируса. Однако высокая стоимость и трудность доставки не позволяет рекомендовать их для широкой практики, поэтому нами была проведена серия опыте» по определению пригодности цыплят для этих целей.

В предыдущих опытах было установлено, что наиболее восприимчивыми к экспериментальному заражению являются цыплята J -10-суточного возраста, поэтому для титрацин вируса использовали цыплят-бройлеров суточного возраста.

Биологическая активность вируса при титрацин его на цыплятах составила Таким образом установлено, что цыплята-

бройлеры могут быть использованы для титрацин.

2.23.Приме»еине реакции диффузной но# орецнпятапмн (РДП) для лшшюстякн ЩП,

В исследованиях, была изучена возможность применения РДП с целью ретроспективной диагностики инфекциодаого гндрочерикардита птиц.

В предварительных опытах изучат оптимальные условия постановки РДП при инфекционном гидроперикарднте птиц. В качестве антигена использовали гомогенат печени.

Установили, что оптимальными условиями для постановки РДП при инфекционном гидроперикарднте птиц являются: концентрация агарового геля-1,5%, 8% концентрация хлористого натрия, толщина агаровой пластинки - 3-4мм, расстояние между лунками-5-8мм и температура +37°С. Для постановки реакции антиген необходимо использовать в исходной кодаентрации, а иммунную сыворотку в рабочем разведении. Предварительный учет реакции производится через 12 часов, окончательный - через 24 часа. Выполнение перечисленных условий обеспечивает наиболее быстрое и четкое проявление линий преципитации.

С целью изучении» распространения аденовирусов были исследованы в РДП с аишгеиом ИГП сыворотки крови птиц, доставленные из 11 благополучных по ИГП птицефабрик разлитых областей России. Всего было исследовано 623 пробы сывороток. В !05 случаях реакция была положительна», что составляет 16,9% от общего количества.

Перекрестное исследование в РДП аэслкток, шшученньце от павших цыплят птицефабрик "Сосноаская", "Бураниая", "Красноярская", "Петрозаводская" и "Фатежская" показало их антигенную вдентнчиость.

2,2-4. Изучение актмгешшх свойств шлямма "АДВ" мрус» Ш11

Сроки появления и динамика накопления вируспрецшштируюхцих ввгитг у шалят, зараженных вирусом ИГП, имеют важное шагавшее при проведения серологических исследований.

Для изучения этого вопроса был проведен следующий опыт. 70 цшдат-бройлеров «росса "Бройлер-^" 15-суто«шоп> воарясга, серонегативных. к штамму "АДЙ", заразили подкожно вирусам с инфекционной аюявностыо в объеме О^мл. 10 цыллгг

такого же возраста использовали в качестве контрольных, В результате заражения в опытной группе погибло 44 голов. V выживших цыплят опытной группы, а также у контрольных произведши взятие крови вя 6 а 7 сутан после заражения, а затем череч каждые 7 суток в течение 77 дней и исследовали сыворотки в реакции диффузионной преципитации.

8 ходе ироведеаия опыта было установило, что у цыплят, зараженных штаммом "АДВ", ггрецишггирующае антитела появлялись на 7 сутки после заряжения, достигали максимума н» 21 супри и массово выявляли«, до 42ди* после »рвжени*.

2.2.5.Иэучение сгеиеня устойчивости вгтжмма "АДВ* вирус* ИГП к воздействие фшлко жшшчесювк факторов.

Инфекционная активность вируса ИГП не снижалась при хранении в замороженном состоянии (при -18°С) в течение двух лет (срок наблюдения).

Хранение вируса при температуре -+4°С вызывало снижение шфекцнониости в 1,9 раза через 1 месяц, а в конце 4 месяца хранения препарат становился неинфекшкжным,

При температуре +37°С материал утрачивал инфекционные свойства через 7 суток.

Вирус сохранял яяфекынояяую активность при воздействии темиературы +56°С в течение 30 минут. Реакое снижение ннфеяцжонностй происходило через 2 часа, а через 4 часа вирус полностью инактивнровался,

Воздействие эфира, хлороформа и изменения рН среда в диапазоне от 3 до 10 не снижали инфекционную ахтивность вируса.

С целью подборе эффективного инатюатора нами было изучено действие раствора формашша на вирус ИГП. Установлено, что оптимальная коае'яая концентрация формалина для инактнадЦви вируса ИГП - 0,1% и экспозиция 24 часа при темпераауре +37°С. Пра таком режиме ннакшваднн предашггарукяшя активность вируса соответствовала активности нггнююго препарата, в то время как концентрация 0,2% к выше снижала антигенную активность. Формалин в этой концентрации обеспечивал получение стерильной вирусной суспензии при посеве на твердые н жидкие^ питательные среды.

2.2.6.Изу1«нне морфолоенчееккх свойств штамм* *АДВП вируса

ИГП.

При электронно-микроскопическом исследования в исследуемых образцах выявляли отдельные вириоиы (подше и ннтактные) или их скопления, имеющие форму икосаэдра. Вириоиы не имели сулсркадсщшой оболочки, нуюзеотад был покрыт одним слоем капсомеров и каждая грань содержала по 6 кавсомеров.

Анализ данных, полученных в ходе исследований, воказая, что выявляемые в электронном микроскопе вирусные часшш имеют одинаковую морфологическую структуру, характерную да* семейства аденовирусов. Вирусов из Других семейств выявлено не было,

2.2.7.Технология юппшешш, схема применение ы контроль нншширтвной вакцины.

Для производства вакцины использовали гомогевяг печени от павших цыплят с признаками ИГП. Биологическая активность

вируссодержшцего материала составляла не менее 4,2 и

преципитирующая активность от 1:8 и выше.

В качестве инактиватора использовали раствор формалина в конечной концентрации 0,1%.

Образцы вакцин готовили из инакгивироаанной вируссодержагаей суспензии, которую соединяли с гелем гидрата окиси алюминия (ГОЛ) до конечной концентрации от 0,5 до В кнчестве контроля использовали инахтявнрованный препарат без ГОЛ. Антигенную активность 1трепаратш контролировали, на цышшгах 15-суточного возраста через 21 сутки после введения препаратов в РДП с антигеном вируса ИГП.

Установлено, fro антигенная активность муцини повышалась с увеличением содержания ГО А. Наименее выраженный иммунный ответ отмечали у цыплят, привитых антигеном без ддыованта (0,43±0,1 logi в РДП). Наиболее высокие титры антител были установлены при введении препаратов содержащих 1 н 1,5% ГОЛ, причем различия в уровне антител у цыплят, привитых этими препаратами были несущественны.

Таким образом, было установлено, что оптимальным количеством ГОЛ в вакцинном препарате следует считать концентрацию 1%.

Опытные серии вакцины изготавливали по трем прописям. Для этого антиген разводили фосфатным буфером в соотношениях J й, 1:3 и 1:4, а затем добавляли равный объем ГОЛ.

Вакцины вводили подкожно в объеме 0,3мл в область нижней трети шеи.

Йммуногениость вакцин оценивали по результатам контрольного заражения цыплят гарусом ИГП через 21 день после вакцинации.

На основании полученных результатов, при изготовлении инактивироваиной вакцины против ИГП, использовали следующую пропись: антигена - 17%, фосфатного буфера - 33% н гидроокиси алюминия - 50%.

Оптимальную дозу препарата определяли на 15-суточных цыплятах путем подкожного или внутримышечного введения вакцины в разных объемах. Иммуногенную активность оценивали через 21 сутки после вакцинации контрольным заражением патогенным штаммом возбудителя. Проведенные исследования показали, что введение вакцины в объемах 0,3мл и 0,5мл обеспечивало 100%-иую

защиту цыплят от контрольного заражения, независимо от метода введения препарата.

Для изучения продолжительности поствакцннального иммунитета и влияния кратности вакцинации на ее эффективность использовали цыплят-бройлеров 10- и 15-суточного возраста, серонегатотяых к вирусу ИГЛ.

На основании подученных результатов сделали вывод,, что вакцинация цьшлет в 15-сугочном возрасте вызывает более продолжительный к. напряженный иммунитет, чем вакцинация в 10-сугочшж возрасте. При вакцинации щшлхт в 10-суточном возрасте необходимо проводить повторную вакцинацию через 10 суток.

Контроль вакцины осуществляла по следующей схеме:

I .на стерильность - путем высева на питательные среды (МПА, М11Б, МППБ под вазелином я бульон Сабуро) согласно ГОСТу 2808589;

2.ка полноту инактивации вируса - путем подкожного введения по 0,3мл цыплятам 15-суточного возраста;

3.ка безвредности - путем введения 10-крапюй дозы препарата 15-сутотным цыплятам;

4.на антигенную активность - путем определения титра преципитинов через 21 день после вакцинации;

5 .на иммуногенность - по уровню специфической защиты цыплят от действия патогенного вируса при контрольном заражении.

2.2.8Л4саытаоне нняктявяроваыной нищщы в жамриметольиьа и производствен иых условиях.

В экспериментальных условиях комиссионные испытания вакцины проводились на базе ВНИВИП согласно программе утвержденной 28 апреля 2003г. директором института. Для проведения испытаний были изготовлены три опытные серии препарата.

Результаты проверки показали, что все три серии испытуемой вакцины были свободны от посторонней микрофлоры, »вирулентны для цыплят 15-суточного возраста и не вызывали у привитых птиц осложнений местного или общего характера. Вазсшша обладает антигенной и иммуногенной активностью и обеспечивает специфическую защиту привитого поголовья цыплят от заражения вирулентным штаммом вируса ИГЛ.

Производственные испытания опытных, серий вакцины проводили на двух птицефабриках мясного направления, и которых наблюдали острое течение ИПТ, подтвержденное вирусологическими и серологическими исследованиями.

На птицефабрике "Петрозаводская" вакцина была применена на поголовье 350 тысяч цыплят 15-суточного возраста. В качестве контроля служили 30 тысяч иевакцинировашшх птиц из этой же партии. В ходе испытаний вакцины признаков манифестации. ИГЛ у привитой птицы не регистрировалось ни всей протяжении выращивания бройлеров, в то время как в контрольной группе имело место переболевание цыплят с характерной для ИГЛ клиникой и картиной патвекрытня. Общий экономический эффект от применения вакцины составил 235 тысяч рублей.

В "период с 27 февраля по 10 апреля 2000г. вакцину применяли на птицефабрике "Красноярская" Красноярского края на поголовье 200 тысяч цыплят-бройлеров 15-суточного возраста кросса "Сибиряк". Вакцину вводили подкожно в область нижней трети шеи в объеме 0,3мл. В качестве контрольных использовали 20 тысяч голов цыплят такого же воз (»ста, не вакцинированных против данной болезни.

В результате применения вакцины установлено, что вакцина обеспечивает повышение сохранности птиц на 11%, увеличение среднесуточного привеса на 3 грамма и уменьшение затрат корма на 1 центнер привеса на 0,13 ц.кг.ед. Общий экономический эффект от применения вакцины составил 75 тысяч рублей.

Таким образом, применение инактивировашгой вакцины позволило купировать инфекцию за короткий промежуток времени, что чрезвычайно важно в условиях высокой концентрации птиц, а также предупредить распространение болезни в вдуте птицехозяйсгва. Оздоровление данных птицефабрик от ИГП было достигнуто без смены всего птицепоголоввя.

ВЫВОДЫ

1 .Проведенные комплексные исследования позволили установить инфехцнонную природу заболевания цыплят-бройлеров с признаками гидроперикардита.

2.Изучены эпизоогологические особенности болезни (возрастная восприимчивость цыплят и некоторые пути передачи возбудителя), клинические признаки и патологоанагомическне изменения у больных цыплят в экспериментальных и производственных, условиях.

3.Выделенные от больных цыплят пять изолятов возбудителя ИГЛ идентичны в антигенном отношении и по своим биологическим н морфологический свойствам являются типичными представителями семейства аденовирусов.

4.Определены оптимальные условия постановки РДП для ретроспективной диагностики ИП1: концентрация агара-1,5%, концентрация хлористого натрия — 8%, толщина агарооой пластннкн -3-4мм, расстояние между лунками - 5-8мм в температура окружающей среды + 37°СЛредв^»ггельный учет реакции проводится через 12 часов, окончательный - через 24 часа. Для постановки реакции антиген берут в исходной концентрации, а иммунную сыворотку - в рабочем разведении.

5.Установлены параметры инактивации вируса ИГП под действием раствора формалина: конечная концентрация -0,1% в течение 24 часов при температуре +37°С.

6.На основе штамма ИАДВ" разработана технология изготовления и контроля ин активирован ной сорбированной вакцины против ИГП.

7.Испытания вакцины в лабораторных и производственных условиях показали высокую эффективность препарата и возможность его применения для специфической профилактики ИЩ в неблагополучных птицехозяйствах.

8.В зависимости от эпизоотической ситуации н срока выращивания бройлеров в хозяйстве рекомендуется однократная вакцинация цыплят в возрасте 15 суток или двукратная в возрастеШн 20 суток.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.

1 .На основании проведенных исследований предлагаются методические рекомендации "Инфекционный гядроаерщарднт у цыплят-бройлеров" по диагностике заболевания для использования в

работе иаучно-исследовггельских учреждений и производственных ветеринарных лабораторий.

2,Разработаяа технолог** изготовления и контроля инактнвированной сорбированной вакцины против ИГЛ птиа т штамма "АДВ".

СПИСОК ОПУБЛИКОВАШШХ РАБОТ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ.

1.Мяютша Н.В.

Гидроперюсардит - инфекционная болезнь | Всероссийская конференция молодых ученых и аспирантов по гггицеводству. Тезисы докладов. Сергее® Посад,-1906. - С.20.

2.Алиев A.C., Никитине JT.B.

Диагностика и специфическая профилактика инфекционного гидропертисардитв птиц Ц Мат, научно-производственной конференции, посвященной 190-ветяю высшего вег. образования в России н 100-яетию вет. науки. С-Петербурп -1998. - 4.1. - С. 14-15

3.Алиев А.С.,Сираждинов P.C., Никитина Н.., Алиева А .К. Клиннко-анатомическая характеристика инфекционного гидроперикарднта птиц || Мат. Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию Ставропольской НИВС. Ставрополь. - 1999. - СЛ4-35.

4. Алиев A.C., Снраждинов P.C., Никитина Н.В. Инфекционный гидроверикардит у цыдяягН)роалеров j| Методические рекомендации, С-Йетербург.- 2000.-20 с.

5 .Алиев A.C., Крон HB., Кузьмин, В .А. Чувстаительвость цьшлят-бройлеров к экспериментальному заражению вирусом инфекционного гкароперикардита Ц Мат. научн. конф. СПБГАВМ. С-Пегербург. - 2003. - C.7-S.

6. Abjev A.S., Djavadov ЕЛХ, Nikitina N.V. Aetiology of hydropcricardium ю broikr chicks I Proc. Xith Int. Congr. of the World Veterimuy Poultry Ass., Hungary, Bmfapeat -1997. - P.257.

7. Aiijev A.S., NikrtinaN.V. Specific prophylactic of chicken infectious hydroperycardimi (j Proc. 10th Evropean Poultry Conf., Israel, Jerusalem. - 1998. * P.7I.

• 1969&

OrorwUrtö дотфРйЬдьяо-мйлйогге^ьным участил* vtntna Фбсауйа+ftftttwi учгбшдо процесса froyavrer» СПвГУ. от I1Ö&03*

ГЬалисяио ш ТРЗДТЬ ЛЗ С ^ллючика*

Ф-t 30*114,Ус&.леч.л*Т,23.Тираж 1Û&акх, ( МЗД, СПй> Ст. Петергоф* ул. Улыспеыжшц д. тм. 42МЭ-ЗД